Convocatoria 2011: Proyectos Multidisciplinarios de Investigación Científica y Desarrollo Tecnológico

INFORME DE AVANCES Febrero 2012

Proyecto multidisciplinario (clave registro: 1320)

Diversidad y aplicaciones biotecnológicas de estreptomicetos aislados de suelos

agrícolas de México

Directores de módulos

Dra. Erika Teresa Quintana Cano (ENCB) Dr. Mario Alonso Bueno Ibarra (CIIDIR SIN)

Dra. Melina López Meyer (CIIDIR SIN) Dra. Claudia Castro Martínez (CIIDIR SIN)

Coordinadora del proyecto

Dra. Melina López Meyer /CIIDIR SIN

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RESUMEN

Los estreptomicetos son microorganismos que habitan una gran variedad de ambientes. Son bacterias del grupo de los actinomicetes y poseen capacidad para la producción de una enorme variedad de metabolitos secundarios, muchos de los cuales se utilizan como fármacos. En sistemas agrícolas, existen evidencias de que este tipo de microorganismos pueden ser efectivos para el control de fitopatógenos. Además, organismos estreptomicetos pueden ser fuente de enzimas de utilidad industrial. Se considera que este grupo de organismos representa la fuente de nuevos productos, no solamente farmacológicos sino con otras aplicaciones, por lo que su aislamiento y caracterización es de relevancia biotecnológica. Por todo esto, en el presente proyecto multidisciplinario se ha propuesto el estudio de estreptomicetos aislados de suelos de México, con los siguientes objetivos: 1) determinar su diversidad y establecer su filogenia, y caracterizar su potencial como antagonistas a patógenos de importancia en la medicina, 2) analizar la secuencia a nivel de ADN de sus regiones biosintéticas y relacionarla con su actividad biológica, 3) caracterizar su potencial uso en la agricultura como antagonistas a fitopatógenos, y 4) evaluar y seleccionar estreptomicetos con potencial celulolítico para su posible uso en la producción de bioetanol. En esta primera etapa, la posición filogenética de estreptomicetos antagonistas a patógenos de importancia médica así como a aislados estreptomicetos causantes de la roña de la papa ha sido concluida. Los análisis moleculares (por REP-PCR) de diversidad de una colección de 126 estreptomicetos aislados de suelos de México ha sido concluida, y está por finalizarse la comparación de secuencias de la región 16S. El análisis de presencia/ausencia de rutas biosintéticas tipo PKSI, PKSII y NRPS por PCR ya se ha obtenido; sin embargo, el análisis de las secuencias de estos productos amplificados está aún por iniciarse. Los trabajos referentes a la separación química para la caracterización de las fracciones bioactivas deberán iniciarse y concluirse en esta segunda etapa. A la fecha, ya han sido finalizada la caracterización del potencial antagonismo de la colección de estreptomicetos contra los fitopatógenos Sclerotinia sclerotiorum y Macrophomina sp. bajo condiciones in vitro y están por iniciarse experimentos a nivel maceta. Además quedaría por realizarse un ensayo en campo en el ciclo otoño-invierno con el mejor aislado seleccionado contra S. sclerotiorum. Se montó la metodología para identificar aislados microbianos capaces de producir ácido indol acético, y por ende, con capacidad para actuar como promotores de crecimiento vegetal. Se ha logrado identificar un aislado con dichas características y su efecto en planta será probado en esta segunda etapa del proyecto. Además, se pudieron identificar y seleccionar aislados estreptomicetos con potencial celulolítico, lo cual los hace candidatos para ser usados en la degradación de biomasa celulolítica (por ejemplo: residuos agrícolas) y en la subsecuente producción de biocombustibles de segunda generación (bioetanol), así como en diferentes procesos biotecnológicos.

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INTRODUCCIÓN

En el orden Actinomycetales, el género Streptomyces es la fuente prolífica más destacada de metabolitos bioactivos, tales como antibióticos e inhibidores de enzimas (Bérdy, 2005). Los actinomicetos están ampliamente distribuidos en la naturaleza, habitando ambientes muy diversos como: sedimentos costeros, sedimentos marinos, bosques pantanosos, praderas sujetas a inundaciones y rizósferas de plantas. Incluso algunos miembros son conocidos por formar asociaciones íntimas con plantas e insectos (Trujillo et al., 2006; Trujillo et al., 2007; Thawai et al., 2007; Kirby & Meyers, 2010, Hirsch & Valdés 2009, Wang et al., 2011). La clase Actinobacteria es uno de los grupos bacterianos más complejos que existen ya que sus representantes son muy difíciles de identificar con base en la morfología macroscópica y microscópica. A nivel molecular la filogenia e identificación de esta clase se inició mediante la secuencia del gen 16S rDNA (Stackebrandt et al., 1997). Profundizar en la variabilidad dentro de la clase Actinobacteria no solo ayudaría a entender la ecología y fisiología de estos organismos, también a descubrir candidatos potenciales que impacten o se pudieran utilizar en procesos biotecnológicos o en la producción y explotación de productos biológicos de alto nivel económico de origen microbiano. Los microorganismos del género Streptomyces o estreptomicetos, son bacterias Gram-positivas con un alto contenido de guanina-citosina en su DNA (G+C, >74%), son organismos aerobios, con un intervalo de crecimiento entre 25 a 30 °C y generalmente a un pH neutro. Su morfología varía dependiendo de la especie, sin embargo, la gran mayoría forman micelio aéreo y cadenas de esporas, las cuales son estructuras de sobrevivencia (McCarthy y Williams, 1992). El género Streptomyces ha sido objeto de diversas investigaciones, tanto de estudios taxonómicos clásicos, como de sistemática molecular, ya que representan la fuente microbiana más promisoria en la producción de metabolitos secundarios. Aunque estos microorganismos son reconocidos por su gran importancia farmacológica, los estreptomicetos son también ampliamente utilizados contra la lucha biológica para la reducción de enfermedades fúngicas de ciertas plantas gracias a sus propiedades antagonistas, (Dommergues y Mangenot, 1970; Goodfellow y Williams, 1983) basadas en su capacidad de producción de antibióticos. Los antibióticos sintetizados por los estreptomicetos exhiben una gran variedad de clases y estructuras químicas. Los poliquétidos son un grupo de metabolitos secundarios que exhiben una amplia diversidad en su estructura y función. Los productos naturales de los poliquétidos son conocidos por su amplio espectro de actividades de importancia farmacológica, que incluyen propiedades antimicrobianas, antiparasíticas y antitumorales. Los poliquétidos son el resultado de reacciones secuenciales catalizadas por las enzimas llamadas poliquétidos sintasas (PKS, del inglés). Las poliquétido sintasas (PKS) del tipo I son proteínas funcionales relativamente grandes que pueden procesar la síntesis de macrólidos como eritromicina, aureotina y lovastatina. Las PKS modulares representan una única clase de poliquétido sintasa tipo I. Las poliquétido sintasas del tipo II están formadas de un complejo de proteínas monofuncionales. Los sitios activos de estas sintasas están comúnmente distribuidos

