Immunfluorescenzuntersuchungen in der klinischen und experimentellen Dermatologie

Arch. klin. exp. Derm. 239, 150--166 (1970) �9 by Springer-Verlag 1970

Immunfluorescenzuntcrsuchungen in der klinischen und experimentellen Dermatologie

I. P r ~ p a r a t i o n , K o p p l u n g u n d Charak te r i s i e rung

yon I m m u n g l o b u l i n e n

V. MISGELD und CHR. IV[EISEL

Klinikum Steglitz der Freien Universitiit Berlin Hautklinik und Poliklinik (Direktor: Prof. Dr. H. W. Spier)

Eingegangen am I0. Juni 1970

Immuno/luoreseence Studies in Clinical and Experimental Dermatology I. Preparation, Conjugation and Characterization o] Immunoglobulins

Summary. The reliability of immunofiuorescence studies necessitate a systematic control of errors. The dermatological interests and the results of this method by other authors are presented. Following items are described in this first paper: preparation and characterization of anti-human-immunoglobulin, anti-human-immunoglobulin G (IgG), the conjugation of anti-human-IgG with fiuorescein-isothiocyanate (FITC), methods of tissue preparation, microscopic examination and documentation. Finally a detailed description of the basic equipment is given.

Anti-human-immunoglobulin with a minimal titer of 1 : 10 is conjugated, anti- human IgG is adjusted to a protein concentration of 20/0 and 10 mg FITC added pro gramm gamma-globulin. A FITC-immunoglobulino-ratio of 1:2 to 1:3,5 is optimal.

Zusammen/assung. Zur Sicherung des Aussagewertes yon Immunfiuorescenz- untersuchungen ist eine systematische Fehlerausschaltung erforderlich. Nach kurzer Zusammenfassung einschliigiger dermatologischer Fragestellungen bzw. Befunde werden in dieser ersten Mitteilung angegeben: Preparation und Charakterisierung yon Anti-Hnman-Immunglobulinen sowie deren Konjugation mit Fluoresceiniso- thiocyanat (FITC), erprobte Verfahren der Gewebebearbeitung, der Untersuchung und Dokumentation der Pr~parate sowie eine Basisausrfistung.

])as aus Anti-Human-Globulin mit einem Minimaltiter yon 1:10 gewonnene Anti-I-Iuman-IgG wird in 2~ Konzentration mit 10 mg FITC pro Gramm Gamma-Globulin gekoppelt. Ein FITC-Anti-Immunglobulinverh~ltnis yon 1:2 his 1 : 3,5 erweist sich als optimal.

A. Einleitnng

I. Immun/luorescenzteehniken ( I F T)

I F T haben innerha lb weniger Jahre als direkte, indirekte, mixed [8], sequential [58] und kombinier te Methode [3] in Rout inediagnos t ik und Forschung aller medizinischen Disziplinen ihren Platz gefunden. Der

Immunfluorescenzuntersuchungen in der klinischen und exp. Dermatologie. I 151

Xnteressierte kann zunehmend Mitteilungen fiber diese ,,sensibelste und schwierigste Methode der Histochemie" (v. Mayersbaeh [55]) registrieren.

Die Dermatologie ist insbesondere mit IFT bei bullSsen Dermatosen einsehlieglieh Dermatitis herpetiformis Duhring, System- und Cutanem Erythematodes, Dermatomyositis, dem Nachweis von Autoimmun- ph/tnomenen, Fragen der Kontaktekzemforsehung und der venero- logisehen Diagnostik beteiligt (Neuere Ubersiehten z.B. [45, 50]).

II. Imitation yon Immun/luorescenzbildern (IFB) de/inierter Dermatosen

Wurden beim Pemphigus vulgaris einerseits eharakteristisehe IFB herausgestellt, so wurde andererseits berichtet, da6 angeblich Pemphigus- vulgaris-~hnliche IFB mittels indirekter IFT naeh Inkubation gesehieh- teter Plattenepithelien mit Serum, welches antiepitheliale Autoanti- kSrper enth~tlt [32,34], mit Antilymphknotenserum [35], Serum yon Verbrennungskranken [1], Antiblutgruppen-Immunseren [33, 48, 70] und Serum yon gesunden Blutspendern [25,25a] erzeugt werden kSnnen (s. aber aueh [48a]). Die Imitierbarkeit des Immunfluoreseenztyps des bullSsen Pemphigoids wurde mit Serum yon Probanden gezeigt, denen bes~immte Medikamente verabreieht worden waren [25]. Anhaltspunkte ffir IFB wie bei eutanem Erythematodes fanden sieh schlie61ieh bei l:~osaeea [2].

III . Methodische Schwierigkeiten der IFT

Von grundlegender Bedeutung ffir den weiteren Einsatz der IFT sind jedoch methodisehe Fragen: Die Berficksiehtigung bzw. Aussehal- tung der Anf/~rbung mit fiberschfissigem freien Farbstoff, der unspezi- ilschen Fi~rbungen oder Reaktionen -- ohne dag eine Immunreaktion zugrunde liegt [27,55] --, Angaben fiber quantitative Charakteristica der gekoppelten Immunglobuline [7--9, 27, 72, 73], ihrer Fluorescenz- eigensehaften [15], die Bearbeitungsweise der verwendeten Gewebe [55] sowie photographiseh-teehnische Daten. Ohne derartige Informationen ist eine Interpretation der IFB dureh andere letztlieh nicht mSglich [9, ]6,73].

