Upload
perrin
View
121
Download
5
Embed Size (px)
DESCRIPTION
Histologická technika. Princip barvení, druhy barviv. Základní a speciální barvicí metody. Identifikace barvicích metod na preparátech. Ústav histologie a embryologie MUDr. Blanka Zajícová Obecná histologie a obecná embryologie, kód B02241 8.10.2012. Barvení. - PowerPoint PPT Presentation
Citation preview
Histologická technika
Princip barvení, druhy barviv. Základní a speciální barvicí metody. Identifikace
barvicích metod na preparátech.
Ústav histologie a embryologieMUDr. Blanka Zajícová
Obecná histologie a obecná embryologie, kód B02241 8.10.2012
Barvení
Neobarvené řezy – nerozlišíme jednotlivé struktury, mají stejný index lomu (prohlížení jen s použitím speciálních optických zařízení – mikroskop s fázovým kontrastem)
Běžná světelná mikroskopie - založena na použití velké palety barvicích metod
Barviva jsou látky, které absorbují světlo určitých vlnových délek. To, co pak vnímáme jako barevný vjem, jsou neabsorbované vlnové délky.
Různé součásti buněk a tkání váží různá barviva – po obarvení se proto dají od sebe dobře odlišit
Barvení nefixovaných tkání:
Vitální: např. tuš, trypanová modř, lithiumkarmín, aplikace do krve či vaziva – vychytávání se sleduje na řezech. Fagocytární aktivita buněk.
Supravitální: např. Janusova zeleň – mitochondrie, methylenová modř – nervové bb.
Histologická barviva1. Zásaditá (bazická), také jádrová, barví bazofilní struktury (jaderný
chromatin, ribosomy), př.: hematoxylin, methylenová modř, toluidinová modř, thionin
2. Kyselá (acidická), také plasmatická, barví acidofilní struktury (cytoplasma, kolagenní vlákna), př.: eosin, světlá zeleň, anilinová modř, oranž G, ponceau, kyselý fuchsin
Bazofilie je vlastnost struktur barvit se bazickými barvivy.
Acidofilie (eosinofilie, oxyfilie) je vlastnost struktur barvit se kyselými barvivy.
Barviva podle původu:
Přírodní: hematoxylin, karmín, orcein, šafrán
Syntetická
Aby bylo dosaženo standardní kvality, jsou dnes i přírodní barviva většinou připravována uměle.
BarveníBarvení podle způsobu aplikace: Progresivní – tkáň se barví pod kontrolou zraku do určité intenzity zbarvení, pak se
proces přeruší Regresivní – tkáň se přebarví, přebytečné barvivo se z tkáně odstraní příslušným
roztokem pod kontrolou zraku (diferenciace) Sukcedánní – barvení řezu postupně v několika barvicích roztocích Simultánní – barvení řezu roztokem různých barviv současně In toto – barvení celého bloku tkáně
Barvení podle výsledků barvení:Ortochromatické – složky tkáně vykazují stejnou barvu jako užité barvivoMetachromatické – jednotlivé komponenty tkáně se obarví jedním barvivem v různě
barevných tónech (např. při průkazu hlenu v buňkách produkujících hlen barvíme toluidinovou modří – hlen je ale červenofialový), metachromatická barviva jsou např.: toluidinová modř, thionin, methylenová modř
Difúzní – barvicí roztok znázorní všechny složky tkáně ve stejném barevném tónu a ve stejné intenzitě
Elektivní – barvicí roztok obarví pouze jednu ze složek buněk či tkání nebo ji výrazně vyzvedá
Přehledné barvicí metodyObarví jádra a cytoplasmu rozdílným barevným tónem a zároveň
obarví i mezibuněčnou hmotu pojivové tkáně.Používá se jádrové a jedno nebo více kyselých barviv (použití více
kyselých barviv umožní barevné rozlišení vaziva a svaloviny).
1. Hematoxylin – eosinZákladní barvicí metoda barvení parafínových řezů
2. Massonovy trichromyPodle zbarvení vaziva:
a) žlutý b) zelený c) modrý
3. Weigert van Gieson4. AZAN
Příprava hematoxylinuHematoxylin je nažloutlý krystalický prášek – jeho roztok sám o sobě
nebarví.Nutná je oxidace v hematein (samovolně na vzduchu zraje měsíce,
urychluje se přidáním oxidačních činidel – jodičnan sodný).Hematein má slabou afinitu ke tkáním, musí se použít mořidlo (soli Al,
Fe)Barví barevný lak hemateinu Podle mořidla se rozeznávají různé druhy hematoxylinů:
Kamencové hematoxyliny (Harrisův, Mayerův): např. HE, žlutý trichrom, dobarvení jader u speciálních metod
Železité hematoxyliny Weigertův: zelený a modrý trichrom, Weigert van Gieson, Heidenhainův hematoxylin
Barvení hematoxylinem a eosinem, HE1. Odparafínování, deparafinaceXylen ve 2 lázních po 5´, alkohol v sestupné řadě (100%, 96%), voda
2. BarveníHematoxylin 3-10´, voda, regresivní barvení, diferencování v kyselém alkoholu (70% alkohol s HCl), vodaEosin 0,1-0,5% roztok 1-3´, voda, diferencování v 80% alkoholu