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entre varios polipéptidos monofuncionales pequeños. Estas enzimas catalizan la formación de moléculas que requieren aromatización y ciclación sin la reducción extensiva o ciclos de reducción/deshidratación. Estas sintasas son análogas a sintasas de ácidos grasos bacterianos. Las poliquétido sintasas de tipo II son responsables de la biosíntesis de actinorhodina en S. coelicolor y además en la biosíntesis de tetracenomicina y doxorubicina. Con respecto a los péptidos no ribosomales, ellos son parte de una familia de productos naturales complejos, que pueden ser encontrados en bacterias y hongos donde son sintetizados por péptidos sintasas no ribosomales (NRPS, del inglés), las cuales son proteínas multifuncionales y multimodulares de alto peso molecular. Una de las características de los sistemas NRPS es su capacidad para incorporar aminoácidos proteinogénicos así como aminoácidos no proteogénicos en los péptidos que son sintetizados. Algunas veces, estas enzimas NRPS trabajan en conjunto con enzimas PKS para generar productos híbridos. Por otro lado, los actinomicetos producen numerosas enzimas, las cuales se utilizan en la industria agro-alimentaria, medicinal y algunos estudios mencionan que están involucrados en la degradación primaria de materia orgánica en compostas y materiales similares (Goodfellow y Williams, 1983) ya que son capaces de excretar una gran variedad de enzimas, incluyendo aquellas involucradas en la degradación de celulosa, hemicelulosa y lignina. Estos resultados indican el posible uso de estas enzimas en diferentes procesos biotecnológicos, especialmente para la producción de bioetanol.

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OBJETIVOS Y METAS CUMPLIDAS POR MÓDULO

(indicando el avance global del proyecto multidisciplinario) AVANCE GLOBAL DEL PROYECTO MULTIDISCIPLINARIO: 60% MODULO I. Diversidad y filogenia de estreptomicetos con potencial

biotecnológico aislados en México. Dra. Erika Teresa Quintana Cano (ENCB)

OBJETIVO 1. Establecer la posición filogenética de aislados del género Streptomyces aislados de suelos de México que tienen efecto antagonista frente a hongos fitopatógenos de importancia agrícola.

META. Establecimiento de la posición filogenética de al menos 200 aislados seleccionados del género Streptomyces incluyendo aislados con actividades antagonistas a patógenos de importancia agrícola, médica y causantes de la roña de la papa en México.

70%

OBJETIVO 2. Establecer la posición filogenética de aislados del género Streptomyces que tienen efecto antagonista frente a hongos filamentosos y levaduriformes de importancia médica en México.

100%

OBJETIVO 3.Establecer la posición filogenética de aislados de estreptomicetos causante de la roña de la papa en México.

100%

MODULO II. Análisis de secuencias de regiones biosintéticas de estreptomicetos y su relación con su actividad biológica contra

fitopatógenos. Dr. Mario Alonso Bueno Ibarra (CIIDIR SIN)

OBJETIVO 1. Establecer la posición filogenética de estreptomicetos aislados de suelos agrícolas de México que presentan las regiones de genes biosintéticos (PKS I, PKS II y NRPS).

META: Establecimiento de la posición filogenética de al menos 200 aislados seleccionados del género Streptomyces con presencia de genes biosintéticos.

50%

OBJETIVO 2. Determinar el potencial biosintético de los aislados estudiados mediante la secuenciación de genes PKS I y PKS II y NRPS.

META. Determinación del potencial biosintético de los aislados que presenten regiones biosintéticas PKS I, PKS II y NRPS mediante la secuenciación de estas regiones.

10%

OBJETIVO 3.Obtener fracciones para separar los componentes bioactivos y determinar la efectividad de cada fracción mediante bioensayos de antagonismo.

META. Obtención de fracciones para separar parcialmente los componentes bioactivos.

0%

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OBJETIVO 4.Analizar la efectividad biológica de los extractos parciales de aislados con regiones biosintéticas (PKS I y II y NRPSs) en hongos fitopatógenos.

META. Determinación de la efectividad de las fracciones obtenidas en bioensayos de antagonismo.

0%

MODULO III. Caracterización del potencial biotecnológico de estreptomicetos en la agricultura

Dra. Melina López Meyer OBJETIVO 1. Establecer la posición filogenética de aislados del género Streptomyces aislados de suelos de México que tienen efecto antagonista frente a hongos fitopatógenos de importancia agrícola.

META: Establecimiento de la posición filogenética de al menos 200 aislados seleccionados del género Streptomyces incluyendo aislados con actividades antagonistas a patógenos de importancia agrícola (S. sclerotiorum, Macrophomina sp. y Fusarium sp.)

85%

OBJETIVO 2. Seleccionar estreptomicetos con propiedades antagonistas contra hongos fitopatógenos (Macrophomina spp., Sclerotinia sclerotiorum, Fusarium spp.)

META: Selección de al menos 1 aislado de estreptomiceto con propiedades antagonistas por cada uno de los siguientes fitopatógenos (Macrophomina spp. Sclerotinia sclerotiorum y Fusarium spp).

50%

OBJETIVO 3. Seleccionar estreptomicetos con propiedades promotoras de crecimiento vegetal (productoras de compuestos tipo auxinas)

META: Selección de al menos 1 aislado de estreptomiceto con capacidad de promoción de crecimiento vegetal.

100%

OBJETIVO 4. Determinar la efectividad en campo de los aislados seleccionados biopesticidas y promotores de crecimiento vegetal.

META: Determinación a nivel de maceta y campo de la efectividad de los aislados esteptomicetos seleccionados como antagonistas a fitopatógenos y promotores de crecimiento.

0%

MODULO IV. Evaluación y selección de estreptomicetos nativos de suelos agrícolas de México con potencial celulolítico y su

producción masiva Dra. Claudia Castro Martínez

OBJETIVO 1. Evaluar el potencial celulolítico de estreptomicetos nativos de suelos agrícolas de México con potencial celulolítico y seleccionarlos.

META. Selección de al menos 2 aislados de estreptomicetos con potencial celulolítico.

100%

OBJETIVO 2. Establecer las condiciones de producción masiva de estreptomicetos seleccionados con actividad celulolítica (fermentador 2 L).

META. Establecimiento de las condiciones de producción de Estreptomicetos con elevada actividad celulolítica a nivel fermentador (2 L).