I V. Zusammen/assung

Die Aussagekraft yon Immunfluoreseenzbefunden kann beeintriich- tigt werden. Bei angeblich korrekter Methodik sollen IFB vergleichbar denen definierter l~rankheitsbflder imitiert bzw. Fehler dureh methodische StSrquellen herbeigeffihrt werden.

V. Folgerungen

Sollen IFT ffir l~outinediagnostik und Forschungsvorhaben kritisch genutzt werden, so hatdie Auseinandersetzung mit methodischer Proble-

152 V. Misgeld und Chr. Meisel:

m~tik im Vordergrund zu stehen. Insbesondere da dieser Frage ,,bisher nieh~ immer die entsprechende Bedeutung beigemessen oder sie diskret umgangen wurde" und ,,es sich nicht um eine Methode handelt, die ohne jeden Aufwand mfihelos sichere l~esultate ]iefert" (v. 1Vfayersbach [55]).

Da mit k~uflichen markierten Immunglobulinen zu arbeiten einerseits wegen fehlender Charakterisierung, andererseits wegen leicht er- kennbarer, sp/~ter zu zeigender Mgngel momentan nicht ra tsam ist (s. anch Cormane [16]), haben wit Anti-Immunglobuline selbst gekoppelt. Die Beschreibung erfolgt hier; sie orientiert sich in ihrem Aufbau an der ghnlich konzipierten Arbeit yon Heise u. Mattheus [42]. Weiter- hin wurde (nach-)untersucht, ob bzw. in welchem Umfang durch Blut- gruppen-Iso-Antik6rper definierte IFT imiti.ert werden [25,70]; dieser Faktor k6nnte prinzipiell bei allen indirekten I F T stSren, In identiseher Anordnung wurde sehlieglieh -- in iJberleitung auf andere Fragestel- lungen - - untersucht, ob mittels IFT-Reakt ionen zwischen Anti-Blut- gruppen-Immunseren und blutgruppenaktiven Substanzen im Haut- organ nachweisbar sind [33, 48]. Diese Ergebnisse sind Inhal t der I I . Mit- teilung.

B. Material , Methoden , B e s p r e e h u n g

Anti-I-Iuman-hnmunoglobuline sollten vorerst selbst hergestellt werden, da kommerziell angebotene Sera zwei Mgngel haben: sie sind -- wie die k~uflichen markierten Immunglobuline -- immunologisch meist nicht ausreichend charak- terisiert [8,16] und stehen in ffir einen Kopplungsablauf erforderlichen und wirt- schaftlich abgepackten Mengen (am besten 50 ml) nicht zur Verffigung; beiden Argumenten sollten sich die Lieferfirmen nicht verschliegen.

I. Pr~iparation und Charakterisierung der Anti-Immunglobuline

Immunisier t werden Kaninchen, da diese zur Gewinnung zirkulie- render Antik6rper (AK) sehr geeignet sind. Immunisierungspl/~ne liegen zahlreich vor [27], zu empfehlen sind einfaehste Schemata [57], z.B. in Anlehnung an Steffen [67] folgendes:

Woche intraperitoneal intravenSs Einzeldosis

1 1 • 2 x 1,0 ml 2 1 • 2 • 1,5 ml 3 1 x 3 x 2,0 ml 4 1 x 3 X 3,0 ml 5 1 • 1 x 5,0 ml

Benutzt wird eine 150 mg-~ Zubereitung aus k~uflichem Gamma- Venin| Die Tiere werden vor der ersten Applikation gewogen und mar- kiert, danach wird Blur zm" Ermitt lung der Leerwerte der Plasmaproteine (s. unten) abgenommen. Zur Injektions- und Blutabnahmetechnik s. [67].

Immunfluoreseenzuntersuchungen in der klinischen und exp. Dermatologie. I 153

Auf komplettes Freundsches Adjuvans als unspezifische Verst/~rkersubstanz der immunogenen Wirkung yon Humanglobulinen wurde verzichtet [42, 55], wenn- gleich dieses in den meisten Immunisierungsschemata empfohlen wird (z. B. [8, 9, 32,57]. Die unbedenklichere Adjuvanswirkung yon Aluminiumhydroxid-Suspen- sion -- einer Gruppe wirkungsmagig versehiedener Stoffe [27,38,67] -- wird jedoch genutzt.

Zusatz yon A l u m i n i u m h y d r o x i d in folgendem Verh~l tn is : 100 ml 150 mg-~ Human-Gamma-Globu l in l6 sung • 5 ml 1 ~ steri le Alumin iumhydrox idsuspens ion .

Nach A p p l i k a t i o n sind jeweils 56 mg H u m a n - G a m m a - G l o b u l i n eingesetzt worden. 5 (bis 7) Tage naeh der le tz ten Boos t e r - In j ek t ion [57] B l u t e n t n a h m e zur Immundif fus ion . Bei night aus re iehend hohem Tiger [9] s .e . -Boosterung im A b s t a n d yon 1 Woehe jeweils mi t 10 mg H u m a n - Gamma-Globu l in + A lumin iumhydrox id -Gemiseh [67].

