Hibridación entre biotipos de arroz maleza y variedades ......Universidad de Costa Rica . Facultad de Ciencias . Escuela de Biología . ... Sin embargo, la hibridación entre el arroz

Universidad de Costa Rica

Facultad de Ciencias

Escuela de Biología

Tesis para optar por el grado de Licenciatura en Biología con énfasis

en Biología Molecular y Biotecnología

Hibridación entre biotipos de arroz maleza y variedades resistentes a

imidazolinonas: análisis morfológico y vigor híbrido

Elena Vásquez Céspedes

A56014

Ciudad Universitaria Rodrigo Facio

2015

MIEMBROS DEL TRIBUNAL

M.Sc. Griselda Arrieta Espinoza ___________________________

Directora de tesis

Dr. Eric Fuchs Castillo ___________________________

Lector de tesis

Dr. Federico Albertazzi Castro ___________________________

Lector de tesis

Dra. Marta Valdez Melara ___________________________

Miembro del Tribunal

Dra. Laura Solís Ramos ___________________________

Presidente del Tribunal

Elena Vásquez Céspedes ___________________________

Postulante

ii

A mis padres

iii

AGRADECIMIENTOS

A mi comité de tesis: Griselda Arrieta, Eric Fuchs y Federico Albertazzi. Por su

guía y apoyo durante la realización de este estudio.

A Bernal Valverde, por compartir su conocimiento sobre malezas asociadas al

cultivo del arroz, así como por la facilitación del herbicida para la aplicación en las plantas.

A Ricardo Alvarado, por su gran ayuda, amabilidad y accesibilidad ante mis dudas

estadísticas.

A mis compañeros de laboratorio y asistentes: Daniela Salazar, Daniel Corrales,

Adriana Orozco, Eddier Villalobos, Cindy Aguilar, Kimberly Valverde y Marcela Turcios.

Por toda la colaboración brindada en el laboratorio e invernaderos, así como por su amistad

durante estos años.

A Lisela Moreira, William Villalobos, Mauricio Montero, Laura Garita, Beatriz

Ortiz y Heidy-Lalo Villalobos. Por la constante motivación para la finalización de este

trabajo.

Al personal del CIBCM: Susan, Heydi, Fran, Elida, Ronal y Dago. Por toda su

colaboración durante mi permanencia en este Centro de Investigación.

Al personal del CIGRAS: Ramiro Alizaga, Carlos Hernández, Verónica Campos y

Guillermo Solano. Por el préstamo de equipo e instalaciones y su amabilidad ante cualquier

duda o contratiempo.

A Wendy Solís, Marcela Vásquez, Ana Catalina Sánchez y Gilbert Barrantes. Por

sus valiosos comentarios y su apoyo en todo momento.

A mis padres y hermanos, por toda su ayuda y su ejemplo, por lo cual, siempre

estaré agradecida.

A mis amigos, y a todos los me motivaron para seguir hasta el final.

¡Muchas Gracias!

iv

ÍNDICE GENERAL

1. Introducción …………...………………….……………...………………………... 1

2. Antecedentes …………………………………….……...……………….……........ 3

3. Justificación…………………………………….………………..……….………... 5

4. Hipótesis y predicciones ……...…………….……………………………………... 6

5. Objetivos ……………………………………………………………………….…..

5.1. Objetivo general ………………………………………………...………..…...

5.2. Objetivos específicos ……………………………………………………….....

6

6

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6. Materiales y métodos ………………………………………….……………...........

6.1. Sitio de estudio ……………………………………………………………......

6.2. Material vegetal ………………………………………………………….........

6.3. Producción de plantas híbridas mediante cruces manuales dirigidos entre

arroz maleza y variedades resistentes a imidazolinonas ……...………………

6.4. Germinación y siembra de semilla híbrida ………………..…………………..

6.5. Caracterización morfológica de las plantas híbridas .…………………...….....

6.6. Extracción de ácido desoxirribonucleico (ADN) genómico total ………...…..

6.7. Confirmación de la naturaleza híbrida de las plantas por PCR …………….....

6.8. Evaluación fenotípica de resistencia al herbicida ……………....…………….

6.9. Análisis de datos ……………....……………....……………....……………....

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7. Resultados ………………………………………………………………………….

7.1. Obtención de plantas híbridas mediante cruces manuales dirigidos entre arroz

maleza y variedades resistentes a imidazolinonas ………………...………...

7.2. Caracterización morfológica de las plantas híbridas (H1 y H2) y líneas

parentales durante el crecimiento vegetativo y madurez ……………..….…...

7.2.1. Altura de la planta ………………………………………………….…..

7.2.2. Número de brotes ………………………………………………..……..

7.2.3. Número de panículas, ancho de la hoja bandera, longitud de panícula,

semilla total y semilla llena ………………………………………..…..

7.2.4. Determinación del período de floración ………………………….…....

7.3. Confirmación de la naturaleza híbrida de las plantas por PCR ………..….…..

17

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7.4. Evaluación fenotípica de resistencia al herbicida …………………….……… 35

8. Discusión …………………….…………………………….……….………...…… 40

9. Conclusiones …………………….…………………………….……….………….. 48

10. Recomendaciones …………………………………………………………………. 49

11. Literatura citada …………………….…………………………….……….………. 50

12. Anexos …………………….…………………………….……….………………... 60

vi

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Procedimiento para realizar cruces manuales producidos en invernadero: 1)

espiguilla de arroz; 2) corte de palea y lema en espiguilla; 3 y 4) emasculación: eliminación

de las anteras mediante succión a través de una pipeta Pasteur conectada a una bomba de

vacío; 5) polinización: contacto directo de la panícula donadora de polen con la panícula

emasculada, 6) etiquetar y proteger la panícula con bolsa microperforada

….………………………………………….……………………………………….……... 10

Figura 2. Altura promedio (cm) de las plantas híbridas, resultantes del cruce de arroz

maleza y variedad CFX-18 (líneas punteadas), y plantas parentales (líneas continuas), en

fase vegetativa y en madurez (mad). En la esquina superior derecha de cada gráfico se

muestra el resultado del análisis estadístico ANOVAr…………………...………………. 20


maleza y variedad Puitá INTA (líneas punteadas), y plantas parentales (líneas continuas),

en fase vegetativa y en madurez (mad). En la esquina superior derecha de cada gráfico se

muestra el resultado del análisis estadístico ANOVAr. …………...………………….… 21

Figura 4. Número de brotes promedio (± error estándar) en híbridos resultantes del cruce

entre arroz maleza y variedad CFx-18 en primera (C1) y segunda generación (C2), y sus

respectivas líneas parentales (020, 120, 023 y 121), en la fase vegetativa y en madurez

(mad) ………………………………………………………………………………….….. 24


entre arroz maleza y variedad Puitá INTA en primera (P1) y segunda generación (P2), y sus


(mad) …………………………………….……………………………………………….. 25

vii

Figura 6. Número de semilla llena y vana (semilla total) producida por las plantas híbridas

en primera y segunda generación, y las líneas parentales (variedades comerciales y

morfotipos de arroz) ………………………...…………………………………….……. 29

Figura 7. Detección del alelo resistente (mutación S653D) mediante PCR. Línea 1: CFx-

18, línea 2: CFx-18, línea 3: híbrido 136C, línea 4: AR136, línea 5: AR136, línea 6: control

negativo (H2O), línea 7: MM 50pb ………………………………………………………. 33

Figura 8. Detección del alelo resistente (mutación A122T) y del alelo susceptible (alelo

normal), gel de agarosa 1.5%. Línea 1: MM 100pb, línea 2: Puitá INTA, línea 3: híbrido-

977P2 (morfotipo-121C2), línea 4: AR977, línea 5: control negativo (H2O). Genotipo

inferido: Puitá INTA: RR (homocigota resistente), híbrido 977P2: RS (hetorocigota),

AR977: SS (homocigota susceptible) ……………………………………………………. 33

Figura 9. Efecto de dosis crecientes de imazapir (0, 36, 72 y 120 g/l) en plantas

susceptibles: líneas maternas (arroz maleza) e híbridos pertenecientes a la segunda

generación (H2), resultantes del cruce entre arroz maleza y variedad CFX-18…………. 36


heterocigotas: híbridos resultantes del cruce entre arroz maleza y variedad CFX-18,

pertenecientes a la primera (H1) y segunda generación (H2) ……………………………. 37


resistentes: híbridos resultantes del cruce entre arroz maleza y variedad CFX-18,

pertenecientes a la segunda generación (H2), y la variedad CFX-18 ………………….... 38

Figura 12. Porcentaje de hojas sanas y hojas afectadas en plantas susceptibles,

heterocigotas y resistentes a imidazolinonas, en contacto con diferentes dosis de imazapir

…………………………………………………………………………………………….. 39

viii

ÍNDICE DE CUADROS

Cuadro 1. Accesiones de arroz maleza caracterizadas como: sativa, intermedio y

rufipogon, pertenecientes al banco de semillas del Centro de Investigación en Biología

Celular y Molecular utilizadas en este estudio .…………………………....………………. 8

Cuadro 2. Iniciadores utilizados en la detección del alelo resistente (Res) y alelo

susceptible (Sus) para cada variedad de arroz resistente a imidazolinonas (CFx-18 y Puitá

INTA) …………………………………………………………………………...……....... 13

Cuadro 3. Inferencia del genotipo para el gen ALS en las plantas híbridas de la segunda

generación (H2), de acuerdo al resultado de las reacciones de PCR con imprimadores

específicos para detectar la presencia del alelo mutado o normal ……………………...… 13

Cuadro 4. Dosis del herbicida Katrin® que se aplicó a las plantas híbridas, líneas

parentales y variedad comercial CFX-18, de acuerdo al genotipo determinado mediante

PCR. *Dosis estandarizadas de acuerdo a curva de respuesta al herbicida, diseñada por B.

Valverde (comunicación personal) …………………………………………………….… 15

Cuadro 5. Número de plantas híbridas caracterizadas morfológicamente, en primera (H1) y

segunda (H2) generación de híbridos resultantes del cruce entre arroz maleza y CFx-18

(híbridos-C) y del cruce entre arroz maleza y Puitá INTA (híbridos-P)

…………………………………………………………………………………………….. 18

Cuadro 6. Número de plantas caracterizadas morfológicamente, correspondientes a las

líneas parentales (maternas y paternas) ……………………………………………..….… 18

ix

Cuadro 7. Determinación de la similitud o diferencia de la altura promedio (cm) de las

plantas híbridas en las dos generaciones con sus respectivas líneas parentales mediante el

análisis de contrastes: C: híbrido es similar al arroz cultivado; M: híbrido es similar al

arroz maleza; CM: híbrido es similar a ambos padres (cultivado y maleza), Het+: híbrido

es superior a ambos padres; I: híbrido difiere de ambos padres y presenta un valor

intermedio ……………………………………………………………………………….. 22

Cuadro 8. Determinación de la similitud o diferencia del número de brotes promedio entre

las plantas híbridas en las dos generaciones con sus respectivas líneas parentales mediante

el análisis de contrastes: C: híbrido es similar al arroz cultivado; M: híbrido es similar al



intermedio. ……………………………………………………………………………...... 26

Cuadro 9. Determinación de la similitud o diferencia del número de panículas (P), ancho

de hoja bandera (HB), longitud de panícula (LP), número de semilla total (ST) y número

de semilla llena (SL) entre las plantas híbridas con sus respectivas líneas parentales en

madurez mediante el análisis de contrastes: C: híbrido es similar del arroz cultivado; M:

híbrido es similar al arroz maleza; CM: híbrido es similar a ambos padres (cultivado y

maleza), Het+: híbrido es superior a ambos padres; Het-: híbrido es inferior a ambos

padres; I: híbrido difiere de ambos padres y presenta un valor intermedio ……………… 28

Cuadro 10. Número de plantas parentales e híbridas que iniciaron el proceso de la

floración en diferentes períodos (DDS: días después de la siembra) …………………... 31

Cuadro 11. Inferencia del genotipo del gen ALS (RR, RS, SS) para las plantas híbridas

pertenecientes a la segunda generación (H2) de híbridos, según los datos moleculares. *NI:

plantas que no se lograron identificar por falta de material vegetal para obtener el ADN

…………………………………………………………………………………………….. 34

x

ÍNDICE DE ANEXOS

Anexo 1. Protocolo para la extracción de ADN genómico total de Lodhi y colaboradores

(1994) modificado para arroz ……………………………………………………………. 60

Anexo 2. Reacción y condiciones cíclicas para detección de la mutación S653D y alelo

susceptible para la variedad CFx-18 mediante PCR ………………………………...…… 61

Anexo 3. Reacción y condiciones cíclicas para detección de la mutación A122T y alelo

susceptible para la variedad Puitá INTA mediante PCR ………………………………… 62

Anexo 4. Probabilidad obtenida en los análisis de contrastes al comprar los promedios de

altura de la planta entre los híbridos y las líneas parentales en la primera y segunda

generación de híbridos (H1 y H2) ………………………………………………………... 63

Anexo 5. Probabilidad obtenida en los análisis de contrastes al comprar los promedios del

número de brotes de la planta entre los híbridos y las líneas parentales en la primera y

segunda generación de híbridos (H1 y H2) …………………………………………….… 64

Anexo 6. Probabilidad obtenida en los análisis de contrastes al comprar el número de

panículas (P), ancho de la hoja bandera (HB), longitud de panícula (LP), semilla total (ST)

y semilla llena (SL), entre los híbridos y las líneas parentales en la primera y segunda

generación de híbridos ……………………………………………………….…………... 65

Anexo 7. Correlación entre número de brotes y número de panículas en madurez ……… 66