0%

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MÉTODOS Y MATERIALES

Módulo I. Diversidad y filogenia de estreptomicetos con potencial biotecnológico aislados en México. Dra. Erika Teresa Quintana Cano (ENCB) Extracción de DNA Para realizar la extracción de DNA se cultivará con la técnica de estría cruzada y con una asa bacteriológica (previamente esterilizada) cada uno de los aislados y se incubaran a 30 ºC, 7 días. Se preparán para cada aislado tubos estériles Eppendorf de plástico (ca. 1.5 mL) y se les agregarán 100 µg de perlas de vidrio (Sigma-Aldrich, EUA) y 500 µL de buffer Glucosa-Tris-EDTA (GTE, Sambrook, 2009). Dos asas de biomasa de cada aislado se colocarán en su correspondiente tubo. Los tubos se agitarán constantemente en un Vórtex a velocidad máxima durante 15 minutos. Los tubos se centrifugaran en una microcentrífuga (Eppendorf, USA) a velocidad máxima (14,000 rpm) durante 15 min. El líquido (entre 300-400 µL) se transferirá a un nuevo tubo Eppendorf limpio, seco y estéril. Se agregará el mismo volumen de solución de lavado Fenol:Cloroformo:Alcohol Isoamílico (25:24:1; v/v; Sigma, USA) y los tubos se centrifugarán nuevamente a velocidad máxima durante 10 minutos. El sobrenadante (aproximadamente 250-300 µL) se transferirá a un nuevo tubo limpio, seco y estéril. Los ácidos nucleicos se precipitaran con una solución de etanol (100%). Los tubos se centrifugarán a máxima velocidad por 15 minutos. El líquido se decantará evitando en todo momento perder la pastilla de DNA. Los ácidos nucleicos se lavarán dos veces con una solución de etanol al 70%. El sobrenadante se desechará por decantación y los tubos (con la pastilla de ADN) se invertirán sobre papel absorbente aproximadamente 5 horas para evaporar el exceso de etanol. Una vez seco el tubo, se agregará en cada tubo 50 µL de solución Buffer 1X Tris-EDTA (TE; pH 8.0) para reconstituir la pastilla de DNA. El material genético se mantendrá en congelación a -20 °C. Reacción en cadena de la polimerasa Preparaciones necesarias para PCR se realizarán agregando 100 ng de DNA a un tubo estéril Eppendorf para preparar un volumen final de 50 µl con 0.2 mM de cada nucleótido o dNTPs, 0.4 µm de cada primer o iniciador universal (27f y 1525r; Lane, 1991), 1.5 mM de MgCl2 y 1.25 Unidades de BioTaq DNA polimerasa y finalmente 1X Buffer de reacción. Controles de PCR sin DNA se prepararan al mismo tiempo que aquellos conteniendo DNA de los microorganismos aislados. La amplificación de los productos de PCR se realizará en un Termociclador (Techne TC-512) de acuerdo al siguiente programa: desnaturalización inicial a 95°C durante 5 minutos, seguido por 30 ciclos de 94°C, 55°C y 72°C y una incubación final de 72°C durante 10 minutos. La visualización del producto de PCR se realizará como se describió en el punto anterior. Secuenciamiento del gen ribosomal 16S rRNA Los productos de PCR se enviaran a secuenciar al Instituto de Biología, Campus Ciudad Universitaria. El secuenciamiento se realizará en un secuenciador capilar modelo 3100 Genetic Analyzer.

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Análisis de las secuencias e identificación de los microorganismos aislados La secuencia de cada aislado se recibirá en un formato “abi” (extensión del programa CROMAS). La secuencia se exportará a formato FASTA (del inglés; formato de texto utilizado para representar las secuencias de las pares de bases que se manifiestan usando códigos de una única letra) utilizando el menú del programa CROMAS, seleccionando la opción “edit”, después “Copy sequence to Clipboard” y finalmente “Fasta format”. Una vez transformada la secuencia y exportada en formato FASTA y con la ayuda del internet se buscará en la página principal de la base de datos llamada GenBank (del inglés; banco de genes, en español) o NCBI (National Center for Biochectonogical Information, por sus siglas del inglés; http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Una vez en GenBank, se seleccionará el hipervínculo “BLAST” (del inglés, no hay traducción al español), después “nucleotides” (nucleótidos, en español) y se insertará la secuencia. La base datos realizará la comparación de la secuencia “problema” con todas aquellas depositadas en la base de datos (toma alrededor de 30 o 60 minutos la búsqueda) y automáticamente se abrirá una ventana con el resultado, obteniendo una lista en orden decreciente en porcentaje (%) respecto a la similitud de los diferentes microorganismos comparados. Estudios filogenéticos de los actinomicetos aislados Las secuencias de los aislados se ensamblaran utilizando en programa Phydit (Chun, 1995; http://plaza.snu.ac.kr/~jchun/phydit/) y el alineamiento de los nucleótidos se realizará de manera visual corrigiendo aquellos posibles errores que el mismo programa no pueda detectar. Posteriormente las secuencias ensambladas se transportarán al programa Treecon y con este programa se realizarán los árboles filogenéticos correspondientes. Los programas antes mencionados son de acceso público. Módulo II. Análisis de secuencias de regiones biosintéticas de estreptomicetos y su relación con su actividad biológica contra fitopatógenos. Dr. Mario Alonso Bueno Ibarra (CIIDIR SIN)

Extracción de DNA Tanto las cepas tipo como los aislados de estreptomicetos serán crecidos en medio GYEA a 28 °C por siete días. La extracción de DNA genómico con el reactivo de DNAzol de acuerdo a las instrucciones del fabricante.

PCR utilizando Oligos específicos de PKS y NRPS para actinomicetos Para amplificar regiones del genoma que contengan el dominio de los genes del sistema PKS I se utilizar oligos “Consenus ketosyntasas” (KS): K1F (5’-TSA AGT CSA ACA TCG GBC A-3’) y M6R (5’-CGC AGG TTS CSG TAC CAG TA-3’). Para el dominios PKS II se usarán KS-alfa (5’-TSG RCT ACR TCAA CGG SCA CGG-3’) y KS-beta (5’-TAC SAG TCS WTC GCC TGG TTC-3’). Para dominios de adenilación NPRS y son A3 (5’- GCS TAC SYS ATS TAC ACS TCS GG-3’) y A7R (5’- SAS GTC VCC SGT SCG GTA S -3’) .Para la amplificación de PCR se tomará 5 μl de DNA genómico producto de la extracción, 0.4 μM de cada oligo, 0.2 mM de cada uno de los 4 dNTPs (Bioline), 1 U de Taq polimerasa (Bioline) con su buffer recomendado y 10 % de DMSO en un volumen final de 50 μl. La reacción de PCR se llevara a cabo en un termociclador (Biorad) y se programará de la siguiente manera: para inicio de 95 °C

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por cinco min, 35 ciclos de 94 °C por 30 s, 55 °C por 2 min para K1F/M6R, 58 °C para KS-alfa/KS-beta y 59 °C para A3F/A7R, y 72 °C por 4 min seguido de un paso final de 72 °C por 10 min. El DNA amplificado será separado electrofotéticamente y visualizado bajo luz UV y fotografiado con un fotodocumentador Chemidoc (Biorad). Secuenciación Los productos de PCR serán limpiados y enviados a secuenciar al laboratorio de secuenciación de LANGEBIO, en CINVESTAV, Guanajuato. Análisis de las secuencias El desarrollo de nuevos algoritmos y aplicaciones en el área de bioinformática es fundamental para dar solución a las problemáticas actuales en el análisis de información provenientes de grandes volúmenes de datos, así el análisis de secuencias derivado de estos organismos se realizará por técnicas convencionales como BLAST del Genbank y el módulo de CLC GWB, sin embargo se desarrollará un conjunto de algoritmos explotando las técnicas actuales de secuenciación masiva, innovando en alguna de estas técnicas, tratando de obtener un conjunto de algoritmos prototipo para el análisis automático de las secuencias de estos genes (PKS I, PKS II y NPRS). La plataforma y base del desarrollo computacional será en base a Matlab utilizando su “toolbox” de bioinformática y por medio de ésta generando se generará las funciones prototipo para lograr los objetivos de análisis planeado en esta propuesta. Fraccionamiento del medio de cultivo de estreptomicetos 50 ml de medio de cultivo de cada uno de los aislados seleccionados por la presencia de genes biosintéticos serán fraccionados por partición en matraces de separación de manera secuencial con solventes de polaridad descendente. Se contarán con al menos tres fracciones por aislado: fracción acuosa (completa), fracción con acetato de etilo y fracción con hexano. Cada fracción será secada en un rotavapor y resuspendida en un volumen pequeño de metanol u otro solvente adecuado para ser agregado al medio de cultivo PDA para llevar a cabo los bioensayos de antagonismo. Módulo III. Caracterización del potencial biotecnológico de estreptomicetos en la agricultura. Dra. Melina López Meyer (CIIDIR SIN) Pruebas de antagonismo in vitro Cepas de los fitopatógenos utilizados serán obtenidos de los laboratorios de Ecología de la Rizosfera del CIIDIR SIN para el caso de Fusarium spp., del cepario del CIAD-Culiacán para el caso de Macrophomina spp., y del propio laboratorio de Interacción microorganismo-planta del CIIDIR SIN para el caso de S. sclerotiorum.

