High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

Oleh:

Andhina Rizkya Satriani [G1C 011 002]Dian Ade Putrawan [G1C 011Emma Zahra [G1C 011Isnaningsih [G1C 011I Gede Jate Swara [G1C 011

• High-Performance Liquid Chromatography (atau disebut juga High-Pressure Liquid Chromatography), HPLC, merupakan teknik kromatografi yang digunakan untuk memisahkan campuran dari senyawa-senyawa pada kimia analitik dan biokimia dengan tujuan mengidentifikasi, mengukur, atau memurnikan komponen-komponen individual dari campuran (Wikipedia).

• HPLC menggunakan kolom dengan diameter umumnya kecil, 2-8 mm dengan ukuran partikel penunjang 50 mikrometer; sedangkan laju aliran dipertinggi dengan tekanan tinggi (Khopkar, 2010).

• Keterangan:1. Wadah pelarut2. Degasser pelarut3. Katup gradien4. Wadah pencampuran5. Pompa bertekanan tinggi6. Katup dalam posisi injeksi6’. Katup dalam posisi load7. Loop injeksi sampel

8. Kolom pengaman9. Kolom analisis10. Detektor (misalnya: IR,

UV)11. Pengolahan data12. Wadah sisa atau fraksi

A. Prinsip Kerja HPLC

• Dengan bantuan pompa, fasa gerak cair dialirkan melalui kolom ke detektor. Cuplikan dimasukkan ke dalam aliran fasa gerak dengan cara penyuntikan.

• Di dalam kolom, terjadi pemisahan komponen-komponen campuran karena perbedaan kekuatan interaksi antara solut-solut terhadap fasa diam.

• Solut-solut yang kurang kuat interaksinya dengan fasa diam akan keluar dari kolom lebih dulu. Sebaliknya, solut-solut yang kuat berinteraksi dengan fasa diam maka solut-solut tersebut akan keluar kolom dideteksi oleh detektor kemudian direkam dalam bentuk kromatogram.

B. Diagram Alur HPLC

Wadah Pelarut

Degasser Pelarut

Pompa Bertekanan

Tinggi

Tempat Injeksi SampelLoopKolom

Detektor (ex: IR, UV) Komputer Kromatogram

(Contoh kromatogram dari campuran kompleks parfum)

B. Diagram Alur HPLC

C. Instrumen HPLC

C. Instrumen HPLC

• Komponen-komponen HPLC:– Eluen (Pelarut atau Fase Gerak)

Tempat pelarut biasanya menggunakan suatu botol yang tahan terhadap pelarut-pelarut organik dan larutan yang digunakan untuk HPLC haruslah terbebas dari partikel-partikel lain yang dapat menggangu.

– Sistem PemompaUntuk memompa eluen.

– Penginjeksi SampelProses injeksi pada awalnya menggunakan syringe melalui sebuah katup elastomer. Syringe yang digunakan memiliki kemampuan melawan tekanan 1500 psi.

C. Instrumen HPLC

– Kolom HPLCKolom HPLC secara umum dibuat dari bahan tabung stainless steel. Kolom untuk analisis HPLC memiliki ukuran panjang kolom berkisar dari 10 – 30 cm. Diameter dalam kolom 4 – 10 mm dengan ukuran partikel 5 – 10 μm.

– DetektorMerupakan pengolah data.

D. Kelebihan dan Kekurangan HPLC

• Kelebihan HPLC:– Kerja lebih mudah dengan automasi dalam prosedur analisis dan

pengolahan data.– Volume sampel kecil (dapat menganalisis sampel yang kecil

kuantitasnya).– Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran dengan

daya pisah tinggi.– Merupakan metode analitis: cepat, peka, akurat, tepat, reproducible,

preparatif.– Dapat digunakan untuk sampel organik dan anorganik, bersifat volatile

dan non volatil, stabil dan tidak stabil secara termal.

D. Kelebihan dan Kekurangan HPLC– Pilihan fase gerak dan fase diamnya luas.– Dapat dihindari terjadinya dekomposisi atau kerusakan bahan analisis.– Dapat digunakan bermacan-macam detektor dengan kepekaan yang

tinggi.– Kolom dapat digunakan kembali.– Waktu analisa cukup singkat.– HPLC dapat digunakan untuk isolasi zat yang tidak mudah menguap

dan zat yang tidak stabil.– Teknik HPLC dapat dilakukan pada suhu kamar.

D. Kelebihan dan Kekurangan HPLC

• Kekurangan HPLC:– Larutan harus dicari fase diamnya terlebih dahulu.– Hanya bisa digunakan untuk asam organik.– Harus mengetahui kombinasi yang optimum antara pelarut, analit dan

gradient elusi.– Harganya mahal sehingga penggunaannya dalam lingkup penelitian

yang terbatas.– Sering ada larutan standar yang tertinggal di injektor.– Pada kolom dengan diameter rata-rata partikel fase diam dengan

ukuran 3 mikrometer dan 5 mikrometer sela-sela partikel lebih mudah tertutup oleh kotoran, jadi harus seringkali dicuci dan kemurnian larutan harus dijaga.

E. Aplikasi dan Kegunaan HPLC

• HPLC cocok digunakan untuk memisahkan minyak atsiri. Minyak atsiri terdiri atas campuran yang sangat rumit dan oleh karena itu HPLC berguna untuk memisahkan campuran rumit menjadi golongan-golongan senyawa atau memisahkan golongan senyawa menjadi komponen-komponennya.

• HPLC digunakan untuk memisahkan golongan minyak, misalnya terpenoid tinggi, segala senyawa jenis fenol, alkaloid, lipid dan gula.

• HPLC baik digunakan untuk senyawa yang dapat dideteksi di daerah spekrum UV atau spectrum sinar tampak.

E. Aplikasi dan Kegunaan HPLC

• Banyak digunakan pada industri farmasi dan pestisida.• Dapat memisahkan dan menganalisis vitamin-vitamin yang

larut dalam air.• Digunakan untuk menentukan berat molekul polimer dan

masalah-masalah biokimia.• Untuk analisis anion nitrat (NO3

-)

ReferensiAnonim. High Performance Liquid Chromatography (HPLC). Diakses di: http://

indonesiakimia.blogspot.com/2011/05/high-performance-liquid-chromatography.html pada tanggal 13 Mei 2013.

Anonim. Kelebihan dan Kekurangan HPLC. Diakses di: http://cha2in-chemistry09.blogspot.com/2011/05/kelebihan-dan-kekurangan-metode.html pada tanggal 13 Mei 2013.

Kealey, D. dan Haines, P. J. 2002. Instant Notes: Analytical Chemistry. New York: BIOS Scientific Publishers Limited.

Khopkar, S. M. 2010. Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta: UI-Press.Lindsay, S. 1992. High Performance Liquid Chrotomagraphy. New York: John Wiley &

Sons.Meyer, F. R. 2004. Practical High-Performance Liquid Chromatography. New York: John

Wiley & Sons.

ReferensiSettle, F. 1997. Handbook of Instrumental Techniques for Analytical Chemistry. New

Jersey: Prentice Hall PTR.Snyder, L. R. Kirkland, S. J. dan Glajch, J. L. 1997. Practical HPLC Method Development.

New York: John Wiley & Sons.Underwood, A.L dan R.A. Day Jr. 1986. Analisis Kimia Kuantitatif. Jakarta : Penerbit

Erlangga.Wikipedia. High-Performance Liquid Chromatography. Diakses di:

http://en.wikipedia.org/wiki/High-performance_liquid_chromatography pada tanggal 13 Mei 2013.