Genome  Sequencing  (Part  1)  

Lecture  4:  August  30,  2012    

Review  from  Last  Lecture  

De  novo  vs.  Re-­‐sequencing  •  De  novo  assembly  (“from  the  beginning”)  implies  that  you  have  no  prior  knowledge  of  the  genome.    No  reference,  no  conNgs,  only  reads.  

•  Re-­‐sequencing  assembly  assumes  you  have  a  copy  of  the  reference  genome  (that  has  been  verified  to  a  certain  degree).  

•  The  programs  that  work  for  re-­‐sequencing  will  not  work  for  de  novo  and  vice  versa.  However,  both  can  create  copies  of  the  genome.  

De  novo  vs.  Re-­‐sequencing  

Sample  PreparaNon  

Fragments

Re-sequencing (LOCAS, Shrimp) requires 15x to 30x coverage. Anything less and re-sequencing programs will not produce results or produce questionable results.

Sample  PreparaNon  

Fragments

De-novo assembly requires higher coverage. At least 30x but upwards to 100x’s coverage. Most de novo assemblers require paired-end data.

IntroducNon  and  History  

Sample  PreparaNon  

Sample  PreparaNon  

Fragments  

Sample  PreparaNon  

Sequencing  

ACGTAGAATCGACCATG

GGGACGTAGAATACGAC

ACGTAGAATACGTAGAA

Reads  

Fragments  

Next  GeneraNon  Sequencing  (NGS)  

Sample  PreparaNon  

Sequencing  

Assembly  

ACGTAGAATACGTAGAAACAGATTAGAGAG…

ConNgs  

Fragments  

Reads  

ACGTAGAATCGACCATG GGGACGTAGAATACGAC

ACGTAGAATACGTAGAA

Sample  PreparaNon  

Sequencing  

Assembly  

Analysis  

Fragments  

Reads  

ConNgs  

Sample  PreparaNon  

Sequencing  

Assembly  

Analysis  

Fragments  

Reads  

ConNgs  

Our  focus  for  today’s  lecture:  1.  Comparison  of  sequencing  

plaXorms  2.  Details  of  sample  preparaNon  3.  DefiniNons  and  terminologies  

concerning  data  and  sequencing  plaXorms  

Landmarks  in  Sequencing  Efficiency    (bp/person/year)  

Year   Event  

1870   Miescher:    Discovers  DNA  

1940   Avery:    Proposes  DNA  as  “GeneNc  Material”  

1953   Watson  &  Crick:    Double  Helix  Structure  of  DNA  

1   1965   Holley:    Sequenced  transfer  RNA  from  Yeast  

1,500   1977   Maxam  &  Gilbert:  "DNA  sequencing  by  chemical  degradaNon”  Sanger:  “DNA  sequencing  with  chain-­‐terminaNng  inhibitors”  

1980   Messing:  DNA  cloning  

15,000   1981   Messing:  Messing  and  his  colleagues  developed  “shotgun  sequencing”  method  

25,000   1986   Hood  et  al.:    ParNal  AutomaNon  

1987   ABI  markets  the  first  sequencing  plaXorm,  ABI  370  

Landmarks  in  Sequencing  Efficiency    (bp/person/year)  

Year   Event  

50,000   1990   NIH  begins  large-­‐scale  sequencing  trials  of  bacteria  genomes.  

200,000   1995   Craig  Venture  and  Hamilton  Smith  at  the  InsNtute  for  Genomic  Research  (TIGR)  published  the  first  complete  genome  of  a  free-­‐living  organism  in  Science.    This  marks  the  first  use  of  whole-­‐genome  shotgun  sequencing,  eliminaNng  the  need  for  iniNal  mapping  efforts.    

2001   A  drai  of  the  human  genome  was  published  in  Science.  

2001   A  drai  of  the  human  genome  was  published  in  Nature.  

50,000,000   2002   454  Life  Sciences  comes  out  with  a  pyrosequencing  machine.  

100,000,000   2008   Next  generaNon  sequencing  machines  arrive.  

Huge   2011   Oxford  Nanopore:  600  Million  base  pairs  per  hour.    

Robert  Holley  and  team  in  1965  

Watson  and  Crick  

Messing:  World’s  most-­‐cited    scienNst  

Francis  and  Collins:  Private  Human  Genome  project.    

Next-­‐Gen  Sequencing  PlaXorms  

454/Roche  GS-­‐20/FLX  (2005)  

PacBio  RS  (2009-­‐2010)  3rd  generaNon?  

