Geni in regulacija njihovega prepisa

• regulacija encimske aktivnosti

• indukcija in represija

• pozitivna in negativna kontrola, atenuacija

• globalna kontrola

• dvokomponentni sistemi

• pogovor bakterij

Regulacija sinteze in aktivnosti proteinov

V celici ločimo dve vrsti regulacije:

- regulacijo aktivnosti že sintetiziranih proteinov

- regulacijo sinteze proteinov

konstitutivno izraženi geni inducibilni geni

Regulacija encimov na različnih nivojih

transkripcija

translacija

gen B

regulacija encimske aktivnosti

protein C

gen C

protein D

produkt

gen Dgen A

Regulacija encimske aktivnosti

Obstaja več mehanizmov regulacije encimske aktivnosti:

• aktivacija s posttranslacijsko cepitvijo proteina

• kovalentna modifikacija proteina (npr. dodajanje acilne skupine,

AMP, ADP, fosfata, metilne skupine)

• deaktivacija z razgradnjo proteina

• mehanizem povratne zanke (pozitivna in negativna)

Mehanizem povratne zanke

substratKončni produkt metabolne poti inhibitorno

deluje na prvi encim v metabolni poti. Na

ta način je zelo učinkovito regulirana

koncentracija metabolitov v celici (npr.

aminokislin).

intermediat 1

intermediat 2

intermediat 3

intermediat n

produkt

Povratna zanka - alosteričen učinek

Regulacija transkrpicije: represija in indukcija

represija encima indukcija encima

Genska represija (negativna kontrola)

Neaktiviran represor

omogoča sintezo proteina.

Prisotnost korepresorja

prepreči, kar negativno

vpliva, na sintezo proteina.

Genska represija (negativna kontrola)

Induktor deaktivira represor,

sprosti negativno kontrolo in

tako omogoči sintezo

proteina.

Prisotnost represorja

prepreči, negativno vpliva,

na sintezo proteina.

Genska indukcija (pozitivna kontrola)

Brez induktorja ni možna

vezava aktivatorskega proteina

na RNA polimerazo, kar slednji

onemogoča vezavo na DNA.

Aktivatorski protein za razliko

od represorja pozitivno vpliva

na sintezo proteina.

Genska indukcija (pozitivna kontrola)

Lahko pa je oddaljeno nekaj

100 bp od mesta za vezavo RNA

polimeraze.

Mesto za vezavo aktivatorja je lahko v neposredni bližini mesta za vezavo RNA polimeraze.

Regulacija translacije - atenuacija

Višek triptofana, transkripcija zaustavljena. Regija 2 in 3 se ne moreta pariti.

Pomankanje triptofana, transkripcija poteka.

DNA regulatorni proteini

Regulacijo prepisa DNA vršijo

regulatorni proteini, ki imajo

specifične interakcije z

regulatorno regijo tarčnega

gena. Običajno so regulatorni

proteini dimeri, ki se vežejo na

invertirane sekvence DNA.

DNA regulatorni proteini

cinkovi-prsti

Cink interagira z dvema cisteinoma in dvema histidinoma

levcinska zadrga

vsaka 7. amino kislina v delu proteina, ki skrbi za interakcije medregulatornimi proteini, je levcin

Regulacija več genov - katabolna represija

Če sta v gojišču na voljo dva vira

ogljika, potem običajno zasledimo

preferenčno rast na enem viru ogljika,

kar imenujemo diauksična rast.