E n t b l u t u n g der Tiere in typ i seher Weise du tch ErSffnen der Vena ]ugualris .

Wenngleieh fiir eine Kopplung des Serums ein bestimmter Minimaltiter gegeben sein muB [9], so seheint andererseits die Gewinnung eines m6gliehst hoeh- titrigen Serums nieht erstrebenswert zu sein, da ,,Kreuzreaktionen" mit einer Verminderung der Spezifit~t auftreten sollen [27, 47, 55, 67]. Auf die Immunisierung mit monospezifischen Immunglobulinen hubert wit verzichtet und die chromato- graphische Separation der gewonnenen Anti-Human-Immunglobuline bevorzugt. Prinzipiell bereitet die Pr//paration monospezifischer Immunogene keine Schwierig- keiten [27, 67, 69, 71], ihr Einsatz ist yore Ziel der Untersuehung abh/ingig.

Die Untersuchung der Serumausgangswerte des zur Immunisierung verwendeten Humanglobulins, der gewonnenen Anti-Human-Immunglobuline mit der Not- wendigkeit, sich fiber ausreichend hohe Immunglobulintiter ffir den Kopplungs- schritt bzw. fiber auffNlige Ver~nderungen derselben dutch die Kopplung zu ver- gewissern [55], erfolgt jeweils mit Immunelektrophorese bzw. Gelprgeipitations- techniken [6, 43, 54, 68]. Auf den ersten Blick scheint dies kaum Probleme mit sich zu bringen, da erprobte Methoden im Gebrauch stehen und fiber auf Erfahrung gegrfindete Modifikationen dieser Techniken hgufig beriehtet wird [19, 21, 30, 39, 51,753.

Die Aktivit~t der Immunglobuline kann sich unterschiedlieh ~ulSern, so in pr~cipitierenden oder nichtpr~eipitierenden Eigenschaften oder dureh Auftreten yon Frfih- bzw. Sp~t-AK [61, 75] und ist yon zahlreichen Faktoren, wie Spezifit~t, Avidit~t, Valenz des Immunglobulins und Eigenschaften des P~eaktionsmilieus wie Triigermedium, pSI, Ionenst~rke des Puffers, molarem Verh~ltnis yon AG (Antigen) zu AK, Inkubationszeiten, Temperatur, Arbeiten im J~quivalenzbereich abh~ngig [29, 67].

Zur (Immun-)~Elektrophorese: Auf die einfache elektrophoretische Trennung von Kaninchen-Vollserum und Gammaglobulin auf Acetatfolien und anschlie~ender Auswertung mit dem Extinktionsschreiber I I I mit IntegrMschreiber der Fa. Zeiss haben wir verzichtet, da-- trotz vergleichender Untersuchungen mit verschiedenen Puffern und Auftragsmethoden -- nur selten reproduzierbare Ergebnisse erzielt werden konnten.

Wich t ige r ersehienen uns genauere immunelekgrophore t i sche Unter - suehungsergebnisse im Hinb l i ek au f die notwendige Differenzierung be- s t i m m t e r I m m u n g l o b u l i n t y p e n [59]. Benu t z t wurden nach Vergleiehen


Abb. 1. Immunelektrophorese: Positiver Naehweis yon Anti-Human-ImmungIo- bulin. Aufgetrennt: Standard-ttumanserum. Gelrinne: Serum Kaninehen, im-

munisiert

Abb.2. Immundiffusion: Positiver Naehweis von Anti-Human-Immunglobulin. Mitte: Serum Kaninohen, immunisiert, t Gamma-Venin500 mg-~ 2 Gamma-

Venin 150 mg-~ 3 Standard-Humanserum

mit anderen Fabrikaten das technisch ausgereifte Ger&t der Fa. Boskamp (Mikrophor). Gelherstellung und Pufferwahl riehten sieh naeh der aus- fiihrlichen und praktikablen Anweisung [10] des Ger~teherstellers (zu weiteren Details s. [18, 74]).

Zur Immundi//usion. Obwohl Gel-Prgcipitationsmethoden ein nieht iiberragend sensibles Verfahren darstellen [62], reiehen diese zur Ermittlung unterer Anti- k6rpertiter fiir den Kopplungsschritt aus [59]. Da Immunprgcipita{ionsmethoden zudem methodische Schwierigkeiten bieten, gewinnt man den Eindruek, dab dem Naehweis der Aktivitgt yon Immunglobulinen, z.B. mit Hgmagglutinations- bzw. t{gmagglutinationsinhibitionsmethoden [11, 66, 67] weiter nachgegangen werden mug.

I m einzelnen: Naeh Vorversuehen Anwendung einer Methode mit m6gliehst geringem Immunglobulinverbraueh. Dies ist bei gelbesehieh- teten Objekttr~gern und Stanzung mit einem Ger~tt der Fa. Boskamp (zentrale und 6 radiale Stanzungen [10]) gegeben. Laufzeit 18--24 Std bei Zimmertemperatur. Hinweise auf andere Laufzeiten, Temperaturen usw. bei [21,41]. Brauehbar ist aueh eine quantitative Immunglobulin- bestimmung naeh der radialen Immundiffusionsmethode in besonders konstruierten Plexiglasplatten mit dem Vorteil, erste Ergebnisse schon naeh 1 Std ablesen zu kSnnen [26].


