Inhalt I

Inhalt

Inhalt.................. .............................................................................................................. I

Abbildungsverzeichnis ................................................................................................ IV

Tabellenverzeichnis ..................................................................................................... VI

Abkürzungsverzeichnis ............................................................................................. VIII

Abstract............ ........................................................................................................... XIII

Zusammenfassung ..................................................................................................... XV

1 Einleitung ....................................................................................................... 1

1.1 Epithelien ........................................................................................................ 1

1.2 Mukoviszidose ................................................................................................. 3

1.3 ENaC (Epithelial Sodium Channel) .................................................................. 8

1.3.1 Molekulare Struktur des ENaC ........................................................................ 9

1.3.2 Regulation von ENaC .................................................................................... 11

1.4 Glucocorticoide ............................................................................................. 13

1.5 Therapiemöglichkeiten bei Mukoviszidose..................................................... 15

1.6 Ziel der Arbeit ................................................................................................ 18

2 Material ........................................................................................................ 20

2.1 Chemikalien und Lösungen ........................................................................... 20

2.2 Lösungen für die Zellkultur ............................................................................ 20

2.3 Lösungen für den Mykoplasmentest .............................................................. 21

2.4 Lösungen für die Elektrophysiologie .............................................................. 22

2.5 Lösungen für die Protein Analyse .................................................................. 22

2.5.1 Lösungen für den Bicinchoninsäuretest (BCA-Test) ...................................... 25

2.5.2 Detektion durch Enhanced Chemilumineszenz (ECL) ................................... 25

II Inhalt

3 Methoden ..................................................................................................... 26

3.1 Zellkultur ....................................................................................................... 26

3.1.1 Humane Zelllinien als Mukoviszidosemodelle ............................................... 26

3.1.2 Beschichten der Zellkulturflaschen ................................................................ 27

3.1.3 Kultivierung und Versorgung der Zellen ........................................................ 28

3.1.4 Passagieren der Zellen ................................................................................. 28

3.1.5 Einfrieren der Zellen ...................................................................................... 29

3.1.6 Auftauen der Zellen ....................................................................................... 30

3.1.7 Mykoplasmen-Test ........................................................................................ 31

3.1.8 Kultivierung der Zellen auf Transwell-Membraneinsätzen ............................. 32

3.1.9 Inkubation der Zellen mit Dexamethason ...................................................... 33

3.2 Elektrophysiologie ......................................................................................... 34

3.2.1 Die Ussing-Kammer ...................................................................................... 34

3.2.2 Verlauf einer Messung in der Ussing-Kammer .............................................. 36

3.2.3 Auswertungen der Ussing-Kammer Messungen ........................................... 36

3.3 Protein Analyse ............................................................................................. 37

3.3.1 Proteinisolation von CFBE41o-- und 16HBE14o--Zellen ................................ 37

3.3.2 Bicinchoninsäuretest (BCA-Test) .................................................................. 38

3.3.3 Diskontinuierliche SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) ....... 38

3.3.4 Proteintransfer auf eine PVDF-Membran ...................................................... 40

3.3.5 Coomassie-Färbung des SDS-Gels .............................................................. 41

3.3.6 Coomassie-Färbung der PVDF-Membran ..................................................... 41

3.3.7 Proteinnachweis durch Antikörper ................................................................. 41

3.3.8 Detektion durch Enhanced Chemilumineszenz (ECL) ................................... 42

3.3.9 Auswertung der Western Blot Analysen ........................................................ 42

4 Ergebnisse .................................................................................................. 43

4.1 Mykoplasmentest .......................................................................................... 43

4.2 Elektrophysiologische Messungen ................................................................ 44

4.2.1 Elektrophysiologische Messungen der CFBE41o- Zellen mit und ohne

Dexamethasonbehandlung ........................................................................................... 45

4.2.2 Elektrophysiologische Messungen der 16HBE14o--Zellen mit und ohne

Dexamethasonbehandlung ........................................................................................... 49

4.2.3 Gegenüberstellung der Ussing-Kammer Messwerte der CFBE41o-- und

16HBE14o--Zelllinien .................................................................................................... 52

Inhalt III

4.3 Proteinbestimmung ....................................................................................... 53

4.3.1 Western Blot Analyse zur Untersuchung der Expression von α- und δ-ENaC

Untereinheiten ............................................................................................................... 53

4.3.1.1 CFBE41o--Zelllinie ......................................................................................... 54

4.3.1.2 16HBE14o--Zelllinie ....................................................................................... 57

4.3.2 Vergleich der Immunoblotanalysen der Zelllinien CFBE41o- und 16HBE14o- 60

5 Diskussion ................................................................................................... 62

5.1 Untersuchungen zur funktionalen ENaC Expression durch

elektrophysiologische Messungen ................................................................................. 63

5.2 Untersuchungen zur quantitativen ENaC Expression durch Western Blot

Analysen.......... ............................................................................................................. 69

6 Ausblick ....................................................................................................... 73

Literatur.......... .............................................................................................................. 75

Anlagen, Abbildungen ................................................................................................... I

Anlagen, Messergebnisse ........................................................................................... III

Anlagen, Chemikalien .................................................................................................. IX

Anlagen, Lösungen für die Zellkultur ......................................................................... XI

Anlagen, Kits ............................................................................................................... XII

Anlagen, Antikörper und Marker ............................................................................... XIII

Anlagen, Geräte .......................................................................................................... XV

Anlagen, Verbrauchsmaterialien ............................................................................ XVIII

Danksagung ............................................................................................................... XIX

Selbstständigkeitserklärung .................................................................................... XXI

IV Abbildungsverzeichnis

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1: Schematischer Aufbau einer Epithelzelle mit Transportsystemen ................. 3

Abbildung 2: Vererbung von CF ........................................................................................ 4

Abbildung 3: Die ΔF508 Mutation ...................................................................................... 6

Abbildung 4: Schematische Abbildung des gestörten Ionentransportes bei Mukoviszidose

......................................................................................................................................... 7

Abbildung 5: Schematische Struktur des epithelialen Na+-Kanals ENaC ......................... 11

Abbildung 6: Regulation der ENaC Expression durch Aldosteron und Vasopressin ........ 13

Abbildung 7: Strukturformel von Aldosteron und Dexamethason ..................................... 14

Abbildung 8:Schematische Abbildung eines Gewebekulturfilter ...................................... 32

Abbildung 9: Schematische Abbildung einer Neubauer-Zählkammer .............................. 33

Abbildung 10: Schematischer Aufbau einer Ussing Kammer .......................................... 35

Abbildung 11: Auftrennung von Proteinen in diskontinuierlichen Polyacrylamidgelen ...... 39

Abbildung 12: Darstellung des verwendeten Markers ..................................................... 40

Abbildung 13: Aufbau eines semidry Western Blots ........................................................ 40

Abbildung 14: Mykoplasmentest von CFBE41o--Zellen ................................................... 44

Abbildung 15: Messverlauf von CFBE41o--Zellen ohne Dexamethason-Inkubation

(Kontrollmessungen) ....................................................................................................... 46

Abbildung 16: Gegenüberstellung der unterschiedlich mit Dexamethason behandelten

CFBE41o--Zellen ............................................................................................................. 48

Abbildung 17: Messverlauf von 16HBE14o--Zellen ohne Dexamethason-Inkubation

(Kontrollmessungen) ....................................................................................................... 50

Abbildungsverzeichnis V

Abbildung 18: Gegenüberstellung der unterschiedlich mit Dexamethason behandelten

16HBE14o--Zellen ........................................................................................................... 52

Abbildung 19: Gegenüberstellung beider Zelllinien .......................................................... 53

Abbildung 20: Nachweis von α-ENaC und α-Tubulin in CFBE41o--Zellen durch

Immunoblot-analysen ...................................................................................................... 55

Abbildung 21: Untersuchung der α-ENaC UE der CFBE41o--Zellen durch unterschiedliche

Dexamethasonbehandlung .............................................................................................. 56

Abbildung 22: Darstellung der δ-ENaC UE und α-Tubulin in CFBE41o--Zellen durch

Immunoblotanalysen ....................................................................................................... 57

Abbildung 23: Nachweis von α-ENaC und α-Tubulin in 16HBE14o--Zellen durch

Immunoblotanalysen ....................................................................................................... 58

Abbildung 24: Untersuchung der α-ENaC UE der 16HBE14o--Zellen durch

unterschiedliche Dexamethasonbehandlung ................................................................... 59

Abbildung 25: Darstellung der δ-ENaC UE und α-Tubulin in 16HBE14o--Zellen durch

Immunoblotanalysen ....................................................................................................... 60

Abbildung 26: Gegenüberstellung der unterschiedlichen Expressionsraten von α-ENaC

bei CFBE41o-- und 16HBE14o--Zellen ............................................................................ 61

Abbildung 27: Verlauf der Messungen der CFBE41o--Zelllinie mit 3 h Dexamethason-

Inkubation .......................................................................................................................... I

Abbildung 28: Verlauf der Messungen der 16HBE14o--Zelllinie mit 3 h Dexamethason-

Inkubation .......................................................................................................................... I

Abbildung 29: Verlauf der Messungen der CFBE41o--Zelllinie mit 24 h Dexamethason-

Inkubation ......................................................................................................................... II

Abbildung 30: Verlauf der Messungen der 16HBE14o--Zelllinie mit 24 h Dexamethason-

Inkubation ......................................................................................................................... II

VI Tabellenverzeichnis

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: Verwendetes Beschichtungsmedium .............................................................. 20

Tabelle 2: Verwendetes Medium und Waschlösung ........................................................ 20

Tabelle 3: Verwendetes Einfriermedium .......................................................................... 21

Tabelle 4: Verwendete Ringerlösungen und Diuretika ..................................................... 22

Tabelle 5: Verwendete Lösungen für die Proteinisolation ................................................ 22

Tabelle 6: Verwendete Lösungen für die Gelelektrophorese ........................................... 23

Tabelle 7: Verwendete Lösungen und Materialien für die Western Blot Analyse ............. 24

Tabelle 8: Verwendete Lösung zum Strippen einer PVDF-Membran............................... 24

Tabelle 9: Verwendete Färbe- und Entfärbemittel für das SDS-Gel ................................ 24

Tabelle 10: Verwendete Färbe- und Entfärbemittel für die PVDF-Membran .................... 24

Tabelle 11: Verwendete Lösungen für die Antikörperbehandlung ................................... 25

Tabelle 12: Programm für den Thermocycler .................................................................. 31

Tabelle 13: Mittelwerte der Initialwerte mit Standardfehler der CFBE41o--Zellen ............ 47

Tabelle 14: Mittelwerte der Initialwerte mit Standartfehler der 16HBE14o--Zellen............ 51

Tabelle 15: Messdaten der CFBE41o--Zellen (Kontrollmessungen) ................................. III

Tabelle 16: Messdaten der CFBE41o--Zellen mit 3 h Dexamethasonbehandlung ............ IV

Tabelle 17: Messdaten der CFBE41o--Zellen mit 24 h Dexamethasonbehandlung ........... V

Tabelle 18: Messdaten der 16HBE14o--Zellen (Kontrollmessungen) ................................ VI

Tabelle 19: Messdaten der 16HBE14o--Zellen mit 3 h Dexamethasonbehandlung ......... VII

Tabelle 20: Messdaten der 16HBE14o--Zellen mit 24 h Dexamethasonbehandlung ...... VIII

Tabellenverzeichnis VII

Tabelle 21: Verwendete Chemikalien ............................................................................... IX

Tabelle 22: Verwendete Medien und Zusätze................................................................... XI

Tabelle 23: Verwendete Kits für proteinbiochemische und molekularbiologische Methoden

........................................................................................................................................ XII

Tabelle 24: Verwendete Antikörper für biochemische Methoden .................................... XIII

Tabelle 25: Verwendete Größenmarker für biochemische und molekularbiologische

Methoden ...................................................................................................................... XIV

Tabelle 26:Verwendete Geräte ....................................................................................... XV

Tabelle 27: Verwendete Materialien ............................................................................ XVIII

VIII Abkürzungsverzeichnis

Abkürzungsverzeichnis

% Prozent

°C Grad Celsius

α Alpha

β Beta

γ Gamma

Δ Delta (groß)

δ Delta (klein)

ε Epsilon

µ Mikro

Ω Ohm

A Ampere

ad Addiere

APS Ammoniumperoxodisulfat

ASL air surface liquid

ATP Adenosintriphosphat

BCA bicinchoninic acid (Bicinchoninsäure)

BSA bovine serum albumin (Rinderserumalbumin)

bzw. beziehungsweise

ca. Circa

Ca2+ Calcium-Kationen

CaCl2 Calciumchlorid

CF cystic fibrosis (Zystische Fibrose)

CFTR cystic fibrosis transmembrane conductance regulator

Cl- Chlorid-Anionen

Abkürzungsverzeichnis IX

cm Centimeter

CO2 Kohlendioxid

Ct transepithelial capacity (transepitheliale Kapazität)

C-Terminus Carboxy-Terminus

Cu2+ Kupfer-Kationen

Da Dalton

Dex Dexamethason

DMSO Dimethylsulfoxid

DTT Dithiothreitol

ECL enhanced Chemilumineszenz

EDTA ethylene diamine tetra-acetic acid (Ethylendiamintetraessigsäure)

ENaC Epithelial Sodium channel (epithelialer Natriumkanal)

et al. et alii (und andere)

F Farad

FKS fötales Kälberserum

g Gramm

GR Glucocorticoidrezeptor

Gt transepithelial conductance (transepitheliale Leitfähigkeit)

h hour (Stunde)

H2O Wasser

H2O2 Wasserstoffperoxid

HCl Salzsäure

HEPES 2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-ethansulfonsäure

hrp horseraddish peroxidase (Meerrettichperoxidase)

IgG Immunglobulin Klasse G

ISC short circuit current (transepithelialer Kurzschlussstrom)

k Kilo

X Abkürzungsverzeichnis

K+ Kalium-Kationen

KCl Kaliumchlorid

KH2PO4 Kaliumdihydrogenphosphat

l Liter

m Meter

m Milli

M Molar (mol/l)

MCC mucociliary clearance

MEM Minimal Essential Medium

MgCl2 Magnesiumchlorid

min Minute

MR Mineralcorticoidrezeptor

n Nano

Na+ Natrium-Kationen

NaCl Natriumchlorid

Na2HPO4 Dinatriumhydrogenphosphat

Nedd4 neural precursor cell expressed developmentally down-regulated protein 4

N-Terminus Amino-Terminus

PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese

PBS phosphate buffered saline (phosphatgepufferte Salzlösung)

pH pondus Hydrogenii

PKA Proteinkinase A

PVDF Polyvinylidenfluorid

Rt transepithelial resistance (transepithelialer Widerstand)

RT Raumtemperatur

s Sekunde

S Siemens

Abkürzungsverzeichnis XI

SDS sodium dodecyl sulfate (Natriumlaurylsulfat)

sem standard error of the mean, (Standardfehler des Mittelwertes)

SGK1 serum/glucocorticoid regulated kinase 1

SV40 Simian-Virus 40

TBS tris buffered saline (TRIS-gepufferte Salzlösung)

TEMED N,N,N‘,N‘-Tetramethylethylendiamin

TMA Tetramethylammoniumchlorid

TRIS Tris(hydroxymethyl)-aminomethan

UE Untereinheit

USP2-45 Ubiquitin-specific protease 2-45

ü.N. über Nacht

V2R vasopressin type 2 receptor

Vt transepithelial voltage (transepitheliale Spannung)

wt Wildtyp

Abstract XIII

Abstract

Various ion channels ensure the homeostasis of intracellular and extracellular water and

salt content in epithelial cells. Dysfunction of these ion channels lead to an altered

homeostasis which often causes diverse diseases. For this maintenance of the balance of

intra-and extracellular epithelial cells basically the chloride ion channel, cystic fibrosis

transmembrane conductance regulator (CFTR) and the epithelial sodium channel (ENaC)

are responsible. Due to a gene defect of the CFTR the disease cystic fibrosis (CF) is also

characterized by Na+-hyperabsorption of ENaC. Up to now, four ENaC subunits (α, β, γ, δ)

are specified to be active in human cells. In addition, it was demonstrated that α and δ

subunits form the channel pore, while β and γ build the channel complex. In this study, the

CFBE41o—cells, obtained from bronchial epithelial cells of an 1 year old CF patient, and

16HBE14o--cell line, generated from a heart and lung transplant, were used. Up to now,

no stable amiloride-sensitive currents could be detected by Ussing chamber

measurements with these cells. Therefore, the aim of this study was to stimulate the α-

and δ subunits of ENaC expression in these cells with the synthetic glucocorticoid

dexamethasone. Furthermore, Western Blot analyses were performed to examine an

increase on the protein level. In addition to this, Ussing chamber measurements were

performed to analyze a potential use of these cells as an appropriate CF-model system.

However, in this study no significant amiloride-sensitive sodium current of ENaC was

observed. But never the less a tendency of an increased current was seen in both cell

lines treated with dexamethasone for 3 and 24 hours. Contrary to that, the biochemical

investigations by Western Blot analysis of the two cell lines treated with dexamethasone

for 3 and 24 hours showed no significant increase in α-ENaC expression. In conclusion, a

tendency of an increased ENaC expression by dexamethasone could be found.

Therefore, the use CFBE41o-- and 16HBE14o--cells as an appropriate CF-model system

by treating with dexamethasone could be possible.

XIV

Zusammenfassung XV

Zusammenfassung

Die Homöostase des Wasser- und Salzgehaltes von Epithelzellen wird intrazellulär als

auch extrazellulär mit Hilfe verschiedener Ionenkanäle gewährleistet. Funktionsstörungen

dieser Ionenkanäle führen zu einer veränderten Homöostase und damit oft zu den

unterschiedlichsten Krankheiten. Zu diesen Ionenkanälen, die zur inter- und

extrazellulären Gleichgewichtserhaltung in Epithelzellen beitragen, gehören unter

anderem der Chloridionenkanal, cystic fibrosis transmembrane conductance regulator

(CFTR), als auch der epitheliale Natriumkanal, epithelial sodium channel (ENaC). Durch

einen Defekt des Chloridionenkanals CFTR im CFTR-Gen, kommt es zu der Krankheit

Mukoviszidose (englisch cystic fibrosis (CF) genannt). Neben dem Defekt des CFTR tritt

eine Natriumhyperabsorption über den ENaC auf. Es wurden bis heute vier ENaC

Untereinheiten (α, β, γ, δ), die in humanen Zellen aktiv sind, nachgewiesen. Dabei formen

die kanalporenbildenden Untereinheiten α- und δ-ENaC mit den anderen beiden

regulativen Untereinheiten β- und γ-ENaC die Kanalpore. Das Hauptaugenmerk dieser

Arbeit lag auf der Expression der α- und δ-ENaC UE in zwei unterschiedlichen Zelllinien.

