INGENIERÍA BIOQUÍMICA

Mario Arias Zabala

Facultad de CienciasUniversidad Nacional de Colombia

Sede Medellín2007

PROGRAMA RESUMIDO

1. Breve reseña histórica2. Generalidades de los Procesos Bioquímicos3. Procesos Fermentativos3.1. Estequiometría de procesos fermentativos3.2. Cinética de procesos fermentativos3.3. Aspectos termodinámicos4. Técnicas del cultivo celular4.1. Cultivo discontinuo (batch)4.2. Cultivo alimentado (fed batch)4.3. Cultivo continuo5. Agitación de Medios de Cultivo6. Aireación de Medios de Cultivo7. Esterilización8. Escalado

BIBLIOGRAFÍA (Libros)

1. Doran, P. : Bioprocess Engineering Principles. Academic Press. 1995.2. Blanch, H. and Clark, D.: Biochemical Engineering. Marcel Dekker. 1997.3. Casablancas, F. y López, J. (Editores): Ingeniería Bioquímica. Editorial

Síntesis.1998.4. Bailey, J. and Ollis, D.: Biochemical Engineering Fundamentals. McGraw-Hill. 1986.5. Quintero, R.: Ingeniería Bioquímica. Editorial Alhambra. 1981. 6. Bu’Lock, J. y Kristiansen, B.: Biotecnología Básica. Edit. Acribia. 1991.7. Stanbury, P., Whitaker, A. and Hall, S.: Principles of Fermentation Technolo-

gy. Edit. Butterworth Heinemann. 1995.8. Nielsen, J. and Villadsen, J.: Bioreaction Engineering Principles. Plenum

Press. 1994.9. Wang, D. y otros: Fermentation and Enzyme Techonology. John Wiley and

Sons. 1979.10. Aiba, S., Humphrey, A. and Millis, N.: Biochemical Engineering. Academic

Press. 1973.11. Shuler, M. and Kargi, F.: Bioprocess Engineering: Basic Concepts. Prentice

Hall. 1992.

BIBLIOGRAFÍA (Revistas)

1. Biotechnology and Bioengineering

2. Biotechnology Progress

3. Journal of Fermentation and Bioengineering

4. Biochemical Engineering Journal

5. Chemical and Biochemical Engineering Quarterly

6. The Chemical Engineering Journal and the Biochemical Engineering Journal

7. Process Biochemistry

8. Applied Biochemistry and Microbiology

9. Applied Microbiology and Biotechnology

10. Journal of Applied Microbiology

11. Letters in Applied Microbiology

12. American Journal of Biochemistry and Biotechnology

13. Biotechnology Advances

14. Critical Reviews in Biotechnology

15. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology

AREAS DE INVESTIGACIÓN EN INGENIERÍA BIOQUÍMICA

• Optimización de procesos existentes.

• Desarrollo de nuevos procesos con base en células microbianas modificadas . genéticamente, células vegetales y células animales.

• Procesos con células y enzimas inmovilizadas.

• Nuevos diseños de biorreactores.

• Desarrollo de biosensores y sensores virtuales.

• Monitoreo y control asistido por computador de bioprocesos.

BREVE RESEÑA HISTÓRICA DE LA MICROBIOLOGÍA

1665 Hook describe la estructura celular del corcho.

1675 Leeuwenhoek mejora los lentes del microscopio y descubre formas de vida unicelular.

1750 Spallanzani aporta evidencias de que los m.o. no surgen espontánea-mente.

1828 Wohler sintetiza la urea, desmintiendo que los compuestos orgánicos sólo pueden ser sintetizados por organismos vivos.

1837 Cagniar, Schwann y Kutzing proponen, independientemente, que las levaduras son plantas y causan la fermentación.

1862 Pasteur postula que todos los procesos fermentativos resultan de activi-dad microbiana y descubre los m.o. anaerobios.

1876 Tyndall desarrolla el método de esterilización discontinua por calenta-miento.

1883 Koch introduce las técnicas del cultivo puro, incluyendo la caja de petri, inventadas por Ricardo Petri.

BREVE CRONOLOGÍA DE LA BIOTECNOLOGÍA

– 1865 Era pre-Pasteur: Bebidas alcohólicas (cerveza, vino); productos lácteos . (quesos, yogurt); otros alimentos fermentados.