Anexo 8. Probabilidad obtenida en la prueba de Tukey, al comprar el porcentaje promedio

del hojas dañadas en plantas susceptibles (SS), heterocigotas (RS) y resistentes (RR),

expuestas a dosis crecientes de imazapir ………………………………………………… 67

xi

RESUMEN

El arroz maleza es un conjunto de plantas del género Oryza que son perjudiciales para la

producción del arroz cultivado (Oryza sativa) en el mundo. Las variedades de arroz

resistentes a imidazolinonas han sido empleadas como método de control, ya que permiten

la aplicación de herbicidas que no sean tóxicos para el cultivo, pero sí para las plantas

arvenses. Sin embargo, la hibridación entre el arroz maleza y estas variedades es posible, y

en nuestro país se ha observado un aumento en la tolerancia al herbicida por parte de las

formas maleza, lo que dificulta su selección y eliminación. Por lo tanto, el objetivo de este

estudio fue determinar los rasgos morfológicos y reproductivos que predominan y persisten

en las plantas híbridas resultantes del cruce entre arroz maleza y variedades resistentes a

imidazolinonas, en las primeras dos generaciones (H1 y H2). Para esto, se realizó cruces

manuales dirigidos entre arroz maleza (5 morfotipos) y dos variedades resistentes a

imidazolinonas (CFx-18 y Puitá INTA), en condiciones de invernadero. Las líneas

parentales y las plantas híbridas resultantes fueron caracterizadas mediante 8 rasgos

morfológicos. Se evaluaron un total de 403 plantas híbridas obtenidas en los cruces y 137

plantas de las líneas parentales. Se determinó una alta variación morfológica en los rasgos

caracterizados en plantas híbridas y no se observan períodos uniformes de floración (96-

116 DDS). Características como el ancho de la hoja bandera, la longitud de la panícula y el

número de semilla total son superiores en los híbridos en comparación con las líneas

parentales. Además, el número de semilla llena presenta heterosis negativa en H1, con un

aumento no mayor a los padres en H2. La resistencia al herbicida, se detecta en todas las

plantas híbridas H1 y se observa segregación en la proporción 1:2:1 en H2. Los resultados

de la presente investigación indican que la hibridación entre el arroz maleza y las

variedades resistentes a imidazolinonas cultivadas en Costa Rica, es completamente

factible, no sólo permite la persistencia de características de interés agronómico generación

tras generación, sino que permite nuevas combinaciones de genomas. Lo cual, origina

amplios rangos morfológicos en los híbridos que van desde heterosis positiva hasta

heterosis negativa dependiendo de la característica evaluada. La generación de múltiples

combinaciones de arroz maleza híbrido con tolerancia al herbicida combinado con una

xii

utilización constante del mismo en el campo puede favorecer la persistencia de los híbridos

y disminuir la vida útil de las variedades comerciales con tolerancia al herbicida para el

control del arroz maleza.

Palabras clave: heterosis, acetolactato sintetasa (ALS), arroz rojo, imazapir, Oryza sativa.

xiii

1. INTRODUCCIÓN

El arroz maleza (también conocido como arroz rojo, por el color que presentan

algunos biotipos en el pericarpo) es un conjunto de plantas del género Oryza que coexisten

y compiten con el arroz cultivado (Oryza sativa L., Vaughan 1989, FAO 2007). Se

caracterizan por su crecimiento vigoroso, producción abundante de semillas, desgrane fácil

y latencia prolongada, lo que les permite una eficiente dispersión y persistencia en el campo

(Diarra et al. 1985, Gu et al. 2005). Estas malezas son perjudiciales para la producción del

arroz cultivado, ya que su control incrementa los costos y su presencia disminuye el

rendimiento y el valor comercial del grano (Fisher y Ramírez 1993).

Para controlar estas plantas, se han implementado varias prácticas que combinan

métodos preventivos, culturales y químicos, como el uso de semilla certificada,

agotamiento de la semilla maleza del banco de semillas del suelo, supresión de la

germinación del arroz maleza (manejo de agua y compuestos químicos), destrucción o

remoción del arroz maleza de los arrozales, rotación con otros cultivos, entre otras (Griffin

y Harger 1990, Ampong-Nyarko y De Datta 1991, Dunand 1996, Pantoja et al. 1997,

Esqueda 2000, Polón et al. 2005). Sin embargo, la mayoría de métodos no han resultado

eficientes y hasta el momento el arroz maleza continúa siendo un grave problema a nivel

mundial, debido a su similitud morfológica y fisiológica con el arroz cultivado (Brenes-

Prendas 2006, FAO 2007, Brown 2013).

Debido a esto, se han desarrollado variedades resistentes a herbicidas como

estrategia de control, entre ellas variedades de arroz convencionales y transgénicas (Oard et

al. 1996, Inui et al. 2001, Tan et al. 2005). Entre las variedades convencionales, se

encuentran las resistentes a imidazolinonas, las cuales fueron desarrolladas mediante la

selección de mutantes inducidos químicamente. Estas variedades han sido oficialmente

aprobadas para la producción comercial de arroz en el continente americano, en

comparación con las transgénicas que requieren mayor cantidad de estudios para su

liberación y comercialización por ser cultivos desarrollados a través de ingeniería genética

(Croughan 1998, Peña 2005, Tan et al. 2005, Grumet et al. 2011, Akio-Kido et al. 2012).

Las variedades de arroz resistentes a imidazolinonas presentan mutaciones en el gen

que codifica para la enzima acetolactato sintetasa (ALS). Esta enzima cataliza el primer

paso en la síntesis de aminoácidos ramificados (valina, leucina e isoleucina) y puede ser

1

inhibida por varios compuestos como las imidazolinonas y sulfonilureas (Wakabayashi y

Böger 2004). Diferentes mutaciones puntuales en esta enzima han sido asociadas con el

cambio de aminoácidos que modifica la forma del sitio al cual se une el herbicida, esto

resulta en la pérdida de varias interacciones con diferentes compuestos (McCourt et al.

2006), y de esta manera se logra que los cultivos de arroz comercial sean resistentes a

imidazolinonas.

Por lo tanto, estas variedades han sido empleadas para realizar el control post-

emergencia (aplicación del herbicida después de la emergencia o germinación del cultivo)

de un amplio espectro de malezas, mediante la aplicación de inhibidores enzimáticos que

no son tóxicos para el cultivo (Webster y Masson 2001, Gressel 2002, Tan et al. 2005,

Whaley et al. 2007). En nuestro país, estas variedades son comercializadas como un

sistema integrado de control de malas hierbas, bajo el nombre Clearfield®. Este sistema

suministra la semilla resistente certificada, el herbicida certificado y un programa de

custodia, el cual monitorea y asiste en la implementación de esta tecnología, con el objetivo

de lograr la limpieza de campos infestados (BASF 2014).

Sin embargo, la utilización de variedades resistentes a herbicidas puede ser

contraproducente, ya que la hibridación entre el arroz cultivado y el maleza ha sido

reportada en varios estudios (Langevin et al. 1990, Chen et al. 2004). Este proceso es

posible, debido a que existe una tasa de exocruzamiento (0.1-0.3%), la cual se da

principalmente por la dispersión de polen a través del viento (OECD 1999). Esto puede

llevar a la aparición de plantas híbridas superiores en diferentes características a sus

progenitores (heterosis o vigor híbrido), y posteriormente, a la introgresión de

características de interés agronómico del arroz comercial al arroz maleza, lo cual entorpece

las estrategias de manejo implementadas para el control de malezas (Ellstrand et al. 1999,

Olofsdotter et al. 2000, Gealy et al. 2003, Gresel y Valverde 2009).

En Costa Rica no hay reportes oficiales de hibridación entre arroz maleza y

variedades resistentes a imidazolinonas; sin embargo, observaciones realizadas en fincas

arroceras en Guanacaste y Parrita indican la existencia de plantas de arroz maleza con

tolerancia al herbicida (obs. per). Una posible explicación a este hecho, es una viable

hibridación entre los materiales descritos anteriormente que requiere un estudio más

detallado, que confirme la hibridación entre las variedades resistentes a imidazolinonas y el

2

arroz maleza, así como una caracterización detallada de los híbridos resultantes del cruce de

estas plantas. Por lo tanto, la presente investigación tiene como objetivo estudiar la

hibridación entre el arroz maleza y comercial tolerante a herbicidas, en condiciones de

invernadero.

2. ANTECEDENTES

La producción de arroz es una de las principales actividades socioeconómicas en

Costa Rica, sólo en el período 2013-2014 se sembró un área total de 66135 hectáreas y se

registró un consumo anual per capita de 48.32 kg (CONARROZ 2015). Sin embargo, la

producción se ve afectada frecuentemente por la incidencia de enfermedades, plagas y

malezas, entre las que se destaca el arroz maleza, por su difícil control y amplia

distribución en el mundo (Castaño 1985, De Galvis et al. 1985, González 1985, González

et al. 1985, FAO 2007).

El arroz maleza en Costa Rica, ha sido clasificado de acuerdo a la morfología, en

tres grandes grupos: grupo sativa, grupo intermedio y grupo rufipogon. Estas categorías

permiten clasificar el arroz maleza que muestra rasgos similares al arroz comercial (O.

sativa), el arroz maleza que posee características similares a la especie silvestre O.

rufipogon y un tercer grupo que muestra características intermedias entre O. sativa y O.

rufipogon (Arrieta-Espinoza et al. 2005). Además, se determinó la presencia de una alta

variabilidad en la morfología y en el ciclo de vida, así como variables importantes

(emergencia de las plántulas, inicio de macollamiento, altura de la planta y períodos de

floración y maduración variables) que sugieren una alta competitividad por espacio y

recursos, que garantiza un mayor desempeño de la progenie y el éxito reproductivo como

un conjunto (Sánchez et al. 2007).

Estudios de hibridación entre arroz maleza y una variedad transgénica de arroz

resistente a glufosinato de amonio fue reportada por Sánchez y colaboradores (2009),

quienes detectaron entre un 0.1 y 0.3% de tasa de hibridación. La cual, es afectada por la

combinación de varios factores, entre ellos: duración del traslape de antesis, morfotipo y

accesión de arroz rojo, pero no por el nivel de infestación (densidad de plantas). Los

híbridos resultantes del cruce entre arroz maleza y esta variedad transgénica, fueron

fenotípicamente variables y se observó heterosis positiva en rasgos de productividad, lo

3

que indica que pueden ser buenos competidores por recursos en el campo. Sin embargo, la

producción de semilla presentó heterosis negativa, esto sugiere depresión exogámica, lo

cual está relacionado con las distancias genéticas de los progenitores (Sánchez et al. 2009).

Las variedades resistentes a imidazolinonas fueron introducidas por primera vez en

Estados Unidos en el 2002 y posteriormente, en países de América Latina bajo el nombre

comercial de Clearfield®. Este sistema es un método popular para el control del arroz

maleza, el cual ha sido empleado en Costa Rica desde el 2003; sin embargo, no se ha

reportado ni observado un control eficaz del arroz maleza. Las variedades resistentes que

han sido utilizadas en nuestro país son: CFx-18 y Puita INTA CL, las cuales fueron

desarrolladas por la Universidad de Luisiana (Estados Unidos) y por la Estación

Experimental Agropecuaria del INTA (Concepción del Uruguay, Argentina),

respectivamente (Croughan 2008, Livore 2005, Linscombe 2010, PROARROZ 2013).

En Costa Rica, no existen estudios de híbridos producto del cruce entre arroz

maleza y variedades resistentes a imidazolinonas. Sin embargo, estudios recientes

realizados en otros países, confirman la hibridación y el flujo de genes entre el arroz

maleza y el comercial resistente a imidazolinonas (Shivrain et al. 2007, 2008, 2009,

Burgos et al. 2008, Zhang et al. 2008, Andres 2013, Goulart et al. 2015). Para Estados

Unidos, China y Brasil, se ha reportado híbridos que producen semillas viables y plantas

fértiles, cuyos rasgos dominantes pertenecen al parental maleza (Shivrain et al. 2006,

Zhang et al. 2006, 2008). Además, poseen una baja capacidad reproductiva en la primera

generación, aumentando leventemente en la siguiente (Zhang et al. 2008). La forma de

herencia de la resistencia a inhibidores de la enzima ALS (imidazolinonas) ha sido

asociada con un único alelo con dominancia incompleta situado en el núcleo (Volenberg

y Stoltenberg 2002). No obstante, se han reportado desviaciones en las proporciones

esperadas, probablemente como consecuencia del tamaño de población y epistasis

(Shivrain et al. 2006).

