-ARTíCULO DE REVISIÓN-

Infección por herpesvirus en tortugas mediterráneasANTONIO 1. RAMIS

Departamento de Medicina y Cirugía. Facultad de VeterinariaUniversitat Autònoma de Barcelona. 08193- Bellaterra, Barcelona

Resumen. La infección por herpesvirus en tortugas terrestres es una enfermedad que afecta especialmente alas vías respiratorias altas. Está descrita en diferentes especies de tortugas, incluídas Testudo graeca y Testudohermanni, que forman parte de la población salvaje de la cuenca mediterránea, En este trabajo se realiza unarevisión de los diferentes aspectos de la enfermedad haciéndose especial hincapié en la epidemiología y el diag-nóstico del proceso.

Palabras clave: Tortuga; Herpesvirus; Rinitis.

Introducción

Bajo la denominación de complejo rinitis-estomatitisde las tortugas terrestres, también conocida comoURTD (Upper respiratory traet disease) en la biblio-grafía anglosajona, se incluyen una serie de procesospatológicos de etiología muy variada (acción de sustan-cias irritantes, infecciones bacterianas asociadas a hipo-vitaminosis A, infección por micoplasmas ...) que unaexploración clínica poco exhaustiva puede inducir aconfundirlos con la infección por herpesvirus'v. Noobstante el cuadro lesional macro y microscópico y laevolución de este proceso son suficientemente caracte-rísticos para estudiarlo como una entidad independien-te; se trata de una enfermedad de etilogía vírica, produ-cida por un herpesvirus y descrita en diferentes especiesde tortugas terrestres, incluidas Testudo graeea y Testu-do hermanni, que forman parte de la población salvajede la cuenca mediterránea (28).

En 1982 Harper realizó la primera descripción rigu-rosa (historia clínica documentada, observación de laslesiones microscópicas patognomónicas y detección,mediante técnicas de microscopía electrónica de trans-misión, de partículas víricas con una morfología ytamaño compatibles con herpesvirus) de la enferme-dad, en una tortuga del desierto americana (Gopherusagassiziis. Poco tiempo después, en 1985, Jacobson et

al. describieron el mismo proceso en tortugas argenti-nas (Geochelone ehilensis). Finalmente, en 1988, Coo-per et al. describieron la infección en una especie delcontinente europeo (T. graeea). A partir de esta fechanumerosos autores (5,8,18,l9,29) han descrito la enferme-dad en muy diversas especies de tortugas terrestres: T.hermanni, Testudo marginata, Agrionemys horsfieldii,Malaeoehersus tornieri, Geoehelone elongata y Geo-ehelone pardalis. Por otra parte han demostrado([3,18,24,25) la presencia de inclusiones víricas en tejidosde la cavidad nasal u oral de los animales afectados yen otros órganos no asociados a éstas (pulmón, hígado,intestino, riñón, bazo y sistema nervioso central) lo quejustificaría que, en algunos casos, la enfermedad semanifieste con diferentes síntomas además de la rinitisy estomatitis características.A pesar de todo, no se había conseguido el aisla-

miento del agente etiológico hasta que en 1994, conpoco tiempo de diferencia Biermann y Blahak por unaparte y Kabisch y Frost por otra consiguieron aislar elvirus a partir de diferentes órganos de T. hermanni y A.horsfieldii infectadas, en cultivos de células de miocár-dicas de tortuga (THC). No obstante, todavía no se hanconseguido completar los postulados de Koch para estainfección vírica y por otra parte los conocimientosacerca de su etiología, patogenia, epidemiología y posi-ble tratamiento son escasos (9,21,22,23).

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Etiología

Los miembros de la familia Herpesviridae son virusADN de cadena doble, con un diámetro aproximado de100 -150 nm. Su cápside presenta una morfología ico-sahédrica con 162 capsómeros delimitados por unaenvoltura externa. La replicación tiene lugar en el inte-rior del núcleo de las células diana, posteriormentepasan al citoplasma adquiriendo la envoltura lipídica apartir de la membrana nuclear. Los lugares de replica-ción intranuclear a menudo se manifiestan como inclu-siones intranucleares y son visibles mediante micros-copía óptica (28,31).

