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Sara Della Torre Adriana Maggi Lab
08.11.11
Ingegneria animale: principi di base
Manipolazione genetica tradizionale
Manipolazione genetica moderna – DNA RICOMBINANTE
Cosa mancava per passare dalla manipolazione genetica tradizionale a
quella moderna?
1967: Scoperta della DNA ligasi
1968:
Scoperta degli enzimi di restrizione
1972: Avanzamenti nelle
tecniche di trasferimento del DNA e nell’uso di
plasmidi
Double helix
Watson and Crick, 1953
DNA
hybridization,
1961
PCR
Kary Mullis, 1983
http://www.karymullis.com
Animale Transgenico: animale nel cui genoma è stato inserito uno o più frammenti di DNA esogeno
Transgene: frammento di DNA esogeno integrato stabilmente nel patrimonio genetico di cellule animali o vegetali
• Arabadopsis (plant)
• C. elegans
• Fruit flies
• Xenopus (rana)
• Zebrafish
• Topo
Organismi utilizzati come modelli transgenici:
• Ratto
• Maiale
• Pecora
• Capra
• Mucca
Tipi di transgene
• Piccole molecole di DNA ricombinante – geni o cDNA legati a sequenze di DNA che permettono la corretta espressione da parte della cellula ospite
• Construtti Reporter – promoter del gene desiderato legato ad una cassetta di espressione la cui presenza può essere facilmente rilevata; es.: GFP, lacZ, luciferasi
• Grandi molecole di DNA – yeast artificial chromosomes (YACs) o bacterial artificial chromosomes (BACs)
Metodi di Ingegneria animale
Metodi principali di ingegneria animale
Clonazione
Transgenesi condizionale
Transgenesi standard
Gene targeting
Microiniezione di DNA lineare nella cellula uovo fecondata
• SCOPO: Guadagno di funzione
• CARATTERISTICA: inserzione random, casuale
Transgenesi standard
Introduzione di una sequenza di DNA purificata in uno dei
due pronuclei della cellula uovo fecondata
Transgenesi standard Work flow
1 • Preparazione degli oociti fecondati
2 • Preparazione dei costrutti
3 • Preparazione delle femmine “pesudogravide”
• Microiniezione e trasferimento nelle femmine “pseudogravide”
4 • Screening della progenie
Cocktail ormonale per la superovulazione: • PMS (pregnant mares serum) • HCG (human chorionic gonadotropin)
♀ ♀
♂
Accoppiamento
♀
Raccolta degli oociti fecondati
Transgenesi standard Work flow: STEP1
1 • Preparazione degli oociti fecondati
Costruzione del transgene Amplificazione del transgene
Purificazione del transgene
Transgenesi standard Work flow: STEP2
2 • Preparazione dei costrutti
Accoppiamento delle femmine con maschio vasectomizzato
♂ vasectomizzato
♀
Transgenesi standard Work flow: STEP3
3 • Preparazione delle femmine “pesudogravide”
• Microiniezione e trasferimento nelle femmine “pseudogravide”
3 • Preparazione delle femmine “pesudogravide”
• Microiniezione e trasferimento nelle femmine “pseudogravide”
Transgenesi standard Work flow: STEP3
Trasferimento delle uova fecondate microiniettate con il gene di interesse nell’utero di femmina pseudogravida
♀ pseudogravida 100-200X
Transgenesi standard Work flow: STEP3
3 • Preparazione delle femmine “pesudogravide”
• Microiniezione e trasferimento nelle femmine “pseudogravide”
Estrazione DNA dalle code della progenie
Analisi tramite PCR Analisi tramite Southern-blot
M C 1 2 3 4 5 C 1 2 3 4 5
Transgenesi standard Work flow: STEP4
4 • Screening della progenie
Transgenesi standard Efficienza
Transgenesi standard Applicazioni: animali come bioreattori
• Metodo più utilizzato per produrre topi transgenici.