4

3. JUSTIFICACIÓN

El arroz (O. sativa) es uno de los cereales más importantes en el mundo y alimenta

cerca de un tercio de la población mundial (Posada 1985, FAO 2013). Se estima que para el

2030 la producción mundial de cereales aumentará en un 60%, por lo que la necesidad de

desarrollar nuevas y mejores variedades, es inevitable (FAO 2002). Con el avance de la

tecnología, existe la posibilidad de desarrollar y utilizar variedades de arroz transgénicas o

convencionales. Sin embargo, para la aprobación y liberación de transgénicos en el mundo,

se requiere rigurosos estudios, así como un adecuado control para evitar el flujo de

transgenes hacia poblaciones silvestres o maleza (Akio-Kido et al. 2012). De la misma

forma, existe la posibilidad de flujo de genes (resistencia a herbicidas, por ejemplo) de

variedades convencionales hacia otras poblaciones, lo cual implicaría la necesidad de

vigilancia para evitar el paso de características de importancia agronómica a otras

poblaciones no-blanco, y así evitar la aparición de especies resistentes a herbicidas

(Valverde et al. 2000, Gresel y Valverde 2009, Heap 2015).

El estudio de la hibridación entre morfotipos de arroz maleza y variedades

resistentes a imidazolinonas, es de importancia para generar información acerca de este

proceso entre estas plantas, ya que el arroz rojo es uno de malezas más problemáticas en la

producción de este cultivo en nuestro país. Su control se dificulta cada vez más, debido a

la alta variabilidad morfológica y a la similitud con las variedades comerciales (FAO

2007). Por lo tanto, es importante comprender el comportamiento de diferentes morfotipos

de arroz rojo y su capacidad de hibridar con variedades comerciales resistentes a

herbicidas, así como las características que predominan en varias generaciones. Esto

permitiría la posibilidad de realizar estudios sobre flujo de genes, así como propuestas para

el posible manejo y control de estos híbridos en el campo.

Además, con este estudio se pretende generar información básica sobre

bioseguridad ambiental para el caso del arroz en nuestro país y determinar de una manera

indirecta, la factibilidad de la introducción de variedades de arroz convencionales o

transgénicas con resistencia a herbicidas con distintos modos de acción, para el control de

malezas. Debido a que es importante, que en nuestro país se realicen estudios en esta línea

de investigación, que permitan una adecuada toma de decisiones por parte de autoridades

competentes.

5

4. HIPÓTESIS Y PREDICCIONES

La combinación de rasgos en las plantas híbridas permite una diferenciación con las

líneas parentales (Langevin et al. 1990). Por lo tanto, las plantas híbridas producidas por el

cruce entre el arroz maleza y los cultivares de arroz resistentes a imidazolinonas, serán

superiores a ambos padres en la primera generación, es decir, serán plantas más altas, con

más brotes, con hojas bandera más anchas y panículas más largas que permiten una mayor

producción de semilla que las de sus padres (Langevin et al. 1990). Ya que la combinación

de rasgos, en la primera generación, les permite el dominio de alelos dominantes sobre

recesivos en el fenotipo (Alberts et al. 2008). En la segunda generación, se observará

mayor variación morfológica, debido a que ocurre segregación al azar en la producción de

gametos, lo cual ha sido observado en arroz y en otros grupos de biología similar (Lippman

y Zamir 2007, Sánchez et al. 2009).

El genotipo del gen ALS en los híbridos determina la respuesta de la planta a las

imidazolinonas (Tranel y Wright 2002). Por lo tanto, la respuesta al herbicida por parte de

las plantas híbridas en la primera generación (H1) será resistencia intermedia entre la

observada en variedades comerciales y los morfotipos de arroz maleza, por la presencia del

gen en forma heterocigota (RS). Sin embargo, en la segunda generación de plantas híbridas

(H2), la característica de resistencia presentará segregación en la proporción 1:2:1 (RR, RS,

SS), por lo tanto se presentarán plantas con diferentes respuestas: resistencia completa,

resistencia intermedia y susceptibilidad al herbicida (Volenberg y Stoltenberg 2002).

5. OBJETIVOS

5.1. Objetivo general

Determinar los rasgos morfológicos y reproductivos que predominan y persisten

en las plantas híbridas (H) resultantes del cruce entre morfotipos de arroz maleza y

variedades resistentes a imidazolinonas, en la primera y segunda generación (H1 y H2) en

condiciones de invernadero.

6

5.2. Objetivos específicos

i. Detectar la naturaleza híbrida de las plantas resultantes del cruce entre morfotipos de

arroz maleza y variedades resistentes a imidazolinonas.

ii. Estimar la heterosis (vigor híbrido) en las plantas híbridas (H1 y H2) resultantes del

cruce entre morfotipos de arroz maleza y variedades resistentes a imidazolinonas.

iii. Evaluar la resistencia al herbicida en las líneas parentales y en las plantas híbridas

(H1 y H2) resultantes del cruce entre morfotipos de arroz maleza y variedades

resistentes a imidazolinonas.

6. MATERIALES Y MÉTODOS

6.1. Sitio de estudio.

La investigación se realizó en el invernadero del Centro de Investigación en

Biología Celular y Molecular (CIBCM), Universidad de Costa Rica

(9°56′25″N, 84°2′37″W). Este sitio presenta temperaturas entre 26 y 40 °C, humedad

relativa entre 50-70% y se encuentra a una elevación de 1200 m.

6.2. Material vegetal.

Se utilizaron 10 accesiones de arroz maleza del banco de semillas del CIBCM de

acuerdo con la viabilidad y disponibilidad de semilla (Cuadro 1). Esta semilla fue colectada

en el año 2000 previo a la liberación de las variedades resistentes a imidazolinonas y

caracterizada como sativa, intermedio y rufipogon (Arrieta-Espinoza et al. 2005). Además,

se utilizaron dos variedades resistentes a herbicida: CFx-18, la cual se ha cultivado en el

país desde el año 2002, y Puitá INTA desde el 2006 (CONARROZ 2015), donadas por el

Centro de Investigación en Granos y Semillas (CIGRAS). La semilla se sembró

semanalmente en el invernadero, en potes con aprox. 500 g de sustrato (mezcla de suelo y

fibra de coco (2:1)), para conseguir sincronización en la floración y realizar cruces para la

obtención de plantas híbridas.

7

Cuadro 1. Accesiones de arroz maleza caracterizadas como: sativa, intermedio y

rufipogon, pertenecientes al banco de semillas del Centro de Investigación en Biología

Celular y Molecular utilizadas en este estudio.

Tipo Morfotipo Sitio de recolecta Georeferencia

(grados decimales)

sativa 020 La Pacífica, Guanacaste 10.45, -85.17

120 El Pelón, Guanacaste 10.43, -85.39

intermedio

023 Barbudal, Parrita 9.50, -84.29

121 Barbudal, Parrita 9.50, -84.29

073 El Pelón, Guanacaste 10.43, -85.40

rufipogon 379 Cañas, Guanacaste 10.44, -85.17

8

6.3. Producción de plantas híbridas H1, mediante cruces manuales dirigidos entre

arroz maleza y variedades resistentes a imidazolinonas.

Se realizaron cruces manuales dirigidos en invernadero, basándose en el protocolo

implementado por Sarkarung (1991). La emasculación de las inflorescencias se realizó

previamente a la antesis (período durante el cual ocurre la polinización). Para ello, se cortó

las glumas fértiles por el área del apículo y se extrajeron las anteras mediante aspiración,

con una pipeta Pasteur conectada a una bomba de vacío GAST® (modelo: 0823-101Q-

SG608X, Estados Unidos). La panícula emasculada, fue polinizada, mediante contacto

directo con las espiguillas de la planta donadora de polen, asegurando la liberación de

polen sobre la panícula emasculada. Luego, se cubrió con una bolsa plástica con

microporos Cryovac® (código: SM570, Francia) para evitar polinización con otras plantas

(Figura 1).

Para los cruces, se utilizó los morfotipos de arroz maleza (Cuadro 1) como líneas

maternas (receptor de polen) y las variedades CFX-18 y Puitá INTA como líneas paternas

(donadores de polen). Se realizaron 47 cruces entre arroz maleza y la variedad CFx-18, 36

cruces entre arroz maleza y la variedad Puitá INTA, y se dejaron 27 panículas emasculadas

sin polinizar, que no produjeron semilla como controles. Los híbridos resultantes del cruce

entre arroz maleza y CFx-18 se identificaron como Híbridos-C, donde la primera y

segunda generación se codificó Híbridos-C1 e Híbridos-C2 respectivamente. Asimismo,

se identificaron los híbridos resultantes del cruce entre arroz maleza y Puitá INTA como

Híbridos-P, donde los Híbridos-P1 corresponde a las plantas híbridas obtenidas en la

primera generación e Híbridos-P2 para las plantas híbridas correspondientes a la segunda

generación.

La semilla resultante de los cruces, corresponde a la primera generación de híbridos

(H1) y se cosechó cuando la planta alcanzó madurez (aproximadamente 115-130 días). La

semilla de la segunda generación de híbridos (H2) se obtuvo de la autopolinización de las

plantas de la primera generación (H1) y se cosechó posteriormente a la maduración de la

planta.

9

Figura 1. Procedimiento para realizar cruces manuales producidos en invernadero: 1)

espiguilla de arroz; 2) corte de palea y lema en espiguilla; 3 y 4) emasculación: eliminación

de las anteras mediante succión a través de una pipeta Pasteur conectada a una bomba de

vacío; 5) polinización: contacto directo de la panícula donadora de polen con la panícula

emasculada, 6) etiquetar y proteger la panícula con bolsa microperforada.

10

6.4. Germinación y siembra de semilla híbrida.

Para la primera generación (H1), se sembró toda la semilla obtenida de los cruces

manuales dirigidos y para la segunda (H2) se tomó una submuestra de la semilla producida

en H1. La semilla se desinfectó con hipoclorito de sodio (3.5%) durante 20 min para evitar

contaminación y se colocó a germinar en placas petri con papel filtro y agua destilada

estéril. Luego, se incubó en el cuarto de crecimiento del CIBCM a una temperatura de 26

°C, 41% de humedad y fotoperíodo 12/12. Cuando las plántulas alcanzaron una altura

aproximada de 10 cm se trasplantaron en potes y se aclimataron en invernadero. Se

sembraron dos plantas por pote, con aproximadamente 500 g de sustrato (mezcla de suelo y

fibra de coco (2:1)) y 3 g de fertilizante granulado Nitrofoska® (Agro Comercial S.A.).

Para el cuidado de las plantas en el invernadero, cada dos días fueron irrigadas con

agua y cada 22 días se realizaron aplicaciones de fertilizante foliar Bayfolan Forte®

(Bayer). Además, se aplicaron diferentes insecticida, acaricidas y fungicidas de forma

alterna para el control de plagas (cada 15 días o cada vez que fue necesario), entre ellos:

Impide® (Dow AgroSciences), Colt® (BravoAG), Mimic® (Certis), Trebon® (Certis),

Mitigan® (AganCheminalManufacturers) y Vitavax® (Bayer).

6.5. Caracterización morfológica de las plantas híbridas.

Se caracterizaron rasgos vegetativos y reproductivos en las plantas híbridas de

ambas generaciones (H1 y H2) y en las líneas parentales, basándose en 8 variables descritas

a continuación (descriptores morfológicos tomados de IRRI-IBPGR 1980): altura de la

planta (cm), número de brotes, inicio de la floración, ancho de la hoja bandera (cm),

longitud de la panícula más alta (cm), número de panículas por planta, número de semilla

llena y vana. La altura de la planta y el número de brotes se midió cada 15 días, después de

la siembra de la semilla (DDS: días después de la siembra), hasta madurez. Las variables

restantes se midieron cuando la planta alcanzó madurez, y luego de esta evaluación se

cosechó la semilla y se podó la planta.

11

6.6. Extracción de ácido desoxirribonucleico (ADN) genómico total.

Se colectó aproximadamente 0.5 g de tejido foliar joven y se colocó durante dos

días a 50 °C en incubadora Digisystem Laboratory Instruments Inc. (modelo: LE-529,

Taiwán) para asegurar la deshidratación completa de las hojas. La maceración del tejido se

realizó, mediante el FastPrep-24® MP Biomedicals (modelo: 910519, Estados Unidos) a

una velocidad de 6 m/s durante 40 s (2 veces). La extracción de ADN genómico total, se

continuó con el protocolo de extracción de Lodhi y colaboradores (1994) modificado para

arroz (Anexo 1). Para visualizar el ADN genómico total se realizó una electroforesis en un

gel de agarosa al 0.8%, que fue teñido GelRed (Thermo Scientific, Estados Unidos) y

fotografiado con una cámara Sony (modelo: DSX-W730). Además, se determinó la

concentración (ng/μl) y pureza (A260/A280) del ADN, mediante un Nano Drop 2000c

(Thermo Scientific, Estados Unidos).

6.7. Confirmación de la naturaleza híbrida de las plantas por PCR.

La presencia de la mutación en el gen ALS se verificó mediante la técnica molecular

Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Las variedades de arroz resistente a herbicida

utilizadas en este estudio poseen una sola mutación que les confiere resistencia a

imidazolinonas y cada variedad presenta una mutación diferente (Cuadro 2). Por lo que, se

utilizó una PCR alelo-específico con imprimadores previamente diseñados (Cuadro 2), que

permitieron la detección del alelo resistente y susceptible para la variedad CFx-18, y el

alelo resistente para Puitá INTA (Kadaru et al. 2008, Rosso et al. 2010a, Anexo 2 y 3).

