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INFORME DE PROYECTO
ESTUDIO INTEGRADO DE LA INCIDENCIA DE
Phytophthora EN LOS CULTIVOS DE PAPAYA EN LA
ZONA COSTA DE OAXACA (2IR1004).
COLABORADORES
M. EN C. JULIETA KARINA CRUZ VÁZQUEZ
LPT FRANCISCO VALDEZ MARTÍNEZ
DR. EDMUNDO LOZOYA GLORIA
DIRECTOR
M. EN C. FRANCISCO GUMARO RUIZ RUIZ
i
INDICE GENERAL
Índice general i Índice de figuras i Abreviaturas ii Índice de tablas ii Resumen iii 1 Introducción 1 2 Objetivos 3 2.1 Objetivo general 3 2.2 Objetivos específicos 3 3 Metodología 3 3.1 Identificación de los principales productores de papaya 3 3.2 Establecimiento de las zonas de colecta 5 3.3 Colecta de muestras 6 3.4 Aislamiento de hongos 6 3.5 Identificación morfológica de los hongos 6 3.6 Preparación de cultivos monospóricos 7 3.7 Pruebas in vitro de inhibición del crecimiento micelial de colletotrichum sp. 8 3.8 Características de los fungicidas 9 4 Resultados 10 4.1 Colectas 10 4.2 Aislamiento de las muestras 13 4.3 Identificación morfológica macroscópica y microscópica 14 4.4 Cultivos monospóricos 16 4.5 Pruebas in vitro de crecimiento micelial 16 5 Conclusiones 19 6 Perspectivas 20 7 Informe financiero 21 8 Bibliografía 21 9 Anexos 23
ABREVIATURAS
µL microlitro ADN Ácido desoxirribonucleico ARN Acido ribonucleico ATP Adenosin trifosfato GDPH Glicerol 3-fosfato deshidrogenasa GPS Sistema de posicionamiento global Ha Hectárea L Litro mg miligramo min minuto ml mililitro mm milimetro N Norte ºC Grado Celcius
ii
PDA Agar de papa dextrosa sp No se ha determinado la especie spp Este género presenta varias especies v/v Volumen/volumen W Oeste
INDICE DE FIGURAS
Figura 1. Distribución de producción de papaya en el estado de Oaxaca 1 Figura 2. Distribución de producción de papaya a nivel nacional 2 Figura 3. Localización de las zonas de colecta 5 Figura 4. Los diferentes fungicidas que serán utilizados en la pruebas de inhibición de crecimiento
8
Figura 5. Riego por aspersión en los plantíos papaya 10 Figura 6. Frutos de papaya que posiblemente presenten algún daño 10 Figura 7. Frutos que son desechados por no haber cerrado de manera adecuada la flor 10 Figura 8. Visualización la proliferación de agentes patógenos 10 Figura 9. El mal manejo de desechos repercute en la proliferación de patógenos 10 Figura 10.Visualización de síntomas característicos de enfermedades 10 Figura 11. Frutos colectados listos para analizarlos 11 Figura 12. Identificación de frutos colectados 11 Figura 13. Equipo del laboratorio de química para los análisis 11 Figura 14. Preparación de muestras 11 Figura 15. Síntomas característicos de infección 12 Figura 16.Trozos de la corteza del fruto en PDA 13 Figura 17.Incubación de las cajas petri 13 Figura 18. Crecimiento micelial en cajas petri 13 Figura 19. Crecimiento algodonoso 13 Figura 20. Característicos fenotípícas de Colletotrichum sp 14 Figura 21. Aspectos morfológicos de Fusarium sp 15 Figura 22. Cultivos monospóricos 15 Figura 23. Los datos graficados representan la inhibición del crecimiento micelial 17
INDICE DE TABLAS
Tabla 1. Datos donde se realizaron las colectas 5 Tabla 2. Fungicidas comerciales 8 Tabla 3 Pruebas de inhibición de crecimiento micelial 16 Tabla 4. Prueba de crecimiento micelial de Colletotrichum sp 18
iii
RESUMEN
El fruto de la Papaya (Carica papaya) es uno de los frutos tropicales con mayor demanda
nacional e internacional. En México en el año 2009 se cultivaron aproximadamente 22,623
Ha, tanto de riego como de temporal, siendo los principales estados productores
Veracruz, Chiapas, Michoacán Yucatán, Oaxaca, Tabasco, Guerrero, Colima. El estado de
Veracruz ha ocupado el primer lugar en superficie plantada y en producción de este frutal.
La pudrición radical de la papaya es considerada una de las enfermedades más
importantes que afectan a este cultivo a escala mundial, dado que esta enfermedad
generalmente es de lento desarrollo en el hospedante, el agente causal de esta
enfermedad ha sido identificado como Phytophthora palmivora; debido a esto, es
importante realizar un estudio preliminar en la zona costa enfocado a la incidencia de
Phytophthora en los cultivos de papaya para conocer el grado de incidencia.
Para las colectas se utilizaron cajas de plástico para transportar los frutos infectados o con
síntomas de daños producidos por agentes patógenos.
Las muestras obtenidas de las colectas fueron transportadas a la Universidad de Mar
campus Puerto Escondido, que se encuentra ubicado en el municipio de San Pedro
Mixtepec en la costa de Oaxaca (15º 53’ 21.53’’ N y 97º 04’ 41.4’’ W); los análisis se
llevaron a cabo en los laboratorios de docencia de dicho campus.
Con los análisis realizados con el periodo de colectas, se puede afirmar que los cultivos
presentaron síntomas de las enfermedades causadas principalmente por hongos entre los
que destaca el hongo conocido como Colletotrichum gloeosporioides y fusarium que
posiblemente juegan un papel predominante en los síntomas de infección que
presentaron los cultivos de papaya.
Se procedió a desarrollar un análisis de inhibición de crecimiento de las cepas aisladas y
los fungicidas que son comúnmente usados en los cultivos de papaya por los agricultores
(Mertec 340-F, RidomilGold Bravo SC, Tega, Amistar); presentando una mayor acción de
inhibición el fungicida RidomilGold Bravo SC.