• L’inserzione del transgene è casuale; non si sa dove si è localizzato il transgene;
• Non si può regolare il numero di copie introdotte nel pronucleo, né quante si uniranno in concatameri per l’integrazione;
• Bassa efficienza
Transgenesi standard Vantaggi e svantaggi
Gene Targeting
Ricombinazione omologa in embrionic stem (ES) cells
• SCOPO: perdita o modifica di funzione
• CARATTERISTICA: inserzione mirata
Gene inattivo AGGTGCCTGACT X X
TTCAGCCGATCCA
TTCAGCCGATCCA
AGGTGCCTGACT
Gene inattivo AGGTGCCTGACT TTCAGCCGATCCA
Gene Targeting Meccanismo: ricombinazione omologa
Gene Targeting
Gene Targeting Meccanismo di selezione positiva e negativa
Gene Targeting
1 • Preparazione delle cellule ES pluripotenti
• Trasfezione
2 • Selezione delle cellule ES
3 • Iniezione delle cellule ES trasfettate in una nuova blastocisti
4 • Screening della progenie
Gene Targeting Work flow
Preparazione del transgene Preparazione delle ES pluripotenti dalla blastocisti
Elettroporazione
Sequenze di ricombinazione
Omologa
Neor – resistenza alla Neomicina
Tk - thymidine kinase
Gene non attivo
1 • Preparazione delle cellule ES pluripotenti
• Trasfezione
Gene Targeting Work flow: STEP1
Sequenze di ricombinazione
Omologa
Neor – resistenza alla Neomicina
Tk - thymidine kinase
Gene non attivo
Trattamento con neomicina e ganciclovir
X
X
No integrazione
Integrazione sito-specifica (1/1000)
Integrazione random
Gene Targeting Work flow: STEP2
2 • Selezione delle cellule ES
ES inserite in una blastocisti di topo agouti
Gene Targeting Work flow: STEP3
3 • Iniezione delle cellule ES trasfettate in una nuova blastocisti
Topo “chimera”
Gene Targeting Work flow: STEP4
4 • Screening della progenie
Gene Targeting
Gene Targeting Applicazioni
Mutagenesi MIRATA può avere come risultato:
• KNOCK-OUT: INATTIVAZIONE dell’espressione di un gene
• KNOCK-IN: INSERZIONE di un gene difettivo/selvatico (modelli di
patologie con mutazioni puntiformi; geni reporter)
PREMIO NOBEL per la MEDICINA 2007 Motivazione: for their work on "principles for introducing specific gene modifications
in mice by the use of embryonic stem cells and gene targeting.”
Mario R. Capecchi
Martin J. Evans Oliver Smithies
Gene Targeting Nobel Prize 2007
• RICOMBINAZIONE OMOLOGA
• L’inserzione del transgene è mirata
• Si conosce la localizzazione genica dell’inserimento del transgene;
• Problemi: espressione tempo e spazio specifica?
Gene Targeting Vantaggi e svantaggi
KO condizionali: l’induzione della mutazione tempo e tessuto specifica
Limite KO costitutivi: possibile mortalità degli omozigoti durante lo sviluppo.
Eliminare un gene in un tessuto, in un organo o in una fase particolare di sviluppo
• SCOPO: ottenere informazioni più precise sulla funzione del gene; garantire il normale sviluppo del topo knockout
• CARATTERISTICA: inserzione mirata e specifica
Transgenesi condizionale Il sistema Cre-loxP
KO condizionali Il sistema Cre-loxP
Sistema di RICOMBINAZIONE del fago P1
CRE (cyclization recombination), ricombinasi specifica
LoxP (locus of X-over P1), locus di crossover (2 seq palindrome di 13bp + regione centrale di 8nt)
Cre
KO condizionali Il sistema Cre-loxP
Il sistema Cre-loxP Ricombinazione omologa tra sequenze loxP
Il sistema Cre-loxP Esempio di delezione tessuto specifica
Bockamp E et al., Physiol. Genomics 2002
Il sistema Cre-loxP Screening tramite PCR
Il sistema Cre-loxP Il topo LERKO: esempio di delezione tessuto specifica
Della Torre et al, Cell Metabolism 2011
Il sistema Cre-loxP Ricombinazione omologa tra sequenze loxP
Controllo dell’espressione genica:
• nello SPAZIO: utilizzo di un PROMOTORE TESSUTO SPECIFICO
• nel TEMPO: utilizzo di un PROMOTORE
dipendente dallo STADIO di SVILUPPO
INDUCIBILE
Il sistema Cre-loxP Espressione genica programmabile
DELEZIONE
KO programmabile
INSERZIONE
K-IN programmabile
Il sistema CreER-loxP Delezione spazio/tempo specifica
TEMPO
SPAZIO
CreER(T): proteine di fusione tra Cre e ER (recettore degli estrogeni)
“The perfect conditional transgenic mouse
should include the following criteria:
1. induced overexpression of the transgene should be tightly controlled such that no leaky background expression precludes the accurate analysis.