La actividad antifúngica para cada aislado estudiado se determinará mediante la técnica de difusión de disco la cual brevemente consiste en cultivar los estreptomicetos en medio PDA por 10 días para posteriormente transferirle un disco (11 mm de diámetro) de micelio de Sclerotinia sclerotiorum, Macrophomina spp y Fusarium spp. Las placas se incuban a 28°C por 4 días y se mide el diámetro de los halos de inhibición para cada patógeno. Los aislados que causan un mayor % de inhibición son seleccionados para ensayos posteriores.

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Pruebas de antagonismo y promoción de crecimiento en maceta Plantas de maíz y frijol serán sembradas en macetas de 2 L con sustrato vermiculita-peat moss (1:1, v/v) a razón de una planta por maceta. Al momento de la siembra, 1 x 106 ufc de los aislados de estreptomicetos seleccionados como antagonistas potenciales a partir de las ensayos in vitro serán agregadas a cada maceta. A la 1-2 semanas de germinación, un número determinado de estructuras infectivas serán agregadas a cada maceta y las plantas mantenidas en condiciones de invernadero. Las plantas serán fertilizadas con solución Hoagland y monitoreadas periódicamente para registrar síntomas de enfermedad. Tratamientos control serán también en donde no se agregue ningún antagonista o fitopatógeno serán incluidos. Para las pruebas de promoción de crecimiento vegetal, la estrategia será similar a la explicada arriba en cuanto al momento de agregar el aislado bacteriano. En este caso, la altura de las plantas, el número de hojas y número de flores será monitoreada durante el transcurso del ciclo de crecimiento de las plantas hasta su madurez. Pruebas de antagonismo de S. sclerotiorum en campo La fecha de siembra será de acuerdo a lo recomendado para la siembra de frijol en la región del norte de Sinaloa (mediados de octubre). Las labores de preparación del suelo se harán de acuerdo a las condiciones del terreno; de manera general se realizará barbecho, rastreo, nivelación y surquería como lo realizan los productores de la región. La unidad experimental se establecerá en una superficie de 40 metros de ancho por 50 metros de largo (2000 m2), el cual será dividido en 27 parcelas con tres camas dobles; cada parcela consistirá de una superficie de 10 x 3.2 m contemplando 6 surcos para cada tratamiento a una distancia entre surcos de 0.80 metros. El método de siembra y la cantidad de semilla a utilizar será similar a la que emplean los productores agrícolas y que corresponde a 100 kg por hectárea (INIFAP-CIRNO-CEVAF, 2003). Dicho método corresponde a una densidad de siembra de 15-18 semillas por metro de surco a hilera sencilla, con la finalidad de obtener de 12-16 plantas, considerando que la semilla a emplear tenga un 85% de germinación. Las labores de cultivo a efectuar consistirán en uno o dos pasos de cultivadora y deshierbes manuales cuando sean necesarios. Para mantener la humedad del suelo adecuada al cultivo se requerirá de un riego inicial antes de sembrar y de 1-2 riegos de auxilio dependiendo de las condiciones de humedad presentes durante el cultivo al igual que la aplicación de fertilizante. Los aislados a probar serán cultivados a nivel fermentador de 2 L y aplicados a suelo y como tratamiento alternativo como aplicación foliar. Las suspensiones bacterianas se aplicarán a una concentración final de 1X108 UFC/ml por aislado utilizando un aspersor de mochila sobre el suelo o follaje del cultivo con la finalidad de homogenizar el producto y lograr así una distribución uniforme. El diseño experimental será por bloques completos al azar con tres repeticiones por tratamiento. Los muestreos para determinar el efecto del patógeno sobre las plantas en cultivo se realizarán con una frecuencia semanal a partir del inicio de los primeros síntomas de la enfermedad en el cultivo de frijol, se evaluarán las plantas ubicadas en las dos líneas centrales (parcela útil) de los tratamientos de cada unidad experimental. La incidencia se determinará al final de la etapa de desarrollo del frijol poco antes de la cosecha midiendo el número total de plantas infectadas entre el número total de plantas de cada parcela, calculado como el porcentaje de plantas con síntomas de la enfermedad de moho blanco. La severidad se calculará usando la siguiente escala descrita por Yang, 2009: 0= no lesiones, 1=

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lesiones <5% del área del tallo, 3= lesiones del 6-15% del tallo, 5= lesiones del 16-30% del tallo, 7= lesiones del 31-50% del tallo, 9= lesiones > al 50% del tallo. Los datos obtenidos en las pruebas serán procesados con el análisis de varianza (ANOVA) usando el programa estadístico SAS, con un nivel de significancia de 0.05% y una prueba de Tukey. Módulo IV. Evaluación y selección de estreptomicetos nativos de suelos agrícolas de México con potencial celulolítico y su producción masiva. Dra. Claudia Castro Martínez (CIIDIR SIN) Determinación cualitativa de la actividad celulolítica Las actividades celulolíticas serán evaluadas primero mediante un ensayo cualitativo mediante crecimiento sobre medio sólido conteniendo Carboxy-Metil-Celulosa (CMC) y rojo Congo, esto es con la finalidad de observar zonas que degraden CMC (Sazci y col., 1986). Se medirán halos de hidrólisis. Preselección de estreptomicetos en medios selectivos Las cepas de Estreptomicetos serán evaluadas en su capacidad celulolítica, según su crecimiento en dos medios líquidos, cuya única fuente de carbono serán tiras de papel filtro y Carboxi-Metil-Celulosa (CMC): el medio Crawford y McCoy (1972) y el medio Skinner (1960), al cual se le agregará extracto de levadura (0.01%). Los cultivos se incubarán a 45°C. Se examinaran diariamente para evaluar la capacidad degradativa sobre el papel filtro y CMC (Ramasamy, 1981). Las cepas serán agrupadas de acuerdo al siguiente criterio de actividad celulolítica:

Muy buena 4+ Buena actividad 3+ Regular actividad 2+ Escasa actividad 1+ Ausencia de actividad --

Determinación cuantitativa de la actividad celulolítica De las cepas que presenten mayor actividad celulolítica según los criterios antes mencionados, se seleccionaran y se les realizaran determinaciones cuantitativas de celulasas. Para ello, se inocularan aproximadamente 40 X 106 esporas por 100 ml de medio mínimo Crawford y McCoy (1972), más CMC y lactosa al 1% como inductores y Tween 0.2%. Los aislados serán incubados en baño maría con agitación constante a 45°C. A las 72 h se extraerán las muestras para las determinaciones de las actividades enzimáticas de las celulasas, de proteínas solubles y de biomasa celular. La actividad endo-β-1,4- glucanasa o CMCasa será determinada siguiendo el protocolo de Stutzenberger (1972); se utilizaran líquidos post cultivos libres de células, obtenidos por centrifugación (6000 x g por 30 min)y filtración a través de una membrana de celulosa. Se tomaran 0.4 ml del liquido libre de células diluido 10 veces y se agregara 3.5 ml de CMC al 1% y 0.1 ml de