El presente proyecto de investigación forma parte de los proyectos con financiamiento
interno de la UMAR evaluados ante el consejo de investigación de dicha institución.
1
1. INTRODUCCION
El estado de Oaxaca colinda al norte con Puebla y Veracruz; al este con Chiapas; al sur
con el Océano Pacífico; al oeste con Guerrero. Con las siguientes coordenadas; Al norte
18°39', al sur 15°39' de latitud norte; al este 93°52', al oeste 98°32' de longitud oeste.[1]
Dentro de las actividades agrícolas de mayor importancia económica que se
desarrollan en Oaxaca destacan: el cultivo de Café, Limón, Papaya, Mango, Cacao,
Coco, chile; esta producción de cultivos perennes se obtiene de los siguientes distritos:
Huajuapan de León, Valles centrales, Costa, Istmo, Cañada, Tuxtepec [2]; siendo la
Papaya, uno de los principales cultivos que destaca en el distrito de la costa [3] (figura
1).
Figura 1. Distribución de producción de papaya en el estado de Oaxaca
2
La disminución de los rendimientos obtenidos en algunos de estos cultivos a nivel
nacional son ocasionados entre otros factores por enfermedades y plagas causadas por
bacterias (Enterobacterium cloacae) y pudrición púrpura por Erwinia herbicola, hongos
(Fusarium, Rhizoctonia, Collectotrichum, Alternaria solani, entre otros), virus (virus
de la mancha anular), oomicetos (Phytophthora sp), insectos (ácaros, dípteros,
homópteros, hemípteros) y nematodos [4].
El fruto de la Papaya (Carica papaya) es uno de los frutos tropicales con mayor
demanda nacional e internacional. En México en el año 2009 se cultivaron
aproximadamente 22,623 Ha, tanto de riego como de temporal, siendo los principales
estados productores Veracruz, Chiapas, Michoacán Yucatán, Oaxaca, Tabasco,
Guerrero, Colima (figura 2). El estado de Veracruz ha ocupado el primer lugar en
superficie plantada y en producción de este fruta [3].
La pudrición radical de la papaya es considerada una de las enfermedades más
importantes que afectan a este cultivo a escala mundial, dado que esta enfermedad
generalmente es de lento desarrollo en el hospedante, el daño mayor se presenta luego
del primer año de edad de la plantación, dando oportunidad al productor de cosechar
parte de la producción, sin embargo su impacto más importante está relacionado con la
reducción en la vida útil de la plantación [5].
Figura 2. Distribución de producción de papaya a nivel nacional
3
El agente causal de esta enfermedad ha sido identificada como Phytophthora palmivora
[5].
Debido a esto, es importante realizar un estudio preliminar en la zona costa enfocado a
la identificación de Phytophthora en los cultivos de papaya para lograr su aislamiento
e identificación como posible agente patógeno, una vez caracterizado se procederá a
realizar investigaciones futuras para proponer estrategias de control empleando
sustancias extraídas de compuestos naturales.
2. OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GENERAL
Aislamiento, Caracterización e Identificación de Phytophthora como el agente causal de
la pudrición radical en los cultivos de papaya en la región costa
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Determinación, identificación y delimitación del área de estudio o colecta de
tejido vegetal
Realizar colectas de tejido y suelo de plantas con signos de enfermedad
Realizar aislamientos de microorganismos de las colectas en medios de cultivo
Obtención de cultivos monosporicos
Realizar caracterización morfológica microscópica y macroscópica de las
diferentes cepas en base a sus estructuras vegetativas
Realizar pruebas de inhibición de crecimiento con cultivos puros y fungicidas
comerciales empleados principalmente en esta región.
3 METODOLOGÍA
3.1 IDENTIFICACIÓN DE LOS PRINCIPALES PRODUCTORES DE PAPAYA
Se contactó al Ingeniero Arturo Segui Reyes Miembro del Consejo Estatal de
Citricultura de Oaxaca y/o Consejo Estatal de Productores de Papaya Maradol,
proporcionando información que sirvió como punto de partida para el actual proyecto
indicando lo siguiente:
4
“El consejo estatal está únicamente integrado por el eslabón de productores, en el caso
de estas dos organizaciones, el presidente del consejo y representante no gubernamental
del sistema producto papaya maradol es el Sr. Víctor González”
“El Ingeniero. Oscar Cruz Loaeza es el técnico del enlace del sistema producto papaya
en el estado de Oaxaca”, entre los productores de papaya se tiene el conocimiento:
Sr. Eleazar Silva Valencia: Rio Grande, Oaxaca. (Miembro del sistema
producto)
Sr. Javier Bermúdez Torres: Santa Rosa de Lima
Sr. Jorge Alberto Reyes Cisneros: Santiago Jamiltepec, Oaxaca
Se procedió a contactar con el Sr. Eleazar Silva, pidiéndole los permisos necesarios
para acudir a realizar las colectas de tejido en las diferentes huertas que tiene a su cargo,
aprobó dichas peticiones para acudir a las colectas tanto de fruto, como raíz y de
muestras de suelo.
Posteriormente se contactaron a los otros productores antes mencionados para
comentar el proyecto y lo apoyen en la realización otorgando los permisos para colectar
tejido (fruto, hojas, tallo, suelo).
Los sitios de muestreo se localizan entre los municipios de Villa de Tututepec de
Melchor Ocampo y San Pedro Mixtepec en las siguientes localidades: Bajos de Chila y
Rio Grande.
El tipo de vegetación en la región es selva baja caducifolia, el clima es cálido
subhúmedo con lluvias en verano.[6]
5
3.2 ESTABLECIMIENTO DE LAS ZONAS DE COLECTAS
En cada sitio de muestreo como lo muestra en la figura 3 se realizaron diferentes
colectas, estos mismos datos y de manera puntual se muestran en la tabla 1.
Se buscaron indicios de enfermedades en las plantas y frutos de papaya, una vez
identificadas se colectaron frutos, muestras de suelo y raíz, posteriormente se
depositarón en recipientes cerrados y en bolsas de plástico respectivamente para su
posterior análisis [9].