1865 – 1940 Era Pasteur: Solventes orgánicos (etanol, butanol, acetona, glicerol); . ác. orgánicos (cítrico, acético, láctico); tratamiento aerobio de aguas

. residuales.

1940 – 1960 Era de los antibióticos: Penicilinas (tecnología de fermentación sumergi-. da); gran variedad de antibióticos; vacunas contra virus, transformaciones

. microbiológicas de esteroides; tecnología de la estructura de la célula ani- . mal.

1960 – 1975 Era post antibióticos: Aminoácidos; proteína unicelular (SCP); enzimas . (detergentes); tecnología de células y enzimas inmovilizadas; tratamiento . anaerobio de aguas residuales (biogás); polisacáridos bacterianos (goma . xantana); gasohol.

1975 – Era de la nueva biotecnología: Tecnología de los hibridomas; anticuerpos . monoclonales; tecnología del ADN recombinante (ingeniería genética); . insulina humana.

Generalidades de los procesos biológicos

La Ingeniería Bioquímica se ocupa del estudio del conjunto de operaciones que hacen uso de células (microbianas, vegetales o animales), o de componentes de dichas células (enzimas), para la obtención de bienes (productos útiles) o servicios (tratamiento de desechos contaminantes o aguas residuales) en condiciones económicas.

Este conjunto de operaciones constituyen los llamados Bioprocesos, Procesos Bioquímicos, Procesos Biotecno-lógicos o Procesos Biológicos.

Bioprocesos

• Procesos Enzimáticos: Utilizan enzimas o complejos enzimáticos aislados de las células, libres en suspensión en un medio líquido o inmovilizadas en soportes físicos. Son procesos catalíticos.

• Procesos Fermentativos: Utilizan células libres en suspensión o inmovilizadas en soportes físicos, tejidos celulares u órganos, como agentes de la biotransforma-ción. Son procesos autocatalíticos.

Biocatalizador: Células, enzimas o complejos enzimáti- cos.

Proceso Enzimático:

S + E P + E (Proceso Catalítico)

(Sustrato) (Enzima) (Producto) (Enzima)

S E P (Sustrato) (Enzima) (Producto)

Proceso Fermentativo:

S + Xo X + P (Proceso Auto-

(Sustratos o (Biomasa o (Biomasa) (Productos o catalítico)

Nutrientes) Inóculo) Metabolitos)

Nutrientes:

• Fuente de carbono y energía: carbohidratos (glucosa, sacarosa, lac-tosa, celulosa, almidón, etc.), hidrocarburos, etc.

• Fuente de nitrógeno: nitrógeno elemental (N2), amoniaco, sales de amonio, úrea, caldo peptonado (hidrolizado de proteínas), extracto de levadura, harinas de soya o pescado, etc.

• Micronutrientes: sulfatos (S) y fosfatos (P) de Na, K u otros metales; precursores, vitaminas, hormonas, etc.

• Oxígeno (procesos aerobios): aire, aire enriquecido con O2, oxíge-no puro.

Sustrato limitante: nutriente presente en menor proporción estequio-métrica. Normalmente es la fuente de C y energía, aunque en algu-nos casos puede ser la fuente de N o el O2.

Inóculo: volumen, Vi, de suspensión de células viables, de concen-

tración adecuada capaz de garantizar, en condiciones económicas, la fermentación de un volumen, V, dado de medio.

Comúnmente: Vi = 0.05-0.1 V

Medio de cultivo: solución, normalmente acuosa, que contiene los nutrientes necesarios para las células.

• Medios sintéticos o definidos: composición exactamente definida; normalmente son medios selectivos (medios de laboratorio).

• Medios complejos: composición no conocida con exactitud (medios industriales). Ej.: melazas, suero de leche, licor de cocción de maíz.

Preparación de medios

• Tipo y cantidad de nutrientes a emplear (formulación)• Esterilización• Ajuste de condiciones ambientales (T, pH, fuerza iónica,

homogenización, etc.)

Control del proceso: T, pH, agitación, nivel de espuma, concentraciones de O2 y CO2.

Fermentación: conversión de los componentes del me-dio en biomasa y productos o metabolitos, por la acción del biocatalizador (células o biomasa).

