Hvordan kan modifisering av histoner påvirke kromatin?

• Tradisjonell forklaring: Modifisering vil påvirke histonenes ladning, noe som igjen vil kunne gi en endret nukleosomstruktur og endrede egenskaper

• Nyere forklaring: Modifiserte aminosyrerester i histonene utgjør bindingsseter for andre proteiner som så avgjør kromatinets videre skjebne

Histoner og histongener

• Pattedyr har 10-20 kopier av hvert histongen, Drosophila rundt 100

• Sære gener, vanligvis uten introner

• Ingen polyadenylering av histon-mRNA

• Histonene kan foreligge i flere varianter i en organisme

Den repeterende enhet i histongen-clusteret hos en rekke organismer

Pag

e 14

41

Halene på histonene modifiseres som signaler til transkripsjon

Acetylation

Methylation

Phosphorylation

Ubiquitination

ADP-ribosylation

Aktivt og inaktivt kromatinActively transcribed chromatin

•is euchromatic, •has particular histone amino groups acetylated, •is less methylated than inactive chromatin, and •has sites that are hypersensitive to DNase I digestion.

Inactive chromatin associated with: •a morphologically condensed state (heterochromatin) •deacetylated, methylated histones, •methylated DNA, •resistance to DNase I.

Histonhalemodifikasjoner i eukromatin og heterokromatin

Histonmodifisering, enzymer, gjenkjenningsdomener

Modifi-sering

Aa Påsetter-enzym

Avtager-enzym

Gjenkjenner-domene

Ac Lys HAT HDAC Bromo

Me Lys (1-3)

Arg (1-2)

HMT HDM??? Chromo

P SerThr

Kinaser Protein fosfataser

?

Ubi Lys Ubi ligaser DeUbi ?

SUMO ? SUMO ligaser

DeSUMO ?

ADPR Arg, Asp, Ser, Thr

PARP PAR glyko-hydrolase

?

Kombinasjoner av modifikasjoner forbundet med aktivt og inaktivt kromatin

Synergistiske og antagonistiske modifikasjoner i halen av H3 og H4

”Skriving” og ”lesing” av histonmodifikasjoner

Hvordan histonkoden oversettes

Gene silencing

Genaktivering

Proteolytisk modell for fjerning av stabil metylering fra histon H3

K9-metylering av histon H3 og HP1-protein i heterokromatin

Telomerer, heterokromatin og eukromatin

MeCP2 – et protein som bindes til metylert

DNA• Bindes spesifikt til metylert

DNA via et metyl-CpG-bindende domene

• Rekrutterer transkripsjonsrepresjonskom-plekset mSin3A/HDAC

• Kan ”invadere” kromatin på en metyleringsavhengig måte og forskyve histon H1 fra kromatin in vitro

• Mutasjoner i mSin3A kan føre til Retts syndrom, en nevrologisk sykdom som stort sett rammer jenter

Symptoms:Girls with Rett Syndrome appear to develop normally until 6 to 18 months of age. They then enter a period of regression, losing speech and hand skills they had acquired. Most girls develop seizures, repetitive hand movements, irregular breathing and motor-control problems. A slowing of the rate of head growth may also become apparent. The girls can live to adulthood, but most never regain the

ability to use their hands or to speak.

RNA interference

Animation

Dicer og RISC

Modell for hvordan RNAi virker

Kobling transkripsjon-translasjon

• Koblet translasjon /transkripsjon i prokaryoter

• Adskilt i eukaryoter

Tre typer endringer

• Spalting, fjerning av sekvenser – Ekso- eller endo-nukleolytisk spalting– Spleising

• Påsetting av nukleotid(er)– 5´-ende og 3´-ende

• Modifikasjon av spesifikke nukleotider

Tre grupper RNA å modifisere

• Pre-mRNA– Påsetting– Spleising

• Ribosomal RNA– Spalting – Påsetting

• tRNA– Spalting– Modifikasjon

Pre-mRNA prosessering

Prokaryoter: primær transkript = mRNA

Eukaryoter: transkripsjon/ translasjon adskilt, mRNA modifisert i kjernen før translasjon i cytosol