In diesen Zelllinien konnte bislang kein stabiler Amilorid-sensitiver Natriumstrom über den

ENaC in der Ussing Kammer gemessen werden. Bei den Zelllinien handelt es sich zum

einen um CFBE41o--Zellen, welche aus bronchialen Epithelzellen eines CF-Patienten

gewonnen wurde, und zum anderen um die Zelllinie 16HBE14o-, die aus einem Herz-

Lungentransplantat generiert wurde und als Wildtyp (wt) dient. Zunächst sollte die

Expression von α- und δ-ENaC mittels des synthetischen Glucocorticoids Dexamethason

in der CFBE41o-- und der 16HBE14o--Zelllinie stimuliert werden. Anschließend wurde

mittels Western Blot Analysen untersucht, ob die Proteinexpression der beiden UE

gesteigert wurde. Zusätzlich wurde überprüft ob eine gesteigerte funktionale Expression

mittels der Ussing-Kammer messbar war und die Zelllinien somit als CF-nahes

Modellsystem dienen können. Bei den elektrophysiologischen Messungen dieser

Zelllinien, mittels der Ussing-Kammer, konnte kein signifikanter Amilorid-sensitiver

Natriumstrom über den ENaC festgestellt werden. Jedoch ist eine Tendenz zu erkennen,

dass dieser in den Zellen beider Zelllinien, welche 3 h und 24 h mit Dexamethason

behandelt wurden, leicht ansteigt. Die biochemischen Untersuchungen durch Western

Blot Analysen der beiden Zelllinien zeigten, dass die Proteinexpression der α-ENaC UE in

den mit Dexamethason, 3 h und 24 h, behandelten CFBE41o-- und 16HBE14o--Zellen

XVI Zusammenfassung

nicht signifikant gesteigert werden konnte. Zudem waren die Standardfehler der

Messergebnisse sehr hoch, so dass keine genaue Aussage über die Expression getroffen

werden konnte. Zusammenfassend kann geschlussfolgert werden, dass trotz der nicht

signifikanten Ergebnisse, eine tendenziell gesteigerte ENaC Expression durch

Dexamethason beobachtet werden konnte. Daher scheint die Verwendung des

Glucocorticoids Dexamethason durch die Erhöhung der ENaC Expression durchaus als

geeignet, um ein nutzbares CF Zellmodels zu etablieren.

Einleitung 1

1 Einleitung

1.1 Epithelien

Epithelien bilden im gesamten Organismus zunächst eine Schutz- und Barrierefunktion.

Neben diesen beiden Funktionen übernehmen sie einen regulatorischen Stoffaustausch

durch Sekretion, Resorption und den Transport von Nährstoffen und anderen Substanzen

über die Epithelmembran. Die Aufrechterhaltung des inneren Milieus bei z.B. der

Nahrungsaufnahme wird hauptsächlich durch die Regelung von Ausscheidung durch die

Lunge, den Darm, die Niere und die Haut gewährleistet. Dafür sind die besonders

angreifbaren Oberflächen mit Epithelien bedeckt. Alle Epithelien besitzen eine polare

Grundstruktur im Zellaufbau. Die apikale Zellmembran ist zur funktionalen Außenseite

gewandt. Damit die Oberfläche nach außen hin vergrößert wird, ist die apikale Seite meist

mit Mikrovilli besetzt. Entgegengesetzt ist die basolaterale Zellmembran nach innen, der

Blutseite und den seitlich gelegenen lateralen Zellmembranen, zugewandt. Für den

Transport durch das Epithel sind in den apikalen und basolateralen Zellmembranen

verschiedene Transportsysteme eingebaut: Die Symporter, bei dem mehrere Ionen in

eine Richtung transportiert werden. Die Antiporter, bei denen verschiedene Ionen in zwei

Richtungen transportiert werden und die Uniporter, die als einfache Carrier dienen. Zwei

Ionenkanäle, die in der apikalen Epithelmembran liegen, sind z.B. der durch zyklisches

Adenosinmonophosphat (cAMP) angetriebene cystic fibrosis transmembrane

conductance regulator Kanal (CFTR) (siehe Abbildung 1) und der Amilorid-sensitive

epitheliale Natriumkanal (ENaC) (siehe Abbildung 1). Bei dem CFTR handelt es sich um

einen Cl--Ionenkanal, der Cl--Ionen von innen nach außen transportiert. Der ENaC ist ein

Amilorid-sensitiver Na+-Ionenkanal, der Na+-Ionen vom Zelläußeren ins Zellinnere

transportiert. Auf der basolateralen Seite befindet sich z.B. die Na+/K+-ATPase und der

Na+/K+/2Cl--Cotransporter. Die Na+/K+-ATPase gehört zu den primär aktiven Carriern.

Dieser Carrier wird durch Energieaufwand, indem ATP zu ADP + Phosphat gespalten

wird, angetrieben. Die Na+/K+-ATPase transportiert pro ATP-Molekül 3 Na+-Ionen aus der

Zelle und 2 K+-Ionen in die Zelle. Durch den Symporter Na+/K+/2Cl--Cotransporter

gelangen Cl--Ionen in die Zelle [Schmidt et al., 2010]. Durch die unterschiedlichen

Transportproteine in der Epithelzellmembran wird ein spezifischer und gerichteter

Transport von Nährstoffen und Substanzen gewährleistet [Silverthorn, 2009]. Dadurch

werden sowohl die Homöostase des Salz- und Wassergehaltes innerhalb und außerhalb

der Epithelzellen, als auch die Zusammensetzung extrazellulärer Flüssigkeiten, wie z.B.

2 Einleitung

des airway surface liquid (ASL), welcher aus einem Mukus und dem periciliary liquid layer

(PCL) besteht, gewährleistet. Der Transport von Nährstoffen und Substanzen kann auf

zwei Wege in das Epithel gelangen. Zum einen transzellulär, durch die angesprochenen

Transporter in den Epithelzellmembranen hindurch, zum anderen parazellulär, passiv an

der Epithelzelle vorbei durch spezielle Zell-Zell-Verbindungen, den so genannten tight

junctions. Je nach Gewebe und Epitheltyp, sind die tight junctions unterschiedlich dicht

ausgeprägt und Nährstoffe oder Substanzen können weniger leicht (z.B. Harnblase) oder

leicht über das Epithel (z.B. obere und untere Atemwege) gelangen. Ein spezieller

Epitheltyp ist das respiratorische Epithel, das die oberen und unteren Atemwege

auskleidet. Hierbei eingeschlossen ist das Bronchialsystem, welches vor Keimen und

Bakterien geschützt werden muss. Durch den oben angesprochenen ASL, der aus einem

Mukus und dem PCL besteht, und den apikal besetzten Kinozillien, können Bakterien,

Viren und andere Schmutzpartikel aus der Lunge entfernt werden [Knowles und Boucher,

2002; Tiddens et al., 2010; Schmidt et al., 2010]. Der Mukus liegt über dem PCL (siehe

Abbildung 1) und die durch die Atmung aufgenommenen Fremdpartikel binden an den

viskosen Mukus und werden entlang des Bronchialtraktes abtransportiert. Diesen

beschriebenen Reinigungs- und Schutzmechanismus nennt man mucociliary clearance

(MCC) [Knowles und Boucher, 2002; Thelin und Boucher, 2007]. Ist dieser Mechanismus

durch eine Dysfunktion gestört, kann es zu weitreichenden Erkrankungen wie z.B.

schweren Lungenentzündung und Zerstörung von Lungengewebe kommen [Schmidt et

al., 2010]. Im respiratorischen Epithel spielt der Na+- und Cl--Ionen Transport eine wichtige

Rolle. Die oben genannten Transporter sind alle in der Zellmembran im respiratorischen

Epithel vorhanden und sorgen für die Viskosität des ASL. Treten ein oder mehrere

Defekte in diesen Ionentransportern auf, kann dieses schwerwiegende Krankheiten wie

z.B. Mukoviszidose (engl. cystic fibrosis, CF) hervorrufen. Der schematische Aufbau mit

allen genannten Ionentransportern wird in der Abbildung 1 dargestellt.

Einleitung 3

1.2 Mukoviszidose

Mukoviszidose ist die häufigste angeborene Stoffwechselerkrankung, die in der

kaukasischen Bevölkerung auftritt [Welsh und Fick, 1987]. Von dieser Krankheit ist in

Europa ca. eins von rund 2500 Neugeborenen betroffen [Davies et al., 2007]. Bei der

afroamerikanischen Bevölkerung tritt Mukoviszidose mit ca. 1:17.000, bei der asiatischen

Bevölkerung mit ca. 1:100.000 seltener auf [Koop, 2002; Davies et al., 2007].

Die hohe Inzidenz in der kaukasischen Bevölkerung wird durch verschiedene

Mechanismen wie der hohen Mutationsrate [Goodman und Reed, 1952], dem

Heterozygotenvorteil [Pritchard et al., 1983], einem genetischen Drift [Wright und Morton,

1968], multipler Loci [Sing et al., 1982] und einer reproduktiven Kompensation [Edwards,

1977] erklärt. In Europa liegt so der prozentuale Anteil der heterozygoten Träger bei ca.

4% [Harrison und Dietel, 2006]. Die Anzahl der betroffenen CF-Patienten liegt weltweit bei

ca. 60.000. Davon sind rund 30.000 in den USA, 20.000 in Europa und 10.000 auf den

Abbildung 1: Schematischer Aufbau einer Epithelzelle mit Transportsystemen

In der Abbildung ist schematisch der Grundaufbau einer Epithelzelle mit den im Text erwähnten Ionenkanälen dargestellt. In der apikalen Membran befinden sich der cAMP induzierbare CFTR und der Amilorid-sensitive ENaC. Die durch den Na

+/K

+/2Cl

--Cotransporter eindringenden Cl

--

Ionen, gelangen über den CFTR ins außen liegende ASL. Die Na+-Ionen, die apikal durch den

ENaC in die Zelle gelangen, werden über die Na+/K

+-ATPase basolateral aus der Zelle

transportiert.

ASL

Mukus

PCL

CFTR ENaC

4 Einleitung

restlichen Kontinenten betroffen, jedoch ist eine genaue Bestimmung wegen der

ethnischen Heterogenität und der dauernd anwachsenden Bevölkerung schwierig [Grody

et al., 2001]. Alleine in Deutschland sind 8.000 Menschen, somit 40% der in Europa

betroffenen Personen, an Mukoviszidose erkrankt.

Erstmalig fand 1936 der Züricher Pädiater Fanconi einen Zusammenhang zwischen dem

Darmverschluss, dem Versagen der Bauchspeicheldrüse und der Lunge [Fanconi et al.,

1936]. Zwei Jahre später, 1938, wurde Mukoviszidose von Dorothy Hansine Andersen als

ein eigenes Krankheitsbild beschrieben [Andersen, 1938]. Heute bezeichnet man die

Mukoviszidose als Multiorgankrankheit, bei der Epithelien verschiedener Organe und aller

exokriner Drüsen betroffen sind [Lindemann, 2004].

Mukoviszidose wird autosomal-rezessiv vererbt, wobei heterozygote Merkmalsträger

phänotypisch nicht erkranken. Der genaue Erbgang ist schematisch in Abbildung 2

dargestellt.

Abbildung 2: Vererbung von CF

Mukoviszidose wird autosomal-rezessiv vererbt. Bei dieser Vererbung müssen beide Elternteile mindestens heterozygote Merkmalsträger sein, damit ein Kind homozygot, also auch phänotypisch an CF erkrankt. Die Wahrscheinlichkeit, dass ein homozygot gesundes oder krankes Kind geboren wird, liegt bei 25%. Zu 50% wird ein Kind als Merkmalsträger mit nur einem betroffenen Allel geboren (verändert nach: http://www.news-medical.net/health/Genetics-of-Cystic-Fibrosis.aspx am 19.03.2013).

Einleitung 5

Hervorgerufen wird die Krankheit von einer Mutation im CFTR-Gen. Dieses Gen kodiert

für den im Abschnitt 1.1 angesprochenen CFTR-Kanal [Riordan et al., 1989a]. Das Gen

besteht aus 27 Exons (250 kb) und ist beim Menschen auf dem langen Arm des

Chromosoms 7q31-32 lokalisiert [Kerem et al., 1989; Rommens et al., 1989; Hirche et al.,

2005; Lindemann, 2004]. Bis heute ist bekannt, dass es mehr als 1940 verschiedene

Mutationen gibt, die verschieden starke Ausprägungen der Krankheit hervorrufen

(http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr/Home.html am 14.07.2013). Die mit 70-75% am

häufigste auftretende Mutation der Mittel- und Nordeuropäer ist die Mutation ΔF508. In

Abbildung 3 ist schematisch dargestellt, dass durch die Deletion eines Basentripletts

(CTT) die Aminosäure Phenylalanin (F) an der Position 508 nicht vorhanden ist. Tritt dies

auf beiden Allelen auf, wird der Chloridionenkanal fehlgefaltet und durch

Kontrollmechanismen der Zellen abgebaut. Die verschiedenen Mutationen werden in

unterschiedliche Klassen unterteilt. Es gibt fünf Mutationsklassen, die je nach Defekt des

Chloridionenkanals und den Auswirkungen der Mutationen eingeteilt werden. Zu der

ersten Klasse zählen Mutationen, die durch nonsense-Mutationen zu einem früheren

Abbruch bei der Transkription führen [Witt, 2003]. Die bekannteste Mutation ΔF508 gehört

zu der zweiten Gruppe, der missense-Mutationen. Hier führt das Fehlen einer Aminosäure

zu einem fehlgefalteten Protein, welches durch zellautonome Kontrollsysteme wieder

abgebaut wird [Witt, 2003]. Bei der dritten und vierten Klasse wird zwar ein korrekt

gefaltetes Protein exprimiert, kann jedoch nach dem Einbau in die Membran nicht aktiviert

werden. Die fünfte und somit letzte Mutationsklasse hat einen instabilen CFTR-Kanal

durch alternatives Splicen zur Folge [Kulczycki et al., 2003].

6 Einleitung

Die Mutation des CFTR-Gens hat zur Folge, dass die Expression des Cl--Ionenkanals

gestört ist. Vorwiegend wird bei gesunden Menschen dieses Protein im Transportepithel

des respiratorischen Traktes exprimiert. Zu der gestörten Cl--Sekretion bei Mukoviszidose

Patienten herrscht zusätzlich eine Na+-Hyperabsorption. Durch die Na+-Hyperabsorption

entsteht ein erhöhter osmotischer Wassereinstrom in die Zelle und ein erhöhter visköser

Mukus. Am Mausmodell konnte von der Arbeitsgruppe um Mall gezeigt werden, dass die

starke Na+-Hyperabsorption zu den Symptomen der Atemwege eines Mukoviszidose

Patienten führt [Mall et al., 2004]. Der schematische Ablauf dieser beiden Defekte wird in

der folgenden Abbildung dargestellt.

Abbildung 3: Die ΔF508 Mutation

In der Abbildung soll der schematische Ablauf verdeutlicht werden, der bei der ΔF508 Mutation auftritt. Die ΔF508 Mutation liegt auf dem Chromosom 7 Abschnitt q31. Durch die Deletion eines Basentripletts (CTT) fehlt nach der Transkription und Translation die Aminosäure Phenylalanin (F) an Position 508. Ist dies auf beiden Allelen der Fall, wird der Chloridionenkanal falsch gefaltet abgebaut (verändert nach:www.springer.com/biomed/human+genetics/book/978-3-7985-1864-3 am 26.03.2013).

Die Aminosäure Phenylalanin (F)

an Position 508 ist nicht vorhanden

Deletion von CTT auf DNA Ebene

Abschnitt 7q31

CFTR-Gen

CFTR-Protein

Chromosom 7

Bei Deletion von CTT auf

beiden Genkopien ist der Chlorid-Ionenkanal

defekt

Einleitung 7

Der Zusammenhang von ENaC und CFTR wird in der Literatur kontrovers diskutiert. Zum

einen haben Forschungsgruppen eine Abhängigkeit zwischen der gestörten Cl--Sekretion

und der Na+-Hyperabsorption entdeckt, indem sie in Xenopus laevis Oozyten, nach der

Expression beider Proteine, durch eine Aktivierung des wt-CFTR, eine Inhibierung des

Amilorid-sensitiven Na+-Strom über den ENaC nachweisen konnten [Mall et al., 1998].

Zum anderen wurde von der Arbeitsgruppe um Reddy ein erhöhter Amilorid-sensitiver

Na+-Strom bei der Aktivierung des CFTR gezeigt [Reddy et al., 1999]. Nicht nur in den

beiden aufgeführten Beispielen wird verdeutlicht wie umstritten das Zusammenwirken der

beiden Kanäle ist. So zeigte erstmals die Arbeitsgruppe um Stutts im Jahre 1995 an

MDCK-Zellen und 3T3-Fibroblasten, dass, wenn beide Ionenkanäle exprimiert werden ein

geringerer Amilorid-sensitiver Na+-Strom vorhanden ist, als in Zellen, ohne CFTR

Expression. Basierend auf diesen Ergebnissen wurde geschlussfolgert, dass eine

inhibierende Wirkung des CFTR auf den ENaC stattfindet [Stutts et al., 1995]. In weiteren

Arbeiten an Xenopus laevis Oozyten wurde der Effekt wiederholt beobachtet [Briel et al.,

1998; Chabot et al., 1999; Hopf et al., 1999; König et al., 2001; Kunzelmann et al., 1997].

Abbildung 4: Schematische Abbildung des gestörten Ionentransportes bei Mukoviszidose

In der linken Zelle wird schematisch der Cl-- und Na

+-Transfer bei gesunden Menschen gezeigt.

Durch den CFTR werden Cl--Ionen vom Zellinneren ins äußere Gewebe transportiert.

Entgegengesetzt gelangen Na+-Ionen durch den ENaC ins Innere der Zelle. Aus osmotischen

Gründen folgt Wasser, sowohl den Cl--Ionen ins umgebene Gewebe, als auch den Na

+-Ionen in

die Zelle. In der rechten Zelle wird der Ionentransfer durch den CFTR und den ENaC bei Mukoviszidose-Erkrankten gezeigt. In diesem Fall ist der Cl

--Ionenkanal durch genetische Mutationen nicht in die

Zellmembran eingebaut. Deswegen können keine Cl--Ionen durch den CFTR in den

extrazellulären Raum gelangen. Zusätzlich kommt es zu einem verstärktem Einstrom von Na+-

Ionen über den ENaC ins Zellinnere, gefolgt von starkem Wassereinstrom in den intrazellulären Raum.

8 Einleitung

Aber auch der Gegenteilige Effekt wurde weiterhin beobachtet. So wurde am

Schweinmodell gezeigt, dass direkt nach der Geburt von CF-Schweinen keine erhöhte

Na+-Absorption beobachtet werden konnte [Chen et al., 2010]. Da in dieser Arbeit das

Hauptaugenmerk auf den ENaC gelegt wird, ist im nächsten Abschnitt dieser genauer

beschrieben.

1.3 ENaC (Epithelial Sodium Channel)

Bereits 1848 wurde von Emil Heinrich du Bois-Reymond beobachtet, dass an isolierter

Haut von Fröschen die innere Seite der Haut positiver geladen war als die äußere [du

Bois-Reymond, 1884]. Dies ließ auf einen Nettostrom von positiv geladenen Ionen über

die Haut von außen nach innen deuten. Dieser Hinweis auf den Nettostrom an der

Froschhaut wurde von dem dänischen Physiologen Hans Ussing in den 1950er und den

1960er Jahren aufgeklärt, indem die physiologische Funktion des ENaC in Epithelien

gezeigt wurde [Koefoed-Johnson und Ussing, 1958].

Erstmalig wurde der ENaC von der Schweizer Arbeitsgruppe um Bernard Rossier kloniert

und charakterisiert, was ein Meilenstein in der Erforschung des ENaC-Kanals und der

damit zusammenhängenden Mukoviszidose darstellt [Canessa et al., 1994b]. Der ENaC

spielt eine wichtige Rolle bei den Funktionen von Organen, wie der Niere, des Darms, der

Lunge oder den Drüsen. Der Kanal ist aber auch an verschiedenen Krankheiten wie z.B.

Bluthochdruck oder Lungenödemen beteiligt. Eine der bekanntesten Krankheiten ist die

erstmals 1963 als das autosomale Liddle-Syndrom, das eine Salz-sensitive

Bluthochdruckerkrankung darstellt, beschrieben. Bei dieser Krankheit liegen of-function-

Mutationen in den β- und γ-ENaC Untereinheiten (UE) vor [Goulet et al., 1998; Liddle et

al., 1963; Chang et al., 1996]. Auch bei Mukoviszidose spielt der ENaC eine wichtige

Rolle. So wurde an Mukoviszidose erkrankten Personen eine erhöhte Na+-Absorption

über den ENaC festgestellt [Chinet et al., 1994]. Dies hat maßgeblich Auswirkungen auf

die Ausbildung der Symptome bei Mukoviszidose durch die Erhöhung der Viskosität des

Mukus im Lungengewebe [Mall et al., 2004; Donaldson und Boucher, 2007].

