Plāzmīdu DNS superspiralizācijas Plāzmīdu DNS superspiralizācijas ietekmē uz tājās klonētu gēnu ietekmē uz tājās klonētu gēnu ekspresijas līmeni ekspresijas līmeni Escherichia Escherichia

coli coli šūnāsšūnās

Jana Sočņeva Jana Sočņeva

Gaļina Makarenkova Gaļina Makarenkova

Irina SominskaIrina Sominska

LU MIKROBIOLOĢIJAS UN BIOTEHNOLOĢIJAS KATEDRA LU MIKROBIOLOĢIJAS UN BIOTEHNOLOĢIJAS KATEDRA

LU BIOMĒDICINAS STUDIJU UN PĒTĪJUMU CENTRS LU BIOMĒDICINAS STUDIJU UN PĒTĪJUMU CENTRS

Lai gan DNS Lai gan DNS divpavedienu divpavedienu struktstruktūūra tika ra tika noskaidrota jau pirms noskaidrota jau pirms piecdesmit gadiem, piecdesmit gadiem, priekšstati par tpriekšstati par tāās s topolotopoloģģijas lomu šijas lomu šūūnnāā notiekošo procesu notiekošo procesu regulregulāācijcijāā veidoj veidojāās s samsamēērrā ā nesennesen..

Gredzenveida divpavedienu plazmīdu DNS Gredzenveida divpavedienu plazmīdu DNS molekulas baktēriju šūnā pastāv molekulas baktēriju šūnā pastāv superspiralizētā formā.superspiralizētā formā.

DNS superspiralizācija var but pozitDNS superspiralizācija var but pozitīīva un va un negatnegatīīva. . va. .

SuperpiralizSuperpiralizāācijas pakcijas pakāāpe var mainpe var mainīītiesties:: DNS replikDNS replikāācijas laikcijas laikāā topoizomertopoizomerāžāžu iedarbu iedarbīības bas

rezultrezultāātata DNS molekulai apvijoties DNS molekulai apvijoties

ap proteap proteīīniem – piemniem – piemēērrāām RNS m RNS

polimerāzipolimerāzi..

DNS superspiralizDNS superspiralizāācijai ir liela loma cijai ir liela loma daudzos šdaudzos šūūnnāā notiekošajos procesos. notiekošajos procesos. Transkripcijas un replikTranskripcijas un replikāācijas laikcijas laikāā

plazmplazmīīdu DNS superspiralizdu DNS superspiralizāācijas pakcijas pakāāpe pe mainmaināāss = = pplazmlazmīīdu superspiralizdu superspiralizāācijas cijas

pakpakāāpe ietekmpe ietekmēē g gēēnu ekspresijas lnu ekspresijas līīmeni meni baktbaktēēriju šriju šūūnnāās. s.

TomTomēēr DNS superspiralizr DNS superspiralizāācijas izmaicijas izmaiņņas as biotehnolobiotehnoloģģiskiem miskiem mēērrķķiem izmantojamiem izmantojamāās s

baktbaktēēriju riju kultkultūūrrāās ir maz ps ir maz pēēttīītas.tas.

DNS superspiralizācija E. coli šūnās tiek regulēta kā kopējas šūnas homeostāzes daļa.

Rekombinanatajos baktēriju celmos kuri tiek izmantoti dažadu svarīgu un vajadzīgu proteinu ražošanai bieži novērojamas nekontrolētas klonēto proteīnu gēnu ekspresijas izmaiņas, kuras nav saistītas:• ar plazmīdas mutācijām;• ar saimniekšūnas mutācijām• ar būtiskām izmaiņām šūnu augšanas

fizioloģiskajos raksturlielumos.

•Par Par mmodeodeļļobjektuobjektu pētnieciska darba pētnieciska darba izstrādāšani izstrādāšani tika izmantoti klon tika izmantoti klonēētutu cilvcilvēēkaka

interferona IFN – interferona IFN – ggēēnu nesošas plazmnu nesošas plazmīīdasdas - - pIF564 pIF564 deldelēēciju varianti, kuru interferona ciju varianti, kuru interferona

sintsintēēzes spzes spēējas savstarpjas savstarpēēji bji būūtiski atštiski atšķīķīrrāās.s.

•IFN – IFN – g gēēnu izolnu izolēēja no hromosomja no hromosomāāllāās DNS s DNS bibliotbibliotēēkas kkas kāā zondi izmantojot nepiln zondi izmantojot nepilnīīggasas

cDNS klonu (K.Henco, J. Brosius 1985). cDNS klonu (K.Henco, J. Brosius 1985).

• ŠŠīī darba m darba mēērrķķis bija noskaidrot, vai is bija noskaidrot, vai plazmplazmīīdu DNS superspiralizdu DNS superspiralizāācijas pakcijas pakāāpe pe

ietekmietekmēē rekombinanta cilv rekombinanta cilvēēka interferona IFN ka interferona IFN – – sintsintēēzi baktzi baktēērijas rijas Escherichia coliEscherichia coli š šūūnas. nas.