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buffer de acetato de sodio 1.0 M (pH 6.0). Se incubará a 50°C durante 30 min. Posteriormente, se medirá la liberación de azúcares reductores por el método de DNS (Miller, 1956). La actividad será expresada en unidades internacionales (UI) por ml, considerando una unidad como la cantidad de enzima que libera un µmol de glucosa por minuto (Steiner y col., 1991). La actividad exo-β-1,4- glucanasa o Avicelasa será determinada por el método de Stutzenberger (1972) y Ceroni y Gutiérrez-Correa (1988). El ensayo consiste en colocar un tubo de ensayo 50 mg de papel filtro Whatman No. 1 al cual se le añadirá 0.8 ml de buffer de acetato de sodio 0.6 M (pH 6.0) y 3.2 ml de líquido libre de células. Se incubará a 50°C durante 30 min y se determinará la liberación de azúcares reductores. La actividad de β-1,4 Glucosidasa se determinará mediante el método descrito por Bernier y Stutzenberger (1989) y Ceroni (1988). Se utilizará 1 ml de filtrado y 1 ml de salicina 10mM en buffer de acetato de sodio 1 M (pH 6.0). Se incubará bajo las mismas condiciones que los casos anteriores y se determinará la liberación de azúcares reductores. Determinación de azúcares reductores y proteínas solubles Los azúcares reductores se determinarán mediante el método de DNS (Miller, 1956), utilizando glucosa como estándar. Las proteínas solubles serán determinadas por el método de Lowry y col. (1951) utilizando seroalbúmina bovina fracción V (BSA) como estándar. Determinación de biomasa celular La biomasa celular será determinada por diferencia de pesos entre los tubos con micelio sedimentado y secado a 105°C durante 24 h y los tubos vacíos secados a 100°C durante dos horas. La biomasa será expresa en mg de micelio/ml. Evaluación de diferentes fuentes de carbono Se evaluarán diferentes fuentes de carbono para la producción de celulasas por Estreptomicetos. Los sustratos orgánicos serán: CMC, celobiosa, arabinosa y rastrojo de maíz. Se utilizará glucosa como control. Producción de celulasas por estreptomicetos usando un diseño factorial Con la finalidad de obtener la mayor producción de celulasas por estreptomicetos se llevará a cabo un diseño factorial completo, modificando parámetros fisicoquímicos como el pH del medio de cultivo, la temperatura de fermentación y la velocidad de agitación. Los experimentos se llevaran a cabo en un fermentador New Brunswick de 2 L por duplicado. Un análisis de varianza (ANOVA) será utilizado para estimar los parámetros estadísticos del modelo generado. Los coeficientes de significancia serán determinados por un análisis t de Student. El software Statgraphics será utilizado para el análisis estadístico y generación de gráficos.

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RESULTADOS OBTENIDOS POR ACTIVIDAD

MODULO I. Diversidad y filogenia de estreptomicetos con potencial

biotecnológico aislados en México Dra. Erika Teresa Quintana Cano (ENCB)

OBJETIVO 1. Establecer la posición filogenética de aislados del género Streptomyces aislados de suelos de México que tienen efecto antagonista frente a hongos fitopatógenos de importancia agrícola. META: Establecimiento de la posición filogenética de al menos 200 aislados seleccionados del género Streptomyces incluyendo aislados con actividades antagonistas a patógenos de importancia agrícola y médica y con presencia de genes biosintéticos.

Actividades Resultados % avance y justificación

Actividad 1. Extracción de ADN. Reacciones de PCR (BOX) y corrida de geles. Análisis bioinformático.

Para llevar a cabo este objetivo se llevaron a cabo análisis de BOX-PCR. El DNA de cada uno de los aislados analizados fue utilizado en reacciones de PCR para obtener patrones de bandeos. Esta información fue analizada con el software NTSYS (ver. 2.2) mediante el cual se obtuvo árbol de similitudes. En el análisis se utilizaron 126 aislados (Figura 1).

100% La meta original era estudiar 200 aislados estreptomicetos, sin embargo, algunos de los aislados no amplificaron con los oligonucleótidos específicos para estreptomicetos. Por otro lado, algunos de los aislados han dejado de crecer in vitro, por lo por lo que se han tenido que excluir del análisis.

Actividad 2. Amplificación de una región 16 S para la comparación de secuencias entre los 126 aislados analizados. PCR de las secuencias, limpieza de las bandas, secuenciación, comparación de a nivel de secuencias.

Las secuencias 16S han sido obtenidas para los 126 aislados y los fragmentos limpiados y a punto de ser enviadas a secuenciar Una vez obtenidas las secuencias se procederá a hacer en análisis bioinformático de comparación de secuencias.

70% En el transcurso del segundo año se llevará a cabo el análisis de secuencias 16S.

OBJETIVO 2. Establecer la posición filogenética de aislados del género Streptomyces que

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tienen efecto antagonista frente a hongos filamentosos y levaduriformes de importancia médica en México. META: Establecimiento de la posición filogenética de al menos 200 aislados seleccionados del género Streptomyces incluyendo aislados con actividades antagonistas a patógenos de importancia médica. Actividad 1. Extracción de DNA y amplificación por PCR. Purificación de producto de PCR. Secuenciación del producto de PCR. Análisis de secuencias.

Se han obtenido aislados con potencial antagonismo a patógenos de importancia médica. En la figura 2 se presentan algunos de la morfología de algunos de estos organismos aislados. En la figura 3 se muestra un gel de electroforesis con ADN extraído de algunas muestras seleccionadas.

100 %

OBJETIVO 3. Establecer la posición filogenética de aislados de estreptomicetos causante de la roña de la papa en México. META: Establecimiento de la posición filogenética de aislados de estreptomicetos causante de la roña de la papa en México. Actividad 1. Extracción de DNA y amplificación por PCR. Purificación de producto de PCR. Secuenciación de producto de PCR. Análisis de secuencias.

En la figura 4 se muestra el producto de amplificación de la región 16 S de algunos aislados estudiados. En la figura 5 se muestra la ubicación taxonómica de uno de los aislados estudiados

100 %

MODULO II. Análisis de secuencias de regiones biosintéticas de estreptomicetos y su relación con su actividad biológica contra

fitopatógenos Dr. Mario Alonso Bueno Ibarra (CIIDIR SIN)

OBJETIVO 1. Establecer la posición filogenética de estreptomicetos aislados de suelos agrícolas de México que presentan las regiones de genes biosintéticos (PKS I, PKS II y NRPS). META: Establecimiento de la posición filogenética de al menos 200 aislados seleccionados del género Streptomyces con presencia de genes biosintéticos.

Actividades Resultados % avance y justificación

Actividad 1. Aislamiento de ADN del banco de estreptomicetos

A la fecha se han obtenido ADN de cada uno de los 126 aislados que se están estudiando. En la figura 6 se muestra a manera de ejemplo la electroforesis en gel de agarosa de algunos de los aislados estudiados.

100%

Actividad 2. PCR para A la fecha se han caracterizado la 50%

15

determinar la presencia de genes biosintéticos con genes específicos.

presencia/ausencia de regiones biosintéticas PKSI, PKSII y NRPS de los 126 aislados que se están estudiando. En la figura 7 se muestra el producto de PCR utilizando oligonucleótidos específicos para genes biosintéticos NRPS de algunos de los aislados esudiados.

Los PCRs para la presencia/ausencia de genes biosintéticos han sido concluidos. Se está trabajando en la reamplificación de estos productos para su purificación y secuenciación.