ENaC ist ein spannungs-unabhängiger Amilorid-sensitiver Kationen-Kanal aus der Klasse

der ENaC-Degenerin-Protein (ENaC-Deg) Familie. Die zugehörigen Kanäle dieser Familie

werden in Invertebraten und Vertebraten exprimiert [Mano und Driscoll, 1999;

Kellenberger und Schild, 2002]. Weitere Proteine dieser Familie sind z.B. die Protonen-

aktiven Acid-sensing Ion Channels (ASICs). Diese Proteine sind in Neuronen des

zentralen und peripheren Nervensystems weit verbreitet. So sind diese unter anderem im

Einleitung 9

Nervensystem von Säuglingen lokalisiert und sind dort für die Detektion und Weiterleitung

sensorischer Information beteiligt [Kellenberger und Schild, 2002].

ENaC wird entlang des respiratorischen Traktes exprimiert, vom Epithel der Nase bis hin

zu den Alveoli [Farman et al., 1997]. Der Kanal wurde ausschließlich in der apikalen

Membran von Epithelzellen lokalisiert [Duc et al., 1994]. Über den ENaC, werden Na+-

Ionen über die apikale Membran in das Zellinnere transportiert, während sie aktiv über die

basolateral liegende Na+/K+-ATPase aus der Zelle heraus transportiert werden, um den

Natriumgradienten über die apikale Zellmembran aufrecht zu erhalten [Kellenberger und

Schild, 2002].

1.3.1 Molekulare Struktur des ENaC

Der ENaC wurde bis vor kurzem noch als ein hetero-multimerer Proteinkomplex

dargestellt, dessen Struktur drei homologe UE (α, β und γ) bilden. Bis zum Jahre 2007

wurde von einer Stöchiometrie α3β3γ3 oder α2βγ ausgegangen [Firsov et al., 1998; Kosari

et al., 1998; Snyder et al., 1998; Anantharam und Palmer, 2007]. Darüber hinaus wurde in

Oozyten des Xenopus leavis demonstriert, dass alleine durch die α-UE Amilorid-sensitiver

Na+-Strom gemessen werden konnte, wohingegen bei Kanälen, die nur aus einer β- oder

γ-UE bestehen kein Na+-Transport nachweisbar ist. Das bedeutet, dass die α-ENaC UE

als kanalporenbildende UE identifiziert wurde und die beiden anderen UE die

regulatorischen Einheiten bilden. Eine maximale Ausbeute des Amilorid-sensitiven Na+-

Stroms wurde mit der Konstellation von allen drei ENaC UE festgestellt [Canessa et al.,

1994b].

Aus der heutigen Literatur ist bekannt, dass in humanen Zellen mindestens vier homologe

Untereinheiten (α, β, γ und δ) des ENaC-Kanals exprimiert werden können. Eine

zusätzliche, nicht-humane ENaC UE, ε, wurde in Xenopus leavis gefunden [Jasti et al.,

2007]. In dieser Arbeit wird nicht genauer auf diese UE eingegangen. Die Expression der

δ-UE wurde bisher im Menschen im nicht-epithelialen und epithelialen Gewebe wie

Pankreas, Dickdarm und Lunge gezeigt [Ji et al., 2006]. Zudem wurde gezeigt, dass diese

UE im respiratorischen Epithel exprimiert wird [Bangel-Ruland et al., 2010]. Diese kann

wie die α-ENaC UE homomere Kanäle bilden, deren Na+-Ionenfluss durch die Bindung mit

den regulativen UE, β und γ, gesteigert werden kann [Waldmann et al., 1995;

Kellenberger und Schild, 2002]. Aus Röntgenstrukturanalysen des verwandten

Ionenkanals ASIC1 geht man bei der molekularen Struktur von ENaC von einem Trimer

aus [Jasti et al., 2007], welcher sich entweder aus α-, β- und γ-UE oder aus δ-, β- und γ-

10 Einleitung

UE bildet [Bhalla und Hallows, 2008]. Die Zusammensetzung der Kanäle ist abhängig

vom Gewebetyp und hat Auswirkungen auf den Amilorid-sensitiven Strom [Kellenberger

und Schild, 2002; Babini et al., 2003]. Die molekularen Strukturen der einzelnen humanen

ENaC UE sind ähnlich. Sie bestehen aus 600-700 Aminosäuren und besitzen zwei

hydrophobe, transmembrane Domänen (M1 und M2), die je einen α-helikalen Anteil und

eine β-Faltblatt-Struktur aufweisen [Garty und Palmer, 1997]. Sie besitzen kurze N- und

C-terminale Enden, welche ins Zellinnere reichen (siehe Abbildung 5). Die ENaC UE

haben zudem extrazelluläre Schleifen von etwa 50 kDa mit Phosphorylierungsstellen

[Alvarez de la Rosa et al., 2000; Bhalla und Hallows, 2008]. An den C-terminalen Enden

befinden sich PY-Motive. Diese Motive vermitteln eine Interaktion mit der in Abschnitt

1.3.2 vorkommenden Ubiquitin-Ligase Nedd4-2 [Goulet et al., 1998]. Die homologen

ENaC UE weisen zudem untereinander eine Sequenzhomologie von 30-40% auf und ihr

Molekulargewicht im glykosylierten Zustand liegt zwischen 80-100 kDa [Canessa et al.,

1994a; Renard et al., 1994; Snyder et al., 1994; Shimkets et al., 1998; Butterworth et al.,

2005; Bhalla und Hallows, 2008].

Der außen liegende Trichter des ENaC-Kanals ist negativ geladen und wird von allen drei

beteiligten ENaC UE gebildet. Durch die negative Ladung werden Kationen selektiv

angezogen [Sheng et al., 2001; Smith und Benos, 1991]. Dadurch, dass sich die Pore in

zytoplasmatischer Richtung verengt, werden nur die kleinsten positiv geladenen Ionen,

wie Na+, Li+ und K+, durch den Kanal gelassen [Palmer, 1999; Shimkets et al., 1997;

Sheng et al., 2001; Smith und Benos, 1991]. Die Pore ist selektiver für Na+- und Li+-Ionen

als für K+- Ionen (Permeabilität/Verhältnis: PLi/PNa > 1 und PNa/PK > 100) [Kellenberger et

al., 1999]. Die Bindung von Amilorid wird in der prä-M2-Domäne vermutet, die mit der M2-

Domäne die Pore bildet [Butterworth et al., 2005]. Durch ein bestimmtes

Membranpotential soll positiv geladenes Amilorid an diese Domäne binden und die

Schließung des Kanals bewirken [Garty und Palmer, 1997].

Die Gene der ENaC UE wurden auf verschiedenen Chromosomen lokalisiert. Die α-UE

(SCNN1a) befindet sich auf dem Chromosom 12p13. Die ENaC UE β und γ liegen auf

dem Chromosom 16 p12.2-p12.1 und auf Chromosom 16q12. Die beiden UE sind sehr

nah beieinander, ca. 400 kb und sind vermutlich aus Genduplikationen entstanden [Voilley

et al., 1995]. Die δ-UE wurde auf dem Chromosom 1p36.3-p36.2 lokalisiert

(www.ncbi.nlm.nhi.gov). In Abbildung 5 ist ein schematischer Aufbau des ENaC-Kanals,

nach Kristallstrukturanalysen des ASIC1, dargestellt, da ein sehr hoher

Verwandtschaftsgrad der beiden Proteine vorhanden ist.

Einleitung 11

1.3.2 Regulation von ENaC

Die ENaC-Aktivität wird durch Aldosteron und viele andere Faktoren, wie Hormone (z.B.

Vasopressin, Angiotensin II, Insulin) [Rossier et al., 1994; Shimkets et al., 1998] [Corvol et

al., 1999], extrazelluläre Proteasen (z.B. Kallikrein, channel-activating protease -1 (Cap1))

[Vuagniaux et al., 2000], intra- und extrazelluläre Ionenkonzentrationen (z.B. Na+ oder

Ca2+), Osmolarität und die Durchflussgeschwindigkeit, reguliert [Kellenberger und Schild,

2002]. Es wird angenommen, dass ENaC im endoplasmatischen Retikulum synthetisiert

und mit einer gewissen Grundaktivität in den Golgi-Apparat transportiert wird.

Hauptsächlich durch die Proprotein-Konvertase Furin, welche im Golgi-Apparat lokalisiert

wurde, wird die α- und γ- ENaC UE proteolytisch gespalten und die Aktivität der α-ENaC

UE um ca. 85% und die der γ-ENaC UE um ca. 90% gesteigert. Die Aktivität des ENaC-

Kanals kann auf gleiche Weise durch andere Proteasen wie Trypsin und Cap1 gesteigert

werden [Kleyman et al., 2009].

Abbildung 5: Schematische Struktur des epithelialen Na+-Kanals ENaC

Der ENaC ist aus drei homologen UE (hier α, β, γ), die eine zentrale Pore bilden, aufgebaut. Die hier abgebildeten Transmembran-Domänen M1 und M2 liegen in der Membran. Die C-terminalen Enden mit dem PY-Motiv Anteil und die N-terminalen Enden befinden sich im Zytosol. Die hier abgebildete schematische Darstellung des ENaC-Kanals ist von der kristallographischen Analyse des bekannten Proteins ASIC1 abgeleitet (verändert nach: http://www.nature.com/nrn/journal/v8/n12/images/nrn2257-i1.jpg am 19.07.2013).

M1 M2

PY

PY

PY

C

C

C N

N

N

12 Einleitung

Da in dieser Arbeit mittels eines Glucocorticoids die Expression verschiedener α- und δ-

ENaC UE gesteigert werden soll, wird das Renin-Angiotensin-Aldosteron System (RAAS),

welches am besten in Nierenepithel untersucht ist, genauer erläutert [Beutler et al., 2003].

Wichtig für die hormonelle Steuerung des ENaC-Kanals in diesem System sind unter

Anderen folgende Rezeptoren: Mineralcorticoidrezeptor (MR) und der Vasopressin-

Rezeptor (V2R). Die Regulation der Expression von ENaC wird durch Aldosteron und

Vasopressin generiert (siehe Abbildung 6). Das Mineralcorticoid Aldosteron stimuliert

ENaC in verschiedenen Geweben, indem es die Expression der unterschiedlichen ENaC

UE induziert. Zudem beeinflusst Aldosteron das Niveau der in der apikalen Membran

verbreiteten ENaC UE [Verrey, 1999]. Durch Angiotensin II wird Aldosteron in der

Nebenniere und Vasopressin im Hypophysenhinterlappen ausgeschüttet. Die Bindung

von Aldosteron an dem MR bildet einen dimeren Ligand-Rezeptor-Komplex, der in den

Zellkern gelangt und dort an empfängliche Elemente der DNA bindet. Dies führt sowohl

zur Induktion einer Reihe von spezifischen Transkripten (aldosterone-induced transcripts,

AIT), wie dem ENaC und der Natrium-Kalium-ATPase oder der SGK1

(serum/glucocorticoid regulated kinase 1), als auch zur Unterdrückung einer Anzahl von

Transkripten (aldosterone-repressed transcripts, ART). Vasopressin bindet an den G-

Protein-gekoppelten Rezeptor vasopressin type 2 receptor (V2R), der zu einer Aktivierung

einer nachgeschalteten Proteinkinase A (PKA) führt. Sowohl SGK1 als auch PKA

inaktivieren die Ubiquitin-Ligase Nedd4-2 durch Phosphorylierung [Snyder et al., 2004].

Dies führt zu einer Erhaltung von aktiven ENaC-Kanälen auf der Membran. Nedd4-2

ubiquitiniert im aktiven Zustand ENaC, indem eine Interaktion der WW-Domäne mit dem

PY-Motiv des zytoplasmatischen C-Terminus der ENaC UE stattfindet. Daraufhin wird

ENaC durch Endocytose ins Zytoplasma überführt und anschließend degradiert [Staub et

al., 1996]. Durch die Ubiquitin-specific protease 2-45 (USP2-45), welche unabhängig von

der Ausschüttung von Aldosteron und Vasopressin exprimiert wird, wird der epitheliale

Natriumkanal deubiquitiniert, durch extrazelluläre Vesikel recycelt und wieder in die

Membran eingebaut [Fakitsas et al., 2007; Zhou und Snyder, 2009; Schild, 2010]. Da bei

Mukoviszidose überwiegend das respiratorische Epithel betroffen ist und dort

hauptsächlich der Glucocorticoidrezeptor vorhanden ist, wird im nächsten Abschnitt

genauer auf Glucocorticoide eingegangen.

Einleitung 13

1.4 Glucocorticoide

Glucocorticoide gehören zu der Gruppe der Steroidhormone. Sie besitzen eine

antiinflammatorische und immunmodulatorische Wirkung, die hauptsächlich genomische

Mechanismen regulieren. Im Menschen modulieren sie diese um rund 10% [Buckingham,

2006]. Für die normale Entwicklung und Wachstum, die Stressreaktion, sowie für die

Regulation des gesamten Immunsystems sind sie unverzichtbar. Sie sind in der heutigen

Medizin zu unverzichtbaren Wirkstoffen geworden. Eines der bekanntesten

Glucocorticoide ist das Cortison, welches 1936 aus der Nebenniere isoliert und von

Hench 1949 zur Behandlung bei rheumatoider Arthritis eingesetzt wurde [Reichstein,

1936; Wintersteiner, 1936; Hench et al., 1949; Hench et al., 1950]. Zunächst galten

Glucocorticoide in der Bevölkerung als ein enormer Gewinn, jedoch wurde nach kürzester

Abbildung 6: Regulation der ENaC Expression durch Aldosteron und Vasopressin

In der Abbildung wird schematisch die Wirkung von Aldosteron und Vasopressin auf die ENaC Expression dargestellt. Durch die Bindung von Aldosteron an den MR wird die Transkription der Zielgene wie z.B. ENaC, Na

+/K

+-ATPase oder SGK1 erhöht. Durch die Erhöhung der Expression von

SGK1 im Zusammenspiel mit PKA, das durch die Bindung von Vasopressin an den V2R freigesetzt wird, wird durch Phosphorylierung Nedd4-2 inhibiert. Somit ist die Endozytose des ENaC-Kanals blockiert und der Na

+-Strom über den ENaC erhöht. Die ENaC-Kanäle, die durch Endozytose in

Vesikeln lagern, können durch USP2-45 deubiquitiniert und in die Membran eingebaut werden (verändert nach: Schild 2010).

14 Einleitung

Zeit festgestellt, dass die Einnahme von Glucocorticoiden eine Reihe von

Nebenwirkungen aufwies. Aus diesem Grund wird ständig weiter nach Alternativen

geforscht.

Glucocorticoide bestehen aus 21 Kohlenstoffatomen und werden in der Nebenniere

synthetisiert [Sapolsky et al., 2000]. Sie können an zwei verschiedene Corticoidrezeptoren

binden. Zum einen an den Mineralcorticoidrezeptor (MR) und zum anderen an den

Glucocorticoidrezeptor (GR). Der Unterschied besteht darin, dass Glucocorticoide, wie

Dexamethason, an beide Rezeptoren binden können und Mineralcorticoide, wie das

Aldosteron, nur an dem MR [Reul et al., 2000; Kellendonk et al., 2002]. Die Affinität der

beiden Corticoidrezeptoren wird durch die Höhe der Konzentration reguliert. Bei dem GR

und dem MR liegen die Ligandenbindungen als ein Multiproteinkomplex vor. Durch die

Bindung eines Glucocorticoids wird der Proteinkomplex abgespalten und das

Glucocorticoid kann im Zellkern die Transkription der Zielgene erhöhen. Die natürliche

Ausschüttung von Steroidhormonen wird durch Stresssituationen hervorgerufen

[Buttgereit, 2000; Gold et al., 2001; Buttgereit und Scheffold, 2002]. In der folgenden

Abbildung werden die Strukturen der Steroidhormone Aldosteron und Dexamethason

gezeigt.

Abbildung 7: Strukturformel von Aldosteron und Dexamethason

Auf der linken Seite A ist das Mineralcorticoid Aldosteron und auf der rechten Seite B das Glucocorticoid Dexamethason abgebildet. Beide Corticoide sind aus 21 C-Atomen aufgebaut und gehören zu der Gruppe der Steroidhormone. Sie ähneln sich in ihren Strukturformeln. Die Ähnlichkeit lässt auf einen analogen physiologischen Effekt schließen (verändert nach: www.freebase.com am 07.14.2013).

In Bezug auf die Mukoviszidoseforschung wurde das Mineralcorticoid Aldosteron getestet.

Forschungen zeigten, dass die Zugabe von Aldosteron in Nierenzellen der Ratte zu einer

erhöhten α-ENaC UE Expression jedoch nicht zu erhöhten β- und γ-ENaC UE Expression

führte [Masilamani et al., 1999]. Die Arbeitsgruppe um Oberleithner fand zudem eine

A) B)

Einleitung 15

erhöhte Expression des ENaC-Kanals durch Anschwellen der mit Aldosteron behandelten

Zellen heraus. Dies resultierte aus einem veränderten Salz- und Wasserhaushalt

[Oberleithner et al., 2003]. In Versuchen an Ratten und Mäusen wurde gezeigt, dass das

Mineralcorticoid am meisten in der Niere exprimiert wird [Masilamani et al., 1999; Schulz-

Baldes et al., 2001]. Da bei Mukoviszidose das Hauptaugenmerk auf der Lunge liegt,

wurde untersucht, inwieweit Aldosteron eine Wirkung auf die Expression von ENaC im

respiratorischen Epithel besitzt. 1994 wurde gezeigt, dass in der Lunge hauptsächlich

Glucocorticoide den ENaC regulieren. Um eine ähnliche Reaktion wie in der Niere zu

erhalten, muss Aldosteron in höheren Konzentrationen eingesetzt werden [Champigny et

al., 1994]. Aus diesem Grund wurde in der Mukoviszidoseforschung das Glucocorticoid

Dexamethason zur Untersuchung des ENaC-Kanals verwendet. Dexamethason ist ein

synthetisch hergestelltes Glucocorticoid, welches eine 30fach höhere Wirkung als das

körpereigene Kortison besitzt. Es wirkt im Zusammenspiel mit einem

Glucocorticoidrezeptor, welcher mit dem Heat-Shock-Protein (HSP90) verbunden ist.

Bindet das Dexamethason an den GR, spaltet sich das HSP90 ab und der Rezeptor-

Ligand-Komplex wandert in den Zellkern. Im Zellkern bindet der Komplex an die

Glucocorticoid-responsive Elemente der DNA und erhöht die Transkription der Zielgene

[Beato et al., 1995; Karin, 1998; Hayashi et al., 2004]. Die Auswirkungen von

Dexamethason in H441 Lungenzellen und in alveolaren Rattenepithelzellen zeigten, dass

die Expression von α-ENaC mRNA bis auf das Fünffache anstieg [Sayegh et al., 1999;

Dagenais et al., 2001]. Zudem konnte die Arbeitsgruppe um Degenais die Stimulation von

den β- und γ-ENaC UE durch Dexamethason nachweisen [Dagenais et al., 2001]. In

Studien von der Arbeitsgruppe um Rubenstein im Jahre 2010 konnte in den humanen

Bronchialepithelzellen, CFBE41o-, gezeigt werden, dass eine 24-stündige Inkubation mit

1 µM Dexamethason eine Auswirkung auf die funktionale Expression des ENaC-Kanals

besitzt, indem der Na+-Strom über diesen erhöht war [Rubenstein et al., 2010]. Da das

Resultat der Untersuchungen an verschiedenen Modellsystemen der Etablierung neuer

Therapiemöglichkeiten in der Mukoviszidoseforschung dient, wird im nächsten Abschnitt

näher auf diese Therapieansätze für die Behandlung von Mukoviszidose eingegangen.

