GENETICA BACTERIANA

Griffiths A., Wessler S., Lewontin R., Gelbart W., Suzuki D., Miller J. (2005) Introduction to

Genetic Analysis (8th ed). W.H. Freeman and Company, New York. QH430/I59/2005

Las bacterias poseen todos

los componentes requeridos

para reproducirse, cosechar

y utilizar la energía del

ambiente.

Se reproducen rápidamente,

una célula da origen a dos

idénticas en cada ciclo de

división, produciendo un

colonia de individuos

idénticos.

Suspensión celular bacteriana Suspensión plaqueada en

caja con agar

Incubación 1 – 2 días

Caja Petri con agar

Células individuales invisibles a simple vista

Colonias visibles procedentes de una célula individual (mismo genotipo y fenotipo)

Prototróficas : Son bacterias silvestres que pueden crecer en medios mínimos (sales inorgánicas, fuente de carbono – glucosa y agua). A partir de estas sustancias mínimas las bacterias pueden construir todas las macromoléculas necesarias para vivir.

Auxotróficas : Las bacterias son generalmente mutantes y no pueden crecer a menos que se adicionen al medio nutrientes específicos (Adenina, biotina, metionina, etc.)

Resistencia o susceptibilidad a antibióticos

Mutantes bacterianas

Marcadores Genéticos

Requiere biotina como suplemento

Requiere arginina como suplemento

Requiere metionina como suplemento

No puede utilizar lactosa como fuente de carbono

No puede utilizar galactosa como fuente de carbono

Resistente al antibiótico estreptomicina

Susceptible al antibiótico estreptomicina

Medio mínimo: medio sintetico básico para el crecimiento bacteriano sin nutrientes adicionales

Transferencia genética horizontal

Transferencia genética vertical

Mecanismos de Transferencia Genética Horizontal

La bacteria donadora es la que contribuye con una

fracción de material genético a la bacteria receptora

El fragmento de DNA donado es llamado exogenota

y el genoma receptor el endogenota

Una bacteria que contiene ambos DNAs, el

exogenota y el endogenota es merocigoto

a+ b+

a b

Exogenota

Endogenota

Material Genético Transferido

DNA bacteriano DNA plasmídico DNA viral

E. coli

Pili

F+

F+ (Factor de fertilidad)

F -

Plásmido F

*Plásmido F codifica alrededor de 100 genes

William Hayes, 1953 Conjugación bacteriana

GENOTIPO

FENOTIPO

¿Es el plásmido F el responsable de fenotipo

WT después de la Conjugación?

¡La frecuencia de transferencia de F es mayor a la

frecuencia de recombinantes para los marcadores genéticos

que se estudiaron!

F +

F –

Estos marcadores genéticos residen en el DNA del cromosoma bacteriano

Para la transferencia de DNA del cromosoma bacteriano mediante conjugación, se necesita la INSERCIÓN del plásmido F al cromosoma generando una célula Hfr

High Frequency of

Recombination

El bajo nivel de transferencia de marcadores genéticos se debe

a la presencia de unas pocas celulas Hfr en la población F+

Integración de F al

cromosoma bacteriano

La inserción de plásmido F en el cromosoma bacteriano puede ocurrir en diferentes lugares mediante recombinación (sitios IS y Tn1000 )

Integración del plásmido F al cromosoma

O

O

Orientación

del origen O

Dependiendo de la orientación del Origen de replicación de F

durante la integración, comenzarán a transferirse los

marcadores genéticos

Experimentos de conjugación interrumpida

Wollman y Jacob, 1957

F- strr × Hfr strs

Str +

azis

tons

lac

gal

azir

tonr

lac+

gal+

Después de 2 h

algunos exconjugantes

se convierten en Hfr

F d c b a O

Orden de Transferencia de Marcadores Genéticos

Dos eventos de recombinación

Generalmente la Conjugación se interrumpe antes de que se

transfiera todo el Hfr; el exogenota es lineal y el endogenota es

circular. Ocurren dos eventos de recombinación.

a+

a–

a+

+

a– No viable

Viable

No viable

Merocigoto

Recombinación entre exogenote y endogenote

¡ Doble entrecruzamiento !