Giinstigster Puffer zur Gelbereitung gemessen an der Pr~icipitations- sch/~rfe ein 0,15 m Phosphatpaffergemiseh, pH 7,1 (Rezept s. [64]), im Vergleieh mit Anweisungen der Fa. Boskamp [10] und dem yon Beut- ner [9] empfohlenen, pH-Messungen mit elektrisehem Photometer der Fa. Knick, Elektroden der Fa. Ingold.

Anti-Immung][obuline mit einem Minhnaltiter yon 1:10 werden zur Kopplung verwendet (Beutner [9]). Zur Dokumentat ion der Pr~Leipitat- linien k6nnen zwei Wegc empfohlen werden: Photographie [64] der ungef~irbten Platte, unter Umst~nden vorangehender Verstgrkung der Pr/icipitatlinien dureh vorsiehtiges Ans/iuern (pit 4,3--4,5, s. [37]) bzw. Photographie nach Anf/~rbung der Precipitate. Vorangehend eintggige Ausw/~sserung mJt physioliseher Kochsalzl6snng znr Entfernung fiber- sehfissigen Proteins. Luftblasenfreie Bedeekung mit angefeuchtetem Vliespapier. Lufttroeknung. 5--10 rain Anf~rbung mit 1 ~ Amido- schwarz 10 B. Answasehen mit Methanol-Eisessig (Verh~ltnis 10:1) ca. 15 rain. 3--4maliges Wechsein der Wasehflfssigkeit. Nachspiilen mit Aqua dest. Lufttrocknung. Arehivierung nach Uberkleben mit Filmolux bzw. Tesafilm mSglich.

Albumine und immunologisch imkompetente Globuline miissen yon dem gewonnenen Anti4mmunserum -- zur Vermeidung unspezifiseher Reaktionen naeh Kopplung -- abgetrennt werden [14,20, 23, 27, 55, 72]. Im Gebrauch sind die Aus- f/illung mit kaltem Athanol, Ethodin, insbesondere aber Ammoniumsulfat [27,47, 55, 72].

Die Globulinfraktionierung mittels Nolekularsiebtrennung und Kombination mit Ionenaustausehehromatographie anstatt durch Ammoniumsulfatausfiillung wird neuerdings dringend empfohten [4,12,20]. Wir haben jedoch uns zur Beibe- haltung des bew~ihrten Arbeitsablaufes unter Einsehalmng der Globulin-Aussa.lzung in Anlehnung an Voss [72] entsehlossen.

Bis maximal 50 ml eines Gemisehes aus 3,2 m Ammoniumsulfatl6sung in 0 ,15m Koehsalzl6sung wird bei + 4 ~ der gleiehen Menge des Ztl bearbeitenden Anti-Human-Serums tropfenweise auf einem Elektro- r fh re r zugesetzt. Zur Ausfgllung kommt es erst mit den tetzten Milli- litern der Ammoniumsulfatl6sung; die Endkonzentrat ion soll dabei 1,6 Mol betragen: um sehon hier m6gliehst alle anderen Globulinkompo- nenten auszuschalten.

Zentrifugation des Niederschlages in der Kfhlzentrifuge bei + 4~ 15000 U/min, 20 min. Einmaliges Wasehen des Bodensatzes mit 2,0 m Ammoniumsulfat in Aqua dest. Erneute Zentrifugation. L6sung des Sedimentes in 0:,15m Koehsalzl6sung; 4 m l NaC1 auf je 10ml Anti- Immunserum als Ausgangswert.

Die Auswasehung yon Ammoniumsulfat ist erforderlich, da dieses bereits in Konzentrationen um 0,08 Mol best immte Protein-Bestim- mungsmethoden (Biuret) st6ren und unter Verminderung der Anti-

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k6rperfluorescenz mi~ Fluoresceinisothiocyanat (FITC) reagieren kann [27, 49, 55, 72].

Die zeitraubenden und in ihrem Erfolg mitunter unbefriedigenden Dialyse- verfahren werden heute yon der schonenden, den pH-Wert der Seren nieht ver~n- dernden Molekfilsiebtrennung fiber quervemetzte Dextran-Gele (,,Sephadex") ab- gelSst. Substanzen kleiner Molekulargewiehte dringen dabei je nach Vernetzungs- grad in die Gelkerne ein, Substanzen gr6Berer Molekulargewichte dagegen nicht [22].

Im einzelnen: Ge]fi]tration mit Sephadex G 25 coarse in Chromatogra- phierohr, L/~nge 100 cm, Durchmesser 2,5 cm uud Auftragung mitte]s Braun-Unitapumpe. Laufgeschwindigkeit zwischen 30 und 120 ml/Std. Ansetzen yon jeweils 50 g Sephadex G 25 fiber Nacht mit ca. 500 ml 0,1 m Tris-HC1-Puffer.

Tris-HCl-Pufferansatz :

0,1 m: 12,11 g Tris pro Liter Gebrauchslg. : 60ml 0,1 m Tris ~ 40 ml 0,1 m HC1;

0,3 m : 36,83 gTris pro Liter Gebrauchslg. : 63,6 ml 0,3 m Tris -~ 36,4 ml 0,3 m HC1;

0,45 m : 54,50 g Tris pro Liter Gebrauchslg. : 60 ml 0,45 m Tris -~ 40 ml 0,45 m HC1.