1.5 Therapiemöglichkeiten bei Mukoviszidose

Seit der Entdeckung des CFTR-Gens wird mittels verschiedener Methoden versucht, ein

Medikament, das gegen die Ursache dieser Krankheit wirkt, zu finden. Bisherige

Forschungen führten jedoch lediglich zu symptomlindernden Maßnahmen wie z.B. der

Inhalation schleimlösender Medikamente oder der Einnahme von Antibiotika [Touw et al.,

1905]. Die dauerhafte Einnahme von Antibiotika, als auch zum Teil von

16 Einleitung

Entzündungshemmern, wirkt dem Bakterienbefall und Entzündungen der Atemwege

entgegen. Weitere Maßnahmen sind die Verabreichung von Pankreasenzymen,

Drainagen und als letzten Schritt eine Lungentransplantation [Pletz et al., 2010]. Versuche

zahlreicher gentherapeutischer Ansätze hatten bis heute, zum Beispiel aufgrund von

Immunreaktionen, keinen Erfolg [Yang et al., 1995]. In der Arbeitsgruppe um Weber

versucht man, eine sogenannte „Transkript-Therapie“ mit CFTR-mRNA statt einer

Gentherapie zu entwickeln [Bangel-Ruland et al., 2013]. Ein großer Vorteil der

Transfektion mit mRNA ist das Umgehen der Zellkernhülle, die bei der Verwendung von

DNA eine große Barriere darstellt. Zudem werden durch Verzicht auf Fremd-DNA und

Viruspartikel die negativen Immunreaktionen umgangen. Weiterhin arbeitete die

Arbeitsgruppe um Weber im Jahre 2012 an einer Studie, in der die ΔF508 Mutation des

CFTR mittels Sildenafil (Phosphodiesterase-5 Inhibitor) korrigiert wird. Es wurde bestätigt,

dass Sildenafil nicht nur als Korrektor des Transportdefektes dient, sondern auch als

Potentiator der CFTR-Aktivität agiert. Da Sildenafil durch diese beiden Wirkungen effizient

zur Linderung von Mukoviszidosesymptomen beitragen kann, wäre diese Substanz eine

sehr interessante Therapiemöglichkeit gewesen. Da aber eine zu große Menge des

Stoffes für Therapiezwecke eingesetzt werden müsste und die Substanz ebenfalls

blutdrucksenkend wirkt, ist diese Therapiemöglichkeit für diese Krankheit nicht

durchführbar [Leier et al., 2012].

In den ersten Jahren, nachdem das CFTR-Gen entdeckt wurde, ist das Hauptaugenmerk

auf den defekten Chloridionenkanal gelegt worden. Mittlerweile weiß man, dass auch die

Na+-Hyperabsorption über den ENaC für die CF-Symptomatik verantwortlich ist [Mall et

al., 2004; Bangel et al., 2008]. Aus diesem Grund wird nicht nur an der Wiederherstellung

des CFTR sondern auch an der Reduktion der Na+-Hyperabsorption geforscht. Eine der

bekanntesten Therapien um die Na+-Hyperabsorption über den ENaC zu verringern, ist

der Einsatz des Diuretikums Amilorid, welches den ENaC an der außen liegenden Pore

blockiert [Hofmann et al., 1998]. In zahlreichen Studien konnte ein Kurzzeiteffekt durch

Inhalation des Diuretikums Amilord festgestellt werden. In diesen Studien wurde unter

anderem eine reduzierte transepitheliale Potentialdifferenz am respiratorischen Epithel

und zum Teil auch eine verbesserte Lungenfunktion festgestellt [Reinhardt et al., 2001].

Eine weitere Therapiemöglichkeit wurde im Jahre 2009 von der Arbeitsgruppe um Weber

veröffentlicht, bei der durch die Applikation von Antisense-Oligonukleotiden (AON) die

Expression des ENaC-Kanals durch Abbruch der Translation verhindert wird [Sobczak et

al., 2009]. Die AON bestehen aus 16 Basenpaaren. Diese sind synthetische und

einzelsträngige DNA-Moleküle. AON sind komplementär zu den ENaC-kodierenden

mRNA-Motiven. Durch die Bindung der komplementären AON an die ENaC-mRNA wird

Einleitung 17

die Expression des ENaC-Kanals unterdrückt. In Versuchen an Nasenepithelzellen konnte

von Sobczak et al. eine 75%ige Inhibition der Expression des ENaC-Kanals erreicht

werden [Sobczak et al., 2009]. Einer der Vorteile dieser Therapiemöglichkeit liegt darin,

dass die maximale Wirkungsdauer 72 Stunden beträgt [Sobczak et al., 2010]. Eine

ähnliche Möglichkeit Mukoviszidose zu behandeln untersuchte die Firma (GSK) in

Kooperation mit anderen Arbeitsgruppen im Jahre 2013. Hierzu wurde die Expression von

α-ENaC mittels siRNA (small-interfering RNA) inhibiert. Durch das Einbringen der siRNA

in humane Nasenepithelzellen wurde die Expression der α-ENaC UE für über 72 Stunden

reduziert. Dies hatte eine Verringerung des Amilorid-sensitiven Na+-Stroms um 69% zur

Folge. Dementsprechend wirkt die eingebrachte siRNA als potentieller Inhibitor auf die

funktionale Expression des ENaC-Kanals ein [Clark et al., 2013]. Für die hier

angesprochenen Therapiemöglichkeiten sind verschiedene Modellsysteme unverzichtbar.

So sollen in dieser Arbeit zwei in der CF-Forschung etablierte Zelllinien, CFBE41o- und

16HBE14o-, einem CF-nahem Systemmodell noch näher gebracht werden.

18 Einleitung

1.6 Ziel der Arbeit

Obwohl das Verständnis für die Krankheit Mukoviszidose seit der Identifizierung des

CFTR-Gens 1989 weit vorangeschritten ist, konnte die Krankheit noch nicht geheilt

werden. Für die Grundlagenforschung ist es zwingend erforderlich möglichst

physiologisch und pathologisch nahe Versuchsmodelle zu etablieren. Neben Tiermodellen

sind immortalisierte Zelllinien, sowie primäre Zellen das Mittel der Wahl zur

grundlegenden Erforschung der defekten Ionentransportvorgänge bei Mukoviszidose.

In der vorliegenden Arbeit werden zu diesem Zweck die humanen bronchialen

Epithelzelllinien CFBE41o- und 16HBE14o- verwendet. Die CFBE41o--Zellen sind

immortalisierte Zellen, die von Bronchialepithelzellen eines einjährigen Mukoviszidose-

Patienten kultiviert wurden und sich besonders gut für die Mukoviszidoseforschung

eignen, da die Zellen polarisierte Monolayer bilden. Die Zellen weisen den genetischen

Defekt ΔF508 homozygot auf [Gruenert et al., 2004; Ehrhardt et al., 2006]. Die

16HBE14o--Zelllinie wurden von einem Herz-Lungen-Transplantat kultiviert und spiegelt

die Wildtyp (wt)-Situation wieder [Cozens et al., 1994]. Bisher konnte in funktionellen

Studien jedoch keine stabile Amilorid-sensitive Na+-Absorption in diesen Zelllinien

nachgewiesen werden, obwohl bereits gezeigt wurde, dass die ENaC-UE auf mRNA und

Proteinebene exprimiert werden [Rubenstein et al., 2010; Lemke, 2012].

Aus der Literatur ist bekannt, dass in Epithelzellen hauptsächlich die α-ENaC UE

exprimiert wird, welche meistens funktionale Kanäle mit der β- und γ-UE ausbildet

[Canessa et al., 1994b; Li et al., 1995]. Durch Untersuchungen der Arbeitsgruppe um

Weber wurde festgestellt, dass auch die δ-UE des ENaC-Kanals in Nasenepithelzellen

eine wichtige Rolle bei der Bildung dieses Kanalproteins spielt. Durch unterschiedliche

Methoden konnte in humanen Nasenepithelzellen dargestellt werden, dass die δ-ENaC

UE hier ca. 50% des Amilorid-sensitiven Na+-Transportes übernimmt [Bangel-Ruland et

al., 2010]. Zudem konnte bereits gezeigt werden, dass das synthetische Glucocorticoid

Dexamethason (1 µM) die funktionale Expression, nach einer 24 h Inkubation mit

Dexamethason, um ca. 50% steigern konnte. Außerdem konnte in der Arbeit die

Proteinexpression proportional zu der Inkubationszeit gesteigert werden [Lemke, 2012].

Auch in anderen Arbeitsgruppen konnte eine Erhöhung der funktionalen Expression durch

Dexamethason (1 µM) ermittelt werden. So zeigte die Arbeitsgruppe um Rubenstein eine

Erhöhung der funktionalen Expression der inkubierten CFBE41o--Zellen, aber keine

Auswirkungen auf die Proteinexpression [Rubenstein et al., 2010]. Ein Nachweis für die

Ergebnisse ist bisher noch nicht erfolgt, so dass in dieser Arbeit sowohl die funktionale

Expression als auch die Proteinexpression überprüft und erhöht werden soll. Zudem soll

Einleitung 19

durch Kanalblocker die unterschiedliche Wirkung des Dexamethasons auf die

verschiedenen ENaC UE, α und δ, untersucht werden. Für diesen Nachweis werden die

Zellen über unterschiedlichen Inkubationszeiten mit Dexamethason inkubiert und

anschließend elektrophysiologisch in einer modifizierten Ussing-Kammer untersucht.

Auch Proteinbiochemisch, soll die Auswirkung des Dexamethasons auf die Expression

der einzelnen ENaC UE, α und δ, untersucht werden. Die mit Dexamethason stimulierte

Proteinexpression soll mittels Western Blot Analyse mit spezifisch gegen α-ENaC UE und

δ-ENaC UE gerichteten Antikörpern untersucht werden.

Ziel der Masterarbeit ist es nun, mit Hilfe des Dexamethasons humane Epithelzellen der

CFBE41o--und der 16HBE14o--Zelllinien so zu stimulieren, dass die α- und δ-ENaC

Expression gesteigert wird, um festzustellen, ob die beiden Zelllinien anschließend als

CF-nahes Systemmodell dienen können.

20 Material

2 Material

2.1 Chemikalien und Lösungen

Die verwendeten Chemikalien, die für das Ansetzen der Lösungen verwendet wurden,

werden in den Anlagen aufgeführt. Soweit nicht anders vermerkt wurden alle Lösungen

mit Millipore-H2O angesetzt und bei RT gelagert. Die pH-Werte wurden mit verdünnter

HCL bzw. verdünnter NaOH oder Tris eingestellt.

2.2 Lösungen für die Zellkultur

Tabelle 1: Verwendetes Beschichtungsmedium

Beschichtungsmedium

44 ml LHC Basalmedium

65 µl Rinderserumalbumin (BSA, 7,5%ig)

1500 µl Rinderkollagen Typ I (1 mg/ ml)

500 µl Humanes Fibronektin (1 mg/ ml)

3935 µl Millipore-H2O (autoklaviert)

Tabelle 2: Verwendetes Medium und Waschlösung

Kulturmedium

10% (v/v) Fötales Kälberserum

1% (v/v) 100x L-Glutamin (Endkonzentration)

1% (v/v) Penicillin (10.000 v/ ml)/ Streptomycin (10.000 µg/ ml)

ad 250 ml Minimum Essential Medium (MEM)

1 x PBS

137 mM NaCl

2,7 mM KCl

10,2 mM Na2HPO4 * H2O

1,8 mM KH2PO4

ad 1000 ml Millipore-H2O

autoklavieren

Material 21

Tabelle 3: Verwendetes Einfriermedium

Einfriermedium

50% (v/v) Fötales Kälberserum

10% (v/v) Demethylsulfoxid (DMSO)

ad Endvolumen mit Minimum Essential Medium (MEM)+ Zusätze (Kulturmedium)

2.3 Lösungen für den Mykoplasmentest

Die Lösungen für den BCA-Test sind dem verwendeten KIT, AG-aliquoted Mycoplasma

Detection Kit for conventional PCR von Venor® GeM Advance, zu entnehmen.

10 x TBE Puffer (pH 8,3)

0,9 M Tris

0,9 M Borsäure

20 mM EDTA

1,5%iges Agarosegel

750 mg Agarose

50 ml 0,5 x TBE-Puffer

1,25 µl Ethidiumbromid

22 Material

2.4 Lösungen für die Elektrophysiologie

Tabelle 4: Verwendete Ringerlösungen und Diuretika

1 x Zellkulturringer pH 7,3

130 mM NaCl

5 mM KCl

1 mM CaCl2

2 mM MgCl2

5 mM Glukose

10 mM HEPES

sterilfiltrieren

1 x Na+-freier Zellkulturringer pH 7,3

130 mM TMA

5 mM KCl

1 mM CaCl2

2 mM MgCl2

5 mM Glukose

10 mM HEPES

sterilfiltrieren

Amilorid 10 mM Amilorid (Stocklösung)

100 µM in 1 x Zellkulturringer

2.5 Lösungen für die Protein Analyse

Tabelle 5: Verwendete Lösungen für die Proteinisolation

2%iger Tritonlysispuffer + PIC

Tris 1 mM

NaCl 15 mM

EDTA 0,2 mM

Triton X-100 2%

1% PIC (wird vor gebrauch hinzugegeben)

Material 23

Tabelle 6: Verwendete Lösungen für die Gelelektrophorese

4 x Proben Puffer

0,32 M Tris HCl

40% Glycerin

8% SDS

10% DTT (1M) frisch vor Gebrauch hinzugegeben

0,04% Bromphenolblau

4 mM EDTA

Lagerung bei RT

Sammelgel

1,3 ml 30% Acrylamid

2,5 ml Sammelgelpuffer

6,2 ml Millipore-H2O

-10 min entgasen-

100 μl 10% APS

10 μl TEMED

Sammelgelpuffer 0,5 M Tris

0,4% SDS

Trenngel 7,5% (für den Ansatz von drei Gelen)

3,75 ml 30% Acrylamid

3,75 ml Trenngelpuffer

7,4 ml Millipore-H2O

-10 min entgasen-

100 μl 10% APS

5 μl TEMED

Trenngelpuffer 1,5 M Tris

0,4%SDS

SDS-Laufpuffer

23 mM Tris

190 mM Glycerin

0,2% SDS

24 Material

Tabelle 7: Verwendete Lösungen und Materialien für die Western Blot Analyse

PVDF Membran Roti®-PVDF (Roth AG, Arlesheim, Schweiz)

Transferpuffer pH 8,3

48 mM Tris-HCl

39 mM Glycerin

10 % Methanol

Filterpapier A. Hartenstein, Würzburg, Deutschland

Tabelle 8: Verwendete Lösung zum Strippen einer PVDF-Membran

Natronlauge 0,2 M NaOH

Tabelle 9: Verwendete Färbe- und Entfärbemittel für das SDS-Gel

CoomassieBrillantBlueTM-Färbelösung

0,2 % (w/v) Coomassie-Brilliant-Blue R-250

10 % (v/v) Essigsäure

10% (v/v) Methanol

Lösung lichtgeschützt lagern

Coomassie-Entfärbelösung 10 % (v/v) Essigsäure

30 % (v/v) Methanol

Tabelle 10: Verwendete Färbe- und Entfärbemittel für die PVDF-Membran

Coomassie Brillant BlueTM-Färbelösung

0,075 % (w/v) Coomassie-Brilliant-Blau R-250

100 ml Methanol

Lösung lichtgeschützt lagern

ad 250 ml Minimum Essential Medium (MEM)

Coomassie-Entfärbelösung

40 % Ethanol

10 % Essigsäure

50 % Millipore-H2O

Material 25

Tabelle 11: Verwendete Lösungen für die Antikörperbehandlung

10 x TBS Waschpuffer Kulturmedium

10 mM TRIS

1,5 mM NaCl

ad 1000 ml Millipore-H2O

TBST Waschpuffer

100 ml 10 x TBS

500 µl Tween 20 (0,05 %)

ad 1000 ml Millipore-H2O

5% Blockpuffer in 1 x TBST 5% Magermilchpulver in 1 x TBST

1% Blockpuffer in 1 x TBST 1% Magermilchpulver in 1 x TBST

2.5.1 Lösungen für den Bicinchoninsäuretest (BCA-Test)

Die Lösungen für den BCA-Test sind dem verwendeten KIT, Pierce® BCA Protein Assay

Kit von Thermo Scientific Inc. (Rockford, Illinois, USA), zu entnehmen.

2.5.2 Detektion durch Enhanced Chemilumineszenz (ECL)

Die Lösungen für die Detektion sind dem KIT, Super Signal® West Pico Chemiluminescent

Substrat, zu entnehmen.

26 Methoden

3 Methoden

In der vorliegenden Arbeit soll, nach Inkubation mit Dexamethason der CFBE41o-- und

16HBE14o--Zellen, die funktionale Expression als auch die Proteinexpression der α- und

δ-ENaC UE untersucht werden. Die funktionale Expression wurde mittels einer

modifizierten Ussing-Kammer gemessen. Die Proteinexpression wurde mit der Western

Blot Analyse ermittelt. Im folgenden Teil der Arbeit werden die angewandten Methoden für

die Kultivierung, die elektrophysiologischen Messungen an der Ussing-Kammer und die

biochemischen Untersuchungen der verwendeten Zelllinien beschrieben. Wurden die

Versuche nach externen Versuchsprotokollen durchgeführt, wird auf diese verwiesen. Alle

verwendeten Materialen, Geräte, Kits und Antikörper sind den Anlagen zu entnehmen.

3.1 Zellkultur

Die verwendeten bronchialen Epithelzellen wurden in einem Inkubator bei 37°C in, 5%

CO2 und 95% Luftfeuchtigkeit gelagert. Die Methoden in der Zellkultur wurden unter

sterilen Bedingungen durchgeführt, um eine Kontamination mit Bakterien zu vermeiden.

Hierzu diente eine Sterilbank, in der die bronchialen Epithelzellen behandelt wurden. Um

eine Kontamination mit anderen Zelllinien auszuschließen, wurde die Arbeitsfläche in der

Sterilbank vor und nach Gebrauch mit Bacillol sterilisiert. Die Zusammensetzungen der

verwendeten Lösungen sind dem Materialteil zu entnehmen.

3.1.1 Humane Zelllinien als Mukoviszidosemodelle

Humane Zelllinien werden häufig in der Mukovizidoseforschung benutzt, um

Regulationsmechanismen in unterschiedlichen Geweben zu untersuchen. Hierbei können

verschiedene Aktivatoren, wie z.B. Dexamethason, oder Inhibitoren, wie z.B. Amilorid,

getestet werden. Einige Zelllinien besitzen die Fähigkeit polarisierte Monolayer

auszubilden. Diese können mit elektrophysiologischen Methoden mittels Ussing-Kammer

untersucht werden. Die Aktivierung oder Inhibierung kann auch mittels

proteinbiochemischen Methoden, wie der Western Blot Analyse, nachgewiesen werden.

Der Vorteil humaner Zelllinien gegenüber Tiermodellen ist zunächst die einfache und

kostengünstigere Versorgung der Zellen. Zusätzlich stammen die Zelllinien aus

unterschiedlichen Organen des Menschen und sind als Modellsystem der Symptomatik

Methoden 27

der Krankheit näher als Tierorganismen. Primärzelllinien sind in der

Mukoviszidoseforschung noch besser geeignet als humane Zelllinien. Jedoch sind diese

nur begrenzt verfügbar, weshalb viele Zelllinien von erkrankten Patienten, z.B. die

CFBE41o--Zelllinie, oder von gesunden Patienten, wie z.B. die 16HBE14o--Zelllinie,

generiert wurden.

