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Il controllo delle micosi: gli antifungini

Prof.Salvatore Oliveri

Azienda Ospedaliero-UniversitariaPoliclinico di Catania

Laboratorio Centralizzato di AnalisiLaboratorio di Micologia

Università degli Studi di CataniaDipartimento di Scienze Microbiologiche

e Scienze Ginecologiche

oliveri@unict.it

Rappresentazione schematica della cellula fungina e principali bersagli dei farmaci antifungini

Da: Odds et al., Trends Microbiol., 2003

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Antifungini attivi sulla membrana cellulare

Membrana cellulare

• Polieni- Amfotericina B- Nistatina (uso topico)

• Allilamine, tiocarbamati, morfoline

• Azoli- Miconazolo, clotrimazolo

(ed altri per uso topico)- Ketoconazolo

- Fluconazolo- Itraconazolo- Voriconazolo- Posaconazolo

Polieni

• L’amfotericina B (AmB), prodotta da Streptomyces nodosus, è stata per molti anni il solo poliene somministrabile per via sistemica

• La modalità di azione è atipica per una molecola antimicrobica, in quanto si lega all’ergosterolo presente nella membrana fungina, determinando alterazioni della permeabilità, fuoriuscita di componenti citoplasmatici vitali e la morte dell’organismo. Tale meccanismo fa sì che AmB possa agire su un ampio spettro di specie fungine, come pure sia tossica per le cellule dei mammiferi

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Meccanismo d’azione dell’Amfotericina B

PORO ErgosteroloFosfolipidi

Amfotericina B

Membrana cellulare

Azoli

• Imidazoli (ketoconazolo, miconazolo e clotrimazolo) e triazoli (fluconazolo e itraconazolo) costituiscono il più ampio gruppo di farmaci antifungini

• Il loro effetto principale è quello di inibire la 14α-demetilazione del lanosterolo nella via biosinteticadell’ergosterolo, agendo sul citocromo P450, CYP51A1, anche chiamato Erg11p, cioè il prodotto del gene ERG11

• In alcune specie fungine tali farmaci possono inibire anche la sterolo ∆22-desaturasi, un enzima coinvolto nell’ultima tappa della biosintesi dell’ergosterolo

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Azoli (2)

• Con la deplezione dell’ergosterolo, risultano alterate la normale permeabilità e fluidità della membrana fungina, con conseguenze secondarie sugli enzimi di membrana coinvolti nella sintesi della parete

• Dotati di un ampio spettro di azione, sono attivi nei confronti di dermatofiti, funghi filamentosi, Candida spp., Cryptococcus neoformans e funghi dimorfi come Histoplasma capsulatum e Coccidioides immitis

Azole Antifungals for Systemic Infections

• Ketoconazole • Itraconazole• Fluconazole• Voriconazole

Imidazole

Triazoles

“2nd generationtriazole”

Fluconazole Ketoconazole

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Allilamine

• Le allilamine (terbinafina e naftifina) inibiscono l’enzima squalene epossidasi, con conseguente deplezionedell’egosterolo ed accumulo di squalene. Hanno effettofungicida nei confronti di dermatofiti e funghifilamentosi, ma sono fungistatici per molti lievitipatogeni. A causa della sua notevole efficacia neiconfronti dei dermatofiti, la terbinafina è il solo farmaco di scelta per il trattamento di micosisuperficiali e infezioni ungueali sostenute da tali muffe

Allylamines - Mechanism

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Cell Wall Active Antifungals

Cell membrane• Polyene antibiotics• Azole antifungals

DNA/RNA synthesis• Pyrimidine analogues- Flucytosine

Cell wall• Echinocandins -Caspofungin acetate

5-fluorocitosina (5-FC)

• In origine sviluppato come agente antineoplastico, agisce come antifungino attraverso la sua conversione a 5-fluorouracile (5-FU) nelle cellule target. Il 5-FU viene incorporato nell’RNA, determinando la terminazione prematura di catena, ed inibisce la sintesi del DNA attraverso i suoi effetti sulla timidilato sintetasi

• Ha attività fungicida, tuttavia lo spettro di attività è limitato ai lieviti patogeni (Candida spp. e Cryptococcus neoformans)

• 5-FC non viene utilizzata nella pratica clinica singolarmente, ma in associazione (ad es. con AmB) a causa del rapido sviluppo di resistenza primaria e secondaria (risultante da difetti negli enzimi permeasi, deaminasi e fosforibosil trasferasi)

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Fluorinated pyrimidinerelated to flurouracil.

Flucytosine

Nuovi farmaci antifungini Echinocandine (1)

• Le echinocandine sono metabolitifungini secondari, costituiti da un core ciclico esapeptidico con una catena lipidica laterale responsabile dell’attività antifungina.