Muchos herpesvirus son capaces de dar lugar a infec-ciones subclínicas que bajo determinadas circunstanciaspueden activarse y dar lugar a una infección activa; losanimales con infecciones subclínicas son portadores delvirus aunque no manifiesten la enfermedad y son capa-ces de transmitirla a otros individuos. Los herpesvirus,por otra parte, pueden dar lugar a infecciones latentes,que podríamos definir como aquellas en que el genomavírico está presente, pero su expresión genética seencuentra limitada y no existe formación de nuevas par-tículas víricas. Las infecciones latentes también puedenactivarse bajo determinadas condiciones y dar lugar auna infección activa. Los animales con infeccioneslatentes no manifiestan la enfermedad y no la transmitena otros individuos mientras no se reactive la infección (I)

Existen muchos aislados de herpesvirus de queloniosprocedentes de tortugas mediterráneas con cuadros derinitis-estomatitis, aunque la mayoría todavía no hansido estudiados en profundidad y no está clara la relaciónantigénica existente entre ellos. En algunos trabajos,mediante la utilización de enzimas de restricción, se hademostrado que estos herpesvirus no están relacionadosen absoluto con los estudiados en algunas especies desalmónidos (12), con herpesvirus aviares, como el de laenfermedad de Pacheco y el de la peste de los patos (21),

ni tampoco con herpesvirus de mamíferos (30). Finalmen-te, se sabe que los patrones de restricción de algunos ais-lados individuales de la enfermedad estudiados son dife-rentes entre sí, aunque se desconoce si estas diferenciaspueden afectar a sus propiedades antigénicas (21).

Epidemiología y patogenia

Se trata de una enfermedad de distribución universalque desde su primera descripción en una tortuga del·desierto americana (G. agassiziii (11) se ha ido obser-vando en otras especies y en diferentes localizaciones

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geográficas por lo que, mientras no se demuestre locontrario, todas las tortugas terrestres deberían ser con-sideradas como susceptibles de padecerla (28). No obs-tante, según ciertos autores (9,16,22), algunas especies(Geochelone carbonaria, T. graeca), aunque son sus-ceptibles a la infección, parecen ser más resistentes aldesarrollo de la enfermedad.Este proceso se ha descrito siempre en colecciones

privadas y no existe información acerca de la prevalen-cia de la enfermedad en poblaciones salvajes (28).

No se conoce con detalle la vía de infección peroteniendo en cuenta la información existente acerca delos herpesvirus en otras especies animales, parece lógi-co pensar que la vía habitual de contagio es la transmi-sión directa de animal a animal por medio de secrecio-nes: algunos autores han postulado que en los animalesinfectados existe una eliminación más o menos cons-tante de virus a partir de las cavidades oral y nasal,mientras que la eliminación conjuntival o cloacal es detipo intermitente (19,22). Por otra parte, se desconocecuánto tiempo puede permanecer viable el virus en elmedio ambiente (28). Finalmente, aunque no se hademostrado, algunos autores plantean la posibilidad detransmisión vertical (25).

Un problema adicional en el estudio de la dinámicade la enfermedad es la posible existencia de individuosportadores inaparentes (animales con infecciones sub-clínicas o con infecciones latentes), que no ha podidoser demostrada, dado que no existen métodos fiablespara identificar estos animales (21). No obstante, de laobservación de la evolución de algunos brotes, sepuede sospechar la existencia de portadores y que hayespecies con mayor tendencia a convertirse en portado-res inaparentes. Un ejemplo de esto lo constituye unbrote de la enfermedad acontecido en una colecciónmixta de T. hermanni y T. graeca, posteriormente a laintroducción de un ejemplar de T. graeca clínicamentesano: se pudo demostrar que este animal era eliminadorde virus y que presentaba una elevada tasa de anticuer-pos específicos, a pesar de no manifestar síntomas;además, se pudo observar que los ejemplares de T. gra-eca de la colección no enfermaban ni presentabanbajas, mientras que los ejemplares de T. hermanni sí; yque en el conjunto total de la población superviviente yclínicamente sana, la mayoría de T. hermanni seguíaneliminando virus y no presentaban anticuerpos neutra-lizantes específicos, mientras que la mayoría de T. gra-eca no eliminaban virus aunque presentaban elevadosniveles de anticuerpos neutralizantes. Todo esto hacepensar que T. graeca tiene una especial predisposiciónpara defenderse de la enfermedad, convirtiéndose en