Mehrmaliges Waschen mit gleiehem Puffer his pH 8,0 erreicht ist. Packen der S/~ule und weitere Bearbeitungsschritte bei ~4~ Auf- tragen der L6sungen und Puffer auf dem Gelbett mit dem Auftrags- get/it nach Voss [72]. Auftragdauer ffir Globulinl6sung ca. 20 rain. Elution mit 0,1 m Tris-HC1-Puffer. Verwerfen des proteinfreien Vor- laufes (ca. 130 m]), Sammeln des nachfolgenden triiben Eluates (ca. 80 ml) mit nahezu quantitativer EiweiBausbeute in Proben zu 10--15 ml. Kontrolle auf (Ammoniumsu]fat-)Salzrest mittels der (umst/~ndliehen) Gefrierpunktbestimmung[72] bzw. der (einfacheren) Bariumsulfat- fallung [46].

Barittmchlorid tropfenweise zu heil~er anges/s Untersuchungs- 16sung geben. Ans/tuern mit 2 n HC1. Wenn Ammoniumsulfatrest vor- handen, Ausf~llung yon weil~em (BaSO4-)Niederschlag.

Nach den Erfahrtmgen yon Voss ist das Ammoniumsulfat bei einer S/~ulenh6he yon 80 em vollst/~udig entfernt.

Zur weiteren Vorbereitung des ammoniumsulfatgereinigten Anti-Human- globulins auf den ](opp]ungsschritt ist eine Separation yon mSgtiehst homogenem IgG-Immunglobulin erforder]ich, um einen gleichm~Bigeren :Farbstoffeinbau und eine Erh6hung der Spezifitat zu erreichen [59, 72].

:Bei groBem Materialvolumen w~re eine derartige Separation mittels Gel- filtration oder Ionenaustauschchromatographie unter Einsatz automatiseher Appa- raturen optimal. (Fraktionssammler, UV-Spektrophotometer, UV-Flow-Analyzer, etc.) Wit setzten die Ionenaustauschchromatographie [4,24,28,65] mit DEAE- Sephadex ein, die Vorteile [721 im Vergleieh mit DEAE-Cellulosetechniken [591 zu besitzen scheint.


Abb.3. Immunelektrophorese- Positiver Nachweis von Anti-Human-Immun- globulin. Aufgetrennt: Standard-Humanserum. Getrinne: Kaninchen-Immunserum (Anti-IgG) nach Ammonsulfatf~lIung, Gelfittration und Ionenaustauscherchro-

matographie

Abb.4. Immundiffusion: Positiver Naehweis von Anti-Human-IgG vor Kopplungs- schritt. Mitre: Standard-Humanserum. 1 Anti-IgG unverd6nnt; 2 Anti-IgG 1:4; 3 Anti IgG 1:8; 4 Anti IgG 1:16; (photographisch nicht darstellbar); 5 Anti IgG

1 : 32 (photographisch nicht darstellbar)

Zubereitung des Gels (Dauer 4 - -5 Std) : 10 g DEAE-Sephadex A 50 auf Filternutsche 25 G 3 1 Std lung bei Zimmertemperatur mit 600 ml Aqua dest. quellen lassen. Entfernen yon Verunreinigungen mit Pipette. Absaugen der Fliissigkeit mit Wasserstrahlpumpe. 75 ml 0,5 m HC1 und 125 ml Aqua dest. zugeben. Umr~hren, absetzen lassen. Absaugen. 3mal waschen mit 250 ml Aqua dest. Auffiillen mit 200 ml 0,5 m NaOH. Absetzen lassen. Absaugen. 4real waschen mit 250 ml Aqua dest. Da- naeh wird Ausgangsvolumen vone DEAE-Sephadex A 50 wieder erreieht. Auff/illen mit 50 ml 0,5 m HCI und 200 ml Aqua dest. 2maliges Um- riihren. Absetzen lassen. Absaugen. Wasehen mit 0,1 m Tris-HC1-Puffer, pH; 8,0, bis Puffer-pH erreieht wird. Packen der S~ule. L~nge 40 era, Durchmesser 2,5 cm, Gelbett ca. 18 em hoeh. Verbraueh ca. 4 g DEAE- Sephadex A 50. Naehwasehen mit 0,1 m Tris-HC1-Puffer.

Auftragen des Anti-Immunglobulins, Zeit ca. 1 Std. Elution mit 0,3 m Tris-HC1-Puffer, p H 8,0. Auffangen der Eluate in Proben zu ca. 10 ml. Gesamtmenge ca. 180 ml. Anschlie[~end Einengung der groB- volumigen Eluate mittels Gefriertroeknung, womit auf die finanziellen wenig, techniseh jedoeh sehr aufwendigen Dialyseverfahren [72] ver- ziehtet werden kann. Brauehbare Immunglobu]ine nach Einengung auf ungefs 100/0 des Ausgangsvolumens. Keine Xnderung der immuno-

