Upload
doancong
View
225
Download
1
Embed Size (px)
Citation preview
Hva bør man tenke på ved valg av kromatografi som analysemetodikk
Ingeborg Amundsen
4. februar 2015
Agenda
• Kromatografiske metoder
• Ny analysemetode- viktige spørsmål
• Screening/bekreftelse
• Ny analysemetode-hvor starter vi
• Metodevalidering
Kromatografi- en svært anvendelig analyse metodikk
• Miljøgifter (mat og luft)
• Oljer, gasser og aromastoffer
• Proteiner og aminosyrer
• Gener
• Vitaminer og hormoner
• Legemidler og narkotiske stoffer
Kromatografiske metoder
• Kromatografisk separasjon
– Gasskromatografi
– Væskekromatografi
• Spesifikk detektor
– Massespektrometri
Prinsipp for Kromatografi (separasjon av stoffer) Eksempel: Væskeromatografi (LC) Mobil fase: Væske (ofte blanding av flere) Stasjonær fase: Kolonne pakket med små partikler <2µm
A B
Buffer Organisk løsningsmiddel (metanol)
Kolonne (5-10 cm)
Ectasy Amfetamin Morfin
Opprenset prøve injiseres med sprøyte i systemet
og føres med væskestrømmen gjennom kolonna
Kromatografi;
Separerer stoffer fra hverandre ved at de vandrer med forskjellig hastighet i et system med en mobil- og en stasjonær fase
Prinsipp for Massespektrometri (MS)
• Danner og analyserer ioner
• Stoffet ioniseres og spaltes (fragmenterer)
• Analyserer i vakuum (gassfase)
• Måler masse over ladning, m/z
Svært spesifikk teknikk
Vi veier ioner! Derav navnet massespektrometri
Ny analysemetode –
Viktige spørsmål • Hvor mange komponenter skal være med i
metoden
• Kvalitativ/kvantitativ
• Hva skal prøveresultatene brukes til
• Hvor mange prøver skal analyseres
• Hva slags prøvemateriale
• Hvor mye prøvemateriale
Viktige spørsmål forts.
• Skal metoden brukes til rutinedrift
• Skal metoden publiseres
• Hva er publisert tidligere
• Analyttenes egenskaper: pKa verdi, polaritet, LogP verdi
• Tilgjengelige instrumenter
• Høydoserte/lavdoserte stoffer
Hva er viktigst
• Lav deteksjonsgrense
• Pålitelige resultater
• God separasjon
• Rene prøveekstrakter
• Rask kromatografi
• Lite løsemiddelforbruk
• Lite forbruk av matriks
• Ergonomi
IS-13
• Prøveresultatet benyttes kun til behandling og diagnostikk
• Medisinske analyser
• Analysen trenger ikke å være spesifikk
• En screeninganalyse
– Positiv prøve – 1 metode og 1 uttak
Screening metode
• Positive/negative prøver
• Prøveopparbeidelse som tar høyde for at alle komponenter ekstraheres
• UPLC-MS/MS: Benytter 1 MRM overgang for stoffene
• Mest fokus rund påvisningsgrensen
IS-14
• Prøveresultatet kan danne grunnlag for alvorlige sanksjoner
• Rettstoksikologiske analyser
• Et positivt resultat skal alltid bekreftes med nytt uttak fra prøven med en spesifikk teknikk
– Positiv prøve – 2 metoder og 2 uttak
Mottak Registrering
Screening Bekreftelse Vurdering