Die CFBE41o--Zelllinie wurde von der Arbeitsgruppe um Gruenert generiert und 2004

beschrieben [Gruenert et al., 2004]. Die Zellen wurden aus Bronchialepithelzellen eines

einjährigen CF-Patienten gewonnen. Über ein replikationskompetentes pSVori-Plasmid

mit Simian-Virus (SV-40 Virus) Antigen wurden die Zellen transformiert und immortalisiert

[Gruenert et al., 2004; Ehrhardt et al., 2006]. Die Zellen weisen die bei CF am häufigsten

auftretende ΔF508 Mutation homozygot auf und sind eine in der CF-Forschung etablierte

Zelllinie [Ehrhardt et al., 2006]. Durch die morphologischen und physiologischen

Eigenschaften, wie die Bildung von polarisierten Monolayer und tight junctions wird ein

transepithelialer Widerstand von 100-500 Ω bei Messungen in der Ussing-Kammer

erreicht [Gruenert et al., 2004].

Die Zelllinie 16HBE14o- wurde wie die CFBE41o--Zellen von der Arbeitsgruppe um

Gruenert generiert [Cozens et al., 1994]. Die Zellen wurden von bronchialen Epithelzellen

eines Herz-Lungen-Transplantats gewonnen. Wie die CFBE41o--Zellen sind diese über

ein replikationskompetentes pSVori-Plasmid mit einem SV-40 Virus Antigen transformiert

und immortalisiert worden. Die 16HBE14o--Zellen sind in der CF-Forschung eine

etablierte Zelllinie, die als Kontrollzelllinie zu der CFBE41o--Zelllinie dient, da diese Zellen

gesunden Bronchialepithelzellen entsprechen und keinen defekten CFTR-Kanal

aufweisen [Cozens et al., 1994]. Auch diese Zellen bilden polarisierten Monolayer und

tight juncions aus, wodurch ein transepithelialer Widerstand von 200-1000 Ω bei den

Ussing-Kammer Messungen entsteht [Gruenert et al., 2004].

3.1.2 Beschichten der Zellkulturflaschen

Um eine bessere Adhäsion der Zellen zu erlangen, wurden sowohl 75 cm2 (T-75) und 25

cm2 (T-25) Zellkulturflaschen, als auch 0,33 cm2 Filter mit einem Beschichtungsmedium

(siehe Materialteil), das 1% Fibronektin und 3% Kollagen beinhaltet, beschichtet.

Fibronektin ist ein hochmolekulares Glykoprotein der extrazellulären Matrix, welches an

Kollagen bindet und zur Förderung der Zellmigration und -adhäsion dient [Ruoslahti et al.,

1979]. Kollagen ist ein Strukturprotein, das hauptsächlich im Bindegewebe vorkommt.

Zusätzlich zu dem verbesserten Wachstum und der Adhäsion der Zellen wird das

28 Methoden

einschichtige Wachstum der Zellen gefördert. Bei dem Beschichten der Flaschen wurden

ca. 1-2 ml (T-25) und ca. 2-3 ml (T-75) Beschichtungsmedium verwendet. Der Boden

musste vollständig benetzt sein. Danach wurde das überflüssige Medium wieder

abgenommen. Die frisch beschichtete Zellkulturflasche wurde für 2 h bei 37°C oder über

Nacht (ü.N.) bei RT unter der Sterilbank inkubiert. Die Filter wurden mit ca. 300 µl

Beschichtungsmedium auf die gleiche Weise beschichtet.

3.1.3 Kultivierung und Versorgung der Zellen

Um bei den Bronchialepithelzellen ein optimales Wachstum sicherzustellen, wurden die

Zellen auf die zuvor beschichteten T-25 und T-75 Zellkulturflaschen kultiviert. Den Zellen

wurde ein spezielles Kulturmedium hinzugefügt, welches sowohl das Wachstum fördert

als auch Bakterienbefall vorbeugt. Das verwendete Kulturmedium setzt sich aus dem

Grundmedium Minimal Essential Medium (MEM), MEM with Earle´s Salts with L-

Glutamine, Wachstumsfaktoren wie fötalem Kälberserum (FKS) und zusätzlichen Anteil

von 1% L-Glutamin sowie Antibiotika, 1%ges Penicillin/Streptomycin-Gemisch,

zusammen. Das Grundmedium MEM wurde 1959 von Harry Eagle entwickelt [Eagle,

1959; Morton, 1970]. Das FKS dient zur Förderung des Zellwachstums. Je mehr FKS dem

Medium hinzugegeben wird, desto schneller wachsen die Zellen. In dem verwendeten

Kulturmedium wurden 10% verwendet. Das eingesetzte L-Glutamin wirkt sich zusätzlich

positiv auf die Wachstumsrate der Zellen aus und das Antibiotikagemisch schützt vor

Bakterienbefall der Zellen und des Mediums selbst. Die Zellen wurden alle zwei bis drei

Tage mit frischem Medium versorgt, indem diesem zunächst das alte Kulturmedium mit

Hilfe einer Pasteurpipette und einer Vakuumpumpe entnommen wurde. Die Zellen wurden

mit 3 ml (T-25 Zellkulturflasche) oder 6 ml (T-75 Zellkulturflasche) sterilem 37°C warmen

PBS gewaschen, um die toten und nicht angewachsenen Zellen zu entfernen und

anschließend wurden 5 ml (T-25 Zellkulturflasche) oder 10 ml (T-75 Zellkulturflasche)

37°C warmes Kulturmedium hinzugegeben.

3.1.4 Passagieren der Zellen

Damit die Zellen nicht absterben, oder ihre morphologischen Eigenschaften verändern,

sollte eine Konfluenz zwischen 80 und 90% nicht überschritten werden. Ist der

Flaschenboden vollständig mit Zellen bewachsen, somit zu 100% konfluent, können durch

Kontakte die Zellen absterben, oder die morphologischen Eigenschaften verändert

werden. Die Konfluenz kann mittels eines Lichtmikroskops beobachtet werden. Sobald

diese zwischen 80 und 90% lag wurden die Zellen auf eine neue Flasche passagiert. Für

Methoden 29

diesen Vorgang wurde zunächst das Medium abgesaugt. Danach wurden die Zellen mit 1

x PBS, das zuvor mit allen anderen verwendeten Lösungen in einem 37°C warmen

Wasserbad vorgewärmt wurde, gewaschen. Bei der T-25 Zellkulturflasche verwendete

man 1 ml und bei der T-75 Zellkulturflasche 2 ml Trypsin/Ethylendiamintetraessigsäure

(EDTA)-Enzymgemisch um die Zellen vom Flaschenboden zu lösen. Dieser Effekt wird

durch den Abbau von extrazellulären Proteinen durch Trypsin gewährleistet. Trypsin

stammt aus der Familie der Serinproteasen [Whitcomb und Lowe, 2007]. Durch den

Zusatz des EDTA werden die Zell-Zell-Verbindungen, durch die Bildung von

Chelatkomplexen mit zweiwertigen Kationen wie Ca2+, unterbrochen [Schmitz, 2011].

Durch das Aufbrechen der Zell-Zell-Verbindungen liegen die Zellen vereinzelt in der

Flasche vor und ermöglichen ein vereinfachtes Passagieren der Zellen in eine neue

Flasche. Nach der Zugabe des Enzymgemisches wurden die Zellen für 7 min in einem

37°C Brutschrank inkubiert da Trypsin sein Temperaturoptimum bei 37°C hat. Nachdem

die Zellkulturflasche aus dem Brutschrank entnommen wurde, wurde leicht gegen die

Zellkulturflaschenwand geklopft, um die Zellen restlos vom Flaschenboden zu lösen.

Konnten nicht alle Zellen vom Flaschenboden entfernt werden, wurde die Flasche erneut

für eine Minute in den Brutschrank gestellt. Nach dieser Minute wurde die Flasche aus

dem Brutschrank genommen und es wurde erneut an die Zellkulturflaschenwand geklopft.

Zu beachten war, dass die Zellen dem Trypsin nicht zu lange ausgesetzt waren, da dies

Stress und den Zelltod bei den Zellen hervorruft. Nach dem trypsinisieren der Zellen

wurde bei den T-25 Zellkulturflaschen 4 ml und bei den T-75 Zellkulturflaschen 8 ml

Kulturmedium hinzugegeben und resuspendiert. Danach wurden die Zellsuspensionen in

15 ml-Zentrifugenröhrchen überführt und für 5 min bei 500 x g bei RT zentrifugiert.

Danach wurde der Überstand verworfen und das Pellet in einem definierten Kulturmedium

aufgenommen und resuspendiert. Es wurde eine 1:15 Verdünnung in den neuen

Zellkulturflaschen hergestellt. Die Zellen wurden nicht nur zur Zelllinienerhaltung

passagiert, wo die Passagennummer das Alter der Zellen anzeigt, sondern auch für

weiterführende Versuche wie der Proteinisolation (siehe Abschnitt 3.3.1). Hierfür mussten

die Zellen für verschiedene Inkubationszeiten mit Dexamethason in mehreren Flaschen

ausgesät werden. Dieser Vorgang wird splitten genannt. Des Weiteren werden

Messungen an der Ussing-Kammer vorgenommen, wofür die Zellen auf bestimmte Filter

ausgesät werden mussten (siehe Abschnitt 3.1.9).

3.1.5 Einfrieren der Zellen

Um einen Vorrat an Zellen zu besitzen oder eine bestimmte Passage für spätere

Versuche zu erhalten, können die Zellen bei -80°C für einen längeren Zeitraum

30 Methoden

eingefroren und gelagert werden. Für das Einfrieren von Zellen muss ein bestimmtes

Einfriermedium verwendet werden. Diesen Vorgang nennt man Kryokonservierung und

beinhaltet das zeitlich befristete Einfrieren von Zellen unter Verwendung eines

Gefrierschutzmittels. Das Gefrierschutzmittel verhindert das Gefrieren des Wassers in den

Zellen und somit den Zelltod [Schmitz, 2011]. Dem Einfriermedium ist das

Gefrierschutzmittel Dimethylsulfoxid (DMSO) hinzugefügt. Die genaue Zusammensetzung

des Einfriermediums ist dem Materialteil zu entnehmen. Das Einfriermedium wurde auf

Eis gehalten bis es zu den Zellen hinzugegeben wurde. Jeder weitere Arbeitsschritt wurde

auf Eis weitergeführt, da DMSO bei RT zelltoxisch wirkt. Zunächst wurde wie in Abschnitt

3.1.5 bis zur Zentrifugation bei 500 x g für 5 min bei RT verfahren. Dem Zellpellet wurden

vorsichtig 5,4 ml des Einfriermediums hinzugegeben und das Pellet resuspendiert. Damit

die Zellen keinem Stress ausgesetzt wurden, wurde das Einfriermedium tröpfchenweise

auf diese gegeben. Nach der Resuspension wurden je 1,8 ml der Zellsuspension in

bestimmte Kryoröhrchen überführt, in denen die Zellen bei -80°C gelagert werden.

Zunächst wurden die Kryoröhrchen mit der Zellsuspension für 15 min auf Eis gehalten

und für mind. 2 h oder ü.N. in einer Styroporbox bei -20°C gelagert. Diese Schritte dienen

der langsamen Aufnahme des DMSO in die Zellen. Als letzten Schritt wurden die Zellen in

den Kryoröhrchen in einen -80°C Gefrierschrank überführt und anschließend gelagert.

3.1.6 Auftauen der Zellen

Im Gegensatz zum langsamen Einfrieren der Zellen, damit das DMSO langsam in die

Zellen eindringen kann, muss beim Auftauen darauf geachtet werden, dass dieser Schritt

schnell vollzogen wird, da das DMSO auch nach dem Einfrieren bei RT Zelltoxisch wirkt.

Nach der Entnahme der Zellen aus einem -80°C Gefrierschrank, wurden diese zügig in

einem 37°C Wasserbad aufgetaut. Nachdem die Zellen aufgetaut waren, wurde die

Zellsuspension schnellstmöglich in ein 15 ml-Zentrifugenröhrchen, das zuvor mit 5-7 ml

warmen Kulturmedium gefüllt wurde, überführt und resuspendiert. Danach wurde die

Zellsuspension für 5 min bei 500 x g bei RT zentrifugiert. Der entstandene Überstand mit

DMSO wurde verworfen und dem Zellpellet 5 ml frisches 37°C warmes Kulturmedium

hinzugefügt und resuspendiert. Nach der Aussaat der Zellen auf eine T-25

Zellkulturflasche wurden diese unter Standardbedingungen bei 37°C, 5 % CO2-Gehalt und

95% Luftfeuchtigkeit inkubiert. Des Weiteren wurde wie in Abschnitt 3.1.4 „Kultivierung

und Versorgung der Zellen“ verfahren.

Methoden 31

3.1.7 Mykoplasmen-Test

Um eine Mykoplasmenkontamination ausschließen zu können, sollte in bestimmten

Abständen, sowie direkt nach dem Auftauen und Erhalten von neuen Zellen, ein

Mykoplasmen-Test durchgeführt werden. Bestmöglich ist der Test mit Zellkulturen

durchzuführen, wenn diese eine Konfluenz von 90-100% erreicht haben. Für den Test

verwendet man 100 µl vom Zellkulturüberstand. Die 100 µl Zellkulturüberstand wurden in

ein DNA freies Reaktionsgefäß gegeben und dicht verschlossen. Im nächsten Schritt

wurden die Proben für 10 min bei 95°C inkubiert. Zur Entfernung der Zellfragmente

wurden die Proben bei 1000 x g für 5 sec zentrifugiert. Der Überstand wurde für die PCR

verwendet. Für die PCR wurde das AG-aliquoted Mycoplasma Detecion Kit for

conventional PCR von Venor® GeM Advance verwendet. Die Verwendeten Lösungen für

die PCR wie die Volumina sind dem Kit zu entnehmen. Zusätzlich für den PCR-Ansatz

wurde die TopTaq DNA-Polymerase (5 U/µl) verwendet.

Zur Analyse der PCR-Produkte wurde eine DNA-Gelelektrophorese durchgeführt. Die

PCR-Produkte lassen sich hierdurch in einer entsprechenden Matrix in einem elektrischen

Feld auftrennen. Die Auftrennung erfolgt dabei umgekehrt proportional zum Logarithmus

ihres Molekulargewichts. Die Größe der jeweiligen Banden kann unter Zuhilfenahme

eines Molekulargewichtsmarkers ermittelt werden, der sich nach den gleichen

Bedingungen im elektrischen Feld wie die Proben verhält und auftrennt. In dieser Arbeit

wurde die Analyse der PCR-Produkte mit einem 1,5%igen Agarose-Gel in 1 x TBE-Puffer

durchgeführt. Danach wurde dem Gel 125 µl Ethidiumbromid (EtBr) zugegeben und in

eine Gelkammer gegossen. EtBr ist eine interkalierende Substanz und bindet an die DNA-

Doppelhelix. Durch das EtBr sind die Banden unter UV-Licht auswertbar. Auf das 1,5%ige

Agarose-Gel wurden 1 µl 6 x Ladepuffer und 5 µl des PCR-Ansatzes aufgetragen, zudem

wurden 5 µl des Fast + RulerTM Low Range DNA Ladder als Marker aufgetragen. Die

Auftrennung der DNA erfolgte bei einer Spannung von 128 V.

Tabelle 12: Programm für den Thermocycler

1 Zyklen 94°C für 2 min

39 Zyklen 94°C für 30 sec 55°C für 30 sec 72°C für 30 sec

Auf 4 °C abkühlen Pause

32 Methoden

3.1.8 Kultivierung der Zellen auf Transwell-Membraneinsätzen

Für die elektrophysiologischen Messungen an der Ussing-Kammer, müssen die Zellen auf

speziellen Membraneinsätzen ausgesät werden. Für die Messungen müssen die Zellen

einschichtig und zu 100 % konfluent wachsen. Für diese Messung wurde eine bestimmte

Zellzahl auf Gewebekulturfiltern, die aus Polysterol bestehen und eine Membran aus

Polyster mit einer Fläche von 0,33 cm2 und eine Porengröße von 0,4 µm beinhalten,

ausgesät.

Die verwendeten Filter wurden vor dem Beginn des Versuchs in eine sterile 24 x

Transwellplatte überführt. Anschließend wurden die Filter wie die Zellkulturflaschen in

Abschnitt 3.1.3 mit Beschichtungsmedium beschichtet. Danach wurden die Zellen

genauso behandelt wie in Abschnitt 3.1.5 „Passagieren der Zellen“ beschrieben wurde.

Nachdem Zentrifugationsschritt wurde dem Zellpellet 6 ml 37°C warmes Kulturmedium

hinzugegeben und das Pellet resuspendiert. Danach wurden die Zellen mit Hilfe einer

Neubauer-Zählkammer ausgezählt. Die Neubauer-Zählkammer besteht aus einem

bestimmten Objektträger. Dieser besitzt zwei eingravierte Zählnetze, eins auf jeder Seite,

getrennt durch einen Spalt. Ein Deckglas wird auf den Objektträger gelegt. Hierbei

entsteht ein winziger Spalt. 10 µl der Zellsuspension wurden auf jede Seite der Neubauer-

Zählkammer pipettiert. Danach wurde unter dem Mikroskop je ein großes Quadrat mit 4 x

4 kleinen Quadraten, von jeder Seite, mäanderförmig ausgezählt. Von den ausgezählten

Quadraten wurde ein Mittelwert gebildet und mit 104 multipliziert, damit wurde die genaue

Zellzahl pro Milliliter bestimmt. Der Wert 104 ergibt sich aus der Kammertiefe mit 0,1 mm

woraus ein Volumen der großen Quadrate von 0,1 mm3 oder 10-4 ml resultiert. Auf die

Abbildung 8:Schematische Abbildung eines Gewebekulturfilter

In der Abbildung ist ein Gewebekulturfilter schematisch dargestellt, der für die Versuche an der Ussing-Kammer verwendet wurde. Abgebildet ist die apikale und basolaterale Seite des Filters. Der Filter besitzt eine Membran mit einem Durchmesser von 6,5 mm.

apikal

basolateral

6,5 mm

Methoden 33

Filter wurden 1,1 x 105 Zellen ausgesät, maximal jedoch 300 µl der Zellsuspension, da

das Fassungsvolumen apikal ca. 300 µl und basolateral ca. 700 µl beträgt. Nachdem das

Volumen der Zellsuspension bekannt war, wurde die fehlende Menge bis zu 300 µl apikal

und 700 µl basolateral in die Filter und Wellplatte vorgelegt.

Abbildung 9: Schematische Abbildung einer Neubauer-Zählkammer

Bei der verwendeten Zählkammer sind zwei von dem hier abgebildeten Quadrat vorhanden. Es wurden je ein blau markiertes Quadrat mäanderförmig ausgezählt, der Mittelwert gebildet und mit 10

4 Multipliziert, um die

genaue Zellzahl pro Milliliter zu erhalten (verändert nach: www.zaehlkammer.de am 31.07.2013).

Nach der Aussaat erfolgte bei den Filtern der erste Mediumwechsel nach zwei Tagen.

Das Medium wurde vollständig apikal und basolateral abgesaugt und danach wurde auf

beiden Seiten mit 37°C warmen 1 x PBS gewaschen. Anschließend wurde apikal 300 µl

und basolateral 700 µl Kulturmedium zu den Zellen gegeben. Beim Medienwechsel und

dem Waschschritt ist darauf zu achten nicht die Membran zu beschädigen. Die weitere

Behandlung der Filter ist in Abschnitt 3.1.3 „Kultivierung und Versorgung der Zellen“

beschrieben.

