Ibridazione degli acidi

nucleici L’ibridazione consiste nel porre a contatto acidi nucleici a singolo

filamento provenienti da fonti diverse:

Sonda – di solito una popolazione omogenea di molecole note.

Bersaglio – di solito una miscela complessa ed eterogenea di acidi nucleici.

Se sonda e bersaglio sono molecole a doppio filamento è necessario provvedere alla loro denaturazione mediante trattamento termico o alcalino.

I parametri che determinano la temperatura di fusione (Melting) della doppia elica, cioè il passaggio da una struttura a doppia elica a quella a singolo filamento sono:

Lunghezza del filamento.

Composizione di basi (%GC).

Ambiente chimico – cationi ionici monovalenti (Na+) stabilizzano la doppia elica mentre denaturanti chimici (formammide, urea) la destabilizzano.

Il DNA genomico di mammifero (GC circa 40%) si denatura a Tm 87°C.

Come favorire la formazione di

heteroduplex sonda-bersaglio

La cinetica di riassociazione descrive la velocità con cui una sequenza a singolo filamento è capace di trovare il filamento complementare.

Concentrazione di partenza della specifica sequenza (Co).

Durata della reazione in secondi (T).

CoT è un unità che utilmente descrive la reazione d’ibridazione

I parametri che entrano i gioco sono:

Temperatura (in genere Tm della sonda – 20°C)

Forza ionica del mezzo (concentrazione salina)

Presenza di agenti chimici denaturanti

Variando opportunamente i diversi parametri è possibile modificare la stringenza delle condizioni d’ibridazione.

Normalmente l’acido nucleico bersaglio è presente in largo eccesso rispetto alla sonda.

Standard assays Labeled probe in solution Unlabeled target bound to solid support

Dot-blot (Figure 5.11)Any labeled DNA or RNA but often an

oligonucleotide

Complex DNA or RNA population; not size-fractionated,

but spotted directly onto membrane

Southern blot (Figures

5.12, 5.16)Any

Often complex genomic DNA (but may be individual DNA

clones); digested with restriction nuclease and size

fractionated, then transferred to membrane

Northern blot (Figure

5.13)Any

Complex RNA population (e.g. total cellular RNA or poly

A+ RNA) which has been size-fractionated, then

transferred to membrane

Chromosome in situ

hybridization (Section

5.3.4; Figure 10.5)

Usually a labeled genomic cloneDNA within chromosomes (often metaphase) of lysed

cells on a microscope slide

Tissue in situ

hybridization (Figure

5.17)

Usually a labeled antisense riboprobe

or oligonucleotide

RNA within cells of fixed tissue sections on a microscope

slide

Colony blot (Figure

5.18)Any

Cell colonies separated after plating out on agar then

transferred to membrane

Plaque lift (Section

5.4.1)Any

Phage-infected bacterial colonies separated after plating

out on agar and transferred to membrane

Gridded clone

hybridization assay

(Figure 5.19)

AnyClones robotically spotted onto membrane in geometric

arrays

Reverse assays Labeled target in solution Unlabeled probes bound to solid support

Reverse dot-blot Complex DNA Oligonucleotides spotted onto membrane

DNA microarray

(Figures 5.20A and

20.6A)

Complex DNA DNA clones robotically spotted onto microscope slide

Oligonucleotide

microarray (Figures

5.20B and 20.6B)

Complex DNA Oligonucleotides synthesized on glass

Saggi d’ibridazione degli

acidi nucleici

Dot Blot con sonde ASO (Allele

Specific Oligonucleotide)

Southern Blot

Southern blot per identificare

mutazioni che modificano un

sito per un enzima di restrizione

ZOO Blot

Northern Blot

Ibridazione in situ dei

cromosomi (FISH)

Una sonda opportunamente marcata, in genere con un fluoroforo, può essere utilizzata per ibridare direttamente i cromosomi.

Si utilizzano linee cellulari linfoblastoidi ottenute da sangue periferico o altri tipi cellulari (amniociti in diagnosi prenatale).

Le cellule sono bloccate in metafase mediante trattamento con colchicina.

Il trattamento con RNasi e proteinchinasi K consente di ottenere DNA cromosomico parzialmente purificato, denaturato poi con formammide.

Il vetrino è poi ibridato con la sonda specifica, lavato nelle opportune condizioni di stringenza e analizzato al microscopio.

Parziale trisomia del Chr 2

A. Cariotipo con tecnica

classica

B. M-FISH

C. Rx-FISH

Ibridazione in situ dei tessuti

Una sonda opportunamente marcata, in genere una sonda a RNA (ribosonda), può essere utilizzata per ibridare direttamente sezioni di tessuti od organi al fine di valutare l’espressione di un determinato gene.

La sonda deve essere complementare all’mRNA, si utilizza quindi una sonda antisenso.

In genere la sonda senso viene comunque utilizzata come controllo negativo (non dà segnale d’ibridazione).

Le sezioni di tessuto sono opportunamente trattate per stabilizzare l’mRNA e denaturarlo.

Il vetrino è poi ibridato con la sonda specifica, lavato nelle opportune condizioni di stringenza e analizzato al microscopio.