påvist stoff(er)
Ikke påvist Ikke påvist
negativ negativ
pos pos
Bekreftelsesmetode
• Ønsker metoder for komponenter med noenlunde samme kjemiske egenskaper
• Spesifikk prøveopparbeidelse
• Separasjonsprinsippet i UPLC forskjellig fra screeningen
• 2 MRM overganger
• Konsentrasjonsområde for komponentene
Eksempler på komponenter som kan ekstraheres sammen
Mianserin pKa 8,3
MW 264,16
C18H20N2
Mirtazapin pKa 7,1
MW 265,16
C17H19N3
Nortriptylin pKa 9,9
MW 263,17
C19H21N
Paroxetin pKa 9,9
MW 329,14
C19H20FNO3
Trimipramin pKa 9,8
MW 294,21
C20H26N2
Sertralin pKa 9,48
MW 305,07
C17H17Cl2N
Oppstart analysemetode UPLC-MS/MS
• Finne MRM-overganger til komponentene
NH
m/z 208 Mianserin m/z 265
Mirtazapin m/z 266
NH N
m/z 195
Oppstart analysemetode UPLC-MS/MS
• Finne MRM-overganger til komponentene
• Finne aktuelle internstandarder
Intern standard
• Et kjemisk stoff som tilsettes i en konstant mengde til prøver, de blanke kontroller og kalibreringsstandarder
• Korrigerer for tap av analytt under prøveopparbeidelse
• Korrigerer for matrikseffekter
• Gjerne deuteriummerket analytt
Oppstart analysemetode UPLC-MS/MS
• Finne MRM-overganger til komponentene
• Finne aktuelle internstandarder
• Teste ulike kolonner og mobilfaser
TIC for BEH Fenyl kolonne med mobilfase bestående av 5 mM ammoniumbikarbonatbuffer pH 8 og MeOH
TIC for BEH C18 kolonne med mobilfase bestående av 5 mM ammoniumacetatbuffer pH 5 og ACN
TIC for BEH C18 kolonne med mobilfase bestående av 5 mM ammoniumbikarbonatbuffer pH 10,2 og MeOH
TIC for BEH C18 kolonne med mobilfase bestående av 5 mM ammoniumbikarbonatbuffer pH 10,2 og ACN
Sammenligning av retensjonsrekkefølge med ulike separasjonssystemer
Oppstart analysemetode UPLC-MS/MS
• Finne MRM-overganger til komponentene
• Finne aktuelle internstandarder
• Teste ulike kolonner og mobilfaser.
• Prøveopparbeidelse
Prøveopparbeidelse
“Opparbeidelses teknikk avhenger mye av matriks” BLOD (utfordring: fosfolipider, ioneundertrykkelse) - SPE, LLE, ACN-felling + fosfolipid-removal kolonne (96 format) URIN (utfordring: salter, overdrag, ioneundertrykkelse) - SPE, LLE, Fortynning (96 format), Fortynning + filtrering (96 format) SPYTT (utfordring: prøvetakingsbuffer + diverse tilsetningstoffer, overdrag, ioneundertrykkelse) - LLE LLE = væske-væske ekstraksjon, SPE = fast fase ekstraksjon
Sammenligning av EtG respons i blod med ulike filtreringsplater og utfellingsreagenser
0
5000
10000
15000
20000
25000
ACN (EtG)
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
18000
20000
ACN:MeOH(85:15) (EtG)
Oppstart analysemetode UPLC-MS/MS
• Finne MRM-overganger til komponentene
• Finne aktuelle internstandarder
• Teste ulike kolonner og mobilfaser.
• Prøveopparbeidelse
• Validering av metoden!