Además, se diseñó el iniciador reverse para la amplificación del alelo susceptible en la

variedad Puitá INTA (Cuadro 2), a partir de la información publicada por Roso y

colaboradores (2010) y de la secuencia AB049822 disponible en GenBank

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank).

La reacción de PCR se llevó a cabo en un termociclador Biometra (modelo: 070-

601, Alemania), el contenido de la reacción y las condiciones cíclicas se describen en

Anexo 2 y 3. Para cada alelo se realizó una reacción por separado de PCR, y de esta forma

se verificó la presencia o ausencia de la mutación en el gen ALS, así como el alelo normal.

Los productos de PCR se visualizaron mediante electroforesis de gel de agarosa al 1.5% en

TAE, el cual se tiñó con GelRed (Thermo Scientific, Estados Unidos), y se fotografió con

12

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank

Cuadro 2. Iniciadores utilizados en la detección del alelo resistente (Res) y alelo

susceptible (Sus) para cada variedad de arroz resistente a imidazolinonas (CFx-18 y Puitá

INTA).

Variedad Mutación Alelo Primers (F/R) Referencia

CFX-18 S653D Res ALSResF/ALSR3

Kadaru et al. 2008 Sus ALSSusF/ALSR3

Puita

INTA A122T

Res Ar6F/SNPPtaRev1 Rosso et al. 2010a

Sus Ar6F/PtaSus Vásquez & Albertazzi 2013

Cuadro 3. Inferencia del genotipo para el gen ALS en las plantas híbridas de la segunda

generación (H2), de acuerdo al resultado de las reacciones de PCR con imprimadores

específicos para detectar la presencia del alelo mutado o normal.

Gen ALS PCR alelo resistente

(mutado)

PCR alelo susceptible

(normal)

RR Presente (+) Ausente (–)

RS Presente (+) Presente (+)

SS Ausente (–) Presente (+)

13

una cámara Sony (modelo: DSX-W730). Para la primera generación, se consideró plantas

híbridas, las que poseían el alelo resistente, ya que el alelo susceptible no se determinó. En

la segunda generación de plantas híbridas, se determinó tanto el alelo resistente como el

susceptible para lograr inferir el genotipo para el gen ALS (Cuadro 3).

6.8. Evaluación fenotípica de resistencia al herbicida.

La evaluación fenotípica de resistencia al herbicida se realizó con las plantas

híbridas-C y sus respectivos padres. Los híbridos-P fueron excluidos, debido a problemas

para detectar los genotipos, los cuales eran necesarios para realizar este ensayo.

Se tomó brotes jóvenes y en buen estado de plantas híbridas (C1 y C2), y de las

líneas parentales. Se les aplicó el producto comercial Katrin® fuera del invernadero, el cual

es un herbicida sistémico cuyo ingrediente activo es el imazapir. Se evaluó seis dosis en las

plantas híbridas y en las líneas parentales, de acuerdo al genotipo determinado en este

estudio (Cuadro 4). Se realizó observaciones cada semana y las plantas fueron evaluadas 30

días después de aplicado el herbicida, donde se realizaron observaciones para determinar

daños en respuesta al herbicida (inhibición del crecimiento, amarillamiento y muerte).

Además, se determinó el número de hojas sanas y el número de hojas con daños, para

determinar el porcentaje de hojas afectadas por el herbicida.

14

Cuadro 4. Dosis del herbicida Katrin® que se aplicó a las plantas híbridas, líneas

parentales y variedad comercial CFX-18, de acuerdo al genotipo determinado mediante

PCR. *Dosis estandarizadas de acuerdo a curva de respuesta al herbicida, diseñada por B.

Valverde (comunicación personal).

Genotipo Imazapir (g/l)* Número de plantas

SS

0 8

36 8

72 8

120 8

RR, RS

0 13

480 13

768 13

1152 13

15

6.9. Análisis de datos

El análisis de datos se realizó de la siguiente manera: 1) un análisis de varianza con

repeticiones múltiples (ANOVAr) seguido de un análisis de contrastes para la altura de las

plantas durante el crecimiento vegetativo y en madurez; 2) un modelo lineal generalizado

(GLM) seguido de un análisis de contrastes para el número de brotes durante el crecimiento

vegetativo y en madurez, el número de panículas por planta y el número de semilla total y

llena; 3) un análisis de varianza (ANOVA) seguido de un análisis de contrastes para el

ancho de la hoja bandera y la longitud de la panícula. Para todos los análisis estadísticos,

los datos mostraron normalidad y homocedasticidad. Todos los modelos lineales

generalizados (GLMs) con distribución de Poisson, mostraron sobre-dispersión, por lo que

se ajustó la distribución a quasipoisson.

El análisis de contrastes, se realizó para determinar diferencias significativas entre

los promedios de los rasgos caracterizados entre plantas híbridas y líneas parentales. Esto

permitió la comparación de la morfología entre los híbridos resultantes y sus respectivos

padres. Además, se empleó la siguiente simbología para describir las características del

híbrido resultante, mediante el análisis de contrastes: C: híbrido es similar del arroz

cultivado; M: híbrido es similar al arroz maleza; CM: híbrido es similar a ambos padres

(cultivado y maleza), Het+: híbrido es superior a ambos padres; Het-: híbrido es inferior a

ambos padres; I: híbrido difiere de ambos padre, presenta un valor intermedio.

Para verificar si la proporción de genotipos obtenidos se ajustó a la proporción de

genotipos esperados (1:2:1), se realizó una prueba de bondad-ajuste (Chi-cuadrado (χ²)).

Además, se calculó una probabilidad binomial (éxito/fallo) para determinar si la proporción

que se obtuvo en los híbridos-P era posible, de acuerdo al tamaño de la muestra analizada,

ya que las proporciones genotípicas observadas se desvían de las esperadas en las plantas

resultantes del cruce entre los morfotipos de arroz maleza y la variedad Puitá INTA.

Para la evaluación fenotípica de resistencia al herbicida, se analizó el porcentaje de

hojas con daños mediante un ANOVA, seguido de una prueba de comparaciones múltiples

(Tukey). Para todos los análisis se utilizó el sistema estadístico R (http://www.r-

project.org/).

16

http://www.r-project.org/


7. RESULTADOS

7.1. Obtención de plantas híbridas mediante cruces manuales dirigidos entre arroz

maleza y variedades resistentes a imidazolinonas.

Se obtuvo un total de 403 plantas híbridas correspondientes a 16 híbridos distintos

distribuidos en 8 morfotipos (Cuadro 5). Para la primera generación (H1) se obtuvo 204

plantas y 199 corresponden a la segunda generación (H2), todas provenientes de cruces

entre el arroz maleza del grupo sativa e intermedio (Cuadro 5). Además, se obtuvo plantas

híbridas provenientes de las dos variedades resistentes a herbicida, sin embargo, se

consiguió un mayor número de híbridos con la variedad Puitá INTA (híbridos-P, n=243),

que con la variedad CFx-18 (híbridos-C, n=160).

Se apreció que la cantidad de plantas híbridas generadas fue muy variable, es decir,

provienen de diferentes accesiones y morfotipos de arroz maleza. Asimismo, se observó

que el número de plantas producidas para cada tipo de híbrido difiere entre sí. Además, a

excepción de uno de los morfotipos híbridos (121C), todos produjeron semilla viable para

la primera generación (Cuadro 5).

De las líneas parentales, se logró el crecimiento de 137 plantas en total (Cuadro 6).

Para las variedades resistentes a herbicida se obtuvieron 23 plantas, mientras que para el

arroz maleza se obtuvieron 114 plantas, del grupo sativa e intermedio. Además, la cantidad

de semilla producida para el arroz maleza es muy variable, debido a que depende de la

viabilidad y disponibilidad de semilla para germinar.

17

Cuadro 5. Número de plantas híbridas caracterizadas morfológicamente, en primera (H1) y

segunda (H2) generación de híbridos resultantes del cruce entre arroz maleza y CFx-18

(híbridos-C) y del cruce entre arroz maleza y Puitá INTA (híbridos-P).

Híbrido Grupo Morfotipo H1 H2 Total

Híbridos-C

sativa 020C 36 60 96

120C 18 17 35

intermedio 023C 6 19 25

121C 4 0 4

Híbridos-P

sativa 020P 55 43 98

120P 40 33 73

intermedio 073P 22 15 37

121P 23 12 35

Total

204 199 403

Cuadro 6. Número de plantas caracterizadas morfológicamente, correspondientes a las

líneas parentales (maternas y paternas).

Líneas Grupo Morfotipo Plantas

Maternas

sativa 020 51

120 22

intermedio

023 15

073 9

121 17

Paternas O. sativa CFx-18 8

O. sativa Puitá INTA 15

Total

137

18

7.2. Caracterización morfológica de las plantas híbridas (H1 y H2) y líneas parentales

durante el crecimiento vegetativo y madurez.

7.2.1. Altura de la planta.

Para los híbridos-C1 (cruces con CFX-18), se observa una predominancia en la

altura de la planta en los híbridos sobre las líneas parentales durante el crecimiento

vegetativo, principalmente entre los 30-60 DDS (Figura 2, Cuadro 7). Al llegar a madurez,

se observa que las plantas híbridas son similares en la altura a las líneas maleza, a

excepción del morfotipo 121C1 que presenta heterosis positiva (Cuadro 7). En la segunda

generación (híbridos-C2), se observa que las plantas híbridas son más altas que las líneas

parentales entre los 45-75 DDS (Figura 2, Cuadro 7). Además, el morfotipo 023C2 presenta

heterosis positiva en madurez, y el morfotipo 121C2, perteneciente a la segunda

generación, no pudo ser caracterizado debido a que la cantidad de semilla llena producida

en H1 fue muy baja y las plantas que lograron germinar no sobrevivieron.

Para los híbridos-P1 (cruces con Puitá INTA) sólo el morfotipo 121P1 es más alto

que los padres durante todo el crecimiento vegetativo. Los demás morfotipos son muy

similares al parental Puitá INTA entre los 30-75 DDS, y algunos presentan heterosis

positiva en algún momento del crecimiento (Figura 3, Cuadro 7). Después de los 90 DDS y

en madurez, los híbridos-P1 alcanzan una altura similar al arroz maleza, a excepción del

121P1 que presenta heterosis positiva (Cuadro 7). En la segunda generación de híbridos

(híbridos-P2), los resultados son muy variables y en todos los morfotipos se observa al

menos una vez heterosis positiva durante el crecimiento vegetativo (Cuadro 8). En

madurez, se observa que el 020P presenta una altura intermedia entre los padres, los

morfotipos 120P y 073P no difieren del parental maleza, y el 121P presenta heterosis

positiva desde los 75 DDS (Figura 3, Cuadro 7).

Además, al comparar los promedios de la altura entre los híbridos de la primera

generación con los de la segunda (H2). Se observó, que los H1 poseen una mayor altura que

los H2 entre los 30-45 DDS (Anexo 4).

19

Altu

ra (c

m)

DDS


maleza y variedad CFX-18 (líneas punteadas), y plantas parentales (líneas continuas), en

fase vegetativa y en madurez (mad). En la esquina superior derecha de cada gráfico se

muestra el resultado del análisis estadístico ANOVAr.

0

20

40

60

80

100

120

140

160

30 45 60 75 90 105 mad

CFx-18020020C1023023C1120120C1121

Híbridos-C1F=408.9, p<0.001

020406080

100120140160

30 45 60 75 90 105 mad

CFx-18020020C2023023C2120120C2

Híbridos-C2F=290.9, p<0.001

20

Altu

ra (c

m)

DDS


maleza y variedad Puitá INTA (líneas punteadas), y plantas parentales (líneas continuas),

en fase vegetativa y en madurez (mad). En la esquina superior derecha de cada gráfico se

muestra el resultado del análisis estadístico ANOVAr.

0

20

40

60

80

100

120

140

30 45 60 75 90 105 mad

P.INTA020020P1073073P1120120P1121121P1

Híbridos-P1F=221.7, p<0.001

0

20

40

60

80

100

120

140

30 45 60 75 90 105 mad

P.INTA020020P2073073P2120120P2121

Híbridos-P2F=238.6, p<0.001

21

Cuadro 7. Determinación de la similitud o diferencia de la altura promedio (cm) de las

plantas híbridas en las dos generaciones con sus respectivas líneas parentales mediante el

análisis de contrastes: C: híbrido es similar al arroz cultivado; M: híbrido es similar al



intermedio.

Nota: valores de probabilidad en Anexo 4.