Optimización del proceso

• Tipo de fermentador• Modo de operación• Tipo de células• Medio de cultivo• Condiciones de operación más adecuadas (T, pH, agitación, etc.)• Control de variables más importantes

Separación y purificación del producto (Down stream processing)

Conjunto de operaciones de separación y purificación de la biomasa o de los metabolitos de interés (centrifugación, filtración, disrupción celular, intercambio iónico, cromatografías, separación con mem-branas, destilación, cristalización, precipitación, extracción, adsor-ción, secado, etc.).

Aspectos a estudiar en un bioproceso

• Estequiometría

• Cinética

• Termodinámica

• Fenómenos de Transporte

• Dinámica y Control

• Economía

ESTEQUIOMETRÍA DE PROCESOS FERMENTATIVOS

Objetivo

Establecimiento de relaciones cuantitativas entre los distintos componentes del proceso, a saber:

• Sustratos o nutrientes (S)• Biocatalizador, células o biomasa (X)• Productos o metabolitos (P)

Aplicaciones

• Formulación de medios de cultivo• Requerimientos de enfriamiento de biorreactores• Control por computador de biorreactores

Enfoques:

Molecular o microscópico: supone el conocimiento del conjunto de reacciones químicas que constituyen el metabolismo celular (mode-los de caja blanca) → Ingeniería Metabólica.

Diseño de Medios de Cultivo

a. Requerimientos Nutricionales y Ambientales Necesidades elementales Necesidades de nutrientes específicos Requerimientos energéticos Necesidades ambientales del cultivo

b. Objetivos del proceso Obtención de productos Producción de biomasa (proteína unicelular, SCP) Mantenimiento celular

c. Restricciones técnico-económicas Disponibilidad y costos de las materias primas Facilidad de recuperación de productos Control de contaminación

Enfoque Macroscópico

No considera los procesos que a nivel molecular ocurren en las células (modelos de caja negra). Se basa en balances elementales de materia, relaciones estequiométricas empíricas y en el conocimiento de la compo-sición elemental de la biomasa.

Características del enfoque macroscópico

• Se deben cumplir los balances de masa y energía.• No se tienen en cuenta los mecanismos o rutas de reacciones que el

sistema emplea.• Es aplicable para propósitos ingenieriles como formulación de medios y

control de biorreactores.• Se requiere conocer el contenido celular de todos los elementos para los

cuales se deban hacer los cálculos (composición elemental de la biomasa).• El número de nutrientes en el medio usualmente es muy grande y no todos

pueden ser incluidos en los cálculos.• Algunos nutrientes pueden ser limitantes o algunos productos pueden ser

inhibitorios.

Ecuación genérica del proceso:

• Fuente C + Fuente N + O2 → Células + Productos + CO2 + H2O

• CaHbOc + NlOmHn + O2 → CαHβOδNγ + CjHvOz+ CO2 + H2O

Donde:

CaHbOc: fórmula genérica para carbohidratos o hidrocarburos.

CαHβOδNγ: “fórmula empírica” de la biomasa.

NlOmHn: fórmula genérica para la fuente de nitrógeno.

CjHvOz: fórmula genérica para el producto extracelular.

Conocida la composición elemental de la biomasa, es posible asociarle una “fórmula empírica”.

Composición elemental de microorganismos

• Sólo 22 elementos químicos, son componentes esenciales de los organismos vivos.

• Elementos de la materia orgánica: C, O, H, N, P

• Iones monoatómicos: Na+, K+, Mg2+, Ca2+, Cl-

• Elementos traza: Mn, Fe, Co, Cu, Zn, B, Al, V, Mo, I, Si X: Elementos presentes sólo en algunas especies.

• La composición elemental de las células varía con la especie, el sustrato limitante, la rata de crecimiento celular, factores ambien-tales, etc.

Ejemplo: Composición elemental de la bacteria Escherichia coli.

Ejemplo: Determine la “fórmula empírica” de un microorganismo que tiene la siguiente composición porcentual en peso seco:

*10-3

Fórmula empírica: CH1.936O0.295N0.251

Ejemplo: Considere la siguiente ecuación química genérica, correspon-diente al crecimiento celular sin formación de productos extracelulares (metabolitos externos):

a CHxOy + b O2 + c HlOmNn → CHαOβNδ + d H2O + e CO2

x: Coeficientes estequiométricos (5 incógnitas)

Establezca las ecuaciones de balance elemental del proceso.