Metodevalidering
• Robusthetstesting og retensjonstids stabilitet
1
1,2
1,4
1,6
1,8
2
2,2
2,4
2,6
pH 10ionestyrke
2,5 mM
pH 10,4ionestyrke
2,5 mM
pH 10ionestyrke
7,5 mM
pH 10,4ionestyrke
7,5 mM
pH 10,2ionestyrke
5,0 mM
9-OH Risperidon
Risperidon
Propranolol
Klozapin
Hydroxyzin
Aripiprazol
Metodevalidering
• Standardkurve, lineært konsentrasjonsområde Klonazepam Diazepam
Metodevalidering
• Matrikseffekter: Forhold i prøven som gjør at MS-responsen for en spesiell analytt forandres fordi en matriks er tilstede
• Exogene stoffer(andre legemidler/narkotika)
• Endogene stoffer (proteiner, lipider, karbohydrater og salter)
• MS-responsen kan forsterkes eller undertrykkes
Ioneundertrykking
0,211 0,266 0,369
Fosfolipider
• Felling kontra LLE
90 % MeOH 98 % MeOH
5 % MeOH
Fosfolipid bakgrunn v/ PPT
Fosfolipid bakgrunn v/ LLE
Fosfolipider- ulike fosfolipidfjerningsplater
Metodevalidering
• MDK= minste detekterbare konsentrasjon
• MKK= minste kvantifiserbare konsentrasjon
• Metodens presisjon og nøyaktighet
• Metodens reproduserbarhet og nøyaktighet
Metodevalidering
• Spesifisitet:
Metodens evne til å bestemme analytten nøyaktig i nærvær av andre komponenter i prøven
• Prøveopparbeidelsen, kromatografisk separasjon og valg av detektor har betydning for metodens spesifisitet
NH
O OHOCH3
N
OH OHO
CH3
N
OH OO
CH3
Hydromorfon C17H19NO3 MV= 285,34
Norkodein C17H19NO3 MV= 285,34
Morfin C17H19NO3 MV= 285,34
God Spesifisitet
NH
O OHOCH3
N
OH OHO
CH3
N
OH OO
CH3
MS/MS
m/z100 120 140 160 180 200 220 240 260
%
0
100
268
121
105 118
225181165
137
132
155153
141
175
215
193
187
209
207 219 243236
226
253
257269
Norkodein
m/z100 120 140 160 180 200 220 240 260
%
0
100185
157
153128
123100 145129
183
171
165
161
227
199
187
211
201 225
229
243
240 268258255
271
Hydromorfon
m/z100 120 140 160 180 200 220 240 260
%
0
100
201
183165
155
145
123121
107141131
157
161
173
181
185
193
229211
209
227219
268
237 239255
269
Morfin
UPLC
Metodevalidering
• Ekstraksjonsutbytte:
Hvor mye av analytten går over fra matriks til organisk løsningsmiddel under ekstraksjonen
Metodevalidering
• Holdbarhet: • Standard- og kontroll-løsningene
• Stoffene i matriks før ekstraksjon
• Ekstrakter etter ekstraksjon
Metodevalidering
• Sammenligne resultater • Screening/bekreftelse
• Gammel bekreftelse/ny bekreftelse
Ulik reløsning-ulik respons
1) 10% ACN og 90% 5 mM ammoniumbikarbonatbuffer pH 10,2 2) 30% ACN og 70% 5 mM ammoniumbikarbonatbuffer pH 10,2 3) 25% ACN og 75% 5 mM ammoniumacatatbuffer pH 5.
Sammenligning ny og gammel metode
(EtG)
«Krav» til positiv prøve
• Over påvisningsgrensen (cut-off)
• Riktig retensjonstid/relativ retensjonstid
• OK internstandard (høyde, retensjonstid)
• Krav til ioneratio (MS)
Kromatografiske metoder
Ulemper:
• Vi finner kun de stoffene som er inkludert i metoden (MRM-metoder)
• Til dels arbeidskrevende og dyr instrumentering
Fordeler:
• Sikrere identifikasjon siden denne gjøres på stoffnivå med krav til retensjonstid, ioneratio og intern standard
• Kvantitativ, kan si noe om påvirkning
• Kan raskt ta inn nye stoffer i metoden
Analytiske utfordringer
• Nye stoffer – mangler renstoff
• Lave konsentrasjoner
• Veldig like stoffer
– Tilstrekkelig separasjon
– Isobare stoffer
JWH-073, MW 327,42 JWH-015, MW 327,42
Oppsummering
• Kromatografiske metoder
– Sikker identifikasjon av stoff
– Kvantitativ
– Ser kun etter de stoff som er lagt inn i metoden
• Metodevalidering
– Grundig, for å vite at du har en robust analysemetode som du kjenner svakhetene til!