Actividad 3. Purificación de los productos de PCR y obtención de las secuencias de cada una de las regiones biosintéticas por aislados.

Programado a realizarse en la segunda etapa del proyecto.

0 %

OBJETIVO 2. Determinar el potencial biosintético de los aislados estudiados mediante la secuenciación de genes PKS I y PKS II y NRPS. META: Determinación del potencial biosintético de los aislados que presenten regiones biosintéticas PKS I, PKS II y NRPS mediante la secuenciación y análisis de estas regiones. Actividad 1. Análisis de secuencias para determinar el potencial biotecnológico de los aislados analizados.

Esta actividad está programada para el segundo año del proyecto.

0%

OBJETIVO 3. Obtener fracciones para separar los componentes bioactivos y determinar la efectividad de cada fracción mediante bioensayos de antagonismo. META: Obtención de fracciones para separar parcialmente los componentes bioactivos. Actividad 1. Obtener fracciones de polaridad descendente de cada una selección de 30 aislados seleccionados.

Esta actividad está programada para el segundo año del proyecto.

0%

OBJETIVO 4. Analizar la efectividad biológica de los extractos parciales de aislados con regiones biosintéticas (PKS I y II y NRPSs) en hongos fitopatógenos. META: Determinación de la efectividad de las fracciones obtenidas en bioensayos de antagonismo. Actividad 1. Realización de bioensayos para probar la efectividad biológica de cada fracción de cada aislado (15 por lote).

Esta actividad está programada para el segundo año del proyecto.

0%

16

MODULO III. Caracterización del potencial biotecnológico de estreptomicetos en la agricultura

Dra. Melina López Meyer (CIIDIR SIN)

OBJETIVO 1. Seleccionar estreptomicetos con propiedades antagonistas contra hongos fitopatógenos (Macrophomina spp., Sclerotinia sclerotiorum, Fusarium spp.) META: Selección de al menos 1 aislado de estreptomiceto con propiedades antagonistas por cada uno de los siguientes fitopatógenos (Macrophomina spp. Sclerotinia sclerotiorum y Fusarium spp).

Actividades Resultados % avance y justificación

Actividad 1. Pruebas de antagonismo in vitro de los estreptomicetos estudiados contra S. sclerotiorum, Macrophomina spp y Fusarium spp.

126 aislados estreptomicetos fueron probados in vitro en ensayos de de antagonismo. 46 aislados presentaron antagonismo contra S. sclerotiorum y 22 contra Macrophomina sp. 40 aislados han sido probados contra Fusarium sp. y uno de ellos han mostrado antagonismo contra este patógeno. Los aislados “e”, “g” e “i” fueron seleccionados como potenciales antagonistas a S. sclerotiorum, aislado “k” a Macrophomina sp. y aislado “fs” a Fusarium sp) ya que presentaron los mayores halos de inhibición. En la figura 8 se muestra ejemplos de ensayos de antagonismo de aislados estreptomicetos contra S. sclerotiorum y Macrophomina sp.

100%

Actividad 2. Pruebas a nivel maceta de al menos 1 estreptomiceto por fitopatógeno para evaluar incidencia y severidad de Macrophomina spp y Fusarium spp en maíz.

Con base en los resultados obtenidos in vitro, los aislados seleccionados serán usados como antagonistas en ensayos in planta en macetas.

0% (Programada para el segundo año). Esta actividad está por iniciarse a mediados de febrero del 2012 y estaba programada inicialmente para el segundo año del proyecto.

Actividad 3. Pruebas a nivel de campo de la efectividad de al menos 1 aislados seleccionado como antagonista contra S. sclerotiorum en cultivos de

Las pruebas de antagonismo en campo fueron iniciadas considerando la aplicación de los aislados “e”, “g” e “i”, sin embargo, el experimento no pudo concluirse ya que el cultivo iniciado

0% (Programada para el segundo año). Ya que el ciclo del

17

frijol.

tuvo problemas de mosca blanca, virosis y maleza, por lo que el experimento tendrá que repetirse el siguiente ciclo. En la figura 9 se muestra el cultivo de frijol con problemas de virosis y malezas. Este ensayo tendrá que repetirse el próximo ciclo agrícola.

cultivo de frijol en Sinaloa es de octubre a febrero, esta actividad se llevará a cabo en el ciclo otoño-invierno 2012-2013.

OBJETIVO 2. Seleccionar estreptomicetos con propiedades promotoras de crecimiento vegetal (productoras de compuestos tipo auxinas) META: Selección de al menos 1 aislado de estreptomiceto con capacidad de promoción de crecimiento vegetal. Actividad 1. Determinación in vitro de la capacidad de producción de compuestos tipo auxinas de cada uno de los aislados seleccionados.

Esta actividad estaba programada para el segundo año del proyecto, sin embargo, se han tenido ya avances en el mismo. Se montó la metodología para la determinación colorimétrica de compuesto tipo auxinas utilizando el reactivo de Salkowsky. Hasta el momento se han probado 40 estreptomicetos, de los cuales se ha obtenido un aislado positivo a la prueba (aislado “fr”) ya que mostró una reacción colorida ante el reactivo de Salkosky. Además, se realizó un scan a diferentes longitudes de onda del medio de cultivo libre de células del aislado “fr” y su espectro de absorbancia fue muy similar al mostrado por acido indol acético (AIA) en solución, lo cual sugiere que el aislado está produciendo AIA pudiendo tener un potencial uso como promotor de crecimiento. En la figura 10 se muestra la prueba de Salkosky en la cual uno de los aislados resultó positivo a la prueba.

100% (Programada para el segundo año, pero ya ha sido concluida)

Actividad 1. Pruebas a nivel maceta para probar la efectividad de al menos un aislado efectivo como promotor de crecimiento en frijol y en maíz.

0% Esta actividad está por iniciarse a mediados de febrero del 2012 y estaba programada inicialmente para el segundo año del proyecto.

OBJETIVO 3. Determinar la efectividad en campo de los aislados seleccionados biopesticidas y promotores de crecimiento vegetal. META: Determinación a nivel de maceta y campo de la efectividad de los aislados esteptomicetos

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seleccionados como antagonistas a fitopatógenos y promotores de crecimiento. Actividad 1. Llevar a cabo una prueba en campo para probar la efectividad de los aislados seleccionados como potenciales antagonista a Macrophomina sp, Fusarium sp y Sclerotinia sp. y el aislado potencial como promotor de crecimiento vegetal.

0% (Programada para el segundo año). Ya que en Sinaloa el cultivo de frijol se realiza en el ciclo otoño-invierno esta actividad se iniciará en el mes de octubre del 2012.

MODULO IV. Evaluación y selección de estreptomicetos nativos de

suelos agrícolas de México con potencial celulolítico y su producción masiva

Dra. Claudia Castro Martínez

OBJETIVO 1. Evaluar el potencial celulolítico de estreptomicetos nativos de suelos agrícolas de México con potencial celulolítico y seleccionarlos. META: Selección de al menos 2 aislados de estreptomicetos con potencial celulolítico.

Actividades Resultados % avance y justificación

Actividad 1. Evaluar el potencial celulolítico de estreptomicetos aislados de México.