• Scoperti negli anni ’70 solo alla fine degli anni ’90 tre composti della classe echinocandine, anidulafungina, caspofungina e micafungina sono entrati nello sviluppo clinico

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Nuovi farmaci antifungini in sviluppo clinicoEchinocandine (2)

• Il bersaglio delle echinocandine è il complesso delle proteine responsabili della sintesi dei β-1,3 glucani della parete, sebbene il preciso meccanismo d’azione rimanga sconosciuto

Resistenza ai farmaci antifungini

• La resistenza ai farmaci antifungini ha componenti cliniche e microbiologiche

• Per resistenza clinica si intende il fallimento del trattamento e la persistenza dell’infezione nonostante la terapia antifungina appropriata. Una risposta clinica adeguata è a sua volta dipendente non solo dalla sensibilità del microrganismo patogeno ma anche da vari fattori, quali il sistema immune, la penetrazione e distribuzione del farmaco, la “compliance” del paziente e l’assenza di un focolaio di infezione protetto o persistente (es. catetere o ascesso)

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Resistenza ai farmaci antifungini

• La resistenza microbiologica di un dato patogeno fungino deve essere ritenuta come una variabile quantificabile, determinata mediante la misurazione della sensibilità al farmaco (es. MIC), e deve essere definita rispetto ad una popolazione di riferimento.

• Un fungo patogeno resistente ad un dato farmaco è perciò un microrganismo che ha una “minimal inhibitoryconcentration” (MIC) più alta del valore medio calcolato nella popolazione totale

• Pertanto la resistenza microbiologica o in vitro di un dato patogeno è basata sulla determinazione delle MIC

In vitro amphotericin B resistance in clinical isolates of Aspergillus terreus, with head-to-head comparison to

voriconazole

0

10

20

30

40

50

60

70

80

n° o

f is

olat

es

0.06 0.25 1 4 16MIC (mcg/ml)

AMBVOR

Sutton et al., JCM, 1999, 37: 2343-2345

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Resistenza ai farmaci antifungini

La resistenza microbiologica può essere distinta in:i) resistenza primaria, anche definita come resistenza

intrinseca, che si osserva prima dell’esposizione in vitro o in vivo al farmaco

ii) resistenza secondaria (o resistenza acquisita) che compare dopo l’esposizione ad un agente antifungino e può essere reversibile o acquisita stabilmente

Meccanismi di resistenza ai polieni

• La resistenza microbiologica ad AmB può essere intrinseca o acquisita

• La resistenza intrinseca è comune ad alcune specie di Candida (C. lusitaniae) e a Trichosporon beigelii

• La resistenza acquisita è spesso associata con alterazioni nel contenuto dei lipidi di membrana e specialmente dell’ergosterolo

• Sono stati descritti ceppi clinici di C. albicans resistenti a AmBche mancavano di ergosterolo e accumulavano altri steroli a causa di un difetto dell’enzima sterolo ∆5,6-desaturasi

• Un altro meccanismo alla base della resistenza sarebbe mediato da un’incrementata attività della catalasi, che potrebbe contribuire a diminuire il danno ossidativo prodotto da AmB

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Mechanisms of resistance topolyenes

Low ergosterol content in the cell membrane of Aspergillus spp. decreases the activity of AMB

Walsh et al., JID, 2003, 188:305-319

Meccanismi di resistenza alla 5-FC

• Anche nei confronti di tale farmaco la resistenza può essere intrinseca o acquisita

• La resistenza intrinseca può presentarsi per un difetto della citosina permeasi, mentre quella acquisita deriva dall’incapacità di metabolizzare 5-FC a 5-FUTP e 5-dUMPoppure può essere dovuta alla perdita di un feedback di controllo della biosintesi della pirimidina

• A causa dell’elevata resistenza intrinseca a 5-FC, tale composto è di gran lunga utilizzato in associazione con altri agenti antifungini, per esempio, con AmB

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Meccanismi di resistenza agli azoli

I meccanismi di resistenza agli azoli possono essere così suddivisi:

1. alterazioni nel trasporto del farmaco o ridotto accumulo di azoli nella cellula dovuto alla up-regolazione di geni “multidrug trasporter” (MDR1, CDR1 e CDR2).