Represijo genov, ki so odgovorni za

izrabo drugega vira ogljika imenujemo

katabolna represija.

rast na laktozi

laktoza

glukoza

rast na glukozi

čas

konc

entr

acija

Lac operon, prototip genske regulacije

O mesto vezave represorja

P promotor RNA polimeraze

LacI gen za represor

Pi promotor za LacI

LacZ gen za beta-galaktozidazo

LacY gen za laktozno permeazo

LacA gen za tioglikozid transacetilazo

Cap gen za sintezo CAP proteina (aktivator)

lacI Pi P O lacZ lacY lacA

RNA polimeraza

cap

mRNAmRNA

Z Y Ainhibitor

Lac operon, ko v mediju ni prisotne laktoze

lacI Pi P O lacZ lacY lacA

RNA polimeraza inhibitor

inhibitor

mRNA

Lac operon, ko je v mediju prisotna laktoza

lacI Pi P O lacZ lacY lacA

Z Y A

mRNAmRNA

RNA polimeraza

inhibitor

laktoza

Lac operator v primeru, ko sta v mediju prisotna glukoza in laktoza

Z Y A

mRNA

Cap

mRNA

inhibitor

RNA polimeraza

lacI Pi P O lacZ lacY lacAcap

cAMPglukoza

cAMP

cAMP

Cap

počasen prepis brez cAMP-Cap

Ko je v mediju prisotna glukoza je vedno tudi izrabljena. Ostali sistemi za izrabo sladkorjev morajo

biti inducirani. Ko je v mediju veliko glukoze, je konc. cAMP nizka. Če se konc. glukoze zmanjša se

poveča konc. cAMP, kar omgoča vezavo cAMP na CAP protein, le ta pa stimulira vezavo RNA

polimeraze na DNA in bistveno večji prepis genov za metabolizem laktoze.

Dvokomponentni regulacijski sistemi

senzor

ligand

vezava liganda P Hisavtofosforilacijasenzorja

prenos fosfata iz histidina senzorja na aspartat odzivnega regulatorja

PHis

AspRNA

polimeraza

promotor operator gen

PAsp

PAsp

odzivni regulator

Nekateri dvokomponentni regulacijski sistemi v mikrobnih celicah

sistem okoljski signal senzorska kinaza odzivni regulator

Arc O2 ArcB ArcA

Nar NO3-, NO2

- NarX, NarQ NarL

Ntr NH4+ NrII NrI

Pho regulon Pi PhoR PhoB

porinski reg. ozmotski pritisk EnvZ OmpR

Evg nizka temp. EvgS EvgA

Tox pH, temp., ozmoza ToxS ToxR

Bvg temp., nikotinskak. BvgS BvgA

“Quorum” zaznava gostote bakterij

Quorum zaznava je vrsta globalne kontrole mikroorganizmov, kjer je

okoljski signal gostota bakterijske kulture. Bakterija ima encim za sintezo

feromona (npr. aciliranega homoserin laktona). Feromon difundira iz

celice. Njegova koncentracija postane znatna šele pri zelo gosti kulturi.

celični agregatcelice začnejo agregirati

celica proizvaja feromon

Kako se bakterije pogovarjajo?

Veliko signala pomeni veliko celic v okolici, čas za spremembo obnašanja!

• produkcija ekstracelularnih signalnih molekul - feromonov

• detekcija povišane celične koncentracije preko membranskih in

citoplazmatskih receptorjev

• sprememba transkripcijskega vzorca in sprememba obnašanja

Kemijska narava signalnih molekul - feromonov

OO

NH

OH

O

3-oxo-C6-HSL iz Vibrio fischeri

homoserinlaktoniG- bakterije

H-Tyr-Ile-Asn- NHAsp

PheLeu

NH

SMe

Me

O

O

G+ bakterijepeptidi

Ciklični peptid iz S. aureus

Druge signalne molekule: γ-butirolaktoni , quinoloni , furanoni

Kateri procesi so regulirani

s quorum zaznavo?

virulenca

transfer genetskega materialaantibiotiki

bakteriocini

plodno telesceekstracelularni encimi

sporulacijabioluminescencabiofilm

Globalna kontrola sinteze proteinov

Organizirani sočasni kontroli več različnih genov v organizmu pravimo

globalna ali integralna kontrola.

sistem signal število reguliranih genov

katabolna represija ciklični AMP >300

aerobna respiracija prisotnost O2 >50

anaerobna respiracija odsotnost O2 70

toplotni šok temperatura 36

asimilacija dušika pomankanje NH4+ >12

oksidativni stres oksidanti >30

SOS odgovor poškodovana DNA >20

Globalana kontrola

signal

citoplazmatska membrana

signalni intermediat

ekspresija induciranih genov

primarni nivo regulacija genov

sekundarni nivo regulacije genov

Mikrobna genetika

• mutacije

• homologna genska rekombinacija:

transformacija

transdukcija

konjugacija

• nehomologna genska rekombinacija

• primerjalana genomika

Mutacije in mutanti

• Mutacija je dedna sprememba, ki se prenaša iz generacije v generacijo.