DDS

Generación Tipo híbrido Morfotipo 30 45 60 75 90 105 Mad

Hïbridos-C1

sativa 020C1 Het+ Het+ Het+ Het+ Het+ Het+ M

120C1 Het+ Het+ Het+ M CM CM M

intermedio 023C1 Het+ Het+ Het+ Het+ Het+ M M

121C1 Het+ Het+ Het+ Het+ C C Het+

Híbridos-C2

sativa 020C2 CM Het+ Het+ Het+ C C CM

120C2 CM Het+ Het+ Het+ M M M

intermedio 023C2 M Het+ Het+ Het+ Het+ M Het+

121C2 - - - - - - -

Híbridos-P1

sativa 020P1 C C Het+ M CM M M

120P1 C C C C M M M

intermedio 073P1 C Het+ C C M M M

121P1 Het+ Het+ Het+ Het+ Het+ Het+ Het+

Híbridos-P2

sativa 020P2 M C Het+ M M M I

120P2 M C C C Het+ Het+ M

intermedio 073P2 M CM Het+ C M Het+ M

121P2 M C C Het+ Het+ Het+ Het+

22

7.2.2. Número de brotes.

Se determinó que el número de brotes no es una característica que se diferencia

entre los híbridos y las líneas parentales, ya que sólo varios morfotipos presentan heterosis

positiva durante cierto momento del crecimiento vegetativo y no se observa una tendencia

de brotación clara y definida a través del tiempo (Figura 4 y 5, Cuadro 8). En madurez, se

encontró que el número de brotes no cambia significativamente en relación a los padres en

ambas generaciones de híbridos. Además, ninguno presenta heterosis positiva o negativa

(Cuadro 8). Al comparar el número de brotes promedio entre los híbridos de la primera

generación con los de la segunda, se observa que los híbridos-H1 presentan una mayor

producción de brotes que los híbridos-H2 entre los 75-105 DAS (Figura 4 y 5, valores de

probabilidad en Anexo 5).

23

Núm

ero

de b

rote

s

DDS


entre arroz maleza y variedad CFx-18 en primera (C1) y segunda generación (C2), y sus


(mad).

0

5

10

15

45 60 75 90 105 mad

CFX020C1020C2020

0

5

10

15

45 60 75 90 105 mad

120C1120C2120

0

5

10

15

45 60 75 90 105 mad

023C1023C2023

0

5

10

15

45 60 75 90 105 mad

121C1121

24

Núm

ero

de b

rote

s

DAS


entre arroz maleza y variedad Puitá INTA en primera (P1) y segunda generación (P2), y sus


(mad).

0

5

10

15

45 60 75 90 105 mad

P.INTA020P1020P2020

02468

101214

45 60 75 90 105 mad

120P1120P2120

0

5

10

15

20

45 60 75 90 105 mad

073P1073P2073

0

5

10

15

45 60 75 90 105 mad

121P1121P2121

25

Cuadro 8. Determinación de la similitud o diferencia del número de brotes promedio entre

las plantas híbridas en las dos generaciones con sus respectivas líneas parentales mediante

el análisis de contrastes: C: híbrido es similar al arroz cultivado; M: híbrido es similar al



intermedio.


DDS

Generación Tipo híbrido Morfotipo 45 60 75 90 105 mad

Hïbridos-C1

sativa 020C1 C Het+ Het+ M CM CM

120C1 CM Het+ Het+ C C C

intermedio 023C1 CM M M CM CM CM

121C1 CM M M CM CM CM

Híbridos-C2

sativa 020C2 CM Het+ CM C C CM

120C2 CM CM CM CM CM CM

intermedio 023C2 CM CM C C C CM

121C2 - - - - - -

Híbridos-P1

sativa 020P1 C C C M M M

120P1 C C C Het+ Het+ CM

intermedio 073P1 Het+ Het+ Het+ Het+ Het+ M

121P1 CM Het+ Het+ M M M

Híbridos-P2

sativa 020P2 M M CM C C C

120P2 M M CM CM CM CM

intermedio 073P2 M M CM CM CM CM

121P2 CM M CM C I CM

26

7.2.3. Número de panículas, ancho de la hoja bandera, longitud de panícula, semilla

total y semilla llena de las plantas híbridas en madurez.

El número de panículas (P), es una característica muy relacionada con el número de

brotes (R2>0.9, Anexo 7). En este rasgo se observa la misma tendencia que presenta el

número de brotes en las plantas híbridas, y se determina que la cantidad de panículas

producidas en los híbridos en ambas generaciones no cambió significativamente en relación

a las líneas parentales en madurez (Cuadro 9).

El ancho de la hoja bandera (HB), fue el rasgo que presentó la menor variación

morfológica en las plantas híbridas. Se observó que todas las plantas de la primera

generación (C1 y P1) presentaron hojas bandera con mayor área foliar que la del arroz

maleza. Para la segunda generación, algunos híbridos presentaron la misma condición

anterior, mientras que los morfotipos 023C2, 120P2, 073P2 y 121P2 mostraron una mayor

área foliar que la observada en ambos padres (Cuadro 9).

Para la longitud de panícula (LP), los morfotipos 023C1, 023C2 y 020C2

presentaron panículas más largas que ambos padres. En los morfotipos restantes de los

híbridos-C, la longitud de la panícula del híbrido fue similar a la del arroz maleza En los

híbridos-P no hubo diferencias en relación a ambos padres en la primera generación.

Mientras que en la segunda se observó heterosis positiva para esta característica en los

morfotipos 120P2, 073P2 y 121P2 (Cuadro 9).

Para el número de semilla total (ST), el resultado fue variable en ambas

generaciones en los híbridos-C (C1 y C2). Los morfotipos 120C1 y 023C1 produjeron la

misma cantidad de semilla total que produjo el arroz maleza, el morfotipo 121C1 produjo

un número de semilla total similar al arroz cultivado. Mientras que la cantidad de semilla

total producida por los morfotipos 020C1, 020C2 y 023C2 superó la cantidad de semilla

que producían los padres. En el caso de los híbridos-P, en las dos generaciones se

observaron morfotipos (020P1, 073P1, 121P1, 120P2, 073P2 y 121P2) con mayor

producción de semilla total que las líneas parentales (Cuadro 9).

Para el número de semilla llena (SL), en la primera generación de híbridos

(híbridos-C e híbridos-P), con la excepción del morfotipo 023C1, la producción de semilla

llena disminuyó considerablemente en las plantas híbridas en comparación con las líneas

parentales. En la segunda generación, sólo el morfotipo 120C2 presenta heterosis negativa,

27

Cuadro 9. Determinación de la similitud o diferencia del número de panículas (P), ancho

de hoja bandera (HB), longitud de panícula (LP), número de semilla total (ST) y número

de semilla llena (SL) entre las plantas híbridas con sus respectivas líneas parentales en

madurez mediante el análisis de contrastes: C: híbrido es similar del arroz cultivado; M:

híbrido es similar al arroz maleza; CM: híbrido es similar a ambos padres (cultivado y

maleza), Het+: híbrido es superior a ambos padres; Het-: híbrido es inferior a ambos

padres; I: híbrido difiere de ambos padres y presenta un valor intermedio.


Generación Tipo híbrido Morfotipo P HB LP ST SL

Hïbridos-C1

sativa 020C1 CM C M Het+ Het-

120C1 C C M M Het-

intermedio 023C1 CM C Het+ M CM

121C1 CM C M C Het-

Híbridos-C2

sativa 020C2 CM C Het+ Het+ C

120C2 CM C M CM Het-

intermedio 023C2 CM Het+ Het+ Het+ C

121C2 - - - - -

Híbridos-P1

sativa 020P1 M C C Het+ Het-

120P1 CM C CM M Het-

intermedio 073P1 M I CM Het+ Het-

121P1 M C CM Het+ Het-

Híbridos-P2

sativa 020P2 CM C C CM CM

120P2 CM Het+ Het+ Het+ CM

intermedio 073P2 CM Het+ Het+ Het+ CM

121P2 CM Het+ Het+ Het+ CM

28

Núm

ero

de se

mill

a

Figura 6. Número de semilla llena y vana (semilla total) producida por las plantas híbridas

en primera y segunda generación, y las líneas parentales (variedades comerciales y

morfotipos de arroz).

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

vanallena

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

29

mientras que los híbridos restantes (020C2, 023C2, 020P2, 120P2, 073P2 y 1212P2) son

semejantes a la cantidad de semilla llena producida por las líneas maternas y paternas

(Cuadro 9, Figura 6).

7.2.4. Determinación del inicio del periodo de floración.

Las plantas maleza y la variedad CFX-18 mostraron períodos de floración superior a

los 116 DDS. Mientras que para la variedad Puitá INTA la floración inició entre los 90-95

DDS (Cuadro 10). Para la primera generación de híbridos (H1), se encontró 68 plantas en

floración entre los 100-105 DDS, y el resto de plantas híbridas inició esta fase luego de los

116 DDS. En la floración de los híbridos pertenecientes a la segunda generación (H2), se

determinó que 55 plantas iniciaron este periodo antes de los 115 DDS. De ellos, 23 plantas

se encontraron en floración entre los 100-105 DAS y 17 plantas entre los 111-115 DDS. El

resto de híbridos iniciaron este periodo, luego de 116 DDS (Cuadro 10). Después de 116

DDS, no se cuantificó la variación en este período.

30

Cuadro 10. Número de plantas parentales e híbridas que iniciaron el proceso de la

floración en diferentes períodos (DDS: días después de la siembra).

Generación Morfotipo-

Variedad

DDS Total

90-95 96-100 100-105 106-110 111-115 >116

Parentales

020 0 0 0 0 0 51 51

120 0 0 0 0 0 22 22

023 0 0 0 0 0 15 15

073 0 0 0 0 0 9 9

121 0 0 0 0 0 17 17

CFX-18 0 0 0 0 0 8 8

Puitá INTA 15 0 0 0 0 0 15

Híbridos-C1

020C1 0 0 26 0 0 10 36

023C1 0 0 5 0 0 1 6

120C1 0 0 7 0 0 11 18

121C1 0 0 4 0 0 0 4

Híbridos-P1

020P1 0 0 5 0 0 50 55

073P1 0 0 19 0 0 3 22

120P1 0 0 2 4 3 31 40

121P1 0 0 0 0 0 23 23

Híbridos-C2

020C2 0 6 11 7 3 33 60

023C2 0 0 0 0 1 18 19

120C2 0 0 2 0 4 11 17

Híbridos-P2

020P2 1 0 1 0 4 37 43

073P2 0 0 2 0 0 13 15

120P2 0 0 4 0 5 24 33

121P2 0 0 3 1 0 8 12

Total

16 6 91 12 20 395 540

31

7.3. Confirmación de la naturaleza híbrida de las plantas por PCR.

Para la primera generación de híbridos, se obtuvo 64 plantas positivas para la

mutación S653D (presente en la variedad CFx-18) y 140 plantas positivas para la mutación

A122T (presente en variedad Puitá INTA). Esto confirmó la naturaleza híbrida de las

plantas H1, debido a que se detectó el alelo resistente proveniente de la planta donadora de

polen.

En las líneas parentales y en la segunda generación de híbridos se determinó tanto el

alelo resistente como el alelo susceptible, lo cual permitió inferir el genotipo para el gen

ALS (Figura 7 y 8). Se encontró que las líneas maternas (arroz maleza) presentan el gen

ALS en forma homocigotas susceptibles (SS), mientras que las variedades resistentes a

imidazolinonas (CFX y Puitá) son homocigotas resistentes (RR, Cuadro 11). Además, para

los híbridos-C2, se obtuvo 20 plantas homocigotas resistentes (RR), 39 heterocigotas (RS)

y 24 homocigotas susceptibles (SS). Para los híbridos-P2, se obtuvo 41 plantas

heterocigotas (RS), 43 homocigotas susceptibles (SS) y el genotipo RR no se detectó en

estos híbridos. Un 16% de las plantas H2 no pudo ser determinado por falta de material

vegetal para extraer el ADN; sin embargo, no se excluyeron del análisis de datos

morfológicos, porque se tuvo certeza que eran plantas híbridas que se derivaron de una H1,

que presentó la mutación que confiere la resistencia al herbicida (Cuadro 11).

En adición, se realizó una prueba de bondad-ajuste (Chi-cuadrado, χ²), que

determinó que los híbridos-C2 sí cumplen con las proporciones esperadas 1:2:1 para cada

uno de los genotipos (χ²= 2.13, gl=4, p=0.71). Mientras, que los híbridos-P no cumplen con

esta disposición (χ²= 105.90, gl=6, p<0.001). Además, se calculó una probabilidad binomial

donde se encontró que la probabilidad de encontrar cero homocigotas resistentes (RR) en

una muestra de 84 plantas (muestra analizada), con una probabilidad de éxito de 0.25, es

muy baja (p<0.001). Por tanto, sería normal que en esta muestra analizada (n=84) se

observara el genotipo RR, lo cual no está ocurriendo y como consecuencia hay una

desviación de las proporciones genotípicas observadas.

32

500pb 250pb 200pb 150pb 100pb 50pb

Figura 7. Detección del alelo resistente (mutación S653D) mediante PCR. Línea 1: CFx-

18, línea 2: CFx-18, línea 3: híbrido 136C, línea 4: AR136, línea 5: AR136, línea 6: control

negativo (H2O), línea 7: MM 50pb.

Resistente Susceptible

1000pb

500pb 300pb 200pb 100pb

Figura 8. Detección del alelo resistente (mutación A122T) y del alelo susceptible (alelo

normal), gel de agarosa 1.5%. Línea 1: MM 100pb, línea 2: Puitá INTA, línea 3: híbrido-

977P2 (morfotipo-121C2), línea 4: AR977, línea 5: control negativo (H2O). Genotipo

inferido: Puitá INTA: RR (homocigota resistente), híbrido 977P2: RS (hetorocigota),

AR977: SS (homocigota susceptible).