11"


logisehen Aktivit/it, Kontrolle mit Immunelektrophorese und Immun- pracipitation (Abb. 3 und 4). Als gfinstigster Ausgangswert erweisen sich ffir das Immunglobulin Proteinkonzentrationen zwischen 1,0 und 2,0~ ( 10 mg--25 mg pro ml) [27, 31,52, 72]. In Anlehnung an Voss gehen wir yon einer 2~ Proteinkonzentration aus. Die Messung erfolgt am Spek- trophotometer (z.B. Zeiss PMQ II ) bei 280 nm; Verdfinmmg der Pro- ~einlSsungen 1:10 mit physiologiseher NaC1. Ats Eiehkurven dient eine Verdfinnungsreihe yon gereinigtem Kaninehen-Gammaglobulin (Voss [72]). Zur Verdfinnung Verwendung yon 0,15 m NaC1. Andere erfolgt bei Proteinbestimmungen s. z.B. Lowry [53]. Die Messung von FITC erfolgt bei 495 nm an Hand einer Eiehkurve mit Werten yon 0-- 10 Gamma FITC/ml.

II. Prigparation und Charakterisierung der Konjugate

Die Schwierigkeiten yon seiten des Fluorochroms werden geringer [55]. Ein- heitlichere Ergebnisse sind durch die haupts~chliche Nutzung der Fluorescein- bzw. Rhodamin B-Isothiocyanate m6glich, welche als wasserl6sliche Substanzen in koloplungsf~ihiger , stabiler Form neuerdings chromatographisch rein im Handel sind [23]. Die Menge des zugesetzten Farbstoffes -- offenbar entscheidender als die Proteinkonzentrationen [31,47] --, wurde ira Laufe der Zeit wesentlich ver- ringert, um EiweiBdenatnrierungen und sog. unspezifische l~eaktionen m6glichst zu verhindern [55].

In unserem Ansatz wird das Verhi~ltnis yon FITC zu Anti- Immun- globulin mit 1:100, entspreehend 10 mg chromatographisch reinem Farbstoff pro Gramm Gammaglobulin festgelegt[27,47,72]. Kopp- lungen mit anderen Farbstoffen, z.B. dem orangerot-fluorescierenden l~hodamin B 200 werden noch nicht durchgeffihrt. Der Versuch, gleich- zeitig zwei Antigene im Gewebe mit unterschiedlich markierten Anti- k6rpern darznstellen, wfirde dies erforderlich machen [27,55].

Die abgestimmte Menge FITC wird in einer briefchenfSrmig ge- falteten Dialysiermembran d e r m i t 0,5 m NaOH auf ein pH yon 9,5 gebrachten 2~ Gamma-Globulinzubereitung gleichm~flig fiber 20--24 Std zugesetzt. Die Schaumbildung scheint bei st~ndigem l~fihren mit einem Elektrorfihrer bei 600 U/rain eher vermeidbar zu sein als mit einem Magnetrfihrer.

Kiihlraum zur Einhaltung der strengen Temperatnrbedingungen yon q-2--4~ erforderlieh, ersatzweise entspreehend umgebauter ]~aus- haltskfihlsehrank. Zu Reaktions- nnd Kopplungsbedingungen s. aueh [13, 27, 56, 59, 60, 76].

Die resultierende eehte Hauptvalenzbindung des Proteinfarbstoffkomplexes gew~hrleistet die feste Haftung der Markierungssubstanz an das Protein, wodurch die Diffusion yon Farbstoffanteilen in Zellen und Gewebe unm6glich wird [55]. Einher geht damit die mehr oder minder deutliche (immuno-)chemische Alteration

Immunfluoreseenzuntersuehungen in der klinisehen und exp. Dermatologie. I 159

des Proteins und dureh die eingefiihrten Farbstoffmolekiile eine Vergnderung des isoelektrisehen Punl:tes des Proteinfarbstoffkomplexes zum negativeren hin [27, 47, 55,72].

Zur Abtrennuug [60] des freien Fluorehroms Auftragung des Gamma- globulin-l~eaktionsproduktes auf das Gelbett einer Sephadex G 25-S/iule. L/~nge 40 era, Durehmesser 2,5 cm, PackungshShe ca. 30 cm entspre- chend ca. 25 g Sephadex G 25. Elution mit 0,1 m Tris-HC1-Puffer his zum Auftreten fluoroehromfreier Proben bei Sieht- bzw. UV-Kontrolle. Dutch Wasehen mit 2000 ml 0,1 m Tris-HC1-Puffer jeweils Regeneration des Gelbettes mSglieh. Aussehiitteln mit Wasser naeh 2- -3mal igem Gebraueh unter Zusatz weniger Tropfen Chloroform zur Verhfitung yon Bakterien- und Pilzwaehstum [72].

Zur Gewinnung yon homogenen Konjugaten mit definiertem Farb- stoffprotein-Verh/iltnis [28, 72] erfolgt Ionenaustausehehromatographie mit DEAE-SephadexA50 des gereinigten FITC-Gamma-Globulin- konjugates. S~ulenlange 40em, Durehmesser 2,5 era, Paekungsh6he 10 em entspreehend 1,5 g troekener Gelsubstanz (Bearbeitungssehritte sonst wie oben). Elution mit steigender Puffermolaritat yon 0,1 fiber 0,3 bis 0,45 Tris-tICtPuffer . Auffangen yon Proben zu 10 ml, ingesamt 200 ml fiber ca. 5 Std. Verlangsamung der Laufzeiten mit steigender Molarit~tt bei Sehrumpfen des Gelbettes. Regeneration nieht m6glieh.

