Upload
liska-ramdanawati
View
88
Download
7
Tags:
Embed Size (px)
DESCRIPTION
HPLC Basic Theory
Citation preview
PT DITEK JAYA SHIMADZU
Macam-macam HPLC
• fase normal
• fase terbalik
• fase terbalik + pasangan ion
• penukar ion
• SEC ( GPC / GFC )
PT DITEK JAYA SHIMADZU
Fase Normal
Petroleum etherPetroleum ether
CaCOCaCO33
Chlorophyll'sChlorophyll's
ChromatoChromatograph
ColorColor
PT DITEK JAYA SHIMADZU
Fase Normal
• Kromatografi pertama
– kolom pemisahan: CaCO3
– fase gerak : Petroleum ether
• Kombinasi ini dikenal
fasefase normalnormalKolomKolom :: polar propertypolar property
Fase gerakFase gerak : : non polar propertynon polar property
PT DITEK JAYA SHIMADZU
Kolom HPLC fase normal
• Silica gel : pemakaian umum
• Cyano : pemakaian umum
• Amino : analisa gula
• Diol : analisa protein
Silica gel
Si
Si
-Si-CH2CH2CH2CN
-Si-CH2CH2CH2NH2
-Si-CH2CH2CH2OCH(OH)-CH2(OH)
Modifikasi Si
PT DITEK JAYA SHIMADZU
Interaksi?
Silica gel (polar)
Ikatan hidrogenIkatan hidrogenNon-polar
PT DITEK JAYA SHIMADZU
Ikatan Hidrogen
• Jika sampel memiliki gugus– -COOH : gugus karboksil
– -NH2 : gugus amino
– -OH : gugus hidroksil
Ikatan Hidrogen menjadi lebih kuatIkatan Hidrogen menjadi lebih kuat..
• Jika sampel memiliki gugus yang besar,
karena hambatankarena hambatan stereo (stereo (ruangruang))
Ikatan Hidrogen menjadi lebih lemahIkatan Hidrogen menjadi lebih lemah..
PT DITEK JAYA SHIMADZU
Waktu retensi dan Ikatan Hidrogen
OH
HO
SiOH
SiOH
kuatkuat
lemahlemah
PT DITEK JAYA SHIMADZU
Peningkatan polaritas solven
0 % 2 % 5% /0 % 2 % 5% / MeOH MeOH
1 : Dioctyl phthalate
2 : Dibutyl phthalate
3 : Diethyl phthalate
4 : Dimethyl phthalate Solven : Hexane
PT DITEK JAYA SHIMADZU
HPLC fase Terbalik
• C18 (ODS)
• C8 (octyl)
• C4 (butyl)
• Phenyl
• TMS
• Cyano
-Si-C18H35
Si
SolvenSolven : : Polar propertyPolar propertyair / metanol / asetonitril
KolomKolom : : Non polar propertyNon polar property
PT DITEK JAYA SHIMADZU
Bagaimana interaksi?
InteraksiInteraksi
hidrofobikhidrofobik
Non-polar
Solven polar
PT DITEK JAYA SHIMADZU
Hidrofobisitas
• Jika sampel memiliki
– CH3CH2CH2--- : rantai karbon
– : gugus aromatis
• Jika sampel memiliki
– -COOH : gugus karboksil
– -NH2 : gugus amino
– -OH : gugus hidroksil
HidrofobisitasHidrofobisitas
Jadi lebih kuatJadi lebih kuat..
Hidrofobisitas Hidrofobisitas
jadi lebih lemahjadi lebih lemah..