2. the inducing compound should be nontoxic and highly specific for the target gene.
3. induction kinetics should be fast and expression levels sufficiently high to produce a rapid and detectable effect.
4. the induced switch should be reversible so that defined developmental periods or critical stages in disease can be appropriately monitored.”
Bockamp E et al., Physiol. Genomics 2002
Transgenesi condizionale Controllo binario dell’espressione genica
3 principal events:
1) ligand-mediated activation of a transcriptional transactivator 2) DNA binding of the transactivator 3) transactivator-induced transcriptional activation
Bockamp E et al., Physiol. Genomics 2002
Transgenesi condizionale Controllo binario dell’espressione genica
CBS: cognate binding site
Bockamp E et al., Physiol. Genomics 2002
Transgenesi condizionale Controllo binario dell’espressione genica
Bockamp E et al., Physiol. Genomics 2002
Effector mouse, expressing a ligand-inducible transcriptional transactivator
Responder mouse, which has the capacity to specifically express a chosen transgene upon stimulation by the transactivator.
Il sistema TET-ON/TET-OFF
Sistema a 3 elementi:
• TeT-Repressor: repressore della trascrizione
• Tc/Dox: tetraciclina/doxyciclina
• TRE: tetracycline response element
Il sistema TET-OFF
tTA Tetraycline controlled
transactivator
TetR: tet repressor VP16: transactivation domain of herpes simplex virus
.
Bockamp E et al., Physiol. Genomics 2002
Il sistema TET-OFF
tTA: tetraycline controlled transactivator
Tet-off system (tTA) will activate expression in the absence of its ligand doxycycline.
Upon addition of DOX, transcription of the gene of interest is extinguished.
MHC-tTA/tetO-Ro1 mice
were obtained by crossing a
transgenic mouse line that
expresses Ro1 receptor under
the control of a tetO gene and
another mouse line
expressing tTA gene under the
regulation of a heart-specific
MHC promoter.
Il sistema TET-OFF
Il sistema TET-OFF
VANTAGGI
• Ben note proprietà della Tc/DOX: farmacocinetica, buona distribuzione tissutale, bassa tossicità, capacità di attraversare membrane cellulari
• Grande induzione in alcuni tessuti (anche 5 ordini di grandezza)
SVANTAGGI
• Attività residua del promoter minimale tetO-CMV
• Tossicità cellulare del transattivatore
• Bassa sensitività alla DOX in alcuni tessuti
• Basse cinetiche di induzione in vivo
Il sistema TET-ON
rtTA Reverse tet-on
Tetraycline controlled transactivator
rTetR: reverse tet repressor VP16: transactivation domain of herpes simplex virus
.
Il sistema TET-ON
rtTA: reverse tet-on tetraycline controlled transactivator
Bockamp E et al., Physiol. Genomics 2002
Addition of DOX to the Tet-on system (rtTA) results in transcriptional induction of the gene of interest.
.