Infección por herpesvirus en tortugas mediterráneas

portador inaparente del virus (22). Por lo tanto, es pocorecomendable el establecimiento de colecciones mix-tas, especialmente si incluyen T. graeca.En cuanto a la patogenia del proceso existe muy

poca información contrastada. Aunque este procesoafecta mayoritariamente a las vías digestivas y respira-torias altas, el que se hayan descrito casos con inclu-siones víricas intranucleares en células de diferentesórganos de los animales afectados (pulmón, hígado,intestino, riñón, bazo, testículo y sistema nerviosocentral) (13,18,24,25) hace pensar que se trata de unaenfermedad que cursa con viremiav". En 1997, Mars-chang et al, consiguieron aislar por primera vez elvirus a partir de leucocitos de sangre periférica, lo quedemuestra que el virus penetra en el torrente circulato-rio durante la infección y que éste podría ser el mediode difusión del virus a los diferentes órganos durantela infección.

Cuadro clínico y lesional

Los animales afectados presentan una sintomatolo-gía muy inespecífica: disnea, de intensidad variable enfunción de la gravedad de las lesiones de la cavidadorofaríngea, anorexia y secreción oculonasal. No obs-tante, en muchas ocasiones es fácilmente observableuna conjuntivitis, así como estomatitis, glositis yfaringitis fibrininecrotizantes características del pro-ceso (32) (Fig. 1). Excepcionalmente se han descritocasos de incoordinación y ataxia debido a la afeccióndel sistema nervioso central (13,15). No hay datos muyfiables acerca del índice de mortalidad y morbilidadpero existe un acuerdo general en que este suele serelevado y que varía según las especies (21).

En la necropsia se suelen observar lesiones fibrino-necrotizantes en la mucosa oral, alrededor de la glotis,la faringe, y el techo del paladar, así como en la lenguay en la cavidad nasal (32); aunque no es lo más frecuen-te, estas lesiones se pueden extender a las vías respira-torias bajas (tráquea y pulmón) (29) y/o digestivas(intestino) (19). En el resto de órganos no existen lesio-nes macroscópicas específicas, pero es habitual laobservación de atrofia serosa y esteatosis hepática (32)

y, en algunos casos, bronconeumonías bacterianasasociadas a la infección vírica (29).

Las lesiones microscópicas en las diferentes muco-sas afectadas ( cavidad oral, cavidad nasal, lengua,faringe) son muy similares. En la lámina epitelial,generalmente se observa una hiperplasia que progresi-vamente da lugar a formación de vesículas en el estra-

to espinoso, así como necrosis y descamación de lascapas epiteliales superficiales con formación de pseu-domembranas, compuestas por restos de epitelionecrótico, granulocitos, hematíes y colonias bacteria-nas; también se pueden observar células epiteliales ysincitios con inclusiones intranucleares eosinófilas (29)

(Fig. 3). En otras ocasiones, el epitelio aparece substi-tuido por amplias áreas de material necrótico y fibrina,entre los cuales se pueden detectar abundantes colo-nias bacterianas y restos de células epiteliales y sinci-tios con las inclusiones características (13) (Fig. 4). Enla lámina propia y la submucosa, existen células infla-matorias en cantidad y características muy variables:en las fases iniciales suele observarse un infiltradoinflamatorio de tipo mixto, asociado a los vasos de lasubmucosa; mientras que en fases más avanzadas, elinfiltrado ocupa gran parte de la lámina propia, apare-ce asociado a las zonas de ulceración epitelial y estacompuesto mayoritariamente por células polinuclea-res, restos de material necrótico y acúmulos de colo-nias bacterianas (ll).