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 6 7

33

Cuadro 11. Inferencia del genotipo del gen ALS (RR, RS, SS) para las plantas híbridas

pertenecientes a la segunda generación (H2) de híbridos, según los datos moleculares. *NI:

plantas que no se lograron identificar por falta de material vegetal para obtener el ADN.

Híbrido Morfotipo RR RS SS NI* Total

Híbridos-C2

020C2 12 25 16 7 60

023C2 5 8 3 3 19

120C2 3 6 5 3 17

Híbridos-P2

020P2 0 2 31 10 43

073P2 0 11 3 1 15

120P2 0 18 8 7 33

121P2 0 10 1 1 12

CFx-18 - 8 0 0 0 8

Puitá INTA - 9 0 0 0 9

Arroz maleza - 0 0 10 0 10

Total 37 80 77 32 226

34

7.4. Evaluación fenotípica de resistencia al herbicida.

Se logró ver diferencias en la tolerancia al herbicida en las plantas sometidas a

diferentes dosis de Katrin® (30 días después de la aplicación). Para las plantas susceptibles

(SS), se observó inhibición del crecimiento en las plantas con diferentes dosis de imazapir y

no se observaron diferencias en el daño en las hojas en plantas expuestas a diferentes dosis

de imazapir (Figura 9 y 12, Anexo 8). En las plantas heterocigotas (RS), se dió una

disminución en el crecimiento con las diferentes dosis de imazapir (Figura 10). Sin

embargo, no se notó un efecto como el que se observó en las plantas susceptibles, a pesar

de ser dosis más concentradas. En las plantas resistentes (RR), se logró apreciar que estas

plantas crecen más que las susceptibles y las heterocigotas en presencia del herbicida

(Figura 11). Además, el porcentaje de hojas con daños es similar entre las tres dosis

utilizadas (480, 768 y 1152 g/l) con los genotipos RS y RR (Figura 12, Anexo 8).

35

0 36 72 120

0 36 72 120

Imazapir (g/l)


susceptibles (SS) para el gen ALS: líneas maternas (arroz maleza) e híbridos pertenecientes

a la segunda generación (H2), resultantes del cruce entre arroz maleza y variedad CFX-18.

Línea materna: Arroz maleza Susceptibles (SS)

Híbridos segunda generación Susceptibles (SS)

36

0 480 768 1152

0 480 768 1152

Imazapir (g/l)


heterocigotas (RS) para el gen ALS: híbridos resultantes del cruce entre arroz maleza y

variedad CFX-18, pertenecientes a la primera (H1) y segunda generación (H2).

Híbridos primera generación Heterocigotas (RS)

Híbridos segunda generación Heterocigotas (RS)

37

0 480 768 1152

0 480 768 1152

Imazapir (g/l)


resistentes (RR): variedad CFX-18 y plantas híbridas resultantes del cruce entre arroz

maleza y variedad CFX-18, pertenecientes a la segunda generación (H2).

Línea paterna: variedad CFX-18 Resistentes (RR)

Híbridos segunda generación Resistentes (RR)

38

SS RS RR

Hoj

as c

on d

años

(%)

Imazapir (g/l)

Figura 12. Porcentaje promedio de hojas con daños en plantas susceptibles (SS),

heterocigotas (RS) y resistentes (RR), expuestas a dosis crecientes de imazapir.

0

20

40

60

80

100

0 36 72 120

0

20

40

60

80

100

048

076

811

52

0

20

40

60

80

100

048

076

811

52

a b b b a b b b a b b b

39

8. DISCUSIÓN

8.1. Producción de híbridos en condiciones de invernadero.

La hibridación y el flujo de genes entre cultivos y malezas, se da de forma natural,

dependiendo de una combinación de factores, tanto ambientales como genéticos (Ellstrand

et al. 1999, Papa y Gepts 2004, Mallet 2005). En condiciones controladas, la hibridación

entre arroz maleza y variedades resistentes a herbicidas es completamente posible, ya que

muchos de los factores ambientales fueron eliminados, y la producción de semilla híbrida

dependió de la cantidad de plantas disponibles para emascular, así como de la disposición

de polen a la hora de polinizar. En este estudio, se obtuvo un mayor número de plantas con

P. INTA (n=243), se cree que esto se debe a que esta variedad producía mayor cantidad de

polen que CFX (obs. pers.), lo que puede haber limitado la producción de híbridos con esta

variedad (Cuadro 6). Además, se realizaron una mayor cantidad de cruces con la variedad

CFX (n=47) que con la variedad P. INTA (n=36), por lo que también se debe considerar

que algunas poblaciones de arroz maleza presentan compatibilidad variable con variedades

resistentes a imidazolinonas (Shivrain et al. 2009).

Asimismo, se produjo una mayor cantidad de híbridos con los morfotipos

correspondientes al grupo sativa, mientras que no se logró la misma cantidad con los

morfotipos pertenecientes al grupo intermedio. Por lo que, se cree que el morfotipo de arroz

maleza utilizado influyeron en la producción de híbridos en invernadero, ya que se ha

reportado que la hibridación varía de acuerdo al arroz maleza utilizado (Sánchez et al.

2009). También, se sugiere que morfotipos del grupo sativa, han sufrido hibridaciones

previas con variedades cultivadas (Arrieta-Espinoza et al. 2005), y por tanto poseen mayor

similitud genética y esto les permite una mayor habilidad para hibridar.

De los morfotipos que hibridaron con las variedades resistentes a imidazolinonas, la

gran mayoría produjo semilla viable, excepto el morfotipo híbrido 121C1 (Cuadro 6). Esto

indica que existe compatibilidad genética entre el arroz maleza y las variedades CFx-18 y

Puitá INTA (Rieseberg 1997, Rieseberg & Willis 2007). Pero, que hay morfotipos que no

presentan estas características, como las plantas resultantes del cruce entre el morfotipo

intermedio 121 y la variedad CFx-18. Para este híbrido (121C), se determinó que la

producción de semilla total fue alta y la semilla llena fue baja (en comparación con ambos

padres), y que las pocas semillas que germinaron, murieron poco después de la emergencia

40

de las plántulas (datos no mostrados). Esto no permitió la producción de plantas para la

segunda generación (Cuadro 6, Figura 7), lo cual puede ocurrir por la presencia de

incompatibilidades genéticas en esta combinación híbrida. Ya que, la viabilidad y fertilidad

depende de interacciones epistáticas entre alelos en diferentes loci, que pueden ser fijados

en algunas poblaciones (variedades cultivadas, por ejemplo). Por lo que, en la hibridación

entre el morfotipo maleza 121 con la variedad CFX-18, se podrían presentar interacciones

epistáticas diferentes entre los genes que controlan esta característica, así como cambios en

la expresión de genes o contribuciones asimétricas de los padres, diferentes a las de los

demás híbridos que sí produjeron semilla (Maheshwari & Barbash 2011, Matsubara et al.

2014).

8.2. Caracterización morfológica de las plantas híbridas y líneas parentales.

El análisis de los diferentes rasgos morfológicos caracterizados en los híbridos,

revela una alta variación en ambas generaciones. Así como la presencia de heterosis

positiva (en altura de la planta, hoja bandera, longitud de panícula y semilla total) y

heterosis negativa (en número de semilla llena) en ciertos rasgos en diferentes momentos

del crecimiento vegetativo o en madurez.

El vigor híbrido observado en la altura de la planta durante el crecimiento

vegetativo, en la primera y segunda generación de híbridos, demuestra que el crecimiento

de estas plantas fue más rápido (aproximadamente 30-60 DDS) que en las líneas parentales.

Los morfotipos híbridos 121C1, 121P1 y 121P2 sobresalen con heterosis positiva en ambos

tipos de cruces (con CFX-18 y Puitá), lo cual puede ser un efecto del morfotipo maleza

121. Es interesante, que los híbridos que se diferencian de los padres en madurez

pertenecen a morfotipos del grupo intermedio, y los del grupo sativa son muy similares a la

maleza, lo cual puede estar relacionado con los eventos previos de hibridación

(anteriormente mencionados) del grupo sativa (Arrieta-Espinoza et al. 2005). En otros

estudios, generalmente se han encontrado plantas híbridas (F1) más altas que sus padres

(Shivrain et al. 2006), pero también plantas que no presentan variaciones sustanciales con

alguno o ambos progenitores (Gealy et al. 2003, Song et al. 2004). Además, entre

generaciones de híbridos (C1-C2 y P2-P2) se observaron diferencias en la altura promedio

sólo en etapas tempranas del crecimiento (30-45 DDS). Esta variación en la altura de la

41

planta, puede ocurrir debido a que se conoce que los caracteres cuantitativos, como la

altura, son reguladas por diferentes genes y mecanismos como la dominancia y la epistasis,

las cuales han sido considerados como los principales contribuidores para la altura de las

plantas híbridas de arroz (Shen et al. 2014).

El número de brotes, durante el crecimiento vegetativo y en madurez, no se

diferencia significativamente con las líneas parentales. Esto puede ocurrir debido se ha

encontrado que patrones temporales de expresión de genes asociados con diferentes rasgos

puede ser diferente e incluso genes individuales o genes en una misma región genómica

pueden tener efectos genéticos opuestos en diferentes etapas del crecimiento (Yan et al.

1998). Por lo que, se sugiere que la expresión de genes que permitieron superioridad en

altura de la planta en los híbridos, pueden haber actuado de forma contraria en la

producción de brotes o viceversa. Como se puede observar en el morfortipo 073C1, que

durante el crecimiento vegetativo presenta una altura similar a los padres, pero en la

producción de brotes se observa heterosis positiva (Cuadro 10).

El número de brotes y panículas por planta son características muy correlacionadas

(R2>0.9), y ambas no cambian significativamente en los híbridos en relación a sus padres

(Cuadro 10). Además, se conoce que el número de brotes es una de las características más

importantes, ya que determina el número de panículas, el cual es un componente clave en el

rendimiento del cultivo (Li et al. 2003). Por tanto, esta variable depende directamente del

número de brotes producidos durante la etapa vegetativa.

La presencia de hojas banderas con mayor área foliar en las plantas híbridas, es una

característica importante, ya que este factor determina el rendimiento potencial de las

plantas, aumentando el número de espiguillas por panícula, lo cual está asociado

directamente con la tasa fotosintética en la hoja bandera (Bing et al. 2006). Además, en

estudios previos, características como la hoja bandera, la longitud de panícula y la

producción de semilla han sido estrechamente asociadas, con diversos QTLs que afectan

rasgos relacionados con el rendimiento, lo cual ha llevado a pensar en el ligamiento de

múltiples genes que afectan diferentes características o con efectos pleiotrópicos en rasgos

relacionados (Xue et al. 2008, Wang et al. 2012). Esto, puede estar ocurriendo en este

estudio, ya que se observó la presencia de vigor híbrido en el tamaño de la hoja bandera, la

longitud de la panícula y en la producción de semilla total (Figura 7). Sin embargo, la

42

cantidad de semilla llena (SL) en la primera generación, presentó heterosis negativa

(depresión endogámica). Los resultados de la investigación coinciden con lo observado en

otros estudios por Song et al. 2004, Zhang et al. 2008, Sánchez et al. 2009 en los que se

explica y se asocia el resultado con la distancia genética entre los progenitores (Ellstrand

2003), y lleva a reducir el valor medio de la cantidad de semilla llena que conduce a la

perdida de vigor en este rasgo y en algunos casos de la fecundidad (ejemplo morfotipo

121C).

Por lo que, en este estudio la hibridación producto del cruce entre arroz maleza y

variedades resistentes a imidazolinonas, genera una amplia variación morfológica en los

rasgos caracterizados. Esto, debido a la combinación de nuevos genomas entre alelos

provenientes de variedades mejoradas, que han sido fijados en las poblaciones de arroz

cultivado, con alelos presentes en el arroz maleza y una constante segregación de esas

características. Además, la heterosis o vigor híbrido en los híbridos fue muy variable

dependiendo de la característica evaluada, la fase de desarrollo (vegetativa o madurez) el

individuo y la generación. Además, se vieron favorecidos rasgos tales como la altura

durante el crecimiento, así como ciertas características relacionadas con el rendimiento del

cultivo. Esto resultado puede deberse tanto de la presencia de ciertos alelos en el genoma de

los híbridos, así como de la expresión de los mismos (Huang et al. 2015, Song et al. 2010).

En adición, estudios previos en nuestro país, han permitido la caracterización

morfológica y genética del arroz maleza presente en Costa Rica, en los que se ha

encontrado una alta diversidad y variabilidad morfológica. La morfología estudiada en el

arroz maleza, indica que existe una alta probabilidad de que hayan ocurrido eventos de

hibridación entre especies silvestres y variedades comerciales (Arrieta-Espinoza et al

2005). Además, un análisis realizado con microsatélites (Trejos-Espinosa 2006), afirma que

el arroz maleza de Costa Rica presenta mayor cercanía con variedades comerciales (O.

sativa). Por lo que, el autor plantea que el arroz maleza en nuestro país no es producto de

hibridación entre especies silvestres y variedades comerciales, sino que es un proceso de

hibridación y degeneración a partir de variedades comerciales de arroz que se han sido

sembradas en el país (tipo indica y japonica). Según Qi et al. 2015 en un estudio realizado

en Estados Unidos este proceso aún no está claro y no ha sido estudiado con suficiente

43

detalle, y quizá sea una combinación de ambas posibilidades o mecanismos genéticos

completamente independientes.