Mutant je organizem, ki nosi dedno spremembo.

• Gene pišemo z malo črko, npr. hisC, recA.

• Proteine, ki nastanejo iz gena pišemo z veliko črko, npr. HisC, RecA

• Fenotip mutante označujemo z oznako + ali - npr. His+ (organizem lahko

naredi histidin) ali pa His- (organizem ne more narediti histidina).

Vrste mutacij

Tihe mutacije: spremenjena je tretja baza kodona (ohrani se isto aminokislina)

Nesmiselne mutacije: formiranje stop kodona, nekompleten protein

Zamenjava aminokisline: spremenjena prva baza kodona

Pogojno letalne mutante: npr. rast pri 30 oC, odsotnost rasti pri 40 oC

Sprememba bralnega okvirja: popolnoma spremenjene aminokisline

Revartante: povratna mutacija, ki povzroči nastanek divjega seva

Vrste mutacij

Supresorske mutacije: vrne fenotip divjega seva (sprememba je lahko v istem

genu, vendar ne na istem mestu kot revartanta, lahko je v drugem genu, ki

komplementira mutiran gen, kar vrne fenotip)

Delecije: izguba večjega števila nukleotidov

Insercije: vgradnja večjega števila nukleotidov

Translokacije: premikanje večjega dela DNA med različnimi lokacijami na

kromosomu

Inverzije: zamenjana orientacija DNA segmenta

Spontana frekvenca mutacij

DNA

~ 10-10/bp

DNA

~10-5/bp

RNA

~ 10-4/bp

protein

• spontana frekvenca mutacij v populaciji celic je ~ 10-6 na generacijo

• spontana frekvenca transpozicij je ~ 10-4 na generacijo

• spontana frekvenca mutacij RNA virusov je ~ 10-3 na generacijo

• mutatorski geni povečajo stopnjo mutacij za ~ 10-15 x

Biološka ura: 10-9 mutacij/bp/leto

Inducirana naključna mutageneza

sredstvo učinkovanje sprememba

analogi baz spremenjeno parjenje A : T T analog : G G : C

HNO2 deaminacija A in C A : T G : C

NH2OH reakcija s C G : C A : T

etilmetansulfonat dodajanje CH3 na G G : C A : T

etidijev bromid interkalacija mikroinsercije, mikrodelecije

mitomicin povezava DNA vijačnic delecije

UV pirimidinski dimeri delecije

X-žarki prosti radikali delecije

Točkasta mutageneza

Omogočajo zamenjavo ene same

aminokisline v proteinu tako, da

na mutiranem mestu v genu

dodamo oligonukleotidni začetnik

z nepopolnim parjenjenjem

nukleotidov. Uporabljamo v

biotehnologiji za pridobivanje

željenih mutiranih proteinov.

Kasetna mutageneza

Željeni del DNA lahko nadomestimo z

mutiranim. Z vgradnjo genske kasete

v izbrani gen na plazmidu po

homologni rekombinaciji s

kromosomalnim genom onsposobimo

gen, obenem pa lahko vnesemo

željene gene in molekularne markerje.