Los resultados obtenidos en esta actividad del proyecto son los siguientes: 1. Se realizaron dos metodologías para

determinar el potencial celulolítico del banco de estreptomicetos que se tenía utilizando rojo Congo como indicador antes y después de crecer los aislados en medio sólido. La mejor metodología obtenida fue utilizando rojo Congo posterior al crecimiento de los aislados de estreptomicetos. De los aislados analizados se obtuvo un 89% con potencial celulolítico y 11% no celulolítico.

2. Se generó un banco de 17 aislados con potencial celulolítico. De los cuales el 17.6% presentaron muy buena actividad celulolítica (4+), seguido por el 41.2% con buena

100% La meta original era estudiar 200 aislados estreptomicetos, sin embargo, dichos microorganismos dejaron de crecer in vitro, a pesar de diferentes técnicas microbiológicas utilizadas para su reactivación. Por lo tanto, fueron excluidos para los siguientes estudios.

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actividad (3+), el 29.4% regular actividad (2+) y el 11.8% (1+) escasa actividad.

3. Se seleccionaron 6 aislados que tuvieron mayor potencial celulolítico en medio sólido (aislados Cc72, Ae6, Z60, Fj116, Tp112, Ab7) para los siguientes análisis (Figura 11).

Actividad 2. Determinar la actividad celulolítica de estreptomicetos seleccionados.

En esta actividad los resultados obtenidos hasta el momento se describen a continuación: 1. Se llevó a cabo la técnica de DNS

para determinar el potencial celulolítico total de los 6 aislados preseleccionados, mostrando que los aislados Ae6, Z60 y Tp112 fueron los que presentaron mayor liberación de azúcares reductores.

2. Se determinaron las actividades enzimáticas de los tres aislados anteriores, para ello se crecieron en diferentes medios de cultivo en líquido (a) actividad endo-β-1,4-glucanasa o CMCasa, (b) actividad exo- β-glucanasa o avicelasa, y (c) glucosidasa o celobiasa. Los resultados muestran una mayor actividad de CMCasa, seguido de glucosidasa y resultados similares para avicelasa. Los valores obtenidos de las actividades enzimáticas son: para CMCasa entre 1.2-1.8 UI/mL (Unidades Internacionales de actividad enzimática por mL de medio de cultivo libre de células). Para la actividad glucosidasa se obtuvieron valores en el rango de 0.35-0.41 UI/mL. Finalmente para la actividad de avicelasa los valores fueron entre 0.18-0.22 UI/mL.

95% Esta actividad sigue en proceso, se finaliza en marzo, esto debido a la falta de disponibilidad de equipo necesario para llevar a cabo las determinaciones. No obstante, en estos momentos ya se cuenta con todo lo indispensable para su terminación.

Actividad 3. Llevar a cabo estudios preliminares para la producción masiva de estreptomicetos

Los 3 aislados seleccionados en las actividades antes descritas están siendo crecidos en medios de cultivo líquido que contienen diferentes fuentes de carbono, tales como: carboxi-metil-celulosa (CMC), Avicel, Celobiosa,

90% Esta actividad será culminada en el mes de marzo, de igual forma que la

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residuos agrícolas y glucosa como control. Resultados preliminares de cinéticas de crecimiento muestran una mayor producción de biomasa a las 96 horas de incubación cuando se utiliza CMC como fuente de carbono, mientras que cuando se utiliza avicel y celobiosa como fuente de carbono la biomasa máxima es a las 108-114 horas de incubación.

anterior actividad no existía equipo suficiente (incubadora con agitación) para llevar a cabo los experimentos planteados. Sin embargo, hoy en día ya se cuenta con equipo suficiente para culminar dicha actividad.

OBJETIVO 2. Establecimiento de las condiciones de producción de Estreptomicetos con elevada actividad celulolítica a nivel fermentador (2 L). META: Establecimiento de las condiciones de producción de Estreptomicetos con elevada actividad celulolítica a nivel fermentador (2 L). Actividad 1. Seleccionar fuente de carbono para la producción masiva de estreptomicetos.

A partir de los resultados obtenidos en la actividad 3 del objetivo 1, se seleccionarán las diferentes fuentes de carbono para el crecimiento de los aislados de estreptomicetos, así como para obtener la mayor actividad enzimática de cada aislado.

0% Actividad programada para el segundo año del proyecto finaliza en mayo 2012.

Actividad 2. Seleccionar factores ambientales (temperatura, pH, oxígeno) para la producción masiva de estreptomicetos.

Afortunadamente ya se cuenta en CIIDIR-SIN con dos fermentadores completamente automatizados, lo cual nos va a permitir llevar a cabo en tiempo y forma esta actividad.

0% Actividad programada para el segundo año durante el periodo: mayo-septiembre 2012.

Actividad 3. Establecer protocolo de producción masiva de estreptomicetos (fermentador de 3 litros)

A partir de los resultados obtenidos anteriormente se podrá establecer el protocolo de producción masiva de estreptomicetos tomando en cuenta las mejores condiciones ambientales para su crecimiento y las diferentes actividades enzimáticas evaluadas. Se realizará un protocolo para cada actividad enzimática y para cada aislado seleccionado.

0% Actividad programada para el segundo año del proyecto en los meses de septiembre-diciembre 2012.

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AVANCE EN LOS PRODUCTOS ENTREGABLES

Productos comprometidos Observaciones Avance MODULO I. Dr. Erika Quintana (ENCB)

1. Establecer la posición filogenética de: a) aislados del género Streptomyces aislados de suelos de México que tienen efecto antagonista frente a hongos fitopatógenos de importancia agrícola, médica y causante de la roña de la papa en México.

Se ha establecido la posición filogenética de estreptomicetos antagonistas a patógenos de importancia médica y causantes de la roña de la papa. Se ha determinado la diversidad de estreptomicetos mediante análisis de rep-pcr. Solo falta por concluir el análisis de secuencias 16S. Estos datos de secuencia servirán para establecer la posición filogenética de estreptomicetos antagonistas a fitopatógenos.

90%

2. Documentos-tesis de Amanda Alejo Viderique (Maestría, CQB).

En proceso 75%

Aunque no se comprometieron, se reportan tres tesis de maestría en proceso derivados del proyecto: 1. Abigail Martínez Torres (semestre 3,

diciembre 2011). 2. Natalye Ruíz Domínguez (semestre 2,

diciembre, 2011). 3. Nicté-Ha Salazar Sánchez (semestre

2, diciembre, 2011).

50%

3. Artículo científico genes PKS I, PKS II Y NRPS.

Artículos científicos (1) sobre antagonismo microbiano (enviado y aceptado). Título: “Isolation, identification and evaluation of the antifungal-antiyeast activities of strains of Streptomyces isolated from Mexico”

100%

4. Presentación de trabajos en el Congreso Inaugural de la Sociedad Internacional de Sistemática Microbiana Bergeys -BISMIs-, China, y

Trabajos presentados en el Congreso Inaugural de la Sociedad Internacional de Sistemática Microbiana Bergeys -BISMIs-, China (2011): 1. Póster de Amanda Alejo Viderique. 2. Póster de Abigail Martínez Torres. 3. Póster de Diana Andrea Gil Rivera y Mariela Segura del Pilar.

100%

5. Presentación de trabajos en el "16avo. Simposio Internacional

Trabajos presentados en el "16avo Simposio Internacional de la Biología de

100%

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de la Biología de los Actinomicetos -ISBA-16", México.

los Actinomicetos, Puerto Vallarta, México. 1. Póster de Amanda Alejo Viderique. 2. Póster de Abigail Martínez Torres. 3. Póster de Mariela Segura del Pilar. 4. Póster de Pablo Iván Lara Maturano.

