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Genoma Umano e malattie genetiche lezione 3-4 Martedì 5 Maggio. le regioni regolative. non ci sono molti esempi già studiati. il primo classico è quella del locus della globina. una Locus Control Region fa parte di un cluster genetico. a livelli superiori mancano degli esempi più chiari. - PowerPoint PPT Presentation
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Genoma Umano e malattie genetichelezione 3-4
Martedì 5 Maggio
le regioni regolative
non ci sono molti esempi già studiati
il primo classico è quella del locus della globina
una Locus Control Region fa parte di un cluster genetico
a livelli superiori mancano degli esempi più chiari
potrebbero mancare oppure sono da scoprire
regioni regolative con funzione bidirezionale
per ora gli esempi più chiari stanno nelle Regioni Regolative costituite da Enhancers
questo livello è molto vicino alla attività trascrizionale dei geni che controllano e che costituiscono il cluster genico
questo tipo di controllo può essere bidirezionale:
TOP - DOWNBOTTOM - UP
esempio del cluster delle Ig
con la regolazione dell’espressione delle Ig sono collegate molte altre funzioni che sono coregolate o coordinate
il coordinamento deve prevedere: - interazioni intracellulari- “ extracellulari
intracellulari: sopravvivenza, selezione, controllo moltiplicativo
extracellulari: interazioni con le altre cellule della risposta immune “cross talking” tramite interleukine
la risposta immunitaria è data dall’interazione di molte cellule e di molte funzioni collegate
partiamo da un esempio
un sistema piuttosto noto ed interessante
la regolazione delle immunoglobuline e dei linfociti B
la maturazione e l’attivazione vanno di pari passo
sistema multifattoriale
esempio di interazione genoma ambiente
the study of the 3’RR
different aspects of the study of a regulatory region
interactions of a regulatory region: unidirectional flux ?
the jerarchy of the regulation
interactions of genome and environment
the genome is controlled by epigenetic events
these events open the possibility of a non univocal flux
needs to be bidirectional
TOR VERGATA
interactions and jerarchy
epigenetic modifications of the region:
nucleosome remodeling; methylation
TOR VERGATA
tools for a RR study
the tools : - evolutionary conservation and transformations - polymorphisms in humans (any kind!) - transgenic models in mouse - in vitro assays with cell lines (mouse and human)
TOR VERGATA
“La regione regolativa 3’ della catena pesante delle Ig: struttura e funzioni”
- processi di maturazione ed interazioni- cluster delle IgH (heavy) e struttura della regione regolativa
- processo evolutivo- instabilità e regioni duplicate
- nell’uomo la regione IgH3’RR duplicata - l’enhancer HS1,2-A/B è duplicato e polimorfico- studio dell’attività tramite geni reporter in cellule trasfettate- studio dei fattori che legano la sequenza enhancer EMSA
La tragedia dei linfociti B nati per morire all’ 80%Il 20 % che sopravvive svolge il suo ruolo solo nella vecchiaia(a parte le memory cells che sono minoranza)
cascata di fosfatasi e kinasi
nel processo di maturazione dei linfociti B si verifica una cascata di segnali
CD45Rap 1 MAPKs
prima degli eventi di riarrangiamento messo in moto dal preBCR
ANTIGENE INDIPENDENTE ANTIGENE DIPENDENTE
CE
LL
UL
E B
VDJriarrangiato. IgM prodotto in membrana
Locus Catene pesanti
Locus Catene leggere
VDJriarrangiato
VJriarrangiato
VJriarrangiato
V-Jprocessing
VDJriarrangiato
V-DJprocessing
D-Jprocessing
VDJriarrangiato. IgM prodotto in membrana.
Lo splicing produce anche
IgD
Fig. 5A Schema del riarrangiamento delle catene leggere e pesanti dell’immunoglobuline in correlazione con la maturazione dei linfociti B.
maturazione
CE
LL
UL
E B
Locus Catene pesanti
Locus Catene leggere
ANTIGENE DIPENDENTE DIFFERENZAZIONE FINALE
VJriarrangiato
VJriarrangiato
VJ riarrangiato Ipermutazioni
somatiche
VJ riarrangiato Ipermutazioni
somatiche
VJ riarrangiato Ipermutazioni
somatiche
PlasmacellulePlasmacelluleCellule MemoriaCellule B attivate
Centrociti
VDJ riarrangiato. Le catene prodotte in
forma di membrana
Switch isotipico a C, C o C. Ipermutazione
somatica
Switch isotipico. Ipermutazione
somatica. Catene pesanti prodotte in
forma di membrana
Switch isotipico. Catene pesanti
prodotte in forma secreta.
VDJ riarrangiato Catene prodotte in forma secreta.
Fig. 5B Schema del riarrangiamento delle catene leggere e pesanti dell’immunoglobuline in correlazione con la maturazione dei linfociti B.
maturazione II
PLASMACELLULE
Cellule B proliferanti
Cellula B attivata (centroblasto)
IL-2; IL-4; IL-5;
IgG2a o IgG3
IgA o IgG2b
IgE o IgG1
IgM
IFN-
IL-4
TNF-
IL-2; IL-4; IL-5;
Citokine proliferanti: IL-2; IL-4; IL-5;
Citokine per il differenzamento: IL-2; IL-4; IL-5; IFN-TNF-
Fig. Azione delle citochine sulla ricombinazione class switching (CSR)
cellule denditriche e T-helper
induzione dello switch
VH DH JH CH
Ricombinazione V(D)J
V(D)J
Risultato dello switch Circolo exciso
Ricombinazione class switching (CSR)
b a
V(D)J
IgM
IgE
2b
2a
Switch region:
• Consiste di sequenze ripetute tra 1 e 10 kb
• Il filamento non stampo è ricco in G
• S, S ed S hanno un repeat di 5 bp. S ha un repeat di 49 bp.