3.1.9 Inkubation der Zellen mit Dexamethason

Für die Inkubation von Dexamethason wurde das Medium in den Zellkulturflaschen

(Proteinisolation) und den Filtern (elektrophysiologische Messungen) vollständig

abgesaugt. Die Zellkulturflaschen wurden wie in Abschnitt 3.1.4 beschrieben mit 1 x PBS

gewaschen. Dann wurde den Zellen 1 µM Dexamethason (mit Kulturmedium angesetzt)

hinzugegeben. Die Filter wurden ebenfalls mit 1 x PBS gewaschen. Anschließend wurde

den Zellen apikal 1 µM Dexamethason (mit Kulturmedium angesetzt) und basolateral 700

µl 37°C warmes Kulturmedium hinzugegeben. Zum Schluss wurde zu den Zellen apikal

5,88 µl Dexamethason hinzugegeben. Die behandelten Zellen wurden 3 h, 24 h oder als

34 Methoden

Kontrolle ohne Dexamethason vor der elektrophysiologischen Messung an der Ussing-

Kammer und vor der Proteinisolation inkubiert.

3.2 Elektrophysiologie

Mit Hilfe der elektrophysiologischen Messungen an der Ussing-Kammer wurde in dieser

Arbeit der transepitheliale Amilorid-sensitive Na+-Strom gemessen und somit kann eine

funktionale Aussage über die Aktivität des ENaC im Zusammenhang mit Dexamethason

getroffen werden. Alle verwendeten Lösungen wurden vor den Messungen auf 37°C

erwärmt. Die Zusammensetzungen der verwendeten Lösungen sind dem Materialteil zu

entnehmen. Nähere Erläuterungen zum Aufbau der Ussing-Kammer sind im folgenden

Abschnitt 3.2.1 beschrieben.

3.2.1 Die Ussing-Kammer

Mittels der 1951 entwickelten Apparatur des dänischen Zoologen Hans Ussing, kann der

transepitheliale Strom und Widerstand von Epithelien ermittelt werden [Ussing und

Zerahn, 1951]. Der transepitheliale Widerstand (Rt) beschreibt die Dichte des Epithels in

Ω*cm2. Der Transport über das Epithel wird als transepithelialer Stromfluss dargestellt.

Um den transepithelialen Widerstand und Stromfluss messen zu können, ist die Kammer

in zwei Hälften geteilt. Die zwei Kammerhälften können z.B. von einem Filter, voneinander

getrennt werden. Der apikalen als auch der basolateralen Seite der Zellen auf der

Membran können verschiedenen Lösungen hinzugefügt werden. Durch die Ausbildung

von tight junctions zwischen den Zellen wird ermöglicht, dass überwiegend nur der

Transport von Ionen durch die Zellen gemessen wird (transzellulär). Zwei gewebsnahe

Spannungselektroden messen die transepitheliale Spannung (Vt). Diese wird durch

Strom, der durch zwei gewebsferne Stromelektroden appliziert wird, auf null gehalten. Bei

dem applizierten Strom spricht man von einem sogenannten Kurzschlussstrom (ISC, short

circum current). Dieser gibt den Ionentransport über das Epithel wieder. Der benötigte,

ausgleichende Kurzschlussstrom wird über eine Voltage Clamp errechnet und der

ermittelte Wert an ein bestimmtes Computerprogramm, ImpDsp 1.4 (Prof. Dr. W. van

Driessche, Leuven, Belgien) über eine dazugehörige Hardware übermittelt und

dargestellt.

Methoden 35

In dieser Arbeit wurde mit einer modifizierten Ussing-Kammer gemessen, die neben der

Messung des Kurzschlussstroms (ISC) in µA/cm2, sowohl die der Kapazität (Ct) in µF/cm2

als auch die der Leitfähigkeit (Gt) in mS/cm2 aufzeichnet. Die Kapazität gibt bei der

Messung ein Maß über die Membranoberfläche wieder. Ein Faktor für den Einfluss auf die

Membranoberfläche ist die Exo- und Endozytose der Zellen. Durch das Hinzugeben

spezieller Substanzen kann die Exo- und Endozytose der Zellen so verändert werden,

dass dies durch die Kapazität wiedergegeben werden kann. Der im oberen Abschnitt

erwähnte Widerstand (Rt) kann mittels des reziproken Wertes der Leitfähigkeit errechnet

werden. Der Aufbau einer Ussing-Kammer ist in der Abbildung 10 schematisch

dargestellt.

Abbildung 10: Schematischer Aufbau einer Ussing Kammer

Das verwendete Epithel, welches auf der Membran sitzt, trennt die apikale Kammerhälfte von der basolateralen Seite. Über die dargestellten Zuläufe werden verschiedene Lösungen hinzugegeben und über die Abläufe wieder abgepumpt. Die Spannungselektroden sind gewebsnah und messen die transepitheliale Spannung. Die Stromelektroden sind gewebsfern und applizieren den Kurzschlussstrom (verändert nach http://users.telenet.be/ep-devices/EPD Ussing chamber - Costar filters.pdf am 14.07.2013)

36 Methoden

3.2.2 Verlauf einer Messung in der Ussing-Kammer

Nach 8-9 Tagen wurden die Filter, auf denen zuvor die Zellen ausgesät wurden, in der

Ussing-Kammer gemessen. Das Wachstum der Zellen wurde täglich unter einem

Lichtmikroskop beobachtet. Werden die Zellen zu früh gemessen, haben sich meist noch

keine Monolayer ausgebildet und man kann oft Lücken zwischen den Zellen auf der

Membran beobachten. Eine zu späte Messung, würde ein mehrschichtiges Wachstum der

Zellen fördern.

Nach Einsetzen des Filters wurden die Zellen sofort apikal und basolateral mit einer

physiologischen Ringerlösung (Zellkulturringer) perfundiert, um ein Austrocknen der

Membran zu vermeiden. Basolateral wurden die Zellen die ganze Messung über mit

Zellkulturringer perfundiert. Nach Stabilisierung der Kapazität, der Leitfähigkeit und des

Kurzschlussstroms, wurden apikal verschiedenen Lösungen hinzugegeben. Es war darauf

zu achten, dass sich immer stabile Werte der Messparameter einstellten, bevor eine neue

Lösung den Zellen hinzugefügt wurde. Als erstes wurde den Zellen Amilorid (100 µM in

Zellkulturringer) hinzugegeben, um den Amilorid-sensitiven Na+-Strom durch den ENaC

zu messen. Damit der Amilorid-sensitive Na+-Strom nach der Messung ausgewertet

werden konnte, wurde als nächster Schritt den Zellen Na+-freie Ringerlösung

hinzugegeben und somit der Na+-Strom über das Epithel gehemmt. Als nächsten Schritt

wurden die Zellen wieder mit Zellkulturringer perfundiert. Um nur den Amilorid-sensitiven

Na+-Strom, der durch die δ-ENaC UE erfolgt, zu messen, wurde den Zellen im nächsten

Schritt der Azofarbstoff Evans-Blue (300 µM in Zellkulturringer) hinzugegeben. Evans-

Blue blockiert die δ-ENaC UE. Um den δ-ENaC UE Anteil am gesamten Amilorid-

sensitiven Strom ermitteln zu können, wurde den Zellen als nächstes Evans Blue mit

Amilorid, in den gleichen Konzentrationen wie zuvor, hinzugegeben. Es wurde erneut Na+-

freier Zellkulturringer hinzugefügt. Im letzten Schritt wurden die Zellen wieder mit

Zellkulturringer perfundiert, um die Ausgangswerte zu erhalten und auch die Reversibilität

der Parameter zu zeigen. Die nicht mit Dexamethason inkubierten Zellen dienten als

Kontrollzellen für die 3 h und 24 h inkubierten Zellen und wurden ebenso behandelt.

3.2.3 Auswertungen der Ussing-Kammer Messungen

Die Auswertungen und Abbildungen der Messungen an der Ussing-Kammer wurden mit

dem Programm OriginPro 6.1 durchgeführt. Für die Abbildungen der Messreihen mussten

die Messdaten in kompatible Daten für das Programm umgeschrieben werden. Für die

weitere Auswertungen der unterschiedlich behandelten Zellen, wurden zunächst absolute

Werte, für den Amilorid-sensitiven Na+-Strom, der über den ENaC erfolgt und für den

Methoden 37

gesamt Na+-Strom, berechnet. Die absoluten Werte für den Amilorid-sensitiven Na+-Strom

über den ENaC wurden durch die Differenz zwischen dem ISC des Zellkulturingers und

des ISC des Amilorids in Relation zum ISC des Na+-Stroms berechnet. Ähnlich wurde der

gesamt Na+-Strom berechnet, durch die Differenz des ISC des Zellkulturringers und des ISC

des Na+-freien Zellkulturringers. Mittels der absoluten Werte, konnte der prozentuale

ENaC-Stromanteil (% ENaC Anteil) bezogen auf den Gesamt Na+-Strom, berechnet

werden. Zusätzlich wurden die Mittelwerte der Leitfähigkeit mit Standardfehler wie

Kapazität mit Standardfehler ermittelt und beschrieben. Die Anzahl gemessener Filter sind

in den Abbildungen mit n gekennzeichnet.

3.3 Protein Analyse

Durch die proteinbiochemischen Analysen können quantitative Aussagen bezüglich des

ENaC getroffen werden. Dafür wurde zunächst eine Proteinisolation der Zellen mit

verschiedenen Inkubationszeiten mit Dexamethason durchgeführt. Anschließend wurden

die Proteine über eine diskontinuierliche SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-

PAGE) aufgetrennt und mittels einer Western Blot Analyse mit folgender Antikörper

Inkubation behandelt. Durch die Detektion kann eine Aussage über die Expression von

ENaC im Zusammenhang mit Dexamethason getroffen werden. Die Zusammensetzungen

der verwendeten Lösungen sind dem Materialteil zu entnehmen.

3.3.1 Proteinisolation von CFBE41o-- und 16HBE14o--Zellen

Nachdem die Zellen eine Konfluenz von 80-90 % in einer T-75 Flasche erreicht hatten,

wurde eine Proteinisolation von drei unterschiedlich behandelten Zellansätzen

durchgeführt. Zum einen Zellen ohne Inkubation mit Dexamethason als Kontrolle, zum

anderen Zellen, die 3 h und 24 h mit 1 µM Dexamethason inkubiert wurden. Als die

gewünschte Konfluenz erreicht wurde, wurden die Zellen auf Eis gestellt und das

Kulturmedium abgesaugt. Die folgenden Schritte wurden auf Eis durchgeführt, falls nicht

anders beschrieben. Die Zellen wurden danach mit 10 ml eiskalten 1 x PBS gewaschen.

Abschließend wurde den Zellen 700 µl 2%iger Tritonlysispuffer, zu dem zuvor 1%

Proteaseinhibitor hinzugegeben wurde, um eine Degradation der Proteine zu vermeiden,

hinzugegeben. Danach wurden die Zellen mit einem Zellschaber abgekratzt, eventuelle

Luftblasenbildung sollte vermieden werden. Die entstandene Zellsuspension wurde in ein

2 ml-Reaktionsgefäße überführt. Die Zellsuspension wurde in ein 2 ml-Reaktionsgefäße

3 x für 2 Sekunden sonifiziert. Danach wurden die aufgeschlossenen Zellen 10 min auf

Eis inkubiert und anschließend für 30 min bei 4000 x g bei 4°C zentrifugiert. Anschließend

38 Methoden

wurde der Überstand in neue 2 ml-Reaktionsgefäße überführt und die Proteinlysate in

flüssigen Stickstoff schockgefroren. Die Stocklösungen werden bei -80°C aufbewahrt.

3.3.2 Bicinchoninsäuretest (BCA-Test)

Diese Methode dient zur Messung von Proteinkonzentrationen. In dieser Arbeit wurden

unterschiedlich mit Dexamethason behandelten CFBE41o-- und 16HBE14o--Zellen mittels

dieser Methode untersucht.

Bei dem BCA-Test handelt es sich um eine Methode, bei der zweiwertige Cu2+-Ionen in

Anwesenheit von Proteinen in einer alkalischen Lösung zu einwertigen Cu+-Ionen

reduziert werden. Diese bilden in Zusammenhang mit Bicinchoninsäure einen violetten

Farbkomplex [Smith et al., 1985]. Mittels eines Photometers können die Proteinmengen

anhand der Farbreaktion bei 562 nm gemessen werden. Die gemessene Absorption ist

proportional der Proteinkonzentration. Um die genaue Proteinkonzentration bestimmen zu

können, wurde eine Messung mit definierten Proteinkonzentrationen von

Kälberserumalbumin durchgeführt. Anhand der so entstandenen Eichgerade konnten nun

die genauen Proteinkonzentrationen der drei unterschiedlich behandelten Proteinlysaten

berechnet werden. Die genaue Durchführung des BCA-Tests ist dem Handbuch des

verwendeten Kits, Pierce® BCA Protein Assay Kit von Thermo Scientific Inc. (Rockford,

Illinois, USA), zu entnehmen. Die Proteinlysate wurden in einer 1:10 und 1:20

Verdünnungen gemessen.

3.3.3 Diskontinuierliche SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)

Durch die diskontinuierliche SDS-Gelelektrophorese wird ermöglicht, dass Proteine

unabhängig von ihrer Eigenladung nur nach ihrem Molekulargewicht in einem elektrischen

Feld aufgetrennt werden [Laemmli, 1970]. Damit die Eigenladung vernachlässigt werden

kann, wurden bei dieser Methode die Proteinlysate mit SDS (engl. Sodium dodecyl sulfate

= Natriumdodecylsulfat) behandelt. SDS ist ein Detergenz, welches sich an die

hydrophoben Aminosäuren des Proteins anlagert und eine große anionische Kopfgruppe

bildet. Dadurch erlangt das ganze Protein eine negative Gesamtladung. Durch den Zusatz

an Dithiothreitol (DTT) werden inter- und intramolekulare Disulfidbrücken denaturiert.

Das SDS-Gel besteht aus zwei unterschiedlichen Gelen, Sammel- und Trenngel, die sich

in ihrem pH-Wert und ihrer Porengröße unterscheiden. In Abbildung 11 wird das SDS-Gel

genauer beschrieben.

Methoden 39

Durch das 3,9%ige Sammelgel wird die Fokussierung der Proteine in scharfe Banden

erreicht und die Proteine können im 7,5%igen Trenngel nach ihrem Molekulargewicht

aufgetrennt werden. Nach der Auftrennung der SDS-Proteinkomplexe können diese

anschließend im Gel mit verschiedenen Färbemethoden, z.B. durch eine Coomassie-

Färbung sichtbar gemacht werden.

Von den gemessenen Proben wurden 40 µg aufgetragen. Die berechneten Mengen

wurden mit 4 x Probenpuffer mit DTT 10% versetzt und mit Lysispuffer auf das

entsprechende Endvolumen aufgefüllt. Die vorbereiteten Proben wurden anschließend bei

95°C für 5 min im Wasserbad denaturiert. Anschließend wurden die Proben auf das SDS-

Gel, welches zuvor in eine SDS-Gel-Elektrophoresekammer eingespannt und diese mit

Elektrophorese-Laufpuffer gefüllt wurde, aufgetragen. Zusätzlich wurden 8 µl von dem

Abbildung 11: Auftrennung von Proteinen in diskontinuierlichen Polyacrylamidgelen

Im großporigen Sammelgel mit einem pH-Wert von 6,8 ordnen sich die SDS-Proteinkomplexe zwischen den voraus-laufenden Chloridionen (Leitionen) und den Glycinionen (Folgeionen) an. Die Glycinionen liegen bei diesem pH als Zwitterionen mit einer Nettoladung von Null vor. Das Glycin erhält in dem kleinporigen Trenngel mit einem pH-Wert von 8,8 eine negative Gesamtladung und überholt die SDS-Proteinkomplexe, wodurch der Sammeleffekt aufgehoben wird. Somit trennen sich die SDS-Protein-Komplexe nach ihrer molekularen Masse auf (verändert nach: http://www.immunbiologie.uni-bonn.de/juergen/MinMap/Uni-Bonn/PAGE-Dateien/image002.jpg am 14.07.2013).

40 Methoden

Marker PageRulerTM Prestained Protein Ladder, um die spätere Größe der detektierten

Banden bestimmen zu können, aufgetragen (siehe Abbildung 12). Die SDS-Gel-

Elektrophoresekammer wurde auf 30 mA und maximaler Spannung eingestellt.

3.3.4 Proteintransfer auf eine PVDF-Membran

Es wurde mit dem SDS-Gel aus Abschnitt 3.3.3 weiter verfahren. Nach Beenden der

Gelelektrophorese, wurden die Proteine vom Gel auf eine PVDF-Membran in einer

semidry Transferkammer für 25 min bei 5 mA/cm2 und maximaler Spannung transferiert.

In der nächsten Abbildung ist schematisch dargestellt, wie der Western Blot aufgebaut

wurde.

Abbildung 12: Darstellung des verwendeten Markers

Der PageRulerTM

Prestained Protein Ladder ist für 4-20%ige Tris-Glycin SDS-Gele geeignet. Der Marker hat Referenzbanden von ca. 10-170 kDa. Mit einer Größe von ca. 70 kDa hebt sich eine rot gefärbte Bande deutlich von den anderen ab und ermöglicht eine erleichterte Auswertung (verändert nach: http://www.piercenet.com/browse.cfm?fldID=717EAB22-C50E-319F-D227-C1EB41C4343C).

Abbildung 13: Aufbau eines semidry Western Blots

Wie in der Abbildung gezeigt wurden die Filterpapiere, das SDS-Gel und die Membran in einer Transferkammer für einen semidry Transfer aufgebaut. Der Blot wurde aufgebaut, indem 5 Filterpapiere, die Membran, das Gel und danach noch einmal 5 Filterpapiere von unten nach oben aufeinander gelegt wurden. Zuvor wurden die Filterpapiere und das SDS-Gel in Transferpuffer eingetaucht und angefeuchtet. Bevor die Membran auf die Filterpapiere gelegt wurde, wurde diese als erstes in Methanol inkubiert und dann ebenfalls in Transferpuffer eingetaucht (verändert nach: http://www.rndsystems.com/DAM_public/5598.gif).

5x Filterpapier

5x Filterpapier

SDS-Gel PVDF-Membran

ANODE (+)

KATHODE (-)

Methoden 41

3.3.5 Coomassie-Färbung des SDS-Gels

Das Gel wurde nach dem Transfer der Proteine auf eine PVDF-Membran in Coomassie-

Brilliant-Blue für 1 h geschüttelt. Danach wurde das Gel ü.N. in Entfärbelösung auf einem

Schüttler entfärbt. Nachdem Entfärben des Gels wird dieses für 15 min in Fixierlösung

inkubiert. Das Gel wird nach dem Fixieren in Millipore-H2O aufgehoben und mittels eines

Scanners digitalisiert. Anhand dieses Gels kann kontrolliert werden, ob bei dem Transfer

die Proteine vollständig auf die PVDF-Membran transferiert worden sind.

3.3.6 Coomassie-Färbung der PVDF-Membran

Die PVDF-Membran wurde in Coomassie-Brilliant-Blue für 1 min geschüttelt. Hierbei

konnte Coomassie-Brilliant-Blue reversibel die membrangebundenen Proteine anfärben.

Danach wurde die Membran in einer Entfärbelösung für ca. 5-10 min auf einem Schüttler

entfärbt. Durch das Anfärben der PVDF-Membran mit Coomassie-Brilliant-Blue, konnte

nach dem Entfärben der PVDF-Membran geprüft werden, ob die Proteine bei dem

Transfer auf die PVDF-Membran überführt wurden.