Embrione di topo (13d)

Sonda b-miosina

Forte espressione nei ventricoli cardiaci

Screening di librerie e

Colony Lift Assay

DNA microarray

I DNA microarray (DNA chip) rappresentano l’ultima innovazione nell’ambito delle tecniche d’ibridazione.

Microarray di cloni di DNA, in cui cloni di DNA noti sono micropipettati sulla superficie del vetrino.

Microarray di oligonucleotidi, in cui specifiche sequenze oligonucleotidiche vengono fissate o sintetizzate (Affimetrix) sulla superficie del vetrino

In questo caso si tratta di tecniche d’ibridazione inversa in cui la sonda, non marcata, è legata al supporto ed è la mistura complessa di molecole di DNA ad essere marcata ed ibridata al supporto.

I campi applicativi sono molteplici ed aumentano in funzione della sempre maggiore miniaturizzazione (Chip di 1.28X1.28 cm possono contenere fino a 300.000 oligonucleotidi).

Analisi d’espressione

Analisi genomica (array-CGH)

SNPs genotyping

Array-based Comparative

Genomic Hybridization (array-

CGH) Delezioni e duplicazioni submicroscopiche (~100 Kb

-10 Mb) costituiscono più del 15% delle mutazioni

osservate per malattie monogeniche.

L’array-CGH consente di analizzare efficientemente

questo tipo di alterazioni cromosomiche.

Rispetto al CGH convenzionale su cromosomi

metafasici, i principali vantaggi sono:

Più alta risoluzione (~100 Kb)

La possibilità di ricondurre immediatamente

l’alterazione osservata ad una precisa

regione/sequenza del cromosoma.

Polymerase chain reaction

(PCR)

La reazione a catena della polimerasi

(PCR) ha di fatto rivoluzionato la genetica

molecolare, con la possibilità di

analizzare e clonare velocemente il DNA.

E’ un metodo in vitro molto versatile per

amplificare determinate sequenze

bersaglio presenti in campioni di DNA.

Sono necessarie informazioni sulla

sequenza del DNA bersaglio, almeno per

consentire il disegno della coppia di

primers specifica da utilizzare nella

reazione di amplificazione.

Kary B. Mullis (USA)

Nobel Prize in 1993 for his

invention of the

polymerase chain reaction

(PCR) method

Cosa ha reso la PCR così

facilmente accessibile?

La disponibilità di DNA polimerasi

termostabili.

Taq DNA polimerasi (estratta da Thermus

aquaticus).

L’ingegnerizzazione di termociclatori capaci

gestire velocemente e con elevata

precisione i cambi di temperatura che

caratterizzano il processo di amplificazione.

Scelta dei primers

Il disegno della coppia di primers è molto importante per la buona riuscita della PCR.

Sono disponibili supporti bioinformatici che aiutano nella selezione.

On-line PRIMER3: http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi

Specificità della reazione di

PCR

Nested PCR - l’utilizzo di primers interni a quelli utilizzati in una precedente amplificazione può garantire la specificità del prodotto

Hot-Start PCR – si creano le condizioni per una partenza a caldo della reazione limitando la formazione di prodotti aspecifici

Touch-down PCR – il termociclatore gestisce la temperatura di annealing, decrementandola ad ogni ciclo in un range definito. E’ possibile così selezionare il prodotto specifico.

Gradient PCR – il termociclatore può gestire contemporaneamente diverse temperature di annealing, consentendo una precisa ottimizzazione delle condizioni di amplificazione.

Vantaggi e Svantaggi della

PCR

Velocità e semplicità.

Sensibilità

Duttilità

Necessità di

informazioni sulla

sequenza bersaglio

Dimensioni ridotte del

prodotto di PCR

Imprecisione della

replicazione del DNA

Genotyping mediante PCR (1)

Genotyping mediante PCR (2)

STR polimorfici

Analisi di Linkage

Test genetico d’identità

personale

Esempio di referto

RISULTATO (in grassetto si evidenziano i marcatori paterni condivisi dal figlio)

Marcatore - cromosoma Padre Figlio Madre D8S1179 – crom. 8(q24.13) 13/13 13/14 14/15 D21S11 – crom 21( q21.1) 29.2/29.2 29.2/32 26.2/32 D7S820- crom 7(q21.11) 8/10 8/11 11/11 CSF1PO – crom. 5(q32) 11/12 11/12 10/12 D3S1358 – crom. 3(p21.31) 15/17 15/16.2 15/16.2 TH01- crom 11(p15.5) 5.3/5.3 5.3/9.3 8.3/9.3 D16S539 – crom. 16(q24.1) 8/10 10/10 10/11 D2S1338 – crom. 2(q35) 17/17 17/23 17/23 D19S433 – crom. 19 (q12) 12/13.2 12.2/13.2 12.2/13.2 vWA- crom. 12(p13.31) 15.2/16 15.2/16 16/17 TPOX- crom. 2(p25.3) 9/11 7/11 7/9 D5S818- crom. 5(q23.2) 7/11 7/13 13/13 FGA – crom. 4(q31.3) 20.2/29 20.2/21.2 21.2/25.2

CONCLUSIONI:. Dall’analisi del DNA emerge una ATTRIBUZIONE della paternità di con una probabilità di paternità maggiore del 99,99%. Questo indica una paternità praticamente provata.