Colecta Latitud N Longitud W Altitud (msnm) Sitio
1 15°59'44.86” 97°24'57.22” 20 Río Grande
2 15°58'51.17” 97°25'44.59” 14 Río Grande
3 15°58'38.29” 97°24'22.02” 15 Río Grande
4 15°57'52.31” 97°23'13.4” 15 Río Grande
5 15°55'8.21” 97°7'57.34” 20 Bajos de Chila
6 15°54'46.48” 97°7'25.55” 20 Bajos de Chila
Tabla 1. Datos donde se realizaron las colectas, generadas por medio de un GPS Garmin etrex vista hcx perteneciente
al laboratorio de sistemas de información geográfica de la universidad del Mar campus Puerto Escondido.
Figura 3. Localización de las zonas de colecta. Muestra los diferentes lugares de colecta comprendidos entre los municipios de San Pedro Mixtepec y Villa de Tututepec de Melchor Ocampo, donde se realizaron las
colectas, generadas por medio de un GPS Garmin etrex vista hcx perteneciente al laboratorio de sistemas de
información geográfica de la universidad del Mar campus Puerto Escondido.
6
3.3 COLECTA DE MUESTRAS
Se procedió a realizar las colectas de tejido vegetal en diferentes puntos dentro de los
municipios antes mencionados, seleccionando las plantas y los frutos con síntomas de
algún daño producido por un agente patógeno, se hicieron un total de seis colectas, las
coordenadas se muestran en la tabla 1, una vez seleccionado el lugar de muestreo y las
plantas y frutos infectados se hizo uso de la metodología descrita posteriormente para
obtener las muestras de tejidos vegetales y de suelo [7, 8].
3.4 AISLAMIENTO DE HONGOS
El análisis de las colectas realizadas se llevó a cabo en los laboratorios de docencia de la
universidad del Mar; se extrajeron partes sanas y enfermas de la superficie de los frutos.
Se cortaron en secciones de 5 mm aproximadamente y se desinfectaron con una
solución clorada al 6% (v/v) durante 1min; después se lavaron tres veces con agua
destilada estéril. Se procedió a secar en papel filtro Whatman e inocular en cajas petri
con medio PDA suplementado con los antibióticos rifampicina (25 mg/L) y cefotaxima
sódica (500 mg/L), y se incubaron a temperatura ambiente (25ºC) durante 24 a 38 horas
[10]
3.5 IDENTIFICACIÓN MORFOLÓGICA DE LOS HONGOS
La identificación se llevó a cabo utilizando las claves de identificación de [11] y [12]
tomando en cuenta:
Características del cultivo: color superficial de micelio aéreo y reverso para el
micelio vegetativo de la colonia, cantidad de hifa aérea, textura de la superficie, forma
del margen, patrón de crecimiento y estructuras formadas.
Morfología del hongo: forma de la hifa, estructuras asexuales como
esporangios, esporas, conidios, entre otras.
7
Para la obtención de cultivos puros, se incubaron a 25 °C durante 15 días con luz
fluorescente continua y mediante montajes permanentes, temporales y micro-cultivos se
procedió a la identificación de cada hongo en crecimiento [12].
3.6 PREPARACIÓN DE CULTIVOS MONOSPÓRICOS
Después de aislar los hongos en agar papa dextrosa se procedió a realizar resiembras,
mediante la transferencia de discos con micelio en crecimiento en cajas de petri con
medio PDA [7, 13].
Para realizar la suspensión de esporas a un cultivo puro y esporulado se le
agregó 10 ml de agua destilada estéril junto con una gota de Tween 80 y con la ayuda de
una varilla de vidrio se removieron los conidios. La solución que se obtiene se vacía en
un tubo de ensaye y se determina la concentración de conidios por mililitro con la
cámara de conteo Neubauer.
De la solución concentrada, se tomó 1 ml y se transfiere en otro tubo que
contiene 9 ml de agua destilada estéril, se homogeneizó la muestra y se tomó,
nuevamente, 1 ml para transferirse a un segundo tubo con 9 ml de agua destilada estéril
hasta completarse 10 tubos o diluciones de 10-1
hasta 10-9
[14].
Posteriormente, se procedió a preparar un microcultivo, el cual consistió en
preparar un triángulo de vidrio, dentro de una caja de petri y se le agregó 3 ml de medio
PDA a un portaobjetos sobre el triángulo. Se depositó 50 µL de cada suspensión de
esporas sobre el PDA para esparcir con una espátula de drisgalski y se esperó 15 min
para que el líquido fuera absorbido por el medio de cultivo [14].
Posteriormente, se revisó el portaobjetos con el objetivo de 10x y se verificó con
el objetivo de 40x, se regresa al objetivo de 10x para ubicar el conidio en el campo
visual.
Se bajó la platina del microscopio con el tornillo del micrométrico, cerrando el
diafragma hasta observar un pequeño haz de luz en la región donde se localizó la espora
y se practican pequeños cortes con un bisturí, de manera que se forme un cuadrado en
torno a la circunferencia del haz de luz. Se volvió a observar con el objetivo 10x y 40x
para verificar el área donde se hizo el corte y que se observará únicamente una espora.
Se tomó esa fracción de medio PDA junto con la espora y se transfirió a una caja
petri con medio PDA nuevo, y finalmente se Incubó a 27°C y se revisó periódicamente
[14].
8
3.7 PRUEBAS in vitro DE FUNGICIDAS SOBRE CRECIMIENTO MICELIAL
DE Colletotrichum sp.
Se inoculó medio PDA adicionado con los fungicidas a las concentraciones de 50, 100,
250, 500 y 1000 mg/L de Azoxystrobin, Trifloxystribin, Metalaxil-M y Tiabendazol con
discos de micelio de cultivos monospóricos (5 mm de diámetro) tomados del límite de
las colonias en crecimiento durante 10 días. Se incubó a temperatura de 27±1 °C con luz
continua durante 7 días o hasta que el micelio del control llene toda la caja. El
experimento se llevó a cabo con tres repeticiones y las mediciones del crecimiento
micelial se realizaron con una regla calibrada, en cuatro ángulos diferentes y se anotó el
promedio obtenido [15].