2. alterazioni del target cellulare:i. diminuzione dell’affinità di Erg11p (per insorgenza

di mutazioni)ii. aumento del contenuto cellulare di Erg11p (per up-

regolazione genica3. alterazioni della via biosintetica dell’ergosterolo,

mediante inattivazione della sterolo ∆5,6-desaturasi

COOHNH2 BA BA

ATP ADP ATP ADP

NH2 COOH

Types of multidrug efflux transporters in yeast

ATP-binding cassette (ABC)-transportersC. albicans CDR1, CDR2 (Candida drug resistance), 170 kDa- 2 x 6 transmembrane domains (TM)- 2 nucleotide binding folds in Walker A and B domains- Efflux a large variety of drugs

Major FacilitatorsC. albicans CaMDR1 (Multidrugresistance), 63 kDa- 2x6 transmembrane domains (TM) - Effluxes a large variety of drugs

Plasma membrane

Sanglard et al. (1995), AAC 39: 2378-2386; (1997), Microbiology 143: 405-416

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Azole resistance mechanisms: enhanced efflux by upregulation of multidrug transporter genes

Azoleresistant

yeast

ATP BindingCassette

(ABC) multidrugTransporter

Major Facilitatormultidrug

transporterCaMDR1

Lanosterol

14α-demethylated sterols

Ergosterol

ERG11

Echinocandins - spectrum

Highly activeCandida albicans, Candida glabrata,Candida tropicalis, Candida kruseiCandida kefyrPneumocystis carinii

Low MIC ,with fungicidal activity and good in-vivo activity.

Very activeCandida parapsilosisCandida gulliermondiiAspergillus fumigatusAspergillus flavusAspergillus terreusCandida lusitaniae

Low MIC, but without fungicidal activity in most instances.

Some activityCoccidioides immitisB. dermatididisScedosporium speciesPaecilomyces variotiiH. capsulatum

Detectable activity, which might have therapeutic potential for man (in some cases in combination with other drugs).

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Echinocandins-Spectrum vs. Moulds

Staining with antisera to glucansynthase subunit

(Fks1p)

• Active against Aspergillusspecies– Glucan synthase localized in

apical tips• Activity against other yeast

and moulds is less well described or variable

Beauvais et al. J. Bacteriol 2001;183:2273-79

Aniline blue staining of β (1-3) glucans –stains only at apex

Echinocandins act at the apical tips of Aspergillus hyphae

DiBAC

Bowman et al. Antimicrob Agent Chemother 2002;46:3001-12

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A Imhof, JCM 2003, 41: 5683-5688

Saggi in terreno liquidoYeastOne-Sensititre

• Possibilità di determinare la CMI e la CMF• Semplicità di interpretazione e di lettura• Possibilità di saggiare funghi filamentosi

farmaci da saggiare e loroconcentrazioni terreno di crescitapHtemperatura e tempo di incubazioneinoculo funginocontrolli lettura interpretazione dei risultati

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NCCLS conditions for antifungal susceptibility testing

48 h (most fungi) 48 h (Candida spp.), 72 h (C. neoformans)

Duration of incubation

Prominent growth reduction from control (~50%) for flucytosine, fluconazole, and azoles; optically clear well for amphotericin B; the T-level revision will propose the use of an optically clear end point for intraconazole and the newer azoles (e.g., voriconazole)

Optically clear well for amphotericin B, ~80% reduction in growth (macrodilution testing with azoles), prominent decrease in turbidity (microdilution testing with flucytosine and the azole antifungals)

End point

35°C 35°C Temp

MicrodilutionMacrodilution or microdilutionFormat

Same as M27-A RPMI 1640, buffered to pH 7.0 with 0.165 M MOPS

Test medium

Spectrophotometric, with specificatiionof a target optical density that varies by fungal genus

Spectrophotometric, with reference to a 0.5 McFarland BaSO4 turbidity standard

Inoculumstandardization

0.4 × 104-5 × 104 CFU/ml 0.5 × 103-2.5 × 103 CFU/ml InoculumConidium- and spore-forming fungi Yeasts Suitability

NCCLS M38-P (133) NCCLS M27-A (135) Characteristic

Da Rex, J. Clin. Microbiol. Rev. 2001, 14: 643-658

Interpretative Breakpoints for Isolates of CandidaSpecies

Drug Concentration (µg/ml)

Susceptible SusceptibleDose-Dependent

Resistant

Flucytosine

Fluconazole

Itraconazole

≤ 4

≤ 8

≤ 0,125

(8-16) ≥ 32

16-32

0,25-0,5

≥ 64

≥ 1

NCCLS: M27-A2 2002*CLSI: M27-S2 2006

Voriconazole* ≤ 1 2≥ 4

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Saggi in agar

• Impossibilità di determinare la CMI e la CMF• Utilizzo di terreni interferenti con l’attività dei

farmaci• Assenza di crescita per alcune specie fungine• Eventuale difficoltà di interpretazione e di lettura• Semplicità e rapidità di esecuzione• Relativa economicità

Diffusione da disco

E-test • Possibilità di determinare la CMI• Impossibilità di determinare la CMF• Utilizzo di terreni interferenti con l’attività dei

farmaci• Assenza di crescita per alcune specie fungine• Eventuale difficoltà di interpretazione e di

lettura• Semplicità e rapidità di esecuzione• Possibilità di saggiare funghi filamentosi