Illumina  HISeq    (2007)  

Comparison  of  NGS  PlaXorms  

Technology   Reads  per  run   Average  Read  Length  

bp  per  run   Types  of  errors  

454  (Roche)   400,000   250-­‐1000bp   70  Million   SubsNtuNon  

SoLID  (ABI)   88-­‐132  Million   35bp   1  Billion  

Illumina  HISeq   150  Million   100  –  200bp   15  Billion   SubsNtuNon  with  exponenNal  increase  

PacBio   45,000   1000-­‐2000bp   45  Million   InserNons  and  deleNons  

\  

Sequencing  Methods  and  Terminology  

Sanger  Sequencing  

•  The  key  principle  of  the  Sanger  method  was  the  dideoxynucleoNde  triphosphates  (ddNTPs)  as  DNA  chain  terminators.    

•  These  ddNTPs  will  also  be  radioacNvely  for  detecNon  in  automated  sequencing  machines.  

•  PosiNves:  longer  reads  (600  to  1000  bp).  •  NegaNves:  poor  coverage  (6x),  expensive,  inaccurate.      

•  SNll  commonly  used  for  small  scale  sequencing.  

Sanger  Sequencing  Video  

Sanger  Sequencing  SHEAR DNA target sample

Sanger  Sequencing  SHEAR DNA target sample

A   A   A   A  

C   G  T  

C   G  T  

C   G  T  

C   G  T  

Close each fragment many times.

Sanger  Sequencing  

28  

SHEAR DNA target sample

A   A   A   A  

C   G  T  

C   G  T  

C   G  T  

C   G  T  A C

G

T

Sanger  Sequencing  

A  C   G  T   A

DNA  polymerase   Primer  

Sanger  Sequencing  

A  C   G  T   A

DNA  polymerase   Primer  

Primer  

DNA  polymerase  

A  C   G  T   A

Sanger  Sequencing  

A  C   G  T   A

Primer  

DNA  polymerase  

A  

A  

A  

G  

G  

C  

C  

C  T  

C  T  A  

C  T  

G  

Sanger  Sequencing  

A  C   G  T   A

Primer  

DNA  polymerase  

A  

A  

A  

G  

G  

C  

C  

C  T  

C  T  A  

C  T  

G  

G  

Sanger  Sequencing  

A  C   G  T   A

Primer  A  

A  

A  

G  

G  

C  

C  

C  T  

C  T  A  

C  T  

C  G  

G  

Sanger  Sequencing  

A  C   G  T   A

Primer  A  

A  

A  

G  

G  

C  

C  

C  T  

C  T  A  

C  T  

G  A  

C  G  

G  

Sanger  Sequencing  

A  C   G  T   A

Primer  A  

A  

A  

G  

G  

C  

C  

C  T  

C  T  A  

C  T  

T  

Sanger  Sequencing  

Primer  A  

A  

A  

G  

G  

C  

C  

C  T  

C  T  A  

C  T  

Sanger  Sequencing  

Primer  A  

A  

A  

G  

G  

C  

C  

C  T  

C  T  A  

C  T  

ConNnue  unNl  all  strands  of  DNA    have  undergone  this  reacNon.    If  you  choose  the  reagents  correctly  then  you    should  have  all  possible  A-­‐terminated    strands;  resulNng  in  sequences  of  varying  lengths.  

Sanger  Sequencing  

Sanger  Sequencing  

In  the  radioacNve  gel,  the  longer  DNA  fragments  move  to  the  bopom  and  the  shorter  ones  move  to    the  top.        Aierward  the  sequence  can  be  read  off  by  going    from  top  to  bopom.  

To  recap…  •  Sanger  Sequencing:    

–  Run  a  PCR  reacNon  in  the  presence  of  a  bunch  of  ddNTPs,  with  each  different  base  pair  dyed  a  different  color.    

– Measure  the  length  and  color  of  the  resulNng  fragments  of  DNA,  and  use  that  to  work  out  the  sequence.  

•  Requires  a  lot  of  space  and  Nme:  you  need  a  place  to  run  the  reacNon,  and  then  you  need  a  capillary  tube  or  a  gel  to  determine  the  length  of  the  DNA.    –  You  could  only  run  perhaps  a  hundred  of  these  reacNons  at  any  one  Nme.    

–  There  are  3  billion  base  pairs  of  DNA  in  the  human  genome,  meaning  about  6  million  500-­‐base  pair  fragments  of  DNA.  