Transkripsjon - prosessering

capAAAAAAAAAAAAA

Pre-mRNA(hnRNA)

mRNA

Koblede prosesser

Påsetting i 5´-ende:capping

• Cap: 3 modifikasjoner– 7-Me-guanosin koblet til 5´-

ende• Kobling via 5´-5´trifosfatbro

• Skjer kotranskripsjonelt

– O2´-metylering av ribose• Cap2, Cap1 (multicellulær), Cap0

(unicellulær)

– N6-metylering av adeninCap-2

Cap-1

Enzymer som deltar

• Capping skjer når RNA bare er 25-30 baser langt - altså kotranskripsjonelt– cap bindes til et ”Cap binding complex” CBC– CBC stimulerer spleising og 3´-endeprosessering

• 3 enzymer deltar– 1.Trifosfatase fjerner et fosfat– 2. Guanylyl transferase kobler på GMP – 3. 7-metyltransferase modifiserer terminalt guanosin

• Fosforylert CTD rekrutterer capping enzym

Modifisering av 3´- ende:poly-adenylering

• Definert 3´-ende dannes ikke via terminering, men via prosessering– Pre-mRNA heterogene 3´-ende,

– mRNA veldefinert 3´-ende

• Poly(A) haler påsettes i 3´-ende– 20-50x A-strekk i en egen prosess

• dvs poly(A) ikke genkodet

capAAAAAAAAAAAAA

Trimming av 3´-ende

capAAAAAAAAAAAAA

Upresisterminering

cap

Presis ende viaSpalting og polyadenylering

0 0

Poly-adenylering - to-trinns prosess

• Spalting 15-25 nedenfor AAUAAA– Innen 50 nt før et mindre konservert (G)U-rikt område

• Poly(A) hale lages av poly(A) polymerase• Koblet:

– AAUAAA binder CPSF• Cleavage and polyadenylation specificity factor

– Bundet CPSF stimulerer poly(A) polymerase

Kotranskripsjonellprosessering

Prosessering i 3´-ende:Kotranskripsjonelle prosesser

• Når RNAPII nærmer seg 3´-enden av transkriptet, skjer flere koblede prosesser– Spleising av terminalt intron– spalting ved poly(A)-setet, – påkobling av poly(A)-hale, – terminering nedstrøms for poly(A)-setet og frigjøring

av RNAPII

• Disse prosesser avhenger av CTD– ”Cleavage-polyadenylation specificity factor” CPSF

og ”cleavage stimulation factor” CstF binder spesifikt til CTD og finnes assosiert med holoRNAPII.

Hvorfor poly(A)?Klippekort-hypotesen• Poly(A) beskytter

mRNA mot degradering i cytosol

• Poly(A) bindes til PABP

• Poly(A) forkortes ettersom mRNA translateres

capAAAAAAAAAAAAA

capAAAAAAAAAA

capAAAAAAA

capAAAA

capA

ustabil

PABP

Spleising• Kodende sekvens er i

eukaryoter oftest stykket opp – avbrutt av ikke-kodende

regioner

• Heterogent nukleært RNA– hnRNA 2 - 20 kb

– Større enn proteinet skulle tilsi

– Rask turnover

• 1977: pre-mRNA har introns– Som blir fjernet ved spleising

Eksempel: ovalbumin• Presisjon - leseramme beholdes• Rekkefølge av eksoner beholdes• Introner er som oftest større enn eksoner

Et typisk humant gen

Sekvenssignaler som definerer introner

• Invariant GU i 5´-spleisesete (5´ss)

• Invariant AG i 3´- spleisesete (3´ss)

• Forgreningspunktsekvens (BPS)

• Polypyrimidinstrekk (Py tract)

Poly-Y tract

Likevel så degenerert at dataprogram bare klarer 50% treff i prediksjon

Mekanisme:via 2 trans-forestringer• Trinn 1 - dannelse

av lassostruktur (lariat)– Ekson-intron (5´)-

brudd og ekson release

– Bro 2´-5´-fosfodiester

– A i forgrening:

– CURAY konsensus

– 20-50 foran 3´-spleisesete

2´-5´-fosfodiesterforgrening

Mekanisme:via 2 trans-forestringer

• Trinn 2 - fusjon av eksoner– Fri 3´-OH fra

ekson N danner fosfodiester binding med 5´-fosfat i ekson (N+1)

– Avspaltet lariat-intron blir raskt degradert

• Uten tilførsel av fri energi

”Snurps”Hvert signal binder en snRNP

• Small nuclear RNA– snRNAs binder protein– og danner:

• Small nuclear ribonucleoproteins• Disse gjenkjenner ulike splice-

signaler, noen via base-paring

Spleisosomet utfører spleising

• Spleisosomet = 5 snRNP + proteiner = 50-60S– U1, U2, U4, U5 og U6 snRNP– Mange andre non-snRNP proteiner

• Trinnvis assembly– 5´ss bindes av U1 snRNP (E kompleks)– Poly-Y + 3´ss bindes av U2AF– Forgrenings-A bindes av U2 snRNP

• ATP-avhengig trinn

– U4/U6-U5 tri-snRNP assosieres og et kompetent spleisekompleks dannes

Bro-dannelse: over ekson og over intron

• SR-proteiner deltar

Fortsatt mye ukjent

Hvorfor spleising?

• Genetiske fossiler eller …

• ….nyttig mekanisme?

Nytte:Alternativ spleising• En måte å øke proteindiversitet

uten å øke antall gener– Drosophila Dscam-genet genererer 38016 isoformer

– 576 alternativt spleisede former av K+-kanal i fugleøre-reseptorer (rolle i gjenkjenning av lydfrekvenser)

• Genomsammenligning– Humane genom bare 30-40 000 gener

– Mer alternative spleising enn i lavere organismer• 3.2 alternative spleiseformer pr humant gen

• 1.34 alternative former pr gen i C.elegans

Eksempel: -tropomyosin

• 7 Celletypespesifikke varianter

Mange måter å variere på• Alternative 5´-spleiseseter

(a)• Alternative 3´- spleiseseter

(b)• Ekson skipping/inklusjon (c)• Alternativ eksonbruk (d)• Intronretensjon (e)

Alternative initieringsseter(alternative 1. eksoner)

• Alternative 1. eksoner ≈ alternative promotere– Benyttes hvor separat regulering/nivå er nødvendig -amylase

Sykdommer pga spleising

• Mange genetiske sykdommer skyldes feil spleising– 15% av genetiske sykdommer er forårsaket av

mutasjoner som ødelegger funksjonelle splicingsseter eller genererer falske nye

Eksoner ≈ proteindomener ?

• W.Gilbert: eksoner tilsvarer primitive protein-domener som større proteiner er satt sammen av– Eks. Pyruvat kinase

Evolusjonshypoteser: ”Intron early” eller ”Intron late”

• Intron early– Var der tidlig og er forsvunnet i prokaryoter

• Intron late– Intron er blitt satt inn i intron-frie ORFs

Prosessering av ribosomal RNA

E.coli pre-rRNA-prosessering

• Endo- og eksonukleaser

RNaser

• Endonukleaser: RNase III, RNase P, RNase E og F– Spalting i baseparede stems

• Eksonukleaser: M16, M23 og M5 trimmer ferdig

rRNA er metylert

• N6,N6-dimetyl-adenin– Funksjon ukjent

• O2´-metylribose– Beskytter mot

nukleaser som benytter 2´-OH

N(CH3)2

Eukaryot rRNA-prosessering ligner den hos prokaryoter

• Små nukleolære RNA (snoRNA) deltar

Prosessering og oppbygging av ribosomer

Prosessering av tRNA

tRNA - kløverblad-struktur

• Mange baser er modifisert

• Antikodon• 3´-CCA

– Kodet hos prokaryoter

– Appended hos eukaryoter via en tRNA nukleotidyltransferase

Modifiserte nukleosider i tRNA

Spleising av tRNA-introner

• Noen eukaryote tRNA har mini-intron ved siden av antikodon

tRNA trimmes i 5´-ende av et ribozym: RNase P

• Rnase P = 377 nt RNA + 14 kD protein– RNA katalytisk

– Protein (basisk) reduserer elektrostatisk frastøtning mellom ribozym og substrat