Solución:

• Balance de C: a = 1 + e (Ec. 1)• Balance de H: ax + cl = α + 2d (Ec. 2)• Balance de O: ay + 2b + cm = β + d + 2e (Ec. 3) • Balance de N: cn = δ (Ec. 4)

Conocidas las fórmulas empíricas de las fuentes de carbono y nitrógeno y de la biomasa, el sistema tendría 4 ecuaciones y 5 incógnitas (los 5 coe-ficientes estequiométricos), requiriendo otra ecuación para su solución.

La otra ecuación generalmente es una relación em-píricamente obtenida entre algún par de coeficientes es-tequiométricos. Estas relaciones se conocen genérica-mente como Factores de Rendimiento.

• Ejercicio: Determine los coeficientes estequiométricos del proceso anterior, si la fuente de carbono es el hexadecano, la fuente de nitrógeno es amoniaco y la biomasa tiene la fórmula empírica CH1.66O0.27N0.20. Se sabe además, por determinación experimental, que el factor de rendimiento Moles CO2 formadas/Moles O2

consumidas, también conocido como Cociente Respiratorio (RQ), es 0.43 moles CO2/mol O2.

Otros factores de rendimiento ampliamente usados

• Yx/s: Rendimiento de biomasa a partir del sustrato. (moles biomasa/mol sustrato, g biomasa/g sustrato).

• Yp/s: Rendimiento del producto a partir del sustrato. (moles producto/mol sustrato, g producto/g sustrato).

• Yp/x: Rendimiento de producto con respecto a la biomasa. (moles producto/mol biomasa, g producto/g biomasa).

• Yx/o: Rendimiento de biomasa con respecto al oxígeno. (moles biomasa/mol oxígeno, g biomasa/g oxígeno).

• Yc/o : Rendimiento de CO2 con respecto al oxígeno (RQ). (moles CO2/mol O2, g CO2/g O2).

Rendimiento Global y Rendimiento Instantáneo

YF/G = ∆F/∆G (Rendimiento Global)

∆F, ∆G: Variaciones en las cantidades de F y G en un intervalo finito de tiempo.

Para un reactor discontinuo (batch), de volumen constante, en el cual la reacción química entre F y G es la única fuente de variación de sus can-tidades, podemos definir:

Lim (∆F/∆G) = dF/dG = (dF/dt)/(dG/dt) = rF/rG = YF/G (Rendimiento ∆G→0 Instantáneo)

rF, rG: Ratas volumétricas de reacción de F y G.

Notas Por definición, los factores de rendimiento son siempre positivos. YF/G ≡ YFG

Rendimiento Teórico y Rendimiento Observado

• Rendimiento Teórico: Dado por la relación estequiométrica existente entre las sustancias relacionadas en el factor de rendimiento. Representa el máximo rendimiento posible.

• Rendimiento Observado: Dado por la relación ∆F/∆G, donde los ∆’s son los cambios medidos u observados en las cantidades de F y G en un intervalo dado de tiempo.

Ejemplo: Considere el proceso fermentativo de producción de biomasa dado por la ecuación:

S → X

∆X: Variación medida u observada en la cantidad de biomasa. ∆ST: Variación total medida u observada en la cantidad de sustrato.

Y’XS = ∆X/-∆ST (Rendimiento observado de biomasa con respecto al . sustrato).

En realidad: ∆ST = ∆SC + ∆SM

∆SC : Sustrato realmente utilizado para crecimiento celular. ∆SM: Sustrato utilizado para mantenimiento celular (movimiento, transporte .

activo de sustancias a través de membranas, recambio de componentes . celulares, etc.).

Por tanto:

YXS = ∆X/-∆SC (Rendimiento Verdadero o Teórico de biomasa con respecto al . sustrato).

Como ∆SC < ∆ST , entonces, YXS > Y’XS

Cuando, además de la biomasa, hay formación de productos extracelulares: ∆ST = ∆SC + ∆SM + ∆SP

Donde:

∆SP: Sustrato consumido para la formación de productos extracelulares.

Estequiometría del crecimiento celular con formación de productos extracelulares

Casos

• El producto principal aparece como resultado del metabolismo ener-gético primario. Ej.: Producción de etanol por S. cerevisiae.

• El producto es un metabolito secundario. Ej.: Producción de antibió-ticos por mohos.

• El producto surge del metabolismo energético. Ej.: Producción de á-cido cítrico por A. niger.

Sólo para procesos de la primera clase se puede expresar la este-quiometría del proceso por una única ecuación química que relacio-na la biomasa acumulada con el sustrato consumido y el producto formado.