40  

Celera  Sequencing  (2001)  

•  300  ABI  DNA  sequencing  plaXorms  •  50  producNon  staff  •  20,000  square  feet  of  wet  lab  space  •  1  million  dollars  /  year  for  electrical  service  •  10  million  dollars  in  reagents  

Total  cost  of  human  genome:  2.7  Billion  dollars  

Celera  Sequencing  (2001)  

•  300  ABI  DNA  sequencing  plaXorms  •  50  producNon  staff  •  20,000  square  feet  of  wet  lab  space  •  1  million  dollars  /  year  for  electrical  service  •  10  million  dollars  in  reagents  

Current  cost  of  human  genome:  <  10,000  $  

•  Second  GeneraNon  sequencing  techniques  overcome  the  restricNons  by  finding  ways  to  sequence  the  DNA  without  having  to  move  it  around.    

•  You  sNck  the  bit  of  DNA  you  want  to  sequence  in  a  liple  dot,  called  a  cluster,  and  you  do  the  sequencing  there;  as  a  result,  you  can  pack  many  millions  of  clusters  into  one  machine.    

Second/Next  GeneraNon  Sequencing  

Sequencing  a  strand  of  DNA  while  keeping  it  held  in  place  is  tricky,  and  requires  a  lot  of  cleverness.  

Illumina  Sequencing  Pipeline  1.  Sample  preparaNon  (1-­‐5  days)  

ligate  adapters  

2.  Cluster  generaNon  on  flow  cell    

3.  Sequencing  and  Imaging  (1  week)  

(1.5  days)  

4.  Analysis  (days,  months,  years…)  

Illumina  Sequencing:  Video  

We  mulNply  up  the  template  stand,  i.e.  the  bit  of  DNA  that  we  are  sequencing,  and  sNck  on  a  few  bases  of  ‘adaptor  sequence’;  this  sequence  sNcks  on  to  complementary  bits  of  DNA  stuck  to  a  surface,  which  holds  the  DNA  in  place  while  we  sequence  it:  

We  then  flood  the  DNA  with  RT-­‐bases.  We  also  add  a  polymerase  enzyme,  which  incorporates  the  RT-­‐base  into  the  new  strand  that  is  complementary  to  the  template  strand:  

We  then  wash  away  all  the  RT-­‐bases,  leaving  just  those  that  were  incorporated  into  the  new  strand;  we  can  read  off  what  base  this  is  by  looking  at  the  color  of  the  dye:  

•  Finally,  we  send  in  the  cleavage  enzyme,  which  cuts  off  the  terminator  region  and  the  dye,  leaving  a  normal  base  pair.  We  can  then  start  again  to  sequence  the  next  base  pair.  

•  In  a  single  Illumina  machine  we  have  hundreds  of  millions  of  these  clusters;  cameras  look  at  all  of  these  dots  and  record  how  they  change  color  over  Nme,  allowing  you  to  determine  the  sequence  of  bases  of  millions  of  bits  of  DNA  at  once.    

•  Sequencing  method  is  actually  prepy  inefficient,  however,  the  machine  is  capable  of  sequencing  millions  of  fragments  of  DNA  at  once.  

Inside  the  Illumina  Machine  

51  

Flow  Cell  Imaging  

A  flow  cell  contains  8  lanes  

Each  lane  contains  three  columns  of  Nles  

Each  column  contains  100  Nles  

20K  to  30K  clusters    Each  Nle  is  imaged  four  Nmes  per  cycle,    which  is  one  image  per  base  

Conclusions  

Sample  PreparaNon  

Sequencing  

Assembly  

Analysis  

Fragments  

Reads  

ConNgs  

“…the  ability  to  determine  DNA  sequences  is  starNng  to  outrun  the  ability  of  researchers  to  store,  transmit  and  especially  to  analyze  the  data.”  

 -­‐  New  York  Times,  November  30,  2011  

What  challenges  are  lei?  

•  Amount  of  data  is  starNng  to  be  overwhelm  biologists  and  data  analysis  people  (aka  bioinformaNcs  people)  are  in  more  demand  

•  Personal  health  care  is  changing  (already);  i.e.  23andme,  sequenom    

•  Data  acquisiNon  is  sNll  difficult  in  some  case  and  advancements  are  needed  in  this  area  

•  SNll  cannot  sequence  some  genomes  

What  will  happen  in  your  lifeNme?  

“We  used  to  think  that  our  fate  was  in  our  stars.  Now  we  know  that,  in  large  measure,  our  fate  is  in  

our  genes.”  -­‐Francis  Crick  

•  You’ll  be  able  to  sequence  your  genome  and  know  the  implicaNons  of  your  genotype  

•  Medical  diagnosis  will  change  •  Plant  and  crop  producNon  will  be  affected  •  We’ll  have  an  improved  knowledge  of  ancestry  of  ourselves  and  other  species