Los fungicidas empleados en éste proyecto se eligieron debido a que éstos son
principalmente usados en los cultivos de papaya por los agricultores en esta área de
estudio (figura 4).
Figura 4. Los diferentes fungicidas que serán utilizados en la pruebas de
inhibición de crecimiento. Al obtener los cultivos axénicos se realizarán pruebas de
inhibición de crecimiento.
Fungicida Ingrediente activo Marca
Mertec 340-F Tiabendazol Arysta LifeScience
RidomilGold Bravo SC Metalaxil-M Syngenta
Tega Trifloxystrobin Bayer CropScience
Amistar Azoxystrobin Syngenta
Tabla 2. Fungicidas comerciales. Se utilizaron estos productos para las pruebas de inhibición, (la información fue obtenida de las etiquetas de cada envase).
9
3.8 CARACTERÍSTICAS DE LOS FUNGICIDAS
RidomilGold es un fungicida sistémico utilizado para combatir enfermedades
fitopatógenas contra Oomycetes y Deuteromycetes. Contiene dos compuestos
denominados Metalaxil-M (también conocido como Mefenoxam) y clorotalonil
(Tetracloroisoptalonitrilo). El primero de ellos pertenece a la familia de las Fenilamidas
y el segundo al de los Ditiocarbamatos [16].
El mecanismo de acción de Metalaxil-M es interferir de manera selectiva con la
síntesis de ARN ribosomal. Más específicamente, inhibe la actividad del complejo ARN
polimerasa. Además, inhibe el crecimiento micelial y la formación de esporas tanto in
vivo como in vitro. No se ha observado efecto sobre la germinación de la espora ni
sobre la penetración de la misma sobre los tejidos de las plantas. En cuanto a
Clorotalonil participa inhibiendo el proceso de la respiración (conversión de
carbohidratos en energía) de las células del hongo, esto ocurre mediante un enlace
rápido de las moléculas de Clorotalonil con grupos sulfidrilos. Enzimas como la
glicerol-3-fosfato deshidrogenasa (GDPH) son también desactivas y no pueden
colaborar con la culminación del ciclo de Krebs e inhibe la producción de ATP [6].
Tega es un fungicida mesosistémico (afinidad con la superficie de la hoja) cuyo
ingrediente activo es el trifloxistrobin (Ester metil ácido (E,E)-metoxyimino)[2-[1-(3-
trifluorometil-fenil)-etilideneaminooximetil]-fenil]-acético), una estrobilurina cuya
diana son las mitocondrias de los hongos. El producto actúa inhibiendo la respiración
mitocondrial y por ello los procesos bioquímicos son severamente afectados, el
crecimiento se detiene y el hongo muere [6].
Mertec 340-F es un fungicida sistémico y de contacto cuyo ingrediente activo es
el Tiabendazol (2-(4-tiazolil)-1 H-benzimidazol) que pertenece a la familia de los
benzimidazoles. El mecanismo de acción de estos es unirse a las beta tubulinas con
polimerización de microtúbulos con pérdidas de vesículas secretoras y alteración de la
captación de glucosa [6].
Finalmente, Amistar cuyo ingrediente activo es el Azoxystrobin (metoxiacrilato)
su nombre químico es Metil-(E)-2-2-6-(2-cianofenoxi)pirimidin-4-iloxi-fenil-3-
metoxiacrilato) es un fungicida con actividad curativa, preventiva y erradicante
inhibiendo el crecimiento micelial y la germinación de las esporas. Tiene propiedades
mesosistémicas y sistémicas [15].
10
4 RESULTADOS
4.1 COLECTAS
Las colectas concordaron con la temporada de lluvia de la región por lo cual se optó en
que pasara la época de precipitación pluvial (figura 5 a 10). De tal manera asegurarnos
que las esporas fueran dispersadas en los cultivos para que posteriormente fueran
infectados los cultivos asegurando de esta manera que se tuviera un alto índice de
infección en los plantíos.
Figura 9. El mal manejo de desechos repercute en la
proliferación de patógenos. Materia orgánica en
descomposición, tal como las hojas del fruto de papaya aumenta las probabilidades de una infección en los plantíos.
Figura 10. Visualización de síntomas característicos de
enfermedades. Se recorrieron papayales en busca de indicios
de daños característicos a los frutos, plantas y tallos producidos por gentes fitopatógenos
Figura 5. Riego por aspersión. en los plantíos papaya, con una
separación de 1 metro entre zurcos. Figura 6. Frutos de papaya que posiblemente presenten
algún daño. Características que exhiben los frutos debido a un
daño en la corteza que induce a la exudación visible de latex en
el fruto
Figura 7. Frutos que son desechados por no haber cerrado
de manera adecuada la flor. Y por consecuencia serán blancos para diferentes patógenos
Figura 8. Visualización la proliferación de agentes
patógenos. Se muestra en el interior del fruto se encuentra un crecimiento excesivo de organismos fúngicos.
11
Las muestras obtenidas de las colectas fueron cuidadosamente transportadas a la
Universidad de Mar campus Puerto Escondido, en cajas debidamente cerradas (figura
11). La universidad se encuentra ubicada en el municipio de San Pedro Mixtepec en la
costa de Oaxaca (15º 53‟ 21.53‟‟ N y 97º 04‟ 41.4‟‟ W); los análisis se llevaron a cabo
en el laboratorio de docencia de química y en el laboratorio de Genética de este campus,
previo a una identificación de los frutos a analizar (figura 12).
Figura 11. Frutos colectados. Los frutos fueron
transportados desde los plantíos hasta el laboratorio de
química de la Universidad del Mar
Figura 12. Identificación de frutos colectados. fueron
medidos y etiquetado por la localización de sus lesiones
En la campana de flujo laminar que se encuentra en las instalaciones del laboratorio de
química se procedió a procesar las partes infectadas de cada uno de los frutos
recolectados, extrayendo dichos tejidos vegetales, lavándolos con una solución de
hipoclorito de sodio para posteriormente inocular en cajas petri conteniendo medio de
cultivo PDA (figura 13-14).