Ecuación genérica:

aCwHxOy + bO2 + cNlOmHn → CHαOβNδ + dH2O + eCO2 + fCHvOz

• Conocidas las fórmulas empíricas de las fuentes de car-bono y nitrógeno, de la biomasa y el producto, se tendrí-an 6 incógnitas (los 6 coeficientes estequiométricos).

• Los balances elementales de C, O, H y N suministrarían 4 ecuaciones, faltando dos ecuaciones para poder resol-ver el sistema.

• Las dos ecuaciones faltantes se pueden obtener a partir de factores de rendimiento, experimentalmente hallados, o a partir de un balance de electrones.

Otra ecuación entre los coeficientes estequiométricos puede obtenerse de un balance de electrones.

Electrones Disponibles: número de electrones disponibles en un com-

puesto para transferir al oxígeno en la oxidación del compuesto hasta CO2, H2O y compuestos que contienen N. Se calcula a partir de la valencia de los distintos elementos que constituyen el compuesto.

C: 4; H: 1; O: -2; S: 6; P: 5; N: -3 (NH3), 0 (N2), 5 (NO3 -).

Grado de Reducción (γ): número equivalentes de electrones disponibles en aquella cantidad del material que contiene 1 at-gr de C.

Ejemplo: Considere el sustrato CwHxOyNz. Calcule el número de electrones disponibles y el grado de reducción.

Solución

• No. de electrones disponibles: 4w + x - 2y – 3z• Grado de reducción (γs): (4w + x - 2y – 3z)/w

Balance de electrones

Los electrones disponibles para transferir al oxígeno son conservados du-rante el metabolismo. Así, para la reacción química genérica de producción de biomasa con formación de producto extracelular:

aCwHxOy + bO2 + cNlOmHn → CHαOβNδ + dH2O + eCO2 + fCjHvOz

el balance de electrones disponibles, con N2 como fuente de nitrógeno, es:

aw γS – 4b = γX + fjγP

Donde:

γS : Grado de reducción del sustrato. γX : Grado de reducción de la biomasa. γP : Grado de reducción del producto.

La ecuación de balance de electrones anterior, provee otra ecuación que

relaciona los coeficientes estequiométricos (incógnitas) la cual, sumada a las ecuaciones de balance elemental y a los factores de rendimiento cono-cidos, permitirá determinar los coeficientes estequiométricos.

Demanda teórica de oxígeno

El requerimiento de oxígeno de un proceso fermentativo, está directamente relacionado con los electrones disponibles en el sustrato para transferir al oxígeno, pudiendo estimarse su demanda teórica a partir de un balance de electrones.

Así, para la fermentación representada por la ecuación genérica:

CwHxOy + aO2 + bNlOmHn → cCHαOβNδ + dH2O + eCO2 + fCjHvOz

Balance de electrones: w γS – 4a = c γX + f j γP

La demanda teórica de oxígeno (dada por el coeficiente estequiométrico a) será:

a = (w γS – c γX – f j γP)/4

De la ecuación: a = (w γS – c γX – f j γP)/4

obtenemos: 1 = ( 4a/w γS) + (c γx /w γS) + (f j γP/w γS)

Donde:

4a/w γS: Fracción de los electrones disponibles del sustrato que salen con el . oxígeno.

cγx /w γS: Fracción de los electrones disponibles del sustrato que salen con la . biomasa.

fjγP/w γS: Fracción de los electrones disponibles del sustrato que salen con el . metabolito extracelular.

En un proceso anaerobio en ausencia de formación de producto:

c γx /w γS = 1

Por tanto:

c = cmax = w γS / γx

Donde:

cmax : Máximo rendimiento teórico o termodinámico posible de biomasa.

Además:

YXS = cMX/MS

Donde:

YXS: Rendimiento de biomasa a partir del sustrato.

MX, MS: Masas moleculares de la biomasa y del sustrato respectivamente.

Por tanto: Yxs, max = w γS MX/ γx MS

Admitiendo como fórmula genérica para la biomasa la fórmula empírica:

CH1.8O0.5N0.2, el grado de reducción de la biomasa (γx) sería:

γx = 4 + 1.8 + 0.5 (-2) + 0.2 (-3) = 4.2

Análogamente: fmax = w γS/ j γP

fmax: Límite superior teórico de rendimiento del producto.