E.coliE.coli TG1 un TG1 un XL Blue MR XL Blue MR celmiemcelmiem

pIF564pIF564 plazmīduplazmīdu

un tas delēcijas un tas delēcijas variantiemvariantiem

pIF693, pIF724 pIF693, pIF724

pIF728, pIF731, pIF728, pIF731,

pIF733, pIF736, pIF733, pIF736,

pIF803, pIF818,pIF803, pIF818,

Darba gaitā tika strādāts ar:Darba gaitā tika strādāts ar:

pIF564

TG1 pIF693

6h 10h 24h

XL pIF693

6h 10h 24h

Plazmīdu superspiralizācijas Plazmīdu superspiralizācijas

blīvuma mērījumiblīvuma mērījumi

Plazmīdas pIF564 un tas delēciju variantu DNS superspiralizāciju

ietekmē: Baktēriju saimniekšūnu ģenētiskais fons un

fizioloģiskais stāvoklis

Novērota korelācija starp rekombinanto plazmīdu superspiralizāciju un IFN - 5 proteīna ekspresijas līmeni – proteīns tiek sintezēts E. coli TG1 celmā, kur plazmīdas ir vairāk superspiralizētas un lielākā skaitā neka XL Blue MR celmā, kur IFN sintēze praktiski nav novērojama

Proteīna uzkrāšanas notiek sākot ar 15 – 24 stundu, sintēze efektīvāk notiek šūnās, kur

plazmīdas šajā laikā ir vairāk relaksētas nekā šūnās, kur plazmīdas ir ilgāk saglabājušas lielu

superspiralizācijas blīvumuRekombinānto plazmīdu superspiralizācijas izmaiņas (Rf) E. coli TG1 augšanas ciklā

Rekombinanta IFN - α5 produktivitāte Tg1 celmā kultūras augšanas ciklā

     

Ievērojot to, ka pētītās plazmīdas izmantotie

replikācijas un gēnu ekspresijas regulācijas elementi ir identiski, var secināt, ka gēnu ekspresijas efektivitātes atšķirības vienā un tajā baktēriju celmā ir atkarīgas

no replikona topoloģijas (superspiralizācijas) īpatnībām. 

Par modeli tālākiem pētījumiem DNS Par modeli tālākiem pētījumiem DNS superspiralizācijas lomas noskaidrošanai uz superspiralizācijas lomas noskaidrošanai uz klonēto gēnu ekspresiju tika izvēlēts HBVc klonēto gēnu ekspresiju tika izvēlēts HBVc antigēna gēns.antigēna gēns.

HBV kora proteina - HBVcHBV kora proteina - HBVc Šīs proteīns spontāni savācas un veido Šīs proteīns spontāni savācas un veido

27nm kora daļiņas 27nm kora daļiņas pat bez citu HBV proteīnu pat bez citu HBV proteīnu klātbūtnesklātbūtnes..

Šīs HBc proteīns ir imunogēns un inducē Šīs HBc proteīns ir imunogēns un inducē organisma augstu anti-HBc titru HBV organisma augstu anti-HBc titru HBV infekcijas laikā ka arī imunizējot dzīvniekus.infekcijas laikā ka arī imunizējot dzīvniekus.

HBV - Kora proteins - HBV - Kora proteins - HBcHBc

Darbā tika izmantots HBc pilna Darbā tika izmantots HBc pilna garuma savvaļas fenotipa un HBc garuma savvaļas fenotipa un HBc saīsinātais gēna variants.saīsinātais gēna variants.

TieTie tika veiksmīgi ieklonēts tika veiksmīgi ieklonēts pTVI un pTVI un pIF693pIF693 (labākās (labākās IFN - 5 producēts) plazmīdas EcoRI saitā, plazmīdas EcoRI saitā, IFN - 5 vietā. Ka rezultāta tika iegūtās jaunas Ka rezultāta tika iegūtās jaunas konstrukcija.konstrukcija.

Tika pārbaudīts arī HBc pilna un HBc Tika pārbaudīts arī HBc pilna un HBc saīsināta ekspresijas līmenis E. coli saīsināta ekspresijas līmenis E. coli TG1 celmā.TG1 celmā.

pHBc-JA-1

pHBc-JA-4pHBc-JA-2

pHBc-JA-3HBc short

HBc short

HBc full

HBc full

pIF693+HBc full pIF693+HBc short

pTVI+HBc shortpTVI+HBc full

Iegūto plazmīdu restrikcijas kartesIegūto plazmīdu restrikcijas kartes

20.kDa

14 kDa

Kont. JA-1 JA-1 JA-2 JA-2 JA-3 JA-3 JA-4

HBc proteīna analīze SDS – PAA HBc proteīna analīze SDS – PAA elektroforēzes gelāelektroforēzes gelā

HBc pilna garuma 22kDa HBc saisinātais variants 15kDa

Paldies par Paldies par uzmanību!uzmanību!