PT DITEK JAYA SHIMADZU
Waktu retensi dan Hidrofobisitas
OH
OH
C18 (ODS)
kuat
lemah
PT DITEK JAYA SHIMADZU
Peningkatan polaritas solven
20 % 30 % 40% / H2O20 % 30 % 40% / H2O
1 : p-Hydoxymethylbenzoate
2 : p-Hydoxyethylbenzoate
3 : p-Hydoxypropylbenzoate
4 : p-Hydoxybutylbenzoatesolven : MeOH
PT DITEK JAYA SHIMADZU
Pengaruh fase diam
C18 (ODS)
kuat
C8
sampel
sampel
sampel
C4
Medium
lemah
PT DITEK JAYA SHIMADZU
Pengaruh fase diam
� Kondisi analisa
� Kolom : Shim-pack CLC-ODS
� Fase gerak : MeOH : H2O = 7 :3
� Kec. alir : 1.0 mL/min
� Temperatur : 40 C
� Vol. suntik : 10 uL
� Deteksi : UV-254 nm
� Puncak
1. Methyl benzoate
2. Ethyl benzoate
3. n-Propyl benzoate
4. n- Butyl benzoate
ODS C8 TMS ODS C8 TMS
PT DITEK JAYA SHIMADZU
Fase Normal vs Terbalik
Parameter Normal Phase Reverse Phase
Polarity of Column High Low
Polarity of Solvent Low High
Elution Sequence Low Polarity First High Polarity First
Increase Solvent Polarity Faster Elution Slower Elution
PT DITEK JAYA SHIMADZU
Kromatografi Fase Terbalik dengan pasangan ion
Ion-Pair Reagent
PT DITEK JAYA SHIMADZU
Reagen Ion-Pair
• Anion
– Tetra-n-butylammonium hydroxide (TBA)
• Cation
– Butanesulfonic acid sodium salt (C4)
– Pentanesulfonic acid sodium salt (C5)
– Hexanesulfonic acid sodium salt (C6)
– Heptanesulfonic acid sodium salt (C7)
– Octanesulfonic acid sodium salt (C8)
– Decanesulfonic acid sodium salt (C10)
PT DITEK JAYA SHIMADZU
Ion PairingSeparation of Carboxylic Acids
Column: Bonded C18
Mobile Phase: H2O/MeOH
1:1 with Tetrabutyl-
Ammonium Hydroxide
PT DITEK JAYA SHIMADZU
Ion-pair Hal yang penting diperhatikan
• Tipe reagen Ion-Pair
• Konsentrasi reagen Ion-Pair
• pH solven
R-COOH RCOO- + H+
(pKa=4.5)
R-NH2 + H+ R-NH3+
(pKa=6.0)
PT DITEK JAYA SHIMADZU
Tipe reagen ion-pair
Mobile Phase: H2O/MeOH
1:1,with 0.005M ion pairing
reagent and 1% HOAc
1 Maleic Acid
2 Phenylephrine
3 Phenylpropanolamine
4 Naphazoline
5 Phenacetin
6 Pyrilamine
Hexane Sulfonate Pentane Sulfonate
PT DITEK JAYA SHIMADZU
Konsentrasi reagen ion-pair
PT DITEK JAYA SHIMADZU
Penukar ion
N+R
R
R
Sampel
SO3- Sampel
+
++
++
++
+
++++
+
Kekuatan antar ion
PT DITEK JAYA SHIMADZU
Penukar ion
• Lingkungan biologi
(protein, peptide, amino acid analysis)
• Kromatografi ion
– Penukar kation
• Strong Cation Exchange (SCX) (R-SO3-)
• Week Cation Exchange (WCX) (R-COO-)
– Penukar anion• Strong Anion Exchange (SAX) (R4N
+)
• Week Anion Exchange (WAX) (DEAE)
PT DITEK JAYA SHIMADZU
Hal yang perlu diperhatikanpada Kromatografi Penukar ion
• pH larutan dapar
• Konsentrasi larutan dapar
• Metoda elusi
– Elusi Isokratik
– Elusi gradien pH
– Elusi gradien peningkatan kekuatan ionik
PT DITEK JAYA SHIMADZU
Apakah SEC ?
•• Size Exclusion Chromatography Size Exclusion Chromatography
(SEC)(SEC)
– GPC (Gel Permeation Chromatography)
• terutama untuk lingkungan polimer
– GFC (Gel Filtration Chromatography)
• terutama untuk lingkungan biologi
PT DITEK JAYA SHIMADZU
Prinsip SEC
•• Tidak ada kekuatan interaksiTidak ada kekuatan interaksi
•• Perbedaan waktu tempuhPerbedaan waktu tempuh
PT DITEK JAYA SHIMADZU
Hubungan antara MW dan RT
Berat molekul(LogMW)
Kolom
GPC
Batas eksklusi
Batas permeasi
Waktu