Horizontalni prenos genov

Za razliko od prenosa genov iz generacije v generacijo (vertikalni

prenos genov) pri horizontalnem prenosu prehaja do izmenjave

(rekombinacije) genov znotraj iste generacije. Ločimo:

• homologno gensko rekombinacijo

• nehomologno gensko rekombinacijo

Homologna genska rekombinacija prokariontov

Pri prokariontih so homologni fragmenti DNA lahko transportirani med

celicami in s homologno rekombinacijo integrirani v gostiteljevo DNA. Trije

najpomembnejši procesi homologne rekombinacije so:

• transformacija (prenos proste DNA)

• transdukcija (prenos DNA z virusi)

• konjugacija (prenos plazmidne DNA med celicami)

Homologna genska rekombinacija

Homologna genska rekombinacija

Rec A in SOS odgovor na DNA poškodbo

Genska transformacija

Transformacija - vnos tuje DNA

ECECEAEA

NucANucANuclease?Nuclease?

ATPATP ADPADP

FAFA

Načini vnosa tuje DNA

Frekvenco vnosa povečamo s Ca2+

ioni in nizko temperaturo. DNA lahko

vnesemo z elektroporacijo. Pri

evkariontih DNA transformiramo z

virusi, endocitozo, elektroporacijo in

balističnimi izstrelki obloženimi z

DNA.

Litični in lizogeni cikel bakteriofagov

Indukcija temperiranega faga

Specializirana transdukcija

Fagna konverzija

bakterija fag protein ali fenotip

Escherichia coli φFC3208, λ enterohemolizin, rezistenca na serum

Shigella flexneri sf6, sfII O-antigen acetilaza, glukozil-transferaza

Salmonella enterica Gifsy-2, superoksid dismutaza, neuraminadaza

Vibrio cholerae CTXφ, VPIφ kolera toksin, TCP pilini

Pseudomonas aeruginosa φCTX citotoksin

Clostridium botulinum C1 neurotoksin

Staphylococcus aureus NA, TSST-1 enterotoksin, šok sindrom

C. diphtheriae β-fag diftereja toksin

Plazmidi

• plazmid je izven kromosomska DNA

• podvojuje se neodvisno od kromosomske DNA.

• nima proteinskega plašča

• plazmidi imajo dvojnovijačno DNA, večinoma krožno

• vsebujejo od 1 do 100 kb, so supernaviti

• encime za replikacijo plazmid večinsko dobi od gostitelja. Število kopij

varira od 1 do 100 na celico.

• plazmidi, ki so transportirani v celico morajo biti kompatibilni z že

obstoječimi plazmidi v celici, sicer so izločeni.

• plazmide, ki se lahko vgradijo v kromosom, imenujemo episome

Vrste plazmidov

• rezistenčni (R) plazmidi: kodirajo zapis za odpornost na antibiotike, težke

kovine, bakteriocine

• plazmidi s fiziološkimi funkcijami: npr. razgradnja oktanov, herbicidov,

nastanek acetona, butanola, nodulacija, izraba laktoze in saharoze,

produkcija pigmentov

• virulenčni plazmidi: imajo zapis za invazivnost: npr. koagulaze, hemolizin,

eneterotoksin, K-antigen, tvorba tumorjev

R 100 (rezistenčni plazmid)

Kodira zapis za rezistenco na:

- živo srebro (mer)

- sulfonamide (sul)

- tetracikline (tet)

- streptomicin (str)

- kloramfenikol (clm)

F-plazmid

gen funkcija

tra transfer

oriT začetek za transfer

oriS začetek replikacije

inc inkompatibilnost

rep replikacija

IS3, IS2, Tn/1000 (transpozoni) potencialna mesta vgradnje v gostiteljski kromosom

Konjugacija

Informacija za konjugacijo je kodirana na plazmidu. Za konjugacijo so

potrebni pili, ki skrbijo za vezavo donorske in recipientske celice, in jih imajo

samo donorski sevi. Ko sta celici stabilizirani pride do fuzije obeh membran

in do prehoda DNA.

Prenos DNA pri konjugaciji

Za prenos DNA je potrebna

sinteza DNA tako v donorju

kot v akceptorju. Po

končanem procesu ima vsaka

celica eno kopijo plazmida.