También es frecuente la observación de lesionesfocales necróticas, sin infiltrado inflamatorio asociadoe inclusiones intranucleares eosinófilas, en células dediferentes tejidos no asociados al tracto digestivo orespiratorio (13.18.24,25): células hepáticas (Fig. 5), célu-las endoteliales de los capilares glomerulares y epite-lio tubular renal (Fig. 6), linfocitos y células muscula-res lisas de arterias trabeculares del bazo (Fig.7), yneuronas células gliales y ependimarias del diencefaloy la médula oblonga.En el estudio ultraestructural de las células que pre-

sentan inclusiones intranucleares eosinófilas en losdiferentes tejidos se demuestra la presencia de partícu-las víricas de localización intranuclear e intracitoplas-mática. Las partículas víricas intranucleares presentanun diámetro medio de 110 nm, morfología icosahédri-ca, carecen de envoltura lipídica y se localizan en elnucleoplasma sin un patrón de distribución concreto.Las partículas intracitoplasmáticas son morfológica-mente similares pero presentan una envoltura lipídicay su diámetro es mayor (150 nm.) (11.13,16.27).

Diagnóstico

Desgraciadamente, en caso de que no exista un cua-dro clínico y lesional evidentes, el único diagnósticototalmente fiable pasa por la realización de necropsiay los estudios virológicos e histopatológicos consi-guientes (21). No obstante, existen diferentes técnicas

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Fig. 1. Testudo graeca. Conjuntivitis y glositis fibrininecrotizantes.En el interior de la cavidad oral se observan abundantes flecos defibrina recubriendo la parte dorsal de la lengua.

Fig. 3. Lengua. Epitelio lingual. Hiperplasia epitelial y necrosis dealgunas células aisladas. Se observan abundantes células epitelialescon inclusiones intranucleares eosinófilas. Tinción de hematoxili-na-eosina (x 200).

diagnósticas aplicables a animales vivos aunque unainterpretación no adecuada de éstas puede conducir aerrores diagnósticos graves. Las más utilizadas son:estudios citológicos de improntas de lengua, detecciónde partículas víricas en exudados o contenido fecalmediante microscopía electrónica (tinciones negati-vas), técnicas de seroneutralización vírica, y técnicasde aislamiento vírico a partir de exudado nasal, oral,conjuntival o contenido cloacal.En las improntas de lengua de animales afectados es

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Fig. 2. Testudo graeca. En la necropsia se puede observar unaintensa reacción inflamatoria fibrinonecrotizante en la cara dorsalde la lengua, techo del paladar y cavidad faríngea.

Fig. 4. Lengua. Epitelio lingual. Intensa necrosis de la lámina epi-telial que presenta amplias áreas de ulceración. En la lámina pro-pia se observan áreas focales hemorrágicas y un discreto infiltradoinflamatorio. Tinción de hematoxilina-eosina (x 100)

posible observar células epiteliales con inclusionesintranucleares eosinófilas y/o sincitios (Fig. 8) aunquela no detección de estas inclusiones no permite descar-tar en absoluto la enfermedad (10,25). Es un método fácil,rápido y barato, pero es muy poco fiable: se ha de pen-sar que sólo se evalúa una pequeña cantidad de célulasdel epitelio lingual y que no todos los animales enfer-mos, aunque presenten lesiones microscópicas caracte-rísticas de la enfermedad, presentan inclusiones en lascélulas epiteliales (22). La detección de partículas víri-

Infección por herpesvirus en tortugas mediterráneas

Fig. 5. Hígado. Se observa un área focal de necrosis sin infiltradoinflamatorio asociado. Algunos hepatocitos presentan inclusionesintranucleares eosinófilas. Tinción de hematoxilina-eosina (x 400).

Fig. 7. Bazo. Pulpa blanca. Áreas focales de necrosis y depleciónlinfocitaria con presencia de inclusiones intranucleares eosinófilasen células mononucleares. También se observan inclusiones intra-nucleares eosinófilas en fibras musculares lisas y endotelio de laarteriola cental. Tinción de hematoxilina-eosina (x 400)

cas mediante técnicas de microscopía electrónica (tin-ciones negativas) a partir de exudado nasal, oral, con-juntival o contenido cloacal (8) además de ser un siste-ma complejo y caro, presenta inconvenientes similaresal de las improntas linguales: la observación de losvirus dependerá de que el animal esté eliminándolos enel momento de la toma de la muestra, y aun en estecaso, no existe ninguna garantía de que la muestra eva-luada sea representativa.

