Immunologische Nachweismethoden

Block „Molekularbiologische Arbeitstechniken“

29.10.2004

Sandra Niemeier

Gliederung

• Antigene

• Antikörper

• Antigen-Antikörper-Reaktion

Was passiert nach dem Protein-Blotting?

• Nachweisreaktion durch Antikörper

• Visualisierung

Maus-Antikörper

Einleitung

Begriff der Antigene und Antikörper aus Immunologie

Antikörper in Organismen von Vertebraten unterscheiden

zwischen Eigen und Fremd; spezifische Abwehr von

Pathogenen (Mikroorganismen, Viren)

Wandelbares + adaptives Immunsystem

Hohes spezifisches Bindungsvermögen als

Nachweismethode für versch. Substanzen in Bioanalytik

einsetzbar

Antigene

• Immunologie: Begriff definiert durch „passenden“

Antikörper; lösen Immunantwort aus

• Proteine, Polysaccharide, selten Glycolipide, synthetisch

hergestellte Makromoleküle

• Teilbereiche auf Ag-Oberfläche

reagieren mit Ak

(Epitope, 5-8 Aminosäuren)

Antigene

Voraussetzungen für Immunogenität:

Chemische Differenz des Ag zum immunisierten Individuum

(evolutionäre Distanz)

Größe mind. bis 5-10 kDa

(kleinere Peptide müssen gekoppelt werden)

Zugänglichkeit der Epitope für Ak

(durch Denaturierung teilw. zu verbessern)

Potenz der Epitope bedingt durch Seitenketten der AS:

polare + große Seitenketten sehr bestimmend

Antikörper

• Glycoproteine, sog. Immunglobuline

• Produziert von B-Lymphocyten ( => Knochenmark)

• Antikörperklassen Ig A, D, G, E, M

IgG = 75% der Ak im Organismus

meist gebrauchter Ak für Nachweisreaktionen

leicht zu gewinnen aus Serum nach Immunisieren von Tieren gut löslich, bei 4ºC lange lagerbar

kann mit anderen Substanzen kovalent gekoppelt werden

Größe: 150 kDa

Antikörper

4 UE:

2 ident. leichte Ketten L

2 ident. schwere Ketten H

Y-förmiges Molekül durch

Disulfidbindung und nicht

kovalente WW

Leichte Kette

Schwere Kette

Antigen-Bindungsstelle besteht aus variabler Region der H- und L-Kette

Antikörper - Handhabung

Problem: 1) Verlust der Antikörperaktivität

Schädigung durch bakterielles Wachstum oder

Aggregieren der Moleküle

Lagerung bei 4ºC + Natriumazid

Hinzufügen von 1% BSA2) Austrocknung durch Einfrieren

Ak am stabilsten in Form von Antiserum

Einfrieren kein Problem

Austrocknen bei Einfrieren kleiner Mengen

Röhrchen fest verschließen, Raum über Probe

mögl. klein halten, T-Schwankungen vermeiden

Antigen-Antikörper-Reaktion

Bindung durch

van-der-Waals-Kräfte,

hydrophobe + ionische WW,

Wasserstoffbrückenbindungen

Dissoziationskonstante 10-4 – 10-10 M

(vergleichbar/größer als Enzym + Substrat)

Antikörper meist divalent -> Bindung von 2 Antigenen

Nachweisreaktion

Wenn zu untersuchendes Protein auf Membran geblottet ist… 1) Absättigen des Protein-Blots (Blocking):

Um überschüssige Proteinbindestellen auf Membran zu sättigen

Verhindert unspez. Bindungen der Nachweisreagenzien

schwach gebundene Proteine können abgelöst werden

Trocknen der Membran vor Auftragen d. Blocking-Reagenz

Welche Lösungen?

Nicht-ionische Detergenzien (Tween 20), nicht relevante Proteine (BSA), Proteinmischungen, Milchpulver, Kombis daraus

! Kreuzreaktionen mit Ak ausschließen

Nachweisreaktion

2) Bindung des Erst-Antikörpers

Ak bindet an Protein auf Membran (nicht sichtbar)

Inkubation 1-6 h bei RT oder üN bei 4ºC

Gründliches Entfernen der Lösung (TBS)

3) Bindung des Zweit-Antikörpers an Erst-Antikörper

Erforderlich zur Visualisierung

Aus anderer Spezies als Erst-Antikörper

Zweit-Antikörper an Enzyme, Radionuclide,

Fluoreszenzfarbstoffe gebunden

Nachweisreaktion

Weitere Brückenmoleküle anlagern um noch

größere Verstärkung zu erzielen (Dritt- oder

Viert-Antikörper)

Verstärkung des Signals, da mehrere Zweit-

Antikörper an Erst-Antikörper binden können

Beispiel: Biotin-Avidin-Signalverstärkersystem

Avidin bindet mit sehr hoher Affinität an Biotin

am Zweit-Ak

Avidin ist tetravalent, bindet 3 Enzymmoleküle

Vervielfachung des Signals

Visualisierung

4) Geblottetes Protein mit gebundenen Antikörpern sichtbar machen

A)Zweit-Antikörper trägt Radionuclid-/Fluorophormarkierung

Direkte Visualisierung

Radioaktiver Abfall

Hoher apparativer Aufwand

Radionuclide gut zur Quantifizierung geeignet

(Visualisierung mit Röntgenfilm + Messung am

Szintillationszähler)

Visualisierung

B) Enzym-Markierung

Indirekte Visualisierung

Welche Enzyme?

Meerrettichperoxidase (günstig, wenig sensitiv)

Alkalische Phosphatase (hohe Sensitivität, aber teuer)

Seltener ß-Galaktosidase

ODER: Lichtemittierendes Produkt (Chemilumineszenz)

1 Enzymmolekül setzt viele Substratmoleküle um => Verstärkung

Zur Quantifizierung nur eingeschränkt geeignet (Farbintensität

schwer unterscheidbar)

Visualisierung

Beispiel: Meerrettichperoxidase-System

Zweit-Antikörper hat Meerrettich-

Peroxidase gebunden

Zugabe von

3,3‘Diaminobenzidin

Umsetzung zu braunem

Farbkomplex

• Photographieren, einscannen, bei RT im Dunkeln für kurze

Zeit lagern

Das war‘s, Das war‘s,

Danke für die Danke für die Aufmerksamkeit!Aufmerksamkeit!