3.3.7 Proteinnachweis durch Antikörper

Nach dem Transfer der Proteine auf die PVDF-Membran, können diese mittels indirekter

Immundetektion nachgewiesen werden. Dazu wurde die Membran in 5%iger

Milchpulverlösung in TBS-Puffer mit Tween (TBST) für 2-3 h bei RT blockiert. Bei diesem

Schritt werden die freien Bindungsstellen auf der Membran blockiert und somit die

Möglichkeit verringert, dass der Antikörper unspezifisch bindet. Danach wurde die PVDF-

Membran ü.N. bei 4°C auf einem Rollinkubator mit dem Primärantikörper (siehe Anlagen)

inkubiert. Der Primärantikörper wurde wie in den Anlagen beschrieben mit einer 5%igen

Milchpulverlösung in TBST verdünnt (α-ENaC 1:1250, δ-ENaC 1:200 und α-Tubulin

1:200). Nach der Inkubation mit dem Primärantikörper wurde die Membran 3 x für 10 min

mit TBST gewaschen. Danach erfolgte eine Inkubation mit dem Sekundärantikörper

(siehe Anlagen). Diese Inkubation für die Untersuchung des α-Tubulin Proteins dauerte 2

h, wohingegen die Inkubation bei der Untersuchung von α- und δ-ENaC 1 h betrug. Der

Sekundärantikörper wurde 1:10000 in 5%igen Milchpulverlösung in TBST verdünnt (siehe

Anlagen). Anschließend wurde die Membran erneut 3 x für 10 min mit TBST gewaschen.

Bei dem letzten Schritt vor der Detektion wurde die Membran 5 min mit TBS gewaschen.

Um zu zeigen, dass die Antikörper spezifisch binden, wurde für den spezifisch gegen δ-

ENaC gerichteten Antikörper als Positivkontrolle die Zelllinie MIA PaCa-2 (50 µg

42 Methoden

Gesamtprotein) aufgetragen. MIA PaCa-2 wird vom Hersteller des Antikörpers (Santa

Cruz) als Positivkontrolle Empfohlen. Diese Zellen sind humane Pankreaskarzinomzellen,

in denen die Expression der δ-ENaC UE nachgewiesen ist. Der spezifisch gegen α-ENaC

gerichtete Antikörper wurde mit einem neutralisierenden Peptid (PEP-088; Dianova)

inkubiert und diente als Negativkontrolle. Hierfür wurde das Peptid mit dem Antikörper

(3:1) für 15 h bei 4°C in 3 ml 5%iger Milchpulverlösung inkubiert und die Membran wurde

anschließend wie oben beschrieben ü.N. mit dieser Lösung behandelt. Der weitere

Verlauf ist wie im oberen Abschnitt beschrieben.

3.3.8 Detektion durch Enhanced Chemilumineszenz (ECL)

Nach der Antikörperbehandlung, die in Abschnitt 3.3.7 beschrieben wird, wurde die

PVDF-Membran in eine große Petrischale (Ø = mm) gelegt und 3 ml der ECL Lösung A

und 3 ml von der ECL Lösung B aus dem Kit, Super Sigal® West Pico Chemiluminescent

Substrat, hinzugegeben. Dieses Gemisch enthält Luminol und die Membran wurde 3 min

in diesem inkubiert. Durch die Oxidation des Luminols, durch die an den Antikörper

gekoppelte Peroxidase, konnte eine Detektion von den Proteinen mittels dem Imager

Fusion-SL Advance von PeQlab, nach unterschiedlichen Expositionszeiten, durchgeführt

und ausgewertet werden.

3.3.9 Auswertung der Western Blot Analysen

Die mittels des Imager, Fusion-SL Advance von Peqlab, ermittelten Ergebnisse wurden

densiometrisch mit dem Computerprogramm Image J 1.45s (National Institutes of Health,

USA) hinsichtlich der Farbdichte der einzelnen Banden analysiert. Dabei wurden die

analysierten Messwerte, die von den Kontrollen gemessen wurden, auf 100 % gesetzt.

Die analysierten Messwerte der 3 h und 24 h mit Dexamethason behandelten Zellen

konnten anschließend mittels dem Computerprogramm OriginPro 6.1 (Origin Lab

Cooperation, Northamton, Massachusetts, USA) in Relation zu den Kontrollen normalisiert

und ausgewertet werden. Dieses gab Aufschluss über die genaue prozentuale Steigung

oder Abfall der Expression der mit Dexamethason inkubierten Zellen. Die ausgewerteten

Daten werden jeweils mit dem Mittelwert ± standard error of the mean (SEM) dargestellt.

Die Anzahl der durchgeführten Proteinisolationen ist in N und die der durchgeführten

Western-Blot Analysen in n in den Abbildungen dargestellt.

Ergebnisse 43

4 Ergebnisse

Im Rahmen dieser Masterarbeit wurde die Dexamethasonwirkung auf die humanen

Bronchialepithelzellen CFBE41o-- und 16HBE14o- mittels proteinbiochemischer und

elektrophysiologischer Methoden untersucht. Zunächst wurde ein Mykoplasmentest der

Zellen durchgeführt, um eine Kontamination mit Mykoplasmen auszuschließen. Die

humanen Bronchialepithelzellen eignen sich sowohl für die proteinbiochemischen, als

auch die elektrophysiologischen Methoden, da diese einfach zu kultivieren sind und

polare Monolayer ausbilden.

4.1 Mykoplasmentest

Der Mykoplasmentest dient zur Untersuchung der Zellen auf eine Kontamination durch

Mykoplasmen. Durch die geringe Größe der Mykoplasmen von ca. 0,3-2 µM, können

diese weitgehend ungehindert in die Zellen eindringen. Da noch nicht genau bekannt ist,

inwieweit Mykoplasmen in die Regulationsmechanismen der Zellen einwirken, jedoch,

dass das Wachstum verlangsamt wird, ist eine Mykoplasmenkontamination unbedingt zu

vermeiden. Sollte eine Zelllinie dennoch mit Mykoplasmen kontaminiert sein, sollte diese

verworfen und durch nicht kontaminierte Zellen neu aufgebaut werden.

Der Abbildung 14 ist zu entnehmen, dass die CFBE41o-- und 16HBE14o--Zelllinien nicht

mit Mykoplasmen kontaminiert waren. Auf die Gele wurden Zelllysate der CFBE41o-- und

16HBE14o--Zellen sowie H2O als Negativkontrolle, als auch eine Positivkontrolle

aufgetragen. Diese enthielt DNA-Fragmenten des Mykoplasma oral-Genoms und war

dem Kit beigefügt. Die CFBE41o-- und die 16HBE14o--Zellen, sowie die Negativkontrolle,

weisen eine Größe von 191 bp auf. Bei der Positivkontrolle ist eine doppelte Bande von

191 und 270 bp zu beobachten. Die Bande bei 191 bp zeigt einen negativen Nachweis für

Mykoplasmen. Die 270 bp große Bande zeigt einen positiven Nachweis für mit

Mykoplasmen kontaminierte Zellen. Die weitere Kultivierung, als auch die

elektrophysiologischen und biochemischen Methoden konnten nach erfolgreichem

Mykoplasmentest weitergeführt werden.

44 Ergebnisse

4.2 Elektrophysiologische Messungen

Für die elektrophysiologischen Messungen in der Ussing-Kammer wurden die Zellen

(1,1 * 105) auf speziellen Filtern ausgesät. Auf diesen wuchsen die Zellen innerhalb von 7-

8 Tagen zu konfluenten Monolayern. Durch die Beobachtung der Filter mit Hilfe eines

Lichtmikroskops, konnte festgestellt werden, dass das optimale Wachstum nach 8 Tagen

erreicht worden war und die Filter einen sehr guten Widerstand für die Messung an der

Ussing-Kammer besaßen. Die Zellen wurden 3 h und 24 h vor den Messungen mit

Dexamethason inkubiert. Danach wurde eine Messung wie in Abschnitt 3.2.2 beschrieben

durchgeführt. In den folgenden Abbildungen werden je zwei Zeitverläufe zur Erfassung

des Kurzschlussstroms der Kontrollmessungen dargestellt. Die weiteren Abbildungen der

3 h und 24 h mit Dexamethason behandelten Zellen sind den Anlagen beigefügt. Bei jeder

Messung wurde eine Doppelbestimmung der Filter durchgeführt und die Ergebnisse für

die weitere Auswertung gemittelt. Die gemittelten Messdaten der absoluten Werte für die

Kurzschlussstrom-Messungen, für Amilorid und Na+-freien Ringer, sind den Anlagen zu

A) B)

Abbildung 14: Mykoplasmentest von CFBE41o--Zellen

In Abbildung A wurde ein Zelllysat der CFBE41o--Zellen, eine Positivkontrolle und als

Negativkontrolle H2O, auf ein 1,5%iges Agarosegel aufgetragen. In Abbildung B wurde anstatt des Zelllysats der CFBE41o

--Zellen ein Zelllysat der 16HBE14o

--Zellen auf ein 1,5%iges Agarosegel

aufgetragen. Zudem wurde die gleiche Negativ- und Positivkontrolle wie in Abbildung A verwendet. Um die Größe der Banden zu identifizieren, wurde auf beide Agarosegele der Fast + Ruler

TM Low

Range DNA Ladder aufgetragen. In den Abbildungen A und B sieht man sowohl bei den CFBE41o

-- und 16HBE14o

--Zellen, als auch der Negativkontrolle eine Bande bei 191 bp. Die

Positivkontrolle weist eine Bande bei 191 bp und bei 270 bp auf.

Ergebnisse 45

entnehmen. Den Abbildungen 16 und 18 ist die Dexamethasonwirkung auf die

unterschiedlich behandelten Zellen zu entnehmen.

4.2.1 Elektrophysiologische Messungen der CFBE41o- Zellen mit und ohne Dexamethasonbehandlung

Zur Untersuchung an der Ussing Kammer dienten unbehandelte CFBE41o--Zellen als

Kontrollen, diese wurden 7-8 Tage nach der Aussaat gemessen. Da bei den Zellen in

früheren Arbeiten kein stabiler Na+-Strom durch den ENaC festgestellt worden war

[Lemke, 2012], wurde kein exaktes Ergebnis für die Kontrollzellen erwartet. Bei den

Kontrollmessungen der CFBE41o--Zellen war ein Absinken des Kurzschlussstroms nach

Hinzugeben von Amilorid zu sehen. Jedoch reagierten die Zellen sehr unterschiedlich auf

Amilorid (siehe Abbildung 15). Auch das weitere, erwartete Absinken des

Kurzschlussstroms, nach Hinzugeben von Na+-freiem Ringer, war zu beobachten. Die

Reversibilität von Amilorid wurde durch das Hinzugeben von Zellkulturringer, nach der

Messung mit Na+-freiem Ringer, dargestellt. Die Abbildung 15 zeigt zwei Zeitverläufe der

CFBE41o--Zellen. In dem Zeitverlauf A ist eine stärkere prozentuale Amiloridantwort, von

39,33%, als bei dem Zeitverlauf B, mit 11,11%, zu sehen. Diese Ergebnisse weisen auf

den nicht-stabilen Na+-Strom hin, der vor den Messungen in früheren Arbeiten ermittelt

worden war [Lemke, 2012]. Der gemittelte prozentuale ENaC-Strom der gemessenen

Filter der CFBE41o--Zellen beträgt 21,67 ± 2,56%. Der Widerstand der gemittelten

Initialwerte liegt bei 213,15 ± 11,99 Ω*cm2 und die der Kapazität bei 1,22 ± 0,02 µF.

46 Ergebnisse

Abbildung 15: Messverlauf von CFBE41o--Zellen ohne Dexamethason-Inkubation

(Kontrollmessungen)

In der Abbildung ist der zeitliche Verlauf von zwei Ussing-Kammer Messungen von CFBE41o--

Zellen ohne Dexamethasonbehandlung dargestellt. Auf der y-Achse ist der gemessene Kurzschlussstrom (ISC) in µA/cm

2 gegen die Zeit in min auf der x-Achse aufgetragen. In den

Abbildungen werden die verschiedenen Lösungen dargestellt, die den Zellen während der Ussing-Kammer Messungen, apikal hinzugegeben wurden. Zeitverlauf A zeigt eine stärkere Amiloridantwort mit 39,33% als Zeitverlauf B mit 11,11%.

B)

A)

Ergebnisse 47

Die Vorbereitung der 3 h lang mit Dexamethason behandelten Zellen, sowie die

anschließenden Messungen erfolgten wie bei den unbehandelten Zellen. Der Unterschied

lag hier in der 3-stündigen Vorbehandlung der Filter mit Dexamethason. Bei diesen

Messungen erwartete man einen größeren prozentualen ENaC-Strom durch den

stimulierenden Effekt des Glucocorticoids Dexamethason. Wie in den Zeitverläufen der

unbehandelten Zellen ist bei den CFBE41o--Zellen, die 3 h mit Dexamethason behandelt

wurden, eine deutliche Antwort auf Amilorid und eine stärkere Antwort auf Na+-freien

Ringer festzustellen. Im Vergleich zu den Kontrollmessungen ist die Amiloridantwort der

mit 3 h Dexamethason behandelten Zellen nicht viel stärker. Der gemittelte prozentuale

ENaC-Strom der CFBE41o--Zellen beträgt 25,17 ± 3,07%. Die gemittelten Initialwerte für

den Widerstand und die Kapazität betragen 264,73 ±18,1 Ω*cm und 1,21 ± 0,02 µF. Auch

nach einer 24 h Inkubation mit Dexamethason der CFBE41o--Zellen ist eine deutliche

Antwort auf Amilorid und eine sehr starke Antwort auf Na+-freien Ringer festzustellen.

Diese Zellen weisen im Vergleich zu den Kontrollmessungen eine leicht stärkere

Amiloridantwort gegenüber den Kontrollmessungen auf. Der gemittelte prozentuale

ENaC-Strom liegt bei 25,21 ± 2,29%. Die gemittelten Initialwerte für den Widerstand und

der Kapazität betragen 256,95 ±21,1 Ω*cm und 1,14 ± 0,05 µF.

In der folgenden Tabelle sind die gemittelten Initialwerte des Kurzschlussstroms (ISC), der

Leitfähigkeit (Gm), der Kapazität (Cm) und des Widerstands (Rt) aufgetragen. In allen

Messdaten sind nur geringe Schwankungen zu erkennen. Jedoch fällt auf, dass die

Kapazitätswerte umso geringer wurden, je länger die Zellen mit Dexamethason inkubiert

waren. Die Werte der Kapazität liefern Aufschluss über mögliche endo- und exozytotische

Proßesse, die über die Zellmembran abgelaufen sind. Zudem gibt der transepithelial

gemessene Widerstand Information über die Dichte des Epithels und inwieweit

parazellulärer Ionenfluss über das Epithel stattfinden konnte.

Tabelle 13: Mittelwerte der Initialwerte mit Standardfehler der CFBE41o--Zellen

Zellen Anzahl der

Filter ISC [µA/cm2]

Gm

[mS/cm2] Cm [µF] Rt [Ω*cm]

CFBE41o-

Kontrolle 24 4,42 ± 1,74 5,16 ± 0,35 1,22 ± 0,02

213,15 ± 11,99

CFBE41o-

3 h Dex 22 2,72 ± 0,99 4,3 ± 0,36 1,21 ± 0,02

264,73 ±18,1

CFBE41o-

24 h Dex 25 3,98 ± 0,32 4,46 ± 0,32 1,136 ± 0,05

256,95 ± 21,1

48 Ergebnisse

Um den prozentualen ENaC-Strom der behandelten CFBE41o--Zellen zu den

Kontrollmessungen zu vergleichen, wurden die Zellen mit dem Statistikprogramm

OriginPro analysiert und die Ergebnisse gegenübergestellt. In den Ergebnissen der mit

Dexamethason behandelten Zellen verglichen zu den Kontrollmessungen ist kein

signifikanter Unterschied vorhanden. Jedoch ist bei den Zellen, die 3 h und 24 h mit

Dexamethason behandelt wurden, eine Tendenz mit einer leichten Steigerung in dem

gemessenen ENaC-Strom zu erkennen. Die unbehandelten Zellen weisen einen

prozentualen ENaC-Strom von 21,67 ± 2,56% auf. Bei den 3 h und 24 h mit

Dexamethason behandelten Zellen liegt der prozentuale ENaC-Strom bei 25,17 ± 3,07%

und 25,21 ± 2,29%.

Abbildung 16: Gegenüberstellung der unterschiedlich mit Dexamethason behandelten CFBE41o

--Zellen

In der Abbildung ist der gemittelte prozentuale ENaC-Stromanteil von den Kontrollmessungen und den 3 h und 24 h mit Dexamethason inkubierten Zellen dargestellt. Die Kontrollmessungen weisen, nach 24 gemessenen Filtern, den geringsten prozentualen ENaC-Stromanteil mit 21,67 ± 2,56% auf. Der prozentuale ENaC-Strom der 3 h und 24 h mit Dexamethason behandelten Zellen ist, nach 22 und 25 gemessenen Filtern, fast gleich und liegt bei 25,17 ± 3,07% und 25,21 ± 2,29%. Es konnte bei der Analyse kein signifikanter Unterschied des prozentualen ENaC-Stromanteils im Vergleich zwischen den unterschiedlich behandelten Zellen ermittelt werden.

Ergebnisse 49

4.2.2 Elektrophysiologische Messungen der 16HBE14o--Zellen mit und ohne Dexamethasonbehandlung

Die 16HBE14o--Zellen wurden genauso behandelt und gemessen wie die CFBE41o--

Zellen. Auch die Kontrollmessungen der 16HBE14o--Zellen zeigten ein Absinken des

Kurzschlussstroms nach Hinzugeben von Amilorid. Zu beobachten war, dass die Antwort

auf Amilorid bei jedem Filter unterschiedlich ausfiel (siehe Abbildung 17). Nach dem

Hinzugeben des Na+-freien Ringers war ein weiteres Absinken des Kurzschlussstroms zu

sehen. Durch das Hinzugeben von Zellkulturringer wurde die Reversibilität von Amilorid,

nach der Zugabe von Na+-freiem Ringer, gezeigt. In Abbildung 17 sind zwei Zeitverläufe

als Beispiel dargestellt, die die unterschiedliche funktionale Expression des ENaC-Kanals

zeigen. Im Zeitverlauf A ist eine 23,90%ige Amiloridantwort und in Zeitverlauf B eine

12,75%ige Amiloridantwort beobachtet worden. Auch diese beiden Beispielmessungen

weisen wie die Beispielmessungen der Kontrollmessungen der CFBE41o--Zellen auf den

nicht stabilen ENaC-Strom hin. Die gemessenen Filter der 16HBE14o--Zellen besitzen

einen gemittelten prozentualen ENaC-Strom von 23,42 ± 2,48% und die gemittelten

Initialwerte für den Widerstand und der Kapazität liegen bei 785,3 ± 5,91 Ω*cm und

1,25 ± 0,02 µF.

B) A)

50 Ergebnisse

Abbildung 17: Messverlauf von 16HBE14o--Zellen ohne Dexamethason-Inkubation

(Kontrollmessungen)

Die Abbildung zeigt die zeitlichen Verläufe zweier Ussing-Kammer Messungen der 16HBE14o--

Zellen ohne Dexamethasonbehandlung. Auf der y-Achse ist der gemessene Kurzschlussstrom (ISC) in µA/cm

2 gegen die Zeit in min auf der x-Achse aufgetragen. Der Abbildung kann entnommen

werden welche verschiedenen Lösungen den Zellen während der Ussing-Kammer Messungen apikal hinzugegeben wurden. Zeitverlauf A zeigt mit 23,09% eine stärkere Amiloridantwort als Zeitverlauf B mit 12,75%.