MODULO II. Dr. Mario Bueno (CIIDIR SIN) 1 alumno de maestría Nataly Soto. En proceso. Fecha tentativa

de graduación (octubre 2013). (co-dirigida con la Dra. Melina López Meyer)

25%

Información sobre el potencial biosintético de 30 aislados estreptomicetos con biosintéticas PKS I, PKS II y NRPS.

Ya existen avances en el DNA aislado y análisis de presencia/ausencia de genes biosintéticos. Están en proceso el análisis de secuencia para seleccionar los 30 aislados.

50%

Información sobre la naturaleza química y actividad biológica de las fracciones químicas provenientes de los cultivos de estreptomicetos con genes biosintéticos.

Actividades por inicarse. 0%

Presentación en un congreso internacional de los resultados obtenidos.

No se han presentado aún los resultados en congresos.

0%

Publicación internacional presentando los resultados obtenidos.

No se ha iniciado. 0%

MODULO III. Dra. Melina López Meyer (CIIDIR SIN) 1 alumno de licenciatura Hugo Michel Ramírez Jacobo. En proceso.

Fecha tentativa de graduación (octubre 2012).

50%

2 alumnos de maestría Nataly Soto. En proceso. Fecha tentativa de graduación (octubre 2013). (co-dirigida con el Dr. Mario Bueno Ibarra). Solamente se incorporó una estudiante de maestría y no dos como se planteó en la propuesta original.

25%

1 alumno de doctorado Hugo Galindo Flores. En proceso. Fecha tentativa de graduación (diciembre 2012).

85%

Un aislado estreptomiceto con actividad antagonista a Macrophomina spp. probado a nivel maceta.

A la fecha se han logrado encontrado 22 aislados que presentan antagonismo contra Macrophomina sp, y tres de ellos han sido seleccionados por la magnitud de los halos de inhibición formados in

50%

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vitro para ser probados en maceta. Un aislado estreptomiceto con actividad antagonista a S. sclerotiorum probado a nivel campo.

A la fecha se han logrado encontrado 46 aislados que presentan antagonismo contra Sclerotinia sclerotiorum sp, y tres de ellos han sido seleccionados por la magnitud de los halos de inhibición formados in vitro para ser probados en campo.

50%

Un aislado estreptomiceto con actividad antagonista a Fusarium spp. probado a nivel maceta.

A la fecha se ha logrado seleccionar in vitro un aislado estreptomiceto con actividad antagonista contra Fusarium sp. el cual será probado a nivel maceta.

50%

Un aislado estreptomiceto con actividad promotora de crecimiento vegetal probado a nivel maceta y/o campo.

A la fecha se ha seleccionado un aislado que resultó positivo a la prueba de Salkosky y muy posiblemente esté produciendo AIA. Será probado a nivel maceta y campo.

25%

Presentación en congreso de los resultados obtenidos.

No se han presentado aún los resultados en congresos.

0%

Publicación internacional presentando los resultados obtenidos.

En preparación. Título tentativo: “Diversity and biosynthetic clusters in culturable Streptomycetes isolated from agricultural soils in Mexico”

25%

MODULO IV. Dra. Claudia Castro Martínez (CIIDIR SIN) Al menos 2 aislados estreptomicetos con potencial celulolítico.

Concluido. 100%

Protocolo de producción de estreptomicetos celulolíticos a nivel fermentador.

Por iniciarse. 0%

Tesis de 1 alumno de licenciatura

Isela Rangel Ventura. Esta alumna se graduó de licenciatura por promedio no por tesis, sin embargo realizó Estancia de investigación y Residencia Profesional participando en este proyecto. Concluyó en diciembre del 2011.

100%

Tesis de 1 alumno de maestría Laura Beltrán Arredondo. En proceso. Fecha tentativa de graduación (octubre 2013).

25%

Protocolo para la producción masiva de estreptomicetos con mayor actividad celulolítica.

Esta actividad será culminada en diciembre del 2012. Meta final del módulo IV del presente proyecto.

60%

Presentación de trabajos en congresos de los resultados obtenidos.

Presentacion de 1 trabajo en congreso en el XIV National Congress of Biochemistry and Plant Molecular Biology & 7th

100%

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Symposium Mexico-USA. Campeche, Mexico. Nov 29th – Dec 2nd, 2011

Artículo científico internacional que incluya los resultados obtenidos sobre estreptomicetos con actividad celulolítica y las condiciones de producción.

No se ha iniciado. 0%

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FIGURAS

Figura 1. Una sección del árbol filogenético obtenido por BOX-PCR de la colección de microorganismos estudiados.

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Figura 2. Fotografías de los aislados E1 (fotografías del panel superior) y V4B (fotografías del panel inferior) que muestran su morfología colonial y microscópica tanto de Microscópia de campo claro como de barrido.

Figura 3. Material genético extraído de 6 aislados identificados como 22, 23, 28, 29, 34 y35. Nota: M es el marcador de talla molecular de 1kb (Bioline).

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Figura 4. Productos de PCR del gen 16S rRNA. Nota: Únicamente se muestran seis aislados. M es el marcador de talla molecular de 1kb (Bioline). CN. Es el control negativo.

Figura 5. Árbol filogenético de las secuencias obtenidas de los productos de PCR del gen 16S rRNA de un aislado.

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Figura 6. Electroforesis en geles de agarosa del ADN extraído de algunos de los aislados estudiados.

Figura 7. Ejemplos de ensayos de antagonismo de aislados estreptomicetos contra Macrophomina sp.(panel A) y S. sclerotiorum (panel B).

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Figura 8. Ejemplos de los productos de PCR utilizando oligonucleótidos específicos para genes biosintéticos NRPS de algunos de los aislados estudiados.

Figura 9. Cultivo de frijol con problemas de virosis y malezas sembrado en noviembre del 2011.

30

Figura 10. Prueba de Salkowsky en la cual uno de los aislados (fr) resultó positivo a la prueba. En los pozos de la primera columna se preparó una curva estándar con diferentes concentraciones de acido indol acético (AIA).

Figura 11. Aislados de estreptomicetos con mayor potencial celulolítico. A) Aislado Z60, B) Aislado Ae6, C) Aislado Tp112.

A) B) C)

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CONCLUSIONES E IMPACTO DE LA INVESTIGACIÓN

A pesar de la importancia de los actinomicetos y en particular de los estreptomicetos tanto desde el punto de vista biológico como biotecnológico, no existen muchos estudios que aborden este grupo de microorganismos en nuestro país. Los objetivos de esta investigación se centran, por un lado, en la generación de información que caracterice la diversidad de este grupo tan importante en México, y por el otro lado en la determinación de su potencial uso biotecnológico. Se están explorando tres aspectos biotecnológicos: 1) su potencial uso en la medicina como antagonistas a patógenos de importancia médica, 2) su potencial uso en la agricultura, como antagonistas a patógenos de importancia agrícola, y 3) su potencial uso en la industria de bioenergéticos como productores de enzimas celulolíticas. El avance general del proyecto es el esperado (60%). Al finalizar el proyecto, se estará en posición de contar con un grupo selecto de aislados con altas posibilidades de ser aplicados a mayores escalas en los ámbitos médico, agrícola y en la industria de los bioenergéticos. Además, la realización de este proyecto ha permitido que estudiantes de nivel maestría y de nivel superior conozcan el vasto mundo microbiano y comiencen a especializarse en este grupo de bacterias tan diverso y complejo.

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