Der Globulin.. und Farbstoffgehalt der diversen Proben wird am Spektrophotometer an Hand der Extinkt ion bei 280 nm (Gammaglo- bulin) und 495 nm (FITC) gemessen. Die Bereehnung des molaren Ver- h/iltnisses yon Farbstoff zu Immunglobulin erfolgt dutch Einsetzen der Extinktionswerte in bestimmte Formeln (die sieh dureh die Gr6Be ein- zelner Faktoren unterseheiden).

Naeh Voss [7f:] :

M FITC M y - - Globulin

bzw.

FITC

2,86 • (E Konjugat 495 nm) (E Konjuga.t 280 nm) -- [0,37 X (E Konjugat 495 nm)]

1,4 x (E Konjuga~ 495 nm) y -- Globulin ( E Konjugat 280 nm) -- [0,35 X (Konjugat 495 nm)]

Zur Kri t ik und Diskussion der Bereehnungsmethodik sowie tier Fehlerm6gliehkeiten s. ausffihrlieh [8, 9,57,72, 76]. Optimal seheint ein molares FITC-Globulin-Verh~ltnis yon 1 :2--1 :3 ,5 zu sein [28,72]. Konjugate mit diesem Verh/~ltnis kSnnen bei 50--600/0 des eingegebenen Kopplungsproduktes erwartet werden (Abb.5). In einem definierten System, z.B. indirekte I F mit einem Pemphigus vulgaris- oder Pem- phigoidserum [73] bzw. direkte I F mit Erythematodes-Biopsie-Material [16] kann bem'teilt werden, in welehem Umfang das markierte dutch


Abb.5. Immunelektrophorese: Positiver Nachweis yon FITC markiertem AntL tIuman-IgG. Aufgetrennt: Standard-Humanserum. Gelrinne: FITC-markiertes

Anti-Human-IgG

den Eluierungsschri t t s tark verdiinnte Ant i - Immunglobul in -- z .B. mittels Gefriertrocknung -- eingeengt werden mug.

Sehlieglieh ist die immunologische Akt ivi ts wieder mittels Immun- elektrophorese und Immunprgcipi ta t ions techniken zu untersuchen.

Lagerung der markier ten Immunglobul ine jeweils ca. 1 ml in ent- sprechenden Ampullen bei - -20~ Vers (Verminderungen) des AntikSrperti ters [40] sind dann zu beffirchten, wenn Einfrieren und Auftauen 5fter wiederholt werden miissen [55,57]. Sterilisierung der Sera bei Lagerung um 0~ erforderlieh, um Proteinsehs durch Bakterien- bzw. Pi lzwaehstum zu verhindern [55].

III . Gewebebearbeitung

Native Ver~rbeitung des Gewebes; eigene Erf~hrungen mit der Kaltfixations- Par~ffineinbettungsteehnik liegen nicht vor [63]. Ist umgehende Bearbeitung nioht m6glich, Aufbewahrung der Exeisate bei mindestens --20~ in kleinsten Wi*ge- gliischen zur Vermeidung yon Autolyse und Austrocknung.

Hgufig gefibt da.s ,,Sna, p-Freezing" [57] mitte[s fiiissigem Stickstoff oder Kglte- misdmngen und anschliel]ende Lagerung des Materials in Kohlensgureschnee. Die ]~edeutung der Verarheitungsteehnik des Oewebes is~ groB, d~ sekon geringfiigige Denaturie~q]ngen zu einer Anderung immunhistologischer Ergeb~isse fiihren k5nnen (v. Mayersb~ch [55]). Einfrieren und Fixieren bewirken obligat Ver~nderungen, zumindest Verschiebungen yon antigenem kleinmolekularem Material. Wahrend der Inkubation koramt es dureh markierte gepufferte Seren zu verst&rkter Extrak- tion, insbesondere yon Proteinen und Zellbestandteilen, wie gNS und DNS. [36] Die Gefriertrocknung [55] bringt offenbar ebenso ArtefaktmSglichkeiten mit rich, die der nativen und ortsrichtigen Erhaltung yon Zellbestandteilen zuwiderlaufen.

Im einzelnen: Arbeiten am K r y o s t a t Modell CT I der Fa. IEC. Auf- frieren des Gewebes mittels Schnellfroster auf Objekttisch. Arbeits- tempera tur - -20~ Schnit tdicke mSglichst 4 ~. Abnahme der Schnit te veto Messer mittels t rockenem geputz tem 18 • 18 m m Deckglas. Auf- bewahrung bei - -20~ falls unmit te lbare Weiterverarbei tung erst sp~iter mSglich. Ansonsten Luft~rocknung und Lagerung auf meander- fSrmigen Glasrohrschlangen im Abs tand yon ca. 1 cm, eingesetzt in Petri-Schalen yon 9 cm Durchmesser. Zur Kennzeichnung - - gleich- zeitig zur Feuchtha l tung der K a m m e r -- auf dem Boden der Petri-Schale Rundfilterpapier.

Immunfluorescenzmatersuchungen in der klinischen und exp. Dermatologie. I 16i

Unumgs ist Fixation von Hautexcisaten, da nut selten wenig 15sliche hoehmolekulare oder strukturell verankerte Antigene vorliegen. Fixierung kann zur Inaktivierung der immunologisehen Systeme und zur Extraktion der in Zellen vorliegenden Substanzen f~hren [55]. Nach Vorversuehen Fixierung mit peroxydfreiem Aeeton (p.a) bei --20~ /iber 15 rain [17].