Figura 13. Material y equipo del laboratorio de química
para los análisis. Se utilizó una campana de flujo laminar para la toma de muestra.
Figura 14. Preparación de muestras. Las muestras se lavaron
con hipoclorito de sodio al 1.6% para realizar la siembra a los medio de cultivo.
12
Los análisis de los frutos de papaya constaron de las siguientes etapas
Desinfección de material vegetal
Sembrar tejido infectado en medio de cultivo papa dextrosa agar (PDA)
Realizar resiembras
Visualización al microscopio
Caracterización morfológica del micelio
Obtención de estructuras germinativas
Obtención de cepas
Preparar medios de cultivo suplementados con los diversos fungicidas a
diferentes concentraciones utilizados en el campo para posterior interacción con
las cepas aisladas
Los frutos colectados presentaban alguno de los síntomas de alguna enfermedad como:
lesiones hundidas-húmedas, bordes y formas irregulares (con formas aproximadamente
circulares), endurecimiento del tejido en las lesiones, presencia de crecimiento micelial
blanquecino-grisáceo y exudados de látex fuera y/o dentro de las lesiones (Figura 15).
Figura 15.- Síntomas característicos de infección. Fueron
encontrados diferentes daños en la corteza que presenta un
crecimiento algodonoso en los frutos posiblemente de alguna enfermedad fungosa,
De acuerdo a la bibliografía, las descripciones realizadas se ajustan con la
patología producida por la antracnosis. Dicha enfermedad es producida por cuatro
hongos diferentes, los cuales son: Diplocarpon, Elsinoe, Glomerella y Gnomonia que
dañan al foliaje, tallo y frutos [13]. Esta enfermedad es considerada una de las mayores
limitantes en la producción de la papaya durante la postcosecha y, aunque afecta en
13
todas las zonas productoras del mundo, ocasiona las mayores pérdidas en Brasil, Hawaii
y México [17].
4.2 AISLAMIENTO DE LAS MUESTRAS
De cada fruto se obtuvieron 3 muestras con tejido sano e infectado. En total fueron 75
muestras de tejido. Las cuales fueron agrupadas en 8 conjuntos de acuerdo a las
características morfológicas de las colonias como la coloración en frente y al reverso,
color de hifa aérea y vegetativa, textura y cantidad de hifa aérea, forma de crecimiento y
borde. De dichos grupos, se eligieron al azar para subcultivarse las siguientes placas
2.A.1, 4.A.1, 17.A.1, 17.A.2, 19.A.1, 21.A.1, 21.A.2 y 23.A.1(figura 16-17).
Una vez sembrado los fragmentos de tejidos vegetales infectados en las cajas petri que
contenían medio PDA, se incubaron a una temperatura de 27°C; trascurridos varios días
se pudo observar un crecimiento fúngico en los bordes del tejido sobre el medio
nutritivo (figura 18-19).
Figura 16. Trozos de la corteza del fruto en PDA. Tejido vegetal que presentaba lesiones fueron trasferidos a medio Papa
Dextrosa Agar
Figura 17. Incubación de las cajas petri. Una vez sembrado los trozos de corteza del fruto en medio PDA fueron incubados
a 27 ºC
Figura 18. Crecimiento miceliar en cajas petri. Una vez
sembrado los fragmentos de corteza su pudo constatar crecimiento
Figura 19. Crecimiento algodonoso. Proliferación de hongos
patógenos.
14
4.3 IDENTIFICACIÓN MORFOLÓGICA MACROSCÓPICA Y
MICROSCÓPICA
En las muestras tamizadas se encontró a Colletotrichum spp. y Fusarium spp. La
morfología de la colonia de Colletotrichum sp. (7.A.1) es de color café-grisácea con
crecimiento radial y bordes irregulares, presenta micelio aéreo escaso con textura
algodonosa y micelio vegetativo hialino. Presenta hifas septadas con apresorios café
oscuros e hifas hialinas, el cuerpo acervular posee setas oscuras estériles y en los
conidióforos, gran cantidad de conidios con forma curva y oblonga, sin apéndices,
unicelulares, hialinas, originados de la parte apical del mismo y, además, se mantienen
en un área húmeda y en pequeñas masas [11];[12] (Figura 20).
En cuanto a Fusarium sp. (23.A.2) la colonia presenta en la parte central una coloración
café oscura y, blanquecina-amarillenta en los bordes. Presenta micelio aéreo escaso con
textura algodonosa. Bordes discontinuos y hundidos, con crecimiento amorfo. Las hifas
del micelio son septadas con clamidoconidios. Presenta macroconidios con 2 a 4
células, con forma de canoa, con células apicales elongadas y microconidios presentes,
usualmente de 1 a 2 células con forma cilíndrica y redondeada en los extremos
[11],[12].
De acuerdo a Barnett & Hunter los aislados de éste género son muy difíciles de
identificar debido a las condiciones físico-químicas de cultivo que ocasiona la
Figura 20. Características fenotípícas de Colletotrichum sp. A) Las características más pronunciadas de la colonia son la escasa presencia de micelio aéreo de color blanco, el color del micelio vegetativo hialino, el
crecimiento radial con bordes irregulares; B) El micelio es septado y C) la presencia del cuerpo acervular con
setas café-oscuras y estériles, en el que existe gran cantidad de conidios, curvos y oblongos, en formación apical
a los conidióforos.
15
malformación del esporodoquio, sin embargo, es posible su identificación debido a la
producción de macro y microconidios en forma de canoa, como se puede observar en la
figura 21C.
4.4 CULTIVOS MONOSPÓRICOS
Del cultivo 7.A.1 se obtuvieron cultivos puros y se realizó la suspensión de esporas,
siguiendo el procedimiento descrito arriba. En total, se realizó la transferencia de 13
esporas del hongo descrito como Colletotrochum sp a las cajas de petri con medio PDA
suplementado con los antibióticos rifampicina (25 mg/L) y cefotaxima sódica (500
mg/L), se incubó durante 7 días y mediante transferencia de disco con micelio en
crecimiento fueron resembrados 8 de los l3 cultivos monospóricos (figura 22). Los otros
5 cultivos se descartaron debido a la ausencia de crecimiento micelial.