Akceptorska celica po

ekspresiji plazmidnih genov

lahko postane donorska.

Mobilizacija kromosoma

Po integraciji F plazmida v kromosom postane tak sev Hfr ali sev z visoko

sposobnostjo rekombinacije. Pri konjugaciji Hfr seva, poleg plazmida,

potuje v recipientsko celico tudi del kromosoma, v katerega je vgrajen F

plazmid.

Plazmidi in virulenčni faktorji

Veliko virulenčnih faktorjev (npr. toksinov, bakteriocinov), ki omogočajo

bakteriji vezavo in kolonizacijo gostitelja je kodiranih na plazmidih.

Virulenčne faktorje poleg plazmidov najdemo tudi na mobilnih genskih

elementih (npr. transpozoni in bakteriofagi) ter na kromosomih.

Transpozicija - nehomologna rekombinacija

Transpozicija omogoča premikanje genov po kromosomu. Pojavlja se s

frekvenco 10-5 do 10-7 na generacijo. Po kromosomu se lahko premikajo le

tisti geni, ki imajo transpozabilne elemente. Ločimo:

• konzervativno transpozicijo (transpozon se izreže in vstavi na novo mesto)

• replikativno transpozicijo (transpozon se podvoji, parentalni ostane na istem

mestu, hčerinski se vgradi na novo lokacijo na kromosomu).

Konzervativna transpozicija

Replikativna transpozicija

Mutageneza s transpozoni

Če se transpozon naključno vgradi v gen ga deaktivira. Za izolacijo mutant

uporabljamo transpozonske gene, ki kodirajo zapis za rezistenco na

antibiotike (vgradnja pomeni rezistenco na antibiotik). Najbolj običajno

uporabljamo Tn10, ki ima marker za tetraciklinsko rezistenco ali Tn5 z

rezistenco na kanamicin in neomicin.

gen A gen B gen C gen D

IS IS

transpozon

Integroni

Nekateri transpozoni vsebujejo poleg genov za rezistenco na antibiotike še

druge gene (genske kasete). Na genskih kasetah je lahko veliko genov za

rezistenco na antibiotike. Najbolj poznan je Tn7 integron.

intI1 P attI aadB sull

intI1 integraza

P promotor

attI mesto vgradnje

sull rezist. na sulfonamide

aadB genska kaseta/rezistenca na aminoglikozilirane antibiotike

Kaj vemo o genomu E.coli

• kromosom ima 4.639.221 bp

• kromosom ima 4.288 bralnih okvirjev (88 % genoma), za okrog 35 %

genskih produktov še vedno ne poznamo fiziološke funkcije

• 1 % genoma predstavljajo geni za tRNA

• 0.5 % genoma so visoko ponavljajoče se sekvence, ki ne kodirajo proteinov

• 10 % genoma predstavljajo regulatorne sekvence (promotorji, operatorji,

začetek podvojevanja, konci podvojevanja DNA)

• geni so bodisi organizirani v klastre-operone (npr. hisG, hisD, hisC, hisB,

hisH, hisA, hisF, hisI, hisE), ali pa razmetani po kromosomu (npr. arg geni)

• okrog 70 % genov je monocistronskih, 6 % je policistronskih

Kaj vemo o genomu E.coli

• na obeh vijačnicah je približno enako število operonov

• na kromosomu je 10 insercijskih elementov IS

• na kromosomu je do 30 % fagnih sekvenc

• na genomu obstaja več patogenih otokov

• približno 20 % celotnega genoma je E.coli pridobila s horizontalnim

genskim prenosom

Primerjava genov pri različnih mikroorganizmih

Transportni sistemi Mycoplasma pneumoniae

Transportni sistemi Haemophilus influenzae

Genomika

Genomika je disciplina, ki se ukvarja z mapiranjem, sekvenciranjem in

analizo genoma. S primerjavo znanih sekvenc lahko določimo potrebne in

zadostne pogoje za opravljanje določenega procesa. Določimo oziroma

sklepamo lahko na:

• konzervativne in variabilne regije v genomu

• urejenost in grupiranje genov

• metabolne poti

• regulatorne mehanizme

• ortologne proteinskih družin (obstja okrog 100 ortolognih proteinskih družin, med

katerimi je možen horizontalen genski prenos)

Postopki pri delu z DNA čipom

• populacijo celic običajno podvržemo okoljskemu faktorju in počakamo da sistem

pride v stacionarno stanje

• ekstrahiramo mRNA in jo reverzno prepišemo (mRNA je hitro razgrajena, zato je

potreben reverzen prepis, žal ta ni kvantitativen)

• fluorescentno označimo cDNA (ker je vezava fluorofora odvisna od dolžine in

sestave DNA ni možno kvantitativno določanje koncentracije)

• hibridizacija cDNA na DNA čip (DNA čip je lahko narejen poljubno in vsebuje ORF

ali poznane gene)

• posnamemo vzorec (vzbujamo z laserjem, detektiramo s CCD kamero)

• interpretacija dobljenega vzorca (težavna, ker hibridizacija ni kvantitativna)

Uporaba DNA čipov

• proučevanje fiziologije organizmov

• proučevanje ekologije organizmov

• odkrivanje genov

• diagnoza bolezni

• odkrivanje novih zdravil

• toksikološke raziskave

Molekularno kloniranje

• molekularna orodja

• vektorji

• izolacija ustreznega klona

• uporaba kloniranja

Genski inženiring

Genski inženiring so postopki izolacije, manipulacije in ekspresije

genetskega materiala s katerim proučujemo mehanizme genske replikacije,

ekspresije in jih uporabljamo za produkcijo različnih koristnih produktov.

Aplikativni uporabi genskega inženiringa pravimo tudi biotehnologija.

Molekularno kloniranje

1. Izbira ustreznega DNA fragmenta. DNA je lahko genomska, fragmentirana

z restrikcijskimi encimi, DNA sintetizirana iz RNA, sintetiziranan s PCR ali

sintetična DNA.

2. spajanje izbranega DNA fragmentov v vektor za kloniranje

3. prenos vektorja za kloniranje v izbrane gostitelje, pomnoževanje

vektorja za kloniranje, ustvarjanje genske knjižnice

4. izolacija in čiščenje ustreznega klona

5. pomnoževanje izbranega klona

Iskanje ustreznega gena za kloniranje

Gen, ki ga želimo klonirati je potrebno dobiti v relativno visokem številu (>

106), saj je vgradnja gena v vektor stohastični proces. Željeni gen za

kloniranje lahko v ustrezni koncentraciji dobimo s:

• PCR pomnoževanjem izbranega gena

• iz poznane mRNA sekvence z reverzno transkripcijo in PCR pomnoževanjem

• iz poznane proteinske sekvence s kemijsko sintezo DNA

Molekularna orodja - molekularne škarje

Restrikcijski encimi so visokospecifične

endonukleaze, ki režejo na izbranih mestih

v DNA sekvenci. Za rezanje z restrikcijskimi

encimi potrebujemo os simetrije okrog

katere režejo restrikcijski encimi. Odrezani

konci so lahko lepljivi ali pa topi.

SmaIEcoRI PstI

Molekularna orodja - molekularno DNA lepilo

DNA konce, ki jih dobimo z restrikcijskimi encimi je potrebno med seboj

zlepiti ali ligirati. Zato uporabljamo encim DNA ligazo. DNA ligaza zlepi 5’

fosfatni konec z 3’ hidroksilnim koncem sosednjih nukleotidov.