Sin embargo, los resultados obtenidos en esta investigación reflejan la amplia

variación fenotípica del arroz maleza y su carácter de enjambre híbrido (Arrieta-Espinoza et

al 2005, Trejos-Espinosa 2006, Sanchez et al. 2007, Sanchez et al. 2009), con un trasfondo

genético que no es conocido con precisión y que debería estudiarse con miras a plantear y

utilizar un manejo adecuado para evitar la hibridación del arroz maleza con las variedades

comerciales.

8.3. Determinación del período de la floración.

La variación observada en el inicio del periodo de floración en plantas híbridas, es

mayor a la que se observa en las líneas parentales. Esta misma tendencia, ha sido observada

en híbridos resultantes del cruce entre arroz maleza y variedades resistentes a

imidazolinonas (Shivrain et al. 2006) y en híbridos resultante del cruce entre arroz rojo y

arroz resistente a glufosinato (Oard et al. 2000, Zhang et al. 2003), lo cual sugiere que esta

variación se da debido a la combinación de alelos que han sido fijados en variedades

comerciales con los alelos presentes en el arroz maleza, que no ha sufrido procesos de

domesticación.

Además, se conoce que la inducción del inicio de la floración en arroz está regulado

por condiciones ambientales, como fotoperiodo y temperatura (Zeevaart 2008, Luan et al.

2009, Song et al. 2012). Se han encontrado al menos 18 genes involucrados en este proceso

(Tsuji et al. 2011) y se conoce que genes relacionados con la sensibilidad al fotoperiodo

(RFT1, Hd1 y Hd3a) son esenciales para la floración en este cultivo (Yano et al. 2000,

Komiya et al. 2008, Shrestha et al. 2014). En estos genes se han reportado variaciones

naturales en cultivares, así como en distintos grupos de arroz maleza (Ogiso-Tanaka et al.

2013, Thuerber et al. 2014), que diversifican el periodo de floración en las plantas y se

consideran responsables de nuevos fenotipos. Por lo que, determinar la presencia de estas

variaciones en los híbridos resultantes en este estudio podría dar otras explicaciones acerca

de las variaciones observadas.

Esta variación en el período de floración en las plantas híbridas de ambas

generaciones es una habilidad importante que poseen los híbridos resultantes del cruce

44

entre arroz maleza y variedades resistentes a imidazolinonas, ya que un amplio ámbito en el

periodo de floración, es uno de los factores que favorece la polinización cruzada con otros

individuos de variedades comerciales o individuos maleza, para así asegurar el éxito

reproductivo y su persistencia en el campo (Gealy et al. 2003, Shivrain et al. 2009).

8.4. Detección de alelos resistentes y susceptibles en plantas híbridas y líneas

parentales.

La detección del alelo resistente en la primera generación de híbridos, permitió

incluir en el análisis de datos morfológicos, sólo plantas que recibieron la mutación S653D

o A122T. Esto, permitió un alto grado de confianza en el estado híbrido de las plantas H1 y

H2, ya que a través de la morfología es muy difícil diferenciarlas de sus parentales (FAO

2007). El alelo susceptible no se determinó en estas plantas, ya que por ser una primera

generación (F1), se concluye que todas las plantas son heterocigotas para el gen ALS.

En la segunda generación de híbridos, al inferir el genotipo del gen ALS, se encontró

que los híbridos-C2 cumplen con las proporciones genotípicas esperadas (1:2:1), debido a

la segregación de caracteres independiente (Alberts et al. 2008). Esto, confirma que los

híbridos-C1 son heterocigotas. Por lo que, probablemente la forma de herencia del gen ALS

en estas plantas esté asociada al núcleo, como se ha descrito previamente en otras plantas

maleza del género Solanum (Volenberg y Stoltenberg 2002, Ashigh et al. 2008).

No obstante, en los híbridos-P2 no se observa esta condición (1:2:1) y no aparece

ninguna planta homocigota resistente (RR). La probabilidad de que esto ocurra es muy baja

(p<0.001), por lo que, la desviación de estas proporciones y no detectar plantas con

genotipo RR, puede estar sucediendo por diferentes situaciones: 1) Las plantas híbridas en

condición homocigota resistente (RR) no germinan o no sobreviven por alguna razón

genética o metabólica, es decir, esta combinación es letal, 2) La temperatura utilizada para

la PCR de la mutación A122T hizo la reacción muy específica, 3) El tamaño de la

población evaluada no es suficiente para observar estas proporciones, y 4) Las plantas Puitá

INTA, son heterocigotas para el gen ALS (sólo presentan un alelo resistente).

En estudios previos, se ha asociado alelos resistentes a imidazolinonas con la

disminución del fitness en plantas, como consecuencia de efectos pleiotrópicos, los cuales

no son letales para la planta, pero perjudican el crecimiento o el rendimiento del cultivo

45

(Zhang et al. 2006, Sha et al. 2007, Vila-Aiub et al. 2009, Yu et al. 2010, Matsubara et al.

2014). Además, se ha reportado que la variedad P. INTA, que posee la mutación A122T,

muestra una germinación más rápida que variedades con otras mutaciones en el gen ALS

(Goulart et al. 2012). Por lo que, debido a las características de los iniciadores, se considera

la opción 2 como la más viable, ya que el diseño del iniciador SNPPtaRev1 fue creado

mediante SNAP (single nucleotide-amplified polymorphism). Esto consiste en la inserción

de un nucleótido adicional en la segunda base desde el extremo 3’ (G/T) que no concuerda

con la secuencia, por lo que se cambian dos nucleótidos de la secuencia original: el

complementario a la mutación y otro adicional. Esto aumenta la fiabilidad de la

amplificación y la discriminación de mutaciones puntuales entre los individuos (Rosso et

al. 2010a).

Al realizar la estandarización de esta PCR, se efectuó cambios del artículo original

(Rosso et al. 2010a), e inicialmente se programó un touchdown-PCR (temperatura de

anneling de 62°C a 55°C, Anexo 3), con el que se determinó la mutación A122T en la

variedad Puitá INTA y en la primera generación (híbridos-P1). Durante la determinación

del alelo resistente para la segunda generación de híbridos, se presentaron problemas con

amplificaciones inespecíficas, por lo que se eliminó el touchdown-PCR y se cambió la

temperatura de anneling a 62°C (Anexo 3). Esto pudo tener consecuencias, ya que la

reacción se hizo más específica, es decir, al aumentar la temperatura, se incrementa la

probabilidad de discriminar primers incorrectamente alineados y reduce el alineamiento de

nucleótidos incorrectos en el extremo 3' (Innis et al. 2012), sitio en el que precisamente ha

sido modificado el iniciador SNPPtaRev1 con una base no complementaria a la secuencia

que se desea detectar (Rosso et al. 2010a).

Esta modificación realizada en el primer SNPPtaRev1, ocurre en el diseño de los

primers para la mutación S653D, pero en la cuarta base desde el extremo 3’ (Kadaru et al.

2008), y este no presentó problemas con las modificaciones realizadas para la

estandarización de la PCR realizadas en este estudio (Anexo 2). Además, en otros estudios,

se han reportado desviaciones de estas proporciones como consecuencia del tamaño de

población (Shivrain et al. 2006), sin embargo, al tomar en cuenta una probabilidad binomial

de éxito baja, este factor puede ser descartado. También, es importante considerar, que la

variedad Puitá INTA, es un producto mejorado y comercializado, por lo que la probabilidad

46

de que presente el gen ALS en su forma hetorocigota es baja, ya que ha pasado por procesos

de selección sucesivos que garantiza la calidad del producto para el control del arroz

maleza (Livore 2005, PROARROZ 2013). En adición, todos los genotipos de Puitá INTA

caracterizados en este estudio, son homocigotas resistentes (n=9, Cuadro 12). Por lo que, el

cambio en la temperatura de anneling del par de primers Ar6F/SNPPtaRev1, pudo

disminuir la amplificación del alelo resistente en las plantas híbridas-P2 y de esta forma

desviar las proporciones observadas de las esperadas.

A pesar, de estas diferencias en la detección del alelo resistente entre los híbridos-

C2 e híbridos-P2, es importante recalcar, que la resistencia a imidazolinonas (S653D,

A122T) aparece en el genoma de las plantas híbridas en la primera y segunda generación

(C1, C2, P1 y P2), ya sea de forma homocigota o heterocigota (RR o RS). Y es heredada de

las variedades resistentes cultivadas en Costa Rica, a través de hibridación, lo cual podría

generar tolerancia del arroz maleza al herbicida y dificultar su selección en el campo.

8.5. Evaluación fenotípica de resistencia la herbicida.

Los daños observados en las plantas híbridas y líneas parentales tratadas con

imazapir, corresponden con el genotipo del gen ALS, detectado a nivel molecular mediante

PCR (Cuadro 11). Por lo que, esto confirma la asociación de este rasgo con un único gen

nuclear y que presenta dominancia incompleta en el fenotipo, como se ha determinado

previamente en plantas maleza del género Solanum (Volenberg y Stoltenberg 2002, Ashigh

et al. 2008). Los resultados observados, confirman la expresión del alelo mutado (S653D)

en las plantas híbridas provenientes del cruce entre arroz maleza y la variedad CFX-18. Ya

que, este gen se traduce en la enzima ALS con cambio de un aminoácido que disminuye las

interacciones con imidazolinonas, y les permite ser resistentes a estos compuestos

(McCourt et al. 2006).

Sin embargo, la mayoría de plantas no murieron con dosis elevadas de imazapir, por

lo que se considera que hubo un efecto del tamaño de las plantas, ya que la aplicación del

herbicida se realiza cuando las plantas tienen entre 24 y 31 DDS. En nuestro caso, se usaron

plantas que presentaban una antigüedad mayor a los 30 DDS y tenían un sistema radicular

muy desarrollado, lo cual les permitió una mayor tolerancia al herbicida.

47

8.6. Implicaciones del análisis morfológico y vigor híbrido en plantas resultantes del

cruce entre arroz maleza y variedades resistentes a herbicidas.

La introducción de variedades resistentes a imidazolinonas en Costa Rica, se realizó

con el propósito de controlar el arroz maleza mediante la aplicación de herbicidas. Sin

embargo, se ha observado que estas variedades no han mostrado un control eficaz de estas

malezas, y el presente análisis comprueba que puede darse hibridación entre variedades

resistentes a imidazolinonas y el arroz maleza.

Esta hibridación reporta la generación de múltiples combinaciones de arroz maleza

híbrido con tolerancia al herbicida, que combinado con una utilización constante del mismo

en el campo puede favorecer la persistencia de los híbridos y disminuir la vida útil de las

variedades comerciales. Además, en estudios previos se reportó la hibridación de estas

variedades resistentes con la especie silvestre Oryza glumaepatula (Villalobos 2015, com.

pers.). Y a pesar de que estos híbridos fueron obtenidos y evaluados en condiciones de

invernadero, se evidencia que las variedades resistentes a imidazolinonas tienen las

condiciones y el potencial para hibridar de forma natural con el arroz maleza y con especies

silvestres. Por lo que, se debería de comprobar la existencia de plantas híbridas resultantes

del cruce del arroz maleza con variedades resistentes a imidazolinonas en arrozales de

nuestro país, ya que la probabilidad de encontrarlas es muy alta.

9. CONCLUSIONES

Se logró producir híbridos entre arroz maleza y dos variedades resistentes a

herbicidas, en condiciones de invernadero. La semilla híbrida producida es fértil en ambas

generaciones de híbridos y estas plantas poseen en su genoma la resistencia al herbicida.

Los rasgos caracterizados en los híbridos revelan una alta variabilidad morfológica en

ambas generaciones y entre los más relevantes se determinan el ancho de la hoja bandera, la

longitud de panícula y el número de semilla total. Los periodos variables de floración es

una habilidad importante en plantas híbridas, que facilita la polinización cruzada, como

estrategia de sobrevivencia en el campo.

Además, se determina que la hibridación entre el arroz maleza y las variedades

resistentes a imidazolinonas cultivadas en Costa Rica, genera múltiples combinaciones

híbridas que facilitan el paso de características de interés agronómico generación tras

48

generación, que pueden estar complementando una posible tolerancia del arroz maleza a las

imidazolinonas y que podría favorecer su persistencia en el campo.

10. RECOMENDACIONES

Como recomendaciones, sería bueno hacer un análisis con mayor muestra para

describir mejor la variación morfológica en los híbridos resultantes del cruce entre los

morfotipos de arroz maleza y las variedades resistentes a imidazolinonas. Además, para

realizar una selección más rápida de las plantas que poseen la mutación, se recomienda

remojar la semilla en herbicida antes de la germinación, ya que esto facilita la selección de

híbridos con base en la longitud de la raíz (Rosso et al. 2010b, Goulart et al. 2015), y es

una técnica más barata, rápida y eficiente. Posteriormente, se puede verificar mediante PCR

para confirmar la presencia de la mutación en el genoma de las plantas. Además, realizar

prueba de PCR para la mutación A122T, con temperaturas de anneling de 62-55°C y de

62°C, para determinar si existe alguna diferencia en la amplificación del alelo resistente en

las mismas muestras con diferentes temperaturas, o talvez, utilizar otro método de

detección más sensible y específico (Rosas et al. 2014).