Die Messungen der 16HBE14o--Zellen nach einer 3h und 24 h Inkubation mit

Dexamethason erfolgten wie die der CFBE41o--Zellen. Auch bei den 16HBE14o--Zellen

wurde eine stärkere Amiloridantwort durch die Stimulation des Glucocorticoids

Dexamethason erwartet. Bei den 3 h und 24 h mit Dexamethason inkubierten Zellen war

eine starke Antwort auf Amilorid und eine noch stärkere Antwort auf Na+-freien Ringer zu

beobachten. Verglichen mit den Kontrollmessungen, zeigten die behandelten Zellen, 3 h

und 24 h mit Dexamethason, eine kaum stärkere Amiloridantwort. Die 3 h mit

Dexamethason inkubierten Zellen besitzen einen gemittelten prozentualen ENaC-Strom

von 25,79 ± 2,99% und die, der 24 h mit Dexamethason inkubierten Zellen, einen von

25,88 ± 2,40%. Die gemittelten Initialwerte der 3 h mit Dexamethason behandelten Zellen

des Widerstands und der Kapazität liegen bei 786,83 ± 71,34 Ω*cm und 1,26 ± 0,02 µF.

Die gemittelten Initialwerte des Widerstands und der Kapazität bei den 24 h mit

Dexamethason behandelten Zellen betragen 256,95 ±21,1 Ω*cm und 1,14 ± 0,05 µF.

Die gemittelten Initialwerte des Kurzschlussstroms (ISC), der Leitfähigkeit (Gm), der

Kapazität (Cm) und des Widerstands (Rt) sind in der folgenden Tabelle dargestellt. Anhand

A) B)

Ergebnisse 51

der Tabelle ist zu beobachten, dass je länger die Zellen mit Dexamethason behandelt

wurden die Leitfähigkeit gesunken und somit der Widerstand erhöht war.

Tabelle 14: Mittelwerte der Initialwerte mit Standartfehler der 16HBE14o--Zellen

Zellen Anzahl der

Filter ISC [µA/cm2]

Gm

[mS/cm2] Cm [µF] Rt [Ω*cm]

16HBE14o-

Kontrolle 20 1,99 ± 0,4 1,51 ± 0,16 1,25 ± 0,02

785,3 ± 5,91

16HBE14o- 3 h Dex

24 2,82 ± 0,42 1,52 ± 0,13 1,26 ± 0,02 786,83 ± 71,34

16HBE14o-

24 h Dex 23 2,34 ± 0,47 1,29 ± 0,13 1,27 ± 0,02

979,81 ± 90,17

Die Gegenüberstellung der Messergebisse der unterschiedlich mit Dexamethason

behandelten 16HBE14o--Zellen zeigten wie die CFBE41o--Zellen, nach der Analyse mit

dem Statistikprogramm OriginPro 6.1, keinen signifikanten Unterschied. Die 3 h und 24 h

mit Dexamethason behandelten Zellen weisen eine Tendenz zu einer Erhöhung zu den

Kontrollmessungen auf. So zeigten die Kontrollmessungen einen gemittelten prozentualen

ENaC-Strom von 23,42 ± 2,48% und die 3 h und 24 h mit Dexamethason von

25,79 ± 2,99% und 25,88% ± 2,40%.

52 Ergebnisse

Abbildung 18: Gegenüberstellung der unterschiedlich mit Dexamethason behandelten 16HBE14o

--Zellen

Die Abbildung zeigt den gemittelten prozentualen ENaC-Stromanteil der Kontrollmessungen und der 3 h und 24 h mit Dexamethason behandelten Zellen. Die Kontrollmessungen zeigen nach 21 gemessenen Filtern den geringsten prozentualen ENaC-Stromanteil mit 23,42 ± 2,48%. Die 3 h und 24 h mit Dexamethason inkubierten Zellen besitzen, nach 24 und 23 gemessenen Filtern, einen leicht erhöhten prozentualen ENaC-Stromanteil mit 25,79 ± 2,99 und 25,88 ± 2,40%. Bei der Analyse konnte kein signifikanter Unterschied zwischen den Kontrollmessungen und den mit Dexamethason behandelten Zellen nachgewiesen werden.

4.2.3 Gegenüberstellung der Ussing-Kammer Messwerte der CFBE41o-- und 16HBE14o--Zelllinien

In dem folgenden Abschnitt werden die gemittelten prozentualen ENaC-Stromanteile der

Zelllinien CFBE41o- und 16HBE14o- gegenübergestellt. Dies lässt einen genaueren

Vergleich zwischen den beiden Ziellinien zu und ermöglicht eine Aussage über eine

eventuell unterschiedliche Stimulation des Dexamethasons bei den jeweiligen Zelllinien.

Der prozentuale ENaC-Stromanteil der CFBE41o--Zellen ist insgesamt geringer als bei

den 16HBE14o--Zellen. Es war zu beobachten, dass beide Zelllinien ähnlich stark mittels

des Glucocorticoids Dexamethason stimuliert werden konnten. So wurde der gemittelte

prozentuale ENaC-Strom bei den CFBE41o-- und 16HBE14o--Zellen nach einer 3-

stündigen Inkubation mit Dexamethason um ca. 3,5% und ca. 2,37% erhöht. Nach einer

24-stündigen Inkubation mit Dexamethason der CFBE41o-- und 16HBE14o--Zellen wurde

ein erhöhter gemittelter prozentualer ENaC-Strom von ca. 3,54% und ca. 2,46%

Ergebnisse 53

beobachtet. In der folgenden Abbildung sind die Messdaten der Abbildungen 16 und 18

zum Vergleich des prozentualen ENaC-Stromanteils der beiden Zelllinien CFBE41o- und

16HBE14o- dargestellt.

Abbildung 19: Gegenüberstellung beider Zelllinien

In der Abbildung ist der gemittelte prozentuale ENaC-Stromanteil der Kontrollmessungen und der 3 h und 24 h mit Dexamethason inkubierten CFBE41o

-- und 16HBE14o

--Zellen, dargestellt. Die

CFBE41o--Zellen (cyan) besitzen in den Kontrollmessungen und den 3 h und 24 h mit

Dexamethason behandelten Zellen, einen leicht geringeren prozentualen ENaC-Stromanteil als die der 16HBE14o

--Zellen (blau). Der Unterschied bei den Kontrollmessungen liegt bei 1,75%, bei den

3 h mit Dexamethason inkubierten Zellen bei 0,62% und bei den 24 h mit Dexamethason behandelten Zellen bei 0,67%.

4.3 Proteinbestimmung

4.3.1 Western Blot Analyse zur Untersuchung der Expression von α- und δ-ENaC Untereinheiten

Die α- und δ-ENaC Proteinexpression der CFBE41o-- und 16HBE14o--Zellen sollten

mittels 1 µM Dexamethason erhöht und mittels Western Blot Analyse untersucht werden.

Hierfür wurden die Zellen beider Zelllinien auf Zellkulturfalschen kultiviert, auf denen diese

konfluente Monolayer bilden konnten (Abschnitt 3.3.1). Die Inkubation erfolgte 3 h und

54 Ergebnisse

24 h vor der Proteinisolation (Abschnitt 3.1.10). Zum Vergleich dienten unbehandelte

Zellen als Kontrollen. Anschließend wurde eine Gelelektrophorese nach Laemmli

durchgeführt (Abschnitt 3.3.3). Die Expression von α- und δ-ENaC UE sowie α-Tubulin

wurde mittels Western Blot Analyse mit spezifischen Antikörpern untersucht (Abbildungen

20, 22, 23 und 25). Dadurch, dass die untersuchten Proteine unterschiedliche

Molekulargewichte besitzen, konnte die Membran nach der Detektion in zwei Teile

geschnitten und gleichzeitig mit den verschiedenen Antikörpern behandelt werden. α-

Tubulin ist ein zytosolisches, nicht-regulierendes Protein, welches in allen Zellen ubiquitär

exprimiert wird. Das Molekulargewicht von α-Tubulin liegt bei ca. 60 kDa. In diesem

Versuch diente α-Tubulin als Ladekontrolle der Proteine und als Qualitätskontrolle der

Zellen. Durch die Detektion des α-Tubulin ist es möglich eine Aussage über die

unterschiedlichen Expressionsraten der α- und δ-ENaC UE in den CFBE41o-- und

16HBE14o--Zellen zu treffen.

4.3.1.1 CFBE41o--Zelllinie

α-ENaC wurde in den Proteinlysaten der CFBE41o--Zellen nach der Gelelektrophorese

mit einem molekularen Gewicht von ca. 120 kDa detektiert. Zudem wurde eine zweite

Bande von α-ENaC bei ca. 125 kDa detektiert (siehe Abbildung 20). Die hier detektierten

Banden könnten eine ubiquitinierte Form des ENaC-Kanals darstellen [Ruffieux-Daidié et

al., 2008]. α-Tubulin wurde in den untersuchten Proben gleich stark exprimiert. Das deutet

darauf hin, dass die Proteinlysate zum einen mit der gleichen Proteinkonzentration

aufgetragen wurden und zum anderen, dass die Proteinlysate, von der Qualität, in einem

guten Zustand waren.

Ergebnisse 55

Abbildung 20: Nachweis von α-ENaC und α-Tubulin in CFBE41o--Zellen durch Immunoblot-

analysen

Die oberen Banden zeigen den Nachweis von α-ENaC durch die Verwendung eines α-ENaC spezifischen Antikörpers bei einer Größe von ca. 120 und 125 kDa. Zur Größenidentifikation wurden 5µl des PageRuler

® Prestained Protein Ladder verwendet. Zum Abgleich der

aufgetragenen Proteinmengen und zum Nachweis der Qualität der Zellen, wurde eine Western Blot Analyse mit einen spezifisch gegen α-Tubulin gerichteten Antikörper (untere Banden, ca. 60 kDa) durchgeführt.

Um die detektierten Banden densiometrisch auszuwerten, wurden diese mittels des

Computerprogramms Image J 1.45s von Wayne Rasband (National Institutes of Health,

USA) hinsichtlich der Farbdichte analysiert. Es wurden beide detektierten Banden (ca.

120 und 125 kDa) ausgewertet und in Relation zu den α-Tubulin Ergebnissen normalisiert.

Anschließend wurden die Werte der unbehandelten Zellen auf 100% gesetzt, um die 3 h

und 24 h mit Dexamethason behandelten Zellen, in Relation zu den Kontrollen zu

normalisieren. Die errechneten Messdaten wurden mittels des Computerprogramms

OriginPro 6.1 analysiert (siehe Abbildung 21). In der folgenden Abbildung ist eine

Tendenz der unterschiedlich starken Expression der α-ENaC UE in den mit

Dexamethason verschieden behandelten Proben zu erkennen. Die Zellen, die 24 h mit

Dexamethason behandelt wurden, exprimieren die α-ENaC UE am stärksten. Es ist eine

Steigerung der α-ENaC Proteinexpression von 10,94 ± 22,35%, bezogen auf die

Kontrollen, zu erkennen. Bei den detektierten Banden der unbehandelten und der 3 h mit

Dexamethason behandelten Zellen ist ein Abfall von ca. 12,08 ± 16,82% der

Proteinexpression der α-ENaC UE, bezogen auf die Kontrollen, zu erkennen.

56 Ergebnisse

Abbildung 21: Untersuchung der α-ENaC UE der CFBE41o--Zellen durch unterschiedliche

Dexamethasonbehandlung

In der Abbildung ist die prozentuale ENaC Proteinexpression der mit Dexamethason unterschiedlich behandelten Zellen dargestellt. Für die Auswertung wurde das Computerprogram OriginPro 6.1 verwendet. Für die Auswertung wurden von allen drei Proben drei Proteinisolationen mit je einer Western Blot Analyse durchgeführt. Die unbehandelten Zellen (Kontrollen) wurden auf 100% gesetzt und in Relation zu den 3 h und 24 h mit Dexamethason behandelten Zellen normalisiert. In Bezug auf die Kontrollen weisen die 3 h mit Dexamethason behandelten Zellen eine geringere und die 24 h mit Dexamethason behandelten Zellen eine höhere Expression der α-ENaC UE auf. Die 3 h mit Dexamethason behandelten Zellen besitzen im Vergleich zu den Kontrollen eine 12,08 ± 16,82% geringere und die 24 h mit Dexamethason behandelten Zellen eine 10,94 ± 22,35% höhere α-ENaC UE Proteinexpression.

Die Western Blot Analyse der δ-ENaC UE wurde mit zwei unterschiedlich spezifisch

gegen δ-ENaC gerichteten Antikörpern untersucht. δ-ENaC kann nach Angaben des

Antikörperherstellers (Santa Cruz) mit einem Molekulargewicht von ca. 110 kDa

nachgewiesen werden. Bei den Untersuchungen der δ-ENaC Proteinexpression wurden

in der ersten durchgeführten Methode (1. AK Santa Cruz (H-230) mehrere Banden

detektiert. Es wurden auch Banden mit einem Molekulargewicht von 110 kDa detektiert,

jedoch sind zu viele weitere Banden vorhanden, dass keine genaue Aussage getroffen

werden kann, welche Bande die δ-ENaC UE darstellt (Abbildung 22 A). Bei den

Untersuchungen mit der zweiten Methode (1.AK Santa Cruz (N-20) wurden spezifische

Banden auf einer Höhe von ca. 110 kDa detektiert. Durch den starken Hintergrund, der

höchstwahrscheinlich durch die Bindung des zweiten Antikörpers an die Membran

entstanden ist, konnten die Banden nicht ausgewertet werden (Abbildung 22 B). Bei

beiden Western Blot Analysen wurde eine Untersuchung mit einem spezifisch gegen α-

Tubulin gerichteten Antikörper durchgeführt. Anhand der erfolgreichen Expression von α-

% E

Na

C P

rote

ine

xp

ress

ion

Inkubation mit Dexamethason

Ergebnisse 57

Tubulin kann gesagt werden, dass die Zelllysate vergleichbar waren. Zusammenfassend

kann aus diesen Ergebnissen die Aussage getroffen werden, dass zu der Expressionsrate

der δ-ENaC UE in den CFBE41o--Zellen keine Auswertung erfolgen kann.

Abbildung 22: Darstellung der δ-ENaC UE und α-Tubulin in CFBE41o--Zellen durch

Immunoblotanalysen

Bei der Western Blot Analyse A wurde mit dem spezifisch gegen δ-ENaC gerichteten Antikörper H-230 gearbeitet. Durch die vielen detektierten Banden ist keine Aussage über die Expression von δ-ENaC zu treffen, obwohl eine Bande bei 110 kDa detektiert wurde, die nach Angaben des Herstellers die δ-ENaC UE nachweist. Auf dem Blot B ist eine spezifische Bande bei ca.110 kDa zu sehen, die höchstwahrscheinlich die δ-ENaC UE darstellt. Durch den starken Hintergrund bei dieser Analyse kann keine Auswertung der Expression von δ-ENaC erfolgen. Zum Abgleich der aufgetragenen Proteinmengen und Nachweis der Qualität der Zellen, wurde eine Immunoblotanalyse mit einen spezifisch gegen α-Tubulin gerichteten Antikörper (untere Banden in Beiden Immunoblotanalysen, ca. 60 kDa) durchgeführt. In beiden Versuchen wurde eine Positivkontrolle, MIA PaCa-2 mitgeführt.

4.3.1.2 16HBE14o--Zelllinie

Bei der Western Blot Analyse der 16HBE14o--Zellen zur Untersuchung der α-ENaC

Proteinexpression wurden wie bei den CFEBE41o--Zellen zwei Banden detektiert. Die

detektierten Banden wiesen eine Größe von ca. 120 kDa und 125 kDa auf. Auch hier

wurden möglicherweise ubiquitinierte Formen des ENaC-Kanals beobachtet. Wie bei den

Immunoblotanalysen zuvor, wurde α-Tubulin in den untersuchten Proben gleich stark

exprimiert. Das deutet auf gleiche Proteinkonzentrationen und gute Qualität der

Proteinlysate hin (Abbildung 23).

A) B)

58 Ergebnisse

Abbildung 23: Nachweis von α-ENaC und α-Tubulin in 16HBE14o--Zellen durch

Immunoblotanalysen

In der Abbildung sind zwei Banden mit den Größen von ca. 120 kDa und 125 kDa, die mittels des spezifisch gegen α-ENaC gerichteten Antikörpers detektiert wurden, dargestellt. Zusätzlich ist eine weitere Bande, die mit einem spezifisch gegen α-Tubulin gerichteten Antikörper detektiert wurde, von ca. 60 kDa zu sehen. α-Tubulin dient zum Abgleich der aufgetragenen Proteinmengen und zum Nachweis der Qualität der Zellen.

Nach erfolgreicher Detektion der α-ENaC UE durch einen spezifischen Antikörper,

konnten diese mit dem Programm Image J 1.45s von Wayne Rasband (National Institutes

of Health, USA) auf ihre Farbdichte hin analysiert werden. Zunächst wurden die

Messdaten der α-ENaC UE in Relation zu den Messdaten des α-Tubulin normalisiert.

Anschließend wurden die analysierten Ergebnisse der Kontrollen auf 100% gesetzt, um

im weiteren Verfahren die Messdaten der 3 h und 24 h mit Dexamethason behandelten

Zellen in Relation zu den Kontrollen zu normalisieren und mit dem Computerprogram

OriginPro 6.1 auszuwerten. Nach der Western Blot Analyse und der Auswertung war eine

Tendenz mit einer leichten Steigerung der α-ENaC Proteinexpression bei den 3 h und

24 h mit Dexamethason behandelten Zellen zu erkennen (siehe Abbildungen 23 und 24).

Die errechnete Steigerung der α-ENaC Proteinexpression bei den 3 h und 24 h mit

Dexamethason behandelten Zellen im Vergleich zu den Kontrollen liegt bei 15,52 ± 13,1%

und 0,51 ± 15,62%. Dies zeigt, dass die α-ENaC Proteinexpression bei den 16HBE14o--

Zellen am stärksten nach 3 h Dexamethasonbehandlung ist.

Ergebnisse 59

Abbildung 24: Untersuchung der α-ENaC UE der 16HBE14o--Zellen durch unterschiedliche

Dexamethasonbehandlung

Die Abbildung zeigt die gemittelte prozentuale Proteinexpression der unterschiedlich mit Dexamethason behandelten Zellen, die mit dem Statistikprogramm OriginPro 6.1 ausgewertet wurden. Je drei Proteinisolationen mit je einer Western Blot Analyse diente für die Auswertung. Für die Auswertung wurden die Kontrollen auf 100% gesetzt und in Relation zu den 3 h und 24 h mit Dexamethason behandelten Zellen normalisiert. Die 3 h mit Dexamethason behandelten Zellen weisen eine 15,52 ± 13,1% höhere α-ENaC Proteinexpression auf als die Kontrollen. Die α-ENaC Proteinkonzentrationen bei den 24 h mit Dexamethason behandelten Zellen ist leicht stärker, mit 0,51 ± 15,62%, als bei den Kontrollen.

Die Detektion der δ-ENaC UE wurde wie bei den CFBE41o--Zellen mit zwei

unterschiedlich spezifisch gegen δ-ENaC gerichteten Antikörpern durchgeführt. Bei der

ersten Methode mit dem Antikörper Santa Cruz (H-230) wurden wie bei den CFBE41o--

Zellen sehr viele Banden detektiert. Nach Angaben des Herstellers, sollte δ-ENaC mit

einem Molekulargewicht von 110 kDa nachgewiesen werden. Die entsprechende Bande

ist nach der Western Blot Analyse detektiert worden, jedoch konnte durch das Auftreten

der anderen Banden keine genaue Aussage getroffen werden, ob die Bande bei 110 kDa

die δ-ENaC UE darstellt (siehe Abbildung 25 A). Nach einer Western Blot Analyse mit

dem Antikörper Santa Cruz (N-20), konnte eine spezifische Bande bei 110 kDa detektiert

werden. Jedoch war wie bei den CFBE41o--Zellen der Hintergrund sehr stark, so dass die

detektierten Banden nicht auswertbar waren. Auch bei den hier untersuchten Zellen

könnte der starke Hintergrund durch die Bindung des 2. Antikörpers an die Membran

entstanden sein (siehe Abbildung 25 B). Dass die Zelllysate