Erste Inkubxeion jeweils mit einem Tropfen des zu untersuchenden Serums. Feuehte Kammer. Brutsehrank 37~ Abwaschen 3real je 2--5 min mit 0,45 m Tris-HCI-Puffer, p i t 8,0 unter vorsiehtigem Ab- saugen mit Pipette. Zweite Inkubation unter identischen Bedingungen mit markiertem Anti-guman-Immunglobulin. Erneutes Auswasehen wie oben. Ablaufenlassen der Spiilfliissigkeit. Trocknen der freien Deek- glasflgehe. Bedecken der materialbesehickten Fls mit 1 Tropfen Glycerin-Tris-HC1-Gemiseh (9 : 1). Luftblgsenfreies Auflegen auf an- schliegend besehriftetem Objekttrgger. Lagerung bei ca. --20~ mindestens 4 Woehen m6glieh.

I V. Untersuchung und DoCumentation

Betrachtung der Pr&patate mit (Durehfieht-)UV-Mikroskop Ortho- plan Leitz, tIBO 200-Queeksilber-tIochdruckbrenner. Erregerfilter BG12, gelegentlioh Vorschaltnng yon UG 5. Orange-gelbes Sperrfilter K 530 Leitz.

Dokumentation der Pr/iparate mit Sehwarz-Weig-Photos oder Farb- diapositiven. Benutzung eines h6ehstempfindlichen Films mit giinstiger Korngr6Se : Ilfbrd, H P 4, 27/I0 DIN. Eehandlung des Negativm~teriMs mit firmeneigenem Entwickler wie 29/10 DIN Film.

Kodak High-speed Ektaehrom-Tageslichtfilm mit 23/10 DIN. Tages- liehtfabrikate anderer Hersteller f~ihren zu gelbbraunem Stich der Diapositive, wi~hrend Kunstliehtfilme fgr den Blau-Griin-Bereich ins- gesamt ungtinstig sind (s. dazu [45]). Bei der ersten Aufnahme einer Untersuchungsreihe, z.B. mit Seren steigender Verdannung, wird die Beliehtungszeit mit einer Stoppuhr festgelaatten und die nachfolgenden Aufnahmen mit, der ermittelten Zeit beliehtet, um eine ,,aufwertende Korrektur der Fluoreseenz" dutch den Be]iehtungsautomaten zu verhindern.

C,, Zusammenstellung einer Basisausriistung

Gerdte Braun-Unita-]Pumpe: B. Braun-Melsungen; Elektrortihrer: Janke u. Kunkel,

Stauffen i. Br. ; Gelstanze: Boskamp, Gergtebau KG, Hersel b. Bonn, Josef Klein- Str. 14; Gefriertrocknung: Leybold GT 1,5, K61n-BayenthM; Imraunelektrophorese: Mikrophor-Ger~t Boskamp, Gergtebau KG; Kiihlzentrifuge: SorvMl fib. L. Hor- muth, tIeidelberg-Wiesloch; Kryostat: IEC, Needham Heights, M~ss., USA; pH-Meter: Knick Typ 34, Knick, Berlin 37, Katharinenstr. 2--4; Elektroden: In-


gold, Frankfurt a. lYL, GrSnerstr. 5; Quecksilberhochdruckbrenner: Osram HBO 200; Sephadex-Chromatographierohr: Pharmacia, Uppsala/Schweden: K 24/25, K25/100, K15/30; Spektrophotometer: PMQII, Zeiss, Oberkochen; Xfivetten 0,5 cm Quarz; UV-Mikroskop: Orthoplan mit 0rthomatkamera, Leitz, WetzIar.

Chemikalien

Aluminimnhydroxid l~ Suspension, Behring-Werke, Marburg; Agar- (Reinagar); Behring-Werke ffir Immunelektrophorese und Geldiffusion; Amido- Schwarz 10B, Merck, Darmstadt; Antiseren: Antihumanglobulin, Anti-IgA, Anti-IgG, Anti-IgM, Behring-Werke; Hyland Antihumanglobulin Anti-IgA, Anti-IgG, Anti-IgM tiber Travenol, Miinchen. Dialysierschlauch: Visking-Dialy- sierschlauch fiber Serva-Entwicklungslabor, Heidelberg; Filmmaterial: Schwarz- WeiB: Ilford HP 4 27-29/10 DIN; Farbe: Kodak High-speed Ektachrom 23/10 DIN Tageslicht; Fotoentwickler: Retinal; Fotopapier: Agfa -- extra hart weifl; Lupex (Kontaktabzfige); Brovira (Vergr5Berungen); Gamma-Venin 500rag Human- Gammaglobulin, Behring-Werke; Sephadex-Gel, Sephadex-DEAE, Pharmacia Uppsala, Schweden.

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Dr. reed. Volker Misgeld Christa Meisel Klinikum Steglitz, Hautklinik Freie Universit~t Berlin D-I000 Berlin 45, Hindenburgdamm 30

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Immunfluorescenzuntersuchungen in der klinischen und experimentellen Dermatologie