Ustvarjanje rekombinantnih DNA molekul

G A A T T CC T T A A G

G A A T T CC T T A A G

restrikcijsko mesto restrikcijsko mesto

G C T T A A

A A T T CG

G C T T A A

A A T T CG

lepljivi konec

G C T T A A

A A T T CG

gostiteljeva DNAgostiteljeva DNA donorska DNA

A A T T CG

G C T T A A

donorska DNA

A A T T CG

G C T T A A

Ostala molekularna orodja

• fosfataze

• kinaze

• ssDNA nukleaze

• DNA polimeraze

• RNA nukleaze

• RNA ligaze

• reverzne transkriptaze

Vektorji za molekularno kloniranje

• plazmidi

• bakteriofagi (M13, lambda)

• kozmidi (plazmidni vektorji s kohezivnimi konci iz bakteriofaga lambda)

• evkariontski virusi (adenovirusi, SV40, vakcinia, retrovirusi, bakulovirusi)

• sintetični kromosomi (HAC, YAC, BAC)

Specifični vektorji za molekularno kloniranje

• fuzijski vektorji (fuzija želejenega gena z drugim genom)

• ekspresijski vektorji (velika ekspresija kloniranega gena)

• sekrecijski vektorji (izboljšano izločanje proteinov)

• taksi (“shuttle”) vektorji (prenos DNA med nesorodnimi organizmi)

Plazmidi kot vektorji

• so majhni

• enostavna manipulacija

• DNA je krožna in zelo stabilna

• imajo neodvisno replikacijo od gostiteljevega krmosoma

• v celici so lahko v več kopijah

• prisotnost selekcijskih markerjev olajša detekcijo in selekcijo

Prototip plazmida za kloniranje - pBR322

• je majhen, 4361 bp

• običajno 20-30 kopij v gostitelju

• lahko dosežemo 1000-3000 kopij

• enostavna izolacija zaradi supernavitja DNA

• inserti so lahko veliki do 10kb

• znana je njegova DNA sekvenca

• ima več mest za enkratno cepljenje s PstI, SalI, EcoRI, HindII, BamHI

• ima gen za rezistenco na ampicilin in tetraciklin,

• s transformacijo gre enostavno v gostitelja

Kloniranje s pBR322

AmpR TcR

BamHI restrikcija

DNA ligaze

transformanta občutljiva na tetraciklin, rezistentna na ampicilin

transformanta rezistentna na tetraciklin in ampicilin

BamHI restrikcija

tuja DNA

Bakteriofag lambda kot vektor za kloniranje

neesencialni delZa kloniranje ima divji sev lambde

preveč restrikcijskih mest. V

rekombinantnem fagu (npr. Charon 4A)

je število restrikcijskih mest manjše.

Lahko kloniramo večje fragmente kot

pri plazmidih. Uspešnost transdukcije je

večja kot uspešnost transformacije.

donorska DNA

pakiranje DNA

infektivni fag

Bakteriofag M13 kot vektor za kloniranje

BamHISmai PstI

SalIEcoRI XbalKpnI

....G A A T T C G A G C T C G G T A C C C G G G G A T C C T C T A G A G T C G A C C T G C A G....

lacZ

polilinkerska sekvenca

Bakteriofag M13 ima polilinkersko sekvenco (večje število enkratnih restrikcijskih

mest. Polilinkerska sekvenca ne spremeni bralnega okvirja za prepis lacZ gena. Če

pride do vgradnje DNA segmenta se bralni okvir poruši in s tem sinteza LacZ.

Fuzijski vektor

kontrolira Ptac promotor, obdodatku glukoze pride do indukcije

fuzija inaktivira lacZ

malE uporaben za izolacijo

amp rezistenca na antibiotikmesto za začetek

podvojevanja vektorja

Spojimo, fuziramo dva gena, zaradi lažje izolacija ali detekcije

izbranega genskega produkta.

Sintetični kvasni kromosom (YAC) kot vektor za kloniranje

TEL TELARS CEN Not I Not I URA3klonirana DNA

Kvasni kromosom, ki ga uporabljamo za kloniranje mora vsebovati:

- mesto za začetek replikacije (ARS)

- telomerazo (TEL)

- centromero (CEN)

- mesto za kloniranje (Not I)

- selekcijski marker (npr. gen za uracil URA3)

V YAC kromosom lahko kloniramo relativno velike segmente DNA od 250 do 1000 kb.