Il sistema TET-ON vs TET-OFF
VANTAGGI
• Aumentata velocità di espressione del transgene: completa attivazione in 1 ora, rispetto alle basse cinetiche di attivazione del sistema tet-OFF (fino ad una settimana)
Il sistema TET-ON/TET-OFF
Il sistema TET-ON/TET-OFF
La Tc SPEGNE il GENE La Tc ACCENDE il GENE
http://www.zmg.uni-mainz.de/tetmouse/
Il sistema TET-ON/TET-OFF
Clonazione
Trasferimento del nucleo di una cellula somatica
in un oocita anucleato
• SCOPO: ottenimento di “gemelli” di un fenotipo di interesse
• CARATTERISTICA: il materiale genetico viene copiato in toto
I Cloni vengono ottenuti attraverso Somatic Cell Nuclear Transfer
Clonazione
Clonazione
Clonazione
Clonazione Possibili applicazioni: Trapianto con cellule autologhe
Clonazione Possibili applicazioni: trapianto con cellule autologhe
Cellule staminali ADULTE SCNT
Clonazione Efficienza molto bassa & etica
Vettori retrovirali
Altre tecniche
Yac-transgenic mice
Integrazione di materiale genetico nella cellula ospite
• SCOPO: Guadagno di funzione
• CARATTERISTICA: - inserzione random, casuale
- vettore max 8Kb
- l’animale puo’ risultare contaminato da retrovirus delle cellule helper
Vettori retrovirali
Vettore virale
Vantaggi Svantaggi
Retrovirus Capacità d'inserimento del gene, integrazione stabile nel DNA dell'ospite,
elevati titoli di virus ricombinante, ampio tropismo d'infettività, relativa facilità di
manipolazione del genoma virale
Difficoltà nel controllare l'infezione virale, mancata infezione delle cellule
non in divisione, integrazione a caso nel genoma dell'ospite
Lentivirus Infezione delle cellule in divisione o meno, espressione stabile del gene, elevata capacità
d'inserimento
Mutagenesi potenziale presenza di sequenze proteiche regolatrici e
accessorie
Adenovirus Elevati titoli di virus, alta espressione genica, grande capacità d'inserimento, infezione di
cellule in divisione e non in divisione
Risposte immuni alle proteine virali, nessuna integrazione nel genoma
dell'ospite, espressione genica transitoria
Virus adeno-associati Infettano le cellule in divisione o meno, ampio tropismo cellulare, potenziale d'integrazione,
bassa immunogenicità e non patogenicità
Limitate capacità per i transgeni, difficile generazione di alti titoli virali, presenza di
adenoviruds o herpevirus per la moltiplicazione dei virus adeno-associati
Herpesvirus Infettano un'ampia varietà di tipi cellulari, alta capacità d'inserzione, tropismo naturale per le cellule neuronali, seguita dalla produzione
di alti titoli virali
Possibile tossicità, rischio di ricombinazione, nessuna integrazione
virale nel DNA dell'ospite
Poxvirus Alta capacità d'inserzione, possibile inserzione di grandi framenti di DNA, alti livelli di di
espressione transgenica,, seguita da virus vivo ricombinante
Possibile effetto citopatico
Virus di Epstein-Barr Infetta cellule in divisione o meno con prevalenza per i linfociti B, alta capacità d'inserimento
Difficoltà di controllare le linee cellulari
Vettori retrovirali
• Alta efficienza di trasduzione
• Possibilità di generare nuovi virus patogeni per ricombinazione con eventuali virus presenti nell’ospite
• Mutagenesi inserzionale (per quelli che si integrano in maniera casuale nel genoma)
• Molecole di DNA di dimensioni limitate (max 8 kb)
• Reazioni immunitarie
• Costi elevati
Vettori retrovirali Vantaggi e Svantaggi
YAC (Yeast Artificial Chromosome)
• SCOPO: trasferire GENI di grandi dimensioni 300-1000Kb.
• CARATTERISTICA: cromosoma artificiale che contiene sequenze (telomeri, centromeri, origini di
replicazione) necessarie per la replicazione e la preservazione nelle cellule del lievito.
Yac-transgenic mice
COME SI TRASFERISCE uno YAC nel TOPO?
• Fusione di SFEROPLASTI (cellule Lievito senza parete) + cellule
ES (rischio di contaminazione con genoma Lievito)
• Purificazione di YAC (separato per elettroforesi) + microiniezione
nel pronucleo (se YAC non ha dimensioni grandi, altrimenti si frammenta)
• Trasferimento di YAC nelle ES tramite LIPOSOMI (vescicole lipidiche artificiali per fusione con membrana)
Yac-transgenic mice
Yac-transgenic mice
• YAC di 670Kb contenente il gene umano HPRT in cellule ES di topo (funzione renale)
• YAC di 400Kb contenente il gene umano APP in cellule ES di topo (codifica il precursore della proteina amiloide Alzheimer)
• YAC contenente il gene umano catena leggera/pesante IgG in topo (produzione di anticorpi)
Yac-transgenic mice Esempi di applicazione