Fig. 6. Riñón. Corpúsculo renal. Inclusiones intranucleares eosinó-filas en células glomerulares no identificadas. Los túbulos contor-neados asociados al corpúsculo renal presentan una intensa necro-sis del epitelio tubular en el que se pueden observar algunasinclusiones intranucleares eosinófilas. Tinción de hematoxilina-eosina (x 400)

Fig. 8. Impronta de superficie lingual. Se observan células epitelia-les descamadas con inclusiones intranucleares eosinófilas. Tinciónde Diff-Quick (x 1000)

Con técnicas de seroneutralización vírica, se detectala presencia de anticuerpos neutralizan tes específicospara el herpesvirus causante de la enfermedad (9). Estemétodo, como todos los métodos indirectos, presenta elinconveniente de que no detecta agente etiológico sinoque se diagnostica la enfermedad mediante la demos-tración de la presencia de anticuerpos específicos con-tra éste. En el caso de la enfermedad que nos ocupa,existen dos problemas adicionales: no hay información

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conocida acerca de la cinética de los anticuerpos duran-te la infección y el periodo de convalecencia, y no seconoce la relación antigénica entre las diferentes cepasdel virus aisladas (21). En relación con esto último hayque decir que, para algunos autores, las diferentescepas del virus aisladas en Europa están íntimamenterelacionadas y presentan una elevada semejanza anti-génica con lo que en las pruebas de seroneutralizaciónes suficiente la utilización de una sola cepa vírica (9);

mientras que para otros (3), las elevadas diferenciasantigénicas existentes entre los aislados de los diferen-tes brotes obligarían a utilizar varias cepas víricas.A pesar de todos estos inconvenientes, las técnicas de

seroneutralización vírica proporcionan una informa-ción mucho más valiosa que las dos anteriores, espe-cialmente en el caso de colecciones. Aunque no sepueda establecer una relación directa entre la positivi-dad de estas pruebas e infección vírica, se debe tener encuenta que los animales positivos pueden correspondera portadores inaparentes que bajo ciertas condicionespodrían llegar a eliminar virus en grandes cantidades.De la misma manera, aunque un resultado negativo nosirva para descartar totalmente la infección, para algu-nos autores dos pruebas negativas separadas por unperiodo de 6 semanas permiten descartarla (9).

El aislamiento del agente etiológico en cultivos decélulas miocárdicas de tortuga (THC), es la técnicadiagnóstica más específica. En los animales infectadosexiste una eliminación más o menos constante de virusa partir de las cavidades oral y nasal, mientras que laeliminación conjuntival o cloacal es de tipo intermiten-te (19,22) por lo que se recomienda la toma de muestras,mediante hisopo, a partir de exudados de la cavidad yfaríngea (22). A pesar de su elevada especificidad, la téc-nica del aislamiento vírico no es capaz de detectar ani-males seropositivos que no estén eliminando virus en elmomento de la toma de muestras.Podemos, por lo tanto, decir que ni las pruebas sero-

lógicas ni el aislamiento vírico aisladamente permitendescartar la presencia del agente etiológico de la enfer-medad en una determinada colección: se puede dar elcaso de animales sera negativos que estén eliminandovirus, y también animales que no eliminen virus en elmomento de muestreo y que presenten una elevada tasade anticuerpos que los hace sospechosos de ser porta-dores inaparentes. Generalmente, en las cuarentenasprevias a la introducción de nuevos animales en unacolección, se recomienda la utilización simultánea depruebas serológicas y aislamiento vírico (22).