Figura 21. Aspectos morfológicos de Fusarium sp. A)Crecimiento colonial de Fusarium sp. es amorfo, con una coloración café
oscura en el centro y la bordea un micelio de color blanco-amarillento, presenta micelio aéreo escaso. B) Las hifas del micelio son
septadas y C.2) macroconidios de más de 2 células hasta 4 y C.1) microconidios de 1 a 2 células.
Figura 22. Cultivos monospóricos. A, B y C) Muestran los conidios en un bloque aproximadamente de 5
mm2 de medio PDA. En la figura C se puede observar el conidio germinado, ya que el tubo germinal aparece
en un extremo del conidio.
16
4.5 PRUEBAS in vitro DE CRECIMIENTO MICELIAL
La prueba duró 8 días en el que se pudo observar que los mejores resultados fueron
inducidos por Metalaxil-M (cuyo nombre comercial es Ridomilgold) debido a que el
crecimiento micelial no fue mayor a 5 mm (1mg/L). Contrastando notablemente con el
testigo (figura 23).
Se puede notar gran diferencia en la inhibición del crecimiento radial fúngico,
cerca de 30 mm de diferencia (tabla 4). Además, es importante mencionar que el hongo
es capaz de inducir el crecimiento de sus hifas radialmente después del segundo día en
exposición a este fungicida (Ver anexos).
Tega y Amistar no muestran capacidad de inhibir el crecimiento micelial del
hongo. Esto se puede observar en la gráfica 1 y en la tabla 3 y 4, en donde claramente el
crecimiento micelial del testigo es muy similar en ambos fungicidas. Por otro lado,
Mertec 340-F muestra ligera inhibición en el crecimiento de los cultivos puros de
Colletotrichum sp. y aunque no es eficiente para detener el crecimiento del hongo, si
difiere estadísticamente tanto de los efectos de Tega como de Amistar.
Estos resultados obtenidos pueden haberse dado debido a la capacidad sistémica
que posee el fungicida RidomilGold debido a que éste presenta dos ingredientes activos:
Clorotalonil y Metalaxil-M. Aumentando la capacidad de inhibir el crecimiento del
hongo. Además, es importante enfatizar los mecanismos de acción de estos dos, ya que
están seriamente implicados en la síntesis de ADN como en la respiración,
Horas
Fungicidas 24 48 72 96 120 144 168 192
Tega 1.469 4.813 9.313 13.719 18.594 23.531 28.531 33.250
Amistar 0.375 3.719 8.656 13.313 18.344 23.500 28.531 33.406
Mertec 340-F 0.875 3.688 6.875 10.031 13.375 16.625 20.000 23.750
RidomilGold 0.000 0.000 0.269 0.713 1.262 2.031 2.938 3.875
Testigo 1.406 4.344 8.719 13.000 17.750 22.906 27.937 33.406
Tabla 3 Pruebas de inhibición de crecimiento micelial. Los datos mostrados se encuentran en milímetros y
representan la media de cuatro observaciones a 1mg/L de los fungicidas.
17
respectivamente, cuyo resultado es el alto de todo metabolismo tanto de degradación de
sustrato y de utilización de ATP [15].
En cuanto al resto de los fungicidas es clara su baja efectividad para evitar el
crecimiento del hongo Colletotrichum sp. debido, quizás, a sus capacidades
mesosistémicas (tabla 3). Es decir, de no ser absorbida por el hongo y permanecer en el
medio de cultivo. Por otro lado, aunque fueran absorbidos por el hongo, mediante
translocación o por algún otro medio de absorción, hacia el citoplasma es muy poco el
efecto de éstos, ya que, al tener dianas como las mitocondrias y a los microtúbulos,
organelo y estructura que no se encargan de metabolismos no tan importantes, pero si
esenciales, no afectar totalmente al crecimiento micelial [15].
0
5
10
15
20
25
30
35
40
24 48 72 96 120 144 168 192
Cre
cim
ien
to m
ice
lial e
n f
orm
a ra
dia
l (m
m)
Tiempo (horas)Figura 23 .- Los datos graficados representan la inhibición del crecimiento micelial. Respresenta elpromedio de las cuatro observaciones de cada dosis cuya concentración fue de 1mg/L para todos
Inhibición de crecimiento miceliar con los diferentes Fungicidas (1mg/mL)
RidomilGold
Mertec 340-F
Testigo
Amistar
Tega
18
Tiempo
Fungicida
48 horas
96 horas
144 horas
192 horas
Control
Tega
Amistar
Mertec 340-
F
RidomilGold
Bravo SC
Tabla 4. Prueba de crecimiento micelial de Colletotrichum sp. Colección de fotografías que indican las horas en que cultivos monospóricos o axénicos de Colletotrichum sp. fueron expuestos a diferentes fungicidas. La mayor
inhibición es producida por RidomilGold Bravo SC y el mayor crecimiento es producido en Tega y Amistar. 1Todos los fungicidas están a una concentración de 1 mg/L.
19
5 CONCLUSIONES
Con los análisis realizados en las colectas, se puede afirmar que los cultivos presentan
enfermedades causadas principalmente por hongos.
Posiblemente Colletotrichum gloeosporioides se encuentre con una probabilidad de
incidencia alta, ha destacado ser el agente causal de la enfermedad conocida como
antracnosis, el cual juega un papel muy importante en la economía de la agricultura a
nivel mundial.
No se pudo comprobar en las colectas realizadas la incidencia de Phytophthora, en los
cultivos de papaya.
Se lograron obtener 10 cultivos monosporicos de Colletotrichum gloeosporioides y 3
cultivos axénicos de Fusarium sp.
En las pruebas de inhibición realizadas con los diferentes fungicidas, los cuales son
comúnmente utilizados en los plantíos de papaya; RidomilGold presentó un mayor
grado de inhibición de crecimiento de Colletotrichum gloeosporioides.