Velikost klonirane DNA pri različnih vektorjih

vektor velikost (kb)

plazmid < 15

bakteriofag < 90

sintetični bakterijski kromosom 100 - 500

sintetični kvasni kromosom 250 - 1000

Selekcija rekombiniranih celic

Pri rekombinaciji tuje DNA dobimo tri vrste celic:

• celice, ki nimajo vgrajenega vektorja (npr. celice so občutljive za antibiotik)

• celice ki imajo vgrajen vektor, vendar nimajo želejene DNA (npr. celice

rezistentne na antibiotik, brez nove fenotipske lastnosti)

• celice, ki imajo vgrajen vektor in željeno DNA (npr. celice rezistentne na

antibiotik, imajo novo fenotipsko lastnost)

Selekcija ustreznega klona

Željeno transformanto dobimo bodisi preko spremenjenega fenotipa ali

spremenjenega genotipa:

• iskanje, ko je gen ekspresiran: uporabimo gostitelja, ki je mutiran za

klonirani gen, kar omogoča rast samo transformantam. Alternativno

uporabljamo protitelo za izbrani protein.

• iskanje, ko gen ni ekspresiran: uporabimo označene DNA ali RNA probe

za željeni gen in naredimo hibridizacijo s klonirano DNA

Praktična uporaba genskega inženirstva - biotehnologija

• metabolni inženiring

• rekombinantne vakcine

• produkcija proteinov sesalcev

• transgene živali in rastline

• okoljska biotehnologija

• genska regulacija in genska terapija

Metabolni inženiring

• inkorporacija genov za večji razpon substratov na katerih organizem

raste

• genetska sprememba metabolnih poti

• več produktov manj biomase

Proizvodnja rekombinantnih humanih proteinov

protein funkcija

inzulin uravnavanje krvnega sladkorja

α-1-antitripsin proteazni inhibitor

epidermijski rastni faktor rast epitelijskih celic

humani rastni hormon rast celic

eritropoetin stimulira rast krvnih celic

faktor IX strjevanje krvi

interlevkini a, b, g protivirusna terapija

interlevkini stimulacija imunskega sistema

urogastron kontrola gastrointestinalne sekrecije

Rekombinantne vakcine

• produkcija antigenov (npr. hepatitis B)

• uporaba spremenjenih virusov (npr. vakcinija virus za črne koze,

steklino)

• uporaba gensko spremenjenih bakterij (npr. Salmonella typhi)

• produkcija antigenskih epitopov (npr. M13)

Uporaba rekombinantne tehnologije v kmetijstvu

• toleranca na herbicide

• rezistenca na škodljivce (Baciullus thurigiensis)

• kontrola patogenih gliv (Pseudomonas fluorescens)

• rezistenca na viruse

• utišanje genov gostitelja

• fiksacija dušika

Gensko spremenjena hrana

••

Nekatere od potencialnih koristi GMO

• povečana hranilna vrednost in obstojnost hrane

• povečana odpornost na škodljivce

• eliminacija alergenov

• produkcija farmacevtskih učinkovin

• bioremediacija toksinov in eksploziv

• produkcija biorazgradljive plastike

• zmanjševanje produkcije polutantov

Nekatere od potencialnih nevarnosti GMO

• neželjen prenos toksičnih genov med vrstami

• nepričakovani rezultati rekombinacije

• zmanjševanje biološke pestrosti

• navzkrižna kontaminacija med GMO in ne-GMO

• nezmožnost dolgoročne napovedi vpliva GMO na okolje

Sproščanje GMO v okolje

• Predno spustimo GMO v okolje moramo odgovoriti na naslednja vprašanja:

• ali lahko GMO preživi izven laboratorija

• ali se lahko razmnožuje z nemodificiranimi predstavniki iste vrste

• ali ima GMO selekcijsko prednost pred ostalimi organizmi v okolju

• ali lahko prihaja do horizontalnega prenosa genov

• ali se GMO lahko premika v okolju