En cuanto al diagnóstico diferencial, independiente-mente de procesos más o menos banales (infecciones

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bacterianas secundarias a hipovitaminosis, acción deagentes irritantes ...), en quelonios existen dos infeccio-nes graves que cursan con rinitis y estomatitis: la infec-ción por iridovirus y la infección por micoplasmas.La infección por iridovirus es un proceso poco cono-

cido, del que hasta ahora sólo existían descripciones decasos esporádicos en T. graeca (14), T. hennanni (26) y G.agasizii (34) y del que recientemente se ha diagnosticadoun brote en T. hermanni, consiguiéndose aislar y carac-terizar el agente etiológico (20). El cuadro clínico y lesio-nal es similar al de la infección por herpesvirus aunqueen los pocos casos que se han descrito, no sólo se cir-cunscribe a la cavidad oral y nasal sino que se extiendeal resto del tracto respiratorio y/o digestivo (14,20,26). Laslesiones histológicas también son similares aunque eneste caso las inclusiones víricas se localizan en el cito-plasma y son basófilas (14,20,26,34). Por otra parte en elbrote descrito en la colonia de T. hermanni, el cuadroapareció simultáneamente con una infección bacterianagrave por Pasteurella testudini, un patógeno oportunistade estas especies, lo que plantea dudas razonables acer-ca de si el iridovirus es el desencadenante del proceso osimplemente es capaz de replicarse en animales debili-tados por un proceso bacteriano previo (20).

La micoplasmosis de los quelonios, no se ha descritohasta el momento en tortugas mediterráneas. Es un pro-ceso infeccioso producido por Mycoplasma agassizii, ygeneralmente asociado a complicaciones secundariasdebidas a bacterias Gram negativas. Presenta un eleva-do índice de mortalidad y se caracteriza por una rinitisseropurulenta, intermitente, que en muchas ocasionesllega a cronificarse, pudiendo llegar a producir obstruc-ciones de las vías respiratorias altas por acumulaciónde material caseoso en las luces de éstas, así como des-hidratación y caquexia del animal en los estadías ter-minales. En principio es una enfermedad circunscrita alas vías respiratorias altas y no se conocen formas sis-témicas del proceso (6,23,33). El cuadro lesional micros-cópico se caracteriza por la presencia de infiltradoinflamatorio en la submucosa y en la lámina propia endiferentes grados de intensidad según la gravedad delproceso. Solamente si la inflamación es muy intensa sepuede observar degeneración, necrosis y perdida de lalámina epitelial aunque en ningún caso se observaninclusiones víricas en las células epiteliales (15).

Tratamiento y profilaxis

El tratamiento de elección son los compuestos antivíri-cos, mientras que los antibióticos pueden ser útiles para

Infección por herpesvirus en tortugas mediterráneas

evitar infecciones secundarias. En estudios experimenta-les in vitro se ha demostrado que el aciclovir y el ganci-clovir son capaces de reducir la replicación vírica en cul-tivos celulares, aunque no existe información rigurosasobre su comportamiento in vivo (22). Para algunos auto-res (28,32) la aplicación local de pomadas con aciclovir al5% mejora la evolución de las lesiones, y la utilizaciónde aciclovir, vía oral, a dosis de 80 mgIKg/día puede serefectiva en animales sospechosos de padecer la enferme-dad. Finalmente, la administración intramuscular deenrofloxacina (lO mglKg/día) ha demostrado ser efecti-va en cuanto a la reducción del número de bajas, por eli-minación de infecciones bacterianas secundarias (27).

En cuanto a profilaxis se recomiendan periodos decuarentena de 90 días como mínimo (28), y la realiza-ción de pruebas de seroneutralización y aislamientovírico a partir de secreciones de la cavidad faríngeadurante este periodo (22).

Las medidas de desinfección dependen mucho deltipo de alojamiento: en los alojamientos al aire librese recomienda hacer rotaciones, dado que se suponeque el virus es incapaz de sobrevivir en el medioambiente y se inactiva a las pocas semanas; si losanimales se mantienen en jaulas metálicas o de plás-tico se recomienda desinfectarlas con hipo cloritasódico al 3% (28).

Surnmary. Herpesvirus infection in tortoises is a disease in which sick animals mainly show upper respiratory signs. It hasbeen observed in several species of tortoises including Testudo graeca and Testudo hermanni, both part of the wild reptilepopulation in the mediterranean basin. This paper is a review of the different aspects of this infection with special emphasi-ze on the epiderniology and diagnosis of the disease.

Key words: Tortoise; Herpesvirus; Rhinitis.

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