Fig. Ricombinazione class switching (CSR) nel topo.
ricombinazione
Locus catena leggera
Locus catena leggera
Locus catena pesante
Cromosoma 22
Cromosoma 2
Cromosoma 14
LOCI DELLE CATENE PESANTI E LEGGERE DELL’Ig
mappe dei loci IgH e IgL
A B C D FETrascrizione regione S
RNA editing ?
AID? AID?
AID?AID?
CSR ricombinasi?
Riconoscimento delle regioni S accessibili
Formazione di breaks al DNAA
B C D FE
AB C
AB C D FE
AB C
CSR ricombinasi?
Modifica l’RNA e/o le strutture del DNA delle regioni S accessibili
Formazione di strutture secondarie (R loop?)
Attivazione dei sistemi di riparazione del DNA
Riparazione dei breaks
SSS S c-myc
una regione Sdue regioni S Switch su un altro cromosoma
traslocazioneClass switching recombination
AAA B B E FC
Delezioni intra-switch
Modelli che spiegano la Ricombinazione class switching (CSR).
1
2
il riarrangiamento
Activation-induced cytidine deaminase (AID)
espressione nelle fasi di sviluppo Sviluppo dei linfociti B indipendente dall’ antigene
pro-B “committed” esprimono B220 (CD45) e anche CD 43,TdT terminal deossitransferasi, RAG-1, RAG-2, CD19
pre-B diminuzione di CD43, RAG-1 e 2, scomparsa di TdT,riarrangiamento della catena pesante, pBCR pre B cellreceptor, riarrangiamento produttivo della catena leggeraespressione di membrana di IgM
Trascrizione dei surrogati delle catene leggere Ig /formano il pre-B cell receptor complex di membranaessenziale per le fasi di sviluppo
(CD45 - B220 - fosfotirosin fosfatasi PTPase integra i segnali durante lo sviluppo, non necessario per la linfopoiesi, forse è un’attività ridondante)CD19 interagisce con le tirosin-kinasi, non è essenziale, però favorisce l’entrata nel circolo periferico
maturazione nel germinal center
avviene in associazione intima con cellule THelper e cellule dendritiche del follicolo :
-proliferazione clonale
-ipermutazioni somatiche
-selezione di affinità (self ed altro)
-selezione negativa
-switch isotipico
strutture regolative della trascrizione e indirettamente del riarrangiamento delle IgH
promotori dei geni V enhancer intronico iEECS (evoluz. conserved seq.) intervening 5’ CH genes
3’ Ig heavy 3’ enhancer complex o regulat. regionk intronico iE3’E light chain E
si attivano per la trascrizione sterile insieme a RAG1/2 con altri enzimi del riparo, variazione di metilazione e di struttura cromatinica, gli enhancers necessari anche per la ricombinazione V(D)J
I riarrangiamenti sono regolati da fattori di trascrizione ubiquitari e tessuto specifico
Cluster organization:
Translocon organization:
Sharks (hom shark)- multiple loci of each type except IgMgj
Channel catfish (700 - 800kb)
lungfish
coelacanths
Xenopus (~800 kb)
Duch and chicken
Cattle
Rabbit
Mouse
Human
IgM
IgM
IgM
IgM
IgNAR IgW IgM1gj
IgW
IgY IgX
E
E
E E
(V DDJ C)200 (V DDDJ NAR)>2 (V DD J C)<10 (VD J C1gj)<10 (multiple chromosomes)(not L chain-associated)
many V’s VDJ D,J’s
C
100-200 V’s D’s
9J’s
C Csec Cmem
several V’s Presumptive arrangement
CD, J’s several V’s CD, J’s
VD’s(>100) J’s C VD’s(>100) J’s C
V’s(100-200) D(>15) J(8-9) CS C S C S
pseudoV’s(~100) V D’s J CS C SC S
V’s(~15) D(>3)
J(2)
SC SC
SC
SCSCSCSC
V’s(~100) D(14)
J(6)
SC SCSCSC SCSC SCSCSC
V’s(~100) D(14)
J(4)
SC S CS CC SCb SCaSC SC
V’s(~100) D(27)
J(6)
SC S CS CC S SC SC SCS CS C
350 kb
200 kb
13 C genes
150 kb (cattle)
48 kb (duck); 80kb (chicken)
Transcriptional orientation
E
E
E
?
7 geni costanti
forse 13 geni costanti
8 geni costanti
10 geni costanti
dipnoi
crossopterigi (latimera)
teleostei
evoluzione delle Ig
Mouse Igh cluster Chromosome 12
Human Igh cluster Chromosome 14
12F1
14q32.33
mta1
mta1
JDV
JDV
mta1 crip2 crip1 hole
mta1 crip2 crip1 hole
a b
J D V
J D V
elk 2.1 hs4 hs1.2 hs3 20bp 1
3’1
hole elk 2.2 hs4 hs1.2 hs320bp 2
3’2
hs 4
hs 3
Bhs
1,2
hs 3
A
hs 4
hs 1
,2hs
3
hs 4
hs 1
,2hs
3
3’2 3’1
BAC199M11(AF450245)
86,035,000 86,040,000 86,045,000 86,050,000 86,055,000 86,065,000 86,070,000 86,075,00086,060,000
85,894,500 85,904,500 85,914,500 85,924,500 85,934,500 85,944,500 85,954,500
centromero telomero
trascrizione
IgH3’RR-A
IgH3’RR-B
(rischio riarrangiamenti)
cluster Ig topo-uomo