También, la aplicación del herbicida debería de repetirse en plantas más jóvenes,

para observar un efecto más claro de acuerdo a los diferentes genotipos determinados

previamente. Por último, estudiar la hibridación en la dirección contraria, es decir, utilizar

las variedades resistentes como líneas maternas y el arroz maleza como donador de polen,

sería útil para determinar características que se heredan del arroz maleza al arroz cultivado.

49

11. LITERATURA CITADA

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59

12. ANEXOS

Anexo 1. Protocolo para la extracción de ADN genómico total de Lodhi y colaboradores

(1994) modificado para arroz.

1. Agregar 500µl de buffer de extracción (Tris-HCl, CTAB 2%, 2-mercaptoetanol) al

tejido macerado e incubar durante 30min a 60°C.

2. Agregar 500 µl de cloroformo:octanol (24:1), mezclar por inversión de tubo.

3. Centrifugar durante 6 min a 8000 rpm. Transferir la fase acuosa a un tubo nuevo.

4. Agregar 1/10 de acetato de sodio (3M) y 2 vol de etanol frio (95%).

5. Refrigerar a -20°C durante 15-20 min.

6. Centrifugar durante 3 min a 3000 rpm y luego durante 3 min a 5000 rpm.

7. Descartar sobrenadante. Lavar el “pellet” con etanol frio (76%).

8. Centrifugar durante 6 min a 5000 rpm y descartar el sobrenadante.

9. Secar (evaporar etanol) a 37 °C durante 30 min.

10. Disolver el ADN en 50µl de TE (Tris-EDTA) e incubar durante 15 min a 50 °C.

11. Cuantificar la concentración de ADN en Nano Drop.

12. Almacenar a corto plazo a -20 °C y a largo plazo a -70°C.

60

Anexo 2. Reacción y condiciones cíclicas para detección de la mutación S653D y alelo

susceptible para la variedad CFx-18 mediante PCR (Kadaru et al. 2008).

Contenido de la reacción

Reactivo µl Agua 11.35 Primer F (10µM) 1.00 Primer R (10µM) 1.00 BSA (10mg/ml) 0.80 10x Buffer Taq 2.00 dNTPs (10mM) 0.40 MgCl2 1.20 Taq Polimerasa 0.25 ADN (50µl/ng) 2.00 Total 20.00

Primers para detección de la mutación S653D: ALS653ResF/ALSR3.

Primers para detección de alelo susceptible: ALS653SusF/ALSR3.

Tamaño del producto de la amplificación: 134bp

Secuencia de los iniciadores (mutación: A/G)

Primer Secuencia Tm (°C) ALS653ResF 5´-GTGCTGCCTATGATCCTAAA-3´ 56.4 ALS653SusF 5´-GTGCTGCCTATGATCCTAAG-3´ 58.4 ALSR3 5´-TGGGTCATTCAGGTCAAACA-3´ 56.4

Condiciones cíclicas: desnaturalización durante 3 min a 94°C, seguido de 28 ciclos de 15 s

a 94°C, 30 s a 63.2°C y 30 s a 72°C, por último 5 min a 72°C de elongación.

61

Anexo 3. Reacción y condiciones cíclicas para detección de la mutación A122T y alelo

susceptible para la variedad Puitá INTA mediante PCR (Roso et al. 2010a).

Contenido de la reacción

Reactivo µl Agua 10.02 Primer F (10µM) 1.00 Primer R (10µM) 1.00 BSA (10mg/ml) 0.80 DMSO (99%) 1.33 10x Buffer Taq 2.00 dNTPs (10mM) 0.40 MgCl2 1.20 Taq Polimerasa 0.25 ADN (50µl/ng) 2.00 Total 20.00

Primers para detección de la mutación A122T: Ar6F, SNPPtaRev1.

Primers para detección de alelo susceptible: Ar6F, PtaSus.

Tamaño del producto de la amplificación: 253pb

Secuencia de los iniciadores (mutación: T/C)

Primer Secuencia Tm (°C) SNPPtaRev1 5’-CCTGGTGGATCTCCATGGACTT-3’ 64.0 PtaSus 5’- TGGTGGATCTCCATGGACGC-3’ 62.5 Ar6F 5’-CCAAGACCGGCCGTAAGAAC-3’ 62.5

Condiciones cíclicas touchdown-PCR (Puitá INTA e híbridos-P1): desnaturalización

durante 3 min a 94°C, seguido de 7 ciclos de 1 min a 94°C, 1 min 62°C (-1°C cada ciclo) y

1.5 min a 72°C, luego 26 ciclos de 1 min a 94°C, 1 min a 55°C y 1.5 min a 72°C. Por

último 10 min a 72°C de elongación.

Condiciones cíclicas (híbridos-P2): desnaturalización durante 3 min a 94°C, seguido de

28 ciclos de 30 s a 94°C, 30 s a 62°C y 1 min a 72°C, por último 10 min a 72°C de

elongación.

62

Anexo 4. Probabilidad obtenida en los análisis de contrastes al comprar altura promedio

entre los híbridos y las líneas parentales en la primera y segunda generación de híbridos.

Comparación 30 DAS 45 DAS 60 DAS 75 DAS 90 DAS 105 DAS madurez CFX-020C * * * * * * * 020-020C * * * * * * 0.982 CFX-020C2 0.051 * * * 0.061 0.113 0.108 020-020C2 0.710 * * * * * 0.170 a 020C1-020C2 * * * 0.605 0.493 0.412 0.450 CFX-120C * * * * 0.195 0.111 * 120-120C * * * 0.066 0.850 1.000 0.985 CFX-120C2 0.055 * * * * * * 120-120C2 0.694 * * * 0.053 0.552 0.993 a 120C1-120C2 * * 0.705 * 0.146 0.437 0.886 CFX-023C * * * * * * * 023-023C * * * * * 0.832 0.336 CFX-023C2 * * * * * * * 023-023C2 0.743 * * * * 0.056 * a 023C1-023C2 * * 0.096 0.932 0.997 0.713 0.983 CFX-121C * * * * 0.103 0.157 * 121-121C * * * * * * * Pta-020P 0.350 0.892 * 0.880 0.064 * * 020-020P * * * * 0.126 0.708 0.824 Pta-020P2 * 0.322 * 0.991 * * * 020-020P2 0.302 * * * 0.074 0.985 * a 020P1-020P2 * * 0.997 0.924 0.981 0.908 0.129 Pta-120P 0.095 0.624 0.989 0.133 * * * 120-120P * * * * 0.096 0.964 1.000 Pta-120P2 * 0.999 0.460 0.059 * * * 120-120P2 0.556 * * * * * 0.539 a 120P1-120P2 * 0.320 0.415 0.947 0.580 * 0.434 Pta-073P 0.153 * 0.990 0.255 * * * 073-073P * * * * 0.974 0.580 0.072 Pta-073P2 * 1.000 * 0.117 * * * 073-073P2 0.382 0.192 * * 0.162 * 0.514 a 073P1-073P2 * * * 0.928 * * * Pta-121P * * * * * * * 121-121P * * * * * * * Pta-121P2 * 0.791 0.928 * * * * 121-121P2 1.000 * * * * * * a 121P1-121P2 * 0.250 * 0.418 0.225 0.105 0.210

a Comparación entre híbridos de primera y segunda generación, *probabilidad < 0.05.

63

Anexo 5. Probabilidad obtenida en los análisis de contrastes al comprar el número de brotes

promedio entre los híbridos y las líneas parentales en la primera y segunda generación de

híbridos.

Comparación 45 DAS 60 DAS 75 DAS 90 DAS 105 DAS madurez CFX-020C 1.000 * * * 0.086 0.225 020-020C * * * 0.168 0.802 0.306 CFX-020C2 1.000 * 0.344 0.985 0.976 1.000 020-020C2 0.422 * 0.705 * * 0.192 a 020C1-020C2 * * * * * * CFX-120C 1.000 * * 0.197 0.248 0.314 120-120C 0.270 * * * * * CFX-120C2 1.000 0.067 0.569 0.991 0.819 0.591 120-120C2 0.466 0.417 0.311 0.512 0.888 0.995 a 120C1-120C2 0.950 * * * * * CFX-023C 1.000 * * 0.452 0.515 0.409 023-023C 0.498 0.792 0.685 0.977 0.977 0.811 CFX-023C2 1.000 0.295 0.986 0.208 0.193 0.998 023-023C2 0.956 0.508 * * * 0.485 a 023C1-023C2 0.715 0.176 * * * 0.177 CFX-121C 1.000 * * 0.289 0.203 0.647 121-121C 0.217 0.114 0.195 0.838 0.879 0.849 Pta-020P 0.647 0.974 0.164 * * * 020-020P * * * 0.800 1.000 0.780 Pta-020P2 * * 0.850 0.766 0.385 0.530 020-020P2 0.992 0.230 1.000 * * * a 020P1-020P2 * * * * * 0.242 Pta-120P 0.644 0.845 0.220 * * 0.058 120-120P * * * * * 0.481 Pta-120P2 * * 0.984 0.734 0.222 0.075 120-120P2 0.945 0.287 0.064 0.468 0.998 0.545 a 120P1-120P2 * * * * * 1.000 Pta-073P * * * * * * 073-073P * * * * * 0.4691 Pta-073P2 * * 0.865 0.994 0.498 0.606 073-073P2 0.969 0.999 0.997 0.718 0.443 0.722 a 073P1-073P2 * * * * * * Pta-121P 0.949 * * * * * 121-121P 0.357 * * 0.969 0.949 0.678 Pta-121P2 0.246 * 0.611 0.988 * 0.097 121-121P2 0.736 0.994 0.483 * * 0.174 a 121P1-121P2 0.080 * * * * 0.641


64

Anexo 6. Probabilidad obtenida en los análisis de contrastes al comprar el número de

panículas (P), ancho de la hoja bandera (HB), longitud de panícula (LP), semilla total (ST)

y semilla llena (SL), entre los híbridos y las líneas parentales en la primera y segunda

generación de híbridos.

Comparación P HB LP ST SL CFX-020C1 0.413 0.864 * * * 020-020C1 0.135 * 0.282 * * CFX-020C2 0.999 0.259 * * 0.868 020-020C2 0.818 * * * * a 020C1-020C2 * 0.350 * 0.926 * CFX-120C1 0.428 0.532 * * * 120-120C1 * * 0.803 0.372 * CFX-120C2 0.684 0.898 * 0.217 * 120-120C2 0.998 * 0.714 0.986 * a 120C1-120C2 * 0.852 0.997 0.098 * CFX-023C1 0.738 0.156 * * 1.000 023-023C1 0.729 * * 0.06 0.999 CFX-023C2 0.997 * * * 0.156 023-023C2 0.980 * * * 0.032 a 023C1-023C2 0.535 0.978 0.130 0.999 0.269 CFX-121C1 0.925 0.392 * 0.151 0.599 121-121C1 0.882 * 0.248 * 0.586 Pta-020P * 0.994 0.997 0.835 * 020-020P 0.770 * * * * Pta-020P2 0.740 0.515 0.660 0.174 0.531 020-020P2 0.266 * * * 1.000 a 020P1-020P2 * 0.408 0.532 0.616 * Pta-120P 0.517 0.118 0.167 * * 120-120P 0.870 * 0.373 0.266 * Pta-120P2 0.114 * * * 0.726 120-120P2 0.295 * * * 0.999 a 120P1-120P2 0.722 * 0.318 0.160 * Pta-WM073P * * 0.954 * * 073-073P 0.617 * 0.551 * * Pta-073P2 0.660 * * * 0.162 073-073P2 0.877 * * * 0.977 a 073P1-073P2 0.085 * * 0.803 * Pta-121P * 0.984 0.803 * * 121-121P 0.885 * 0.223 * * Pta-121P2 0.215 * * * 0.518 121-121P2 0.518 * * * 0.986 a 121P1-121P2 0.853 * * 0.052 *


65

Anexo 7. Correlación entre número de brotes y número de panículas en madurez.

Núm

ero

de p

aníc

ulas

Número de brotes

R² = 0,9201

0

5

10

15

20

0 5 10 15 20

R² = 0,9009

0

5

10

15

20

0 5 10 15 20

Híbridos-C

Híbridos-P

66

Anexo 8. Probabilidad obtenida en prueba de Tukey, al comprar el porcentaje de hojas

dañadas en plantas susceptibles (SS), heterocigotas (RS) y resistentes (RR), expuestas a

dosis crecientes de imazapir.

Genotipo Comparación entre dosis Probabilidad

SS

0-36 * 0-72 * 0-120 * 36-72 0.639 36-120 0.888 120-72 0.965

RS

0-480 * 0-768 * 0-1152 * 480-768 1.000 480-1152 0.121 768-1152 0.139

RR

0-480 * 0-768 * 0-1152 * 480-768 0.860 480-1152 0.999 768-1152 0.646

*probabilidad < 0.05.

67

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Hibridación entre biotipos de arroz maleza y variedades ......Universidad de Costa Rica . Facultad de Ciencias . Escuela de Biología . ... Sin embargo, la hibridación entre el arroz