Con este proyecto se podrá dar información a los productores de papaya de la
efectividad de RidomilGold contra la proliferación de Colletotrichum gloeosporioides,
ya que al carecer de análisis de inhibición optan por agregar una gran variedad de
fungicidas sin obtener los resultados deseados en la erradicación de dicho agente
patógeno en sus cultivos.
Se encontró que la concentración óptima de inhibición de crecimiento de
Colletotrichum gloeosporioides fue de 1mg/mL
No se realizaron más colectas y análisis de identificación molecular debido al recorte
del presupuesto inicial.
En este proyecto participó el alumno C. Epifanio Santiz Rodríguez, en modalidad de
servicio social (Ver anexos).
20
6 PERSPECTIVAS
Con el aislamiento de los cultivos de Colletotrichum gloeosporioides se harán ensayos
en laboratorio de interacción fruto-patógeno en cuanto a la inhibición de crecimiento in
situ para comprobar así la efectividad de acción encontrada en RidomilGold en las
pruebas de inhibición realizadas en los medios de cultivo.
Identificar y caracterizar de manera micro y macroscópicamente todas las cepas que se
obtuvieron de las colectas
Una vez identificadas de manera micro y macroscópicamente a las cepas Colletotrichum
gloeosporioides se procederán hacer análisis a nivel de Biología Molecular, para
identificar la variedad de hongo y a su vez determinar si provienen de la misma especie
o si son cepas diferentes (polimorfismo); por medio de las técnicas de reacción en
cadena de la polimerasa (PCR) y DNA polimórfico amplificado al azar (RAPD).
Una vez identificado a RidomilGold como el fungicida con mayor acción inhibitoria
patogénica se procederá a realizar aplicaciones directas hacia el fruto en proceso de
floración y maduración, para así comparar los efectos de inhibición fruto-patógeno en el
laboratorio y en el campo.
Continuar con la identificación de agentes fitopatógenos del cultivo de papaya, con el
objetivo de caracterizarlos y establecer estrategias de control, manejo pre-cosecha,
manejo durante el cultivo y posterior a las cosechas del cultivo de papayas, a fin de
minimizar las pérdidas en los cultivos por daño ocasionado por agentes fitopatogenos,
tales como bacterias y hongos principalmente.
Iniciar platicas informativas respecto a los resultados obtenidos en las pruebas de
inhibición del crecimiento de Colletotrichum gloeosporioides, a los principales
productores del cultivo de papaya, para resaltar los efectos de los fungicidas que
utilizan. Explicarles las ventajas y desventajas del uso discriminado de estos agentes
antifungicos y su papel en la contaminación de los mantos freáticos y en ambiente,
aunado a las pérdidas económicas que estos les ocasionan al adquirirlos, aplicarlos y no
tener efecto alguno sobre sus problemas de plagas.
21
7 INFORME FINANCIERO
Se anexan copias de las facturas del material adquirido para la realización del presente
proyecto, con un gasto total de $24460.29 (Ver anexos).
El monto aprobado para el presente proyecto fue de $25000.00.
8. BIBLIOGRAFÍA
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22
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23
9. ANEXOS
Formato para las pruebas de crecimiento
Fungicida:Mertec Medición en: mm
Concentración Días 1 2 3 4 5 6 7 8
50 mg/L
0.875 4.125 7.375 11.375 15.250 19.500 24.000 28.375
0.875 4.000 7.500 11.375 15.875 20.000 24.125 28.625
1.125 4.375 7.625 11.625 15.750 19.875 24.500 29.000
1.125 4.125 7.875 11.750 15.750 20.125 24.250 28.625
100 mg/L
1.000 4.125 7.500 11.375 15.125 18.875 22.750 26.750
1.500 4.250 7.875 11.000 15.125 18.500 22.500 26.500
1.000 4.000 7.375 11.250 14.875 18.625 22.625 26.375
1.000 3.875 7.625 11.125 15.000 18.625 22.750 26.625
250 mg/L
1.000 3.875 7.125 10.375 14.000 17.250 29.000 24.125
1.125 3.500 6.625 9.875 13.625 17.000 20.250 23.875
0.750 2.125 5.000 7.250 10.000 12.750 15.750 19.125
0.375 2.000 4.750 7.125 10.125 13.000 16.000 19.125
500 mg/L
1.000 3.875 7.000 10.500 14.000 17.500 20.875 24.250
1.125 3.500 7.125 10.375 14.125 17.625 21.000 24.750
1.125 3.750 7.000 10.625 14.375 17.500 21.000 25.000
1.000 3.750 7.250 10.625 14.250 17.625 20.875 24.750
1000 mg/L
1.000 3.750 7.000 10.000 13.500 16.750 20.000 24.000
1.000 3.875 7.000 10.125 13.375 16.500 20.000 24.000
0.750 3.625 6.750 10.125 13.625 17.125 20.500 23.875
0.750 3.500 6.750 9.875 13.000 16.125 19.500 23.125
Control
1.375 4.625 8.875 13.125 18.125 22.750 27.625 32.375
1.375 4.125 8.625 12.750 17.500 22.625 27.750 33.375
1.375 4.125 8.625 12.750 17.000 22.625 27.750 33.375
1.500 4.500 8.750 13.375 18.375 23.625 28.625 34.500
Condiciones
T ambiente 20°C T de experimentación 27 ±1°C
El experimento se llevó con los diferentes fungicidas empleando tres repeticiones de cada dosis y el número de cada celda es el promedio de 4 mediciones realizadas a cada caja petri. Para las mediciones se utilizó una regla milimétrica calibrada. Los discos de micelio inoculados en cada caja fueron de 5mm. Se utilizó testigos universales.