3. OdvodněníDvě lázně alkoholu 96%, fenolxylen 20-25%, 3´
4. Projasnění2 lázně xylenu po 5 min.
5. ZamontováníZamontování do montovacího média, sušení
Montovací média
Požadavky: bezbarvé, vysoký index lomu, nesmí odbarvovat, musí mít konzervační účinek
• rozpustná ve vodě: glycerin, glycerínová želatina
• nerozpustná ve vodě: kanadský balzám, epoxidová pryskyřice - Entelan
Pomocí montovacího média obarvený řez zamontujeme pod krycí sklo.
Hematoxylin-eosin (HE)
Hematoxylin barví bazofilní součásti buňky- jádro, ribosomy, GEREosin barví acidofilní struktury buňky – hlavně proteiny (cytoplasma, mitochondrie,
hladké ER)Výsledek barvení: jádra – modrá, modročerná, cytoplasma růžová, svalovina
červená, kolagenní vlákna růžová
jádra
vazivo
sval
HE, močový měchýř
svalovina
vazivo
epitel
vazivo
cévy
sval
Massonovy trichromyŽlutý Massonův trichrom (ŽT)Žlutý Massonův trichrom (ŽT): Barviva: Harrisův hematoxylin, eosin, šafrán
Výsledek barvení: jádra tmavě modrá, cytoplasma světle růžová, kolagenní vlákna žlutá, svalovina červená, erytrocyty červené
Modrý Massonův trichrom (MT)Modrý Massonův trichrom (MT): Barviva: hematoxylin (Weigertův), kyselý fuchsin-ponceau, anilínová modř
Výsledek barvení: jádra tmavě hnědá, cytoplasma světle růžová, kolagenní vlákna modrá, svalovina červená
Zelený Massonův trichrom (ZT)Zelený Massonův trichrom (ZT): Barviva: hematoxylin (Weigertův), ponceau–kyselý fuchsin–světlá zeleň, oranž G
Výsledek barvení: jádra tmavě hnědá, cytoplasma okrová, kolagenní vlákna zelená, svalovina červená, erytrocyty oranžové
Massonův žlutý trichrom, jícen
Mikrofotografie: prof. Martínek
epitel
kolag. vazivo
svalovina
žlázkyKolagenní vlákna se barví žlutě.
Massonův modrý trichrom, fundus žaludkusvalovina
kolag. vazivo
céva
epitel
Kolagenní vlákna se
barví modře.
Massonův zelený trichrom, larynx
epitel
Kolagenní vlákna se
barví zeleně.
žlázky
svalovina
kolag. vazivo
Hrot jazyka
Dřeň ledviny
Weigert van Gieson
Foto: doc. Z. Jirsová
Mikrofotografie: Kühnel, Pocket Atlas, 2003
Barviva: Weigertův železitý hematoxylin, pikrofuchsin
Výsledek bavení: jádra hnědočerně, fuchsin barví kolagenní vlákna červeně, kyselina pikrová cytoplasmu, svalovinu a erytrocyty žlutě
vazivosvalovina
AZAN, slinná žláza
Výsledek barvení:
Jádra karmínově červená, cytoplasma světle fialová, kolagenní vlákna blankytně modrá, svalovina červená, erytrocyty oranžovočervené
Barviva: azokarmín, anilínová modř, oranž G
jádravazivo
AZAN
svalovina
jádra
kolag. vazivo
Speciální barvicí metody - příklady• Cílené metody, které znázorní pouze určitý typ buněk nebo buněčný či
tkáňový detail• Cytologické metody: Heidenhainovo barvení• Barvení elastických vláken (elastinu): orcein, aldehyd-fuchsin,
resorcin-fuchsin• Průkaz retikulárních vláken: impregnace stříbrem, PAS reakce• Histochemické metody• Neurohistologické metody:
– Barevné: • průkaz Nisslovy substance (Nisslova metoda)• Průkaz myelinu: Weigertova metoda, luxolová modř
– Impregnační:• Znázornění neurofibril• Znázornění gliových buněk
Heidenhainův železitý hematoxylin, HHMitochondrie,
HHKosterní sval, HH
Barvení na elastiku, artérie
Membrana elastica interna
Elastická vlákna v medii
Membr. elastica externa
Retikulární vlákna, impregnace, játraTrámce hepatocytů
Retikulární vlákna
Portobiliární prostor