Recombinantes

recíprocos

Conclusiones:

1. El cromosoma de E. coli es circular.

2. El plasmido F es circular.

3. La orientación en la que se intergra F al

cromosoma determina la polaridad del cromosma

Hfr.

4. Un extremo de F integrado es el Origen donde

comienza la transferencia y el otro extremo es el

término que NO se transfiere a menos que antes

se haya transferido TODO el cromosoma Hfr.

Resumen de la Conjugación bacteriana

1. Eco RI

2. Sa/I

3. tetracycline resistance

4. origin of replication

5. Pstl

6. amplicillin resistance

7. Pst I

8. EcoRI

9. SalI

PLÁSMIDOS

Elementos de ADN extracromosomal, de doble cadena

circular, covalentemente cerrado. Contienen: origen propio

de replicación, sitios de reconocimiento para enzimas de

restricción, marcadores de selección (resistencia a

antibióticos). Presentes en elevado número de copias en la

célula.

CLASIFICACIÓN DE PLÁSMIDOS

Por su capacidad de transferencia:

-Conjugativos (a través de un pili a otra membrana)

-No conjugativos

Por sus efectos fenotípicos:

-Fertilidad (factores F)

-Plásmidos bacteriocinogénicos (codifican una proteína

tóxica para otras bacterias que no portan ese tipo de

plásmido)

-Plásmidos de resistencia (factores R)

Por el número de copias:

-Relajados (>1000 copias/célula)

-Restringidos (<100 copias/célula)

Episoma (F’) : Plasmido F con genes bacterianos

Exconjugante

Donadora

Mapeo por frecuencia de recombinantes

Si seleccionamos leu como marcador: Podemos medir la distancia entre los genes porque todos tienen la misma oportunidad de incorporarse al cromosoma receptor

La frecuencia de recombinación indicará la distancia entre los genes

Las posibilidades de recombinación que existen:

muy poco frecuente

4%

9%

87%

0%

leu+ arg - met - 4%

leu+ arg+ met - 9%

leu+ arg+ met+ 87%

leu -- arg 4 u.m. y arg – met 9 u.m.

En E. coli, cuatro cepas Hfr donaron los siguientes marcadores genéticos en el orden: Cepa 1: Q W D M T Cepa 2: A X P T M Cepa 3: B N C A X Cepa 4: B Q W D M Todas las cepas Hfr strains derivan de la misma cepa F+. ¿Cuál es el orden de los marcadores en el cromosoma original? (1)

Q W

D

M

T P X

A

C

B N

(2)

(3) (4)

Tarea: 1) Se realizó la conjugación entre una cepa Hfr que es met+ thi+ pur+ con una cepa F que es met thi pur de manera interrumpida. Se encontró que met es el marcador que se transfiere último, así que los exconjugantes se seleccionaron en un medio sin metionina. Para probar la presencia de los alelos thi+ y pur+ se hizo selección en medios sin estos compuestos, encontrando los siguientes datos: met+ thi+ pur+ 280 met+ thi+ pur- 0 met+ thi– pur+ 6 met+ thi- pur- 52 Determina el orden de estos marcadores en el cromosoma Calcula la distancia entre los marcadores en unidades de mapa

2) Se aisló una bacteria mutante con fenotipo StrR pero incapaz de usar acetato como fuente de carbono (ace-). Para determinar dónde mapea el gen responsable de la mutación se utilizó la conjugación con cuatro cepas diferentes donadoras StrS ace+ Hfr que se muestran. Las flechas indican la posición y orientación de F en cada Hfr.

a) ¿En qué medio seleccionamos los exconjugantes en este experimenmto? b) ¿Cómo vamos a excluir las células donadoras en este experimento? c) Si se tienen los siguientes resultados, ubica el gen ace en el mapa (tomando en cuenta el tiempo en minutos).