24
Formato para las pruebas de crecimiento
Fungicida: Tega Medición en: mm
Concentración Días 1 2 3 4 5 6 7 8
50 mg/L
1.500 4.625 8.125 12.625 17.375 22.500 27.750 32.625
1.000 4.375 8.000 12.625 17.375 22.125 27.000 32.125
1.625 4.500 8.500 12.875 17.875 23.000 28.250 33.500
1.125 4.875 8.750 12.875 17.625 22.500 27.500 32.750
100 mg/L
1.250 4.625 8.500 13.000 17.500 22.875 28.000 33.125
1.380 5.125 9.000 13.375 18.000 22.000 28.000 33.000
1.000 4.125 7.250 12.000 16.500 21.250 26.375 31.500
1.500 4.000 7.500 12.250 16.875 21.750 26.625 31.750
250 mg/L
1.500 4.250 8.375 12.875 17.375 22.500 28.125 33.125
1.375 4.875 9.125 13.500 18.375 23.375 28.125 33.125
1.125 4.125 8.000 12.875 17.500 23.000 28.125 33.625
1.250 4.250 8.250 13.000 17.750 22.875 28.375 33.625
500 mg/L
1.125 4.250 8.875 13.625 18.125 23.125 28.100 33.750
1.250 4.500 8.875 13.125 17.875 23.000 28.625 33.500
1.125 4.250 8.500 13.125 18.000 23.125 28.250 33.500
1.125 4.500 8.000 12.250 16.875 21.500 26.500 31.625
1000 mg/L
1.375 4.500 9.000 13.375 18.375 23.375 28.375 33.375
1.250 4.750 9.125 13.375 18.250 23.000 27.875 32.875
1.375 5.000 9.375 14.000 18.750 23.750 28.875 33.500
1.875 5.000 9.750 14.125 19.000 24.000 29.000 33.250
Control
1.375 4.625 8.875 13.125 18.125 22.750 27.625 32.375
1.375 4.125 8.625 12.750 17.500 22.625 27.750 33.375
1.375 4.125 8.625 12.750 17.000 22.625 27.750 33.375
1.500 4.500 8.750 13.375 18.375 23.625 28.625 34.500
25
Formato para las pruebas de crecimiento
Fungicida: Amistar Medición en: mm
Concentración Días 1 2 3 4 5 6 7 8
50 mg/L
0.750 3.875 8.500 13.125 18.250 23.500 29.000 33.875
0.500 3.625 8.500 13.125 18.250 23.250 29.000 33.875
0.375 3.500 7.500 12.375 17.750 22.875 28.375 33.875
0.250 3.250 7.625 12.625 17.750 22.750 27.875 33.500
100 mg/L
0.375 3.250 7.750 12.500 17.625 23.375 28.500 33.625
0.750 3.625 8.125 12.375 17.625 22.875 28.125 33.750
0.750 3.625 8.375 13.125 18.500 23.875 29.250 34.750
0.650 3.750 8.750 13.375 18.625 24.250 29.750 35.125
250 mg/L
0.000 3.250 8.000 13.125 18.250 23.375 28.875 34.375
0.000 3.625 8.250 13.250 18.625 23.625 28.875 34.000
0.000 3.250 8.375 13.125 18.250 23.750 29.000 34.250
0.000 3.250 8.250 13.250 18.750 24.000 29.375 35.000
500 mg/L
0.375 3.500 7.375 12.875 18.250 23.750 28.875 34.250
0.375 3.500 7.750 12.625 17.375 22.750 28.000 33.000
0.625 3.500 8.375 13.375 18.625 24.000 29.250 34.500
0.625 3.750 8.375 13.250 18.500 24.250 29.250 34.875
1000 mg/L
0.375 4.000 9.000 14.000 18.875 24.000 29.000 33.625
0.000 3.250 8.375 13.000 17.875 22.750 28.125 33.000
0.500 3.875 8.625 13.250 18.500 23.875 28.750 33.875
0.625 3.750 8.625 13.000 18.125 23.375 28.250 33.125
Control
1.375 4.625 8.875 13.125 18.125 22.750 27.625 32.375
1.375 4.125 8.625 12.750 17.500 22.625 27.750 33.375
1.375 4.125 8.625 12.750 17.000 22.625 27.750 33.375
1.500 4.500 8.750 13.375 18.375 23.625 28.625 34.500
26
Formato para las pruebas de crecimiento
Fungicida: Ridomil Medición en: mm
Concentración Días 1 2 3 4 5 6 7 8
50 mg/L
0.000 0.300 2.750 5.000 8.000 10.125 13.375 16.250
0.000 0.875 3.125 5.375 7.625 10.500 13.625 16.750
0.000 0.250 2.500 5.125 7.625 10.250 13.500 16.500
0.000 0.375 2.875 5.125 7.625 10.500 13.750 16.750
100 mg/L
0.000 0.225 2.250 4.000 5.750 8.375 10.750 12.750
0.000 0.550 2.750 4.625 6.875 8.875 11.250 13.625
0.000 0.625 2.625 4.500 6.750 8.375 10.750 12.750
0.000 0.300 2.375 4.125 6.125 8.250 10.875 12.750
250 mg/L
0.000 0.250 1.250 2.875 4.625 5.875 7.375 9.500
0.000 0.000 1.375 2.950 4.625 6.125 7.875 10.750
0.000 0.000 1.125 2.500 4.250 5.550 6.875 8.875
0.000 0.000 1.125 2.625 4.250 5.875 7.250 9.000
500 mg/L
0.000 0.000 0.700 1.675 2.875 3.750 4.875 7.125
0.000 0.000 0.800 1.750 2.750 4.000 4.750 6.125
0.000 0.125 0.525 1.250 2.250 3.500 4.500 6.500
0.000 0.125 1.100 2.000 3.050 4.375 5.250 7.375
1000 mg/L
0.000 0.000 0.225 0.600 1.050 2.000 2.750 3.750
0.000 0.000 0.375 0.700 1.250 2.000 2.875 4.000
0.000 0.000 0.150 0.725 1.325 2.000 3.000 3.625
0.000 0.000 0.325 0.825 1.425 2.125 3.125 4.125
Control
1.375 4.625 8.875 13.125 18.125 22.750 27.625 32.375
1.375 4.125 8.625 12.750 17.500 22.625 27.750 33.375
1.375 4.125 8.625 12.750 17.000 22.625 27.750 33.375
1.500 4.500 8.750 13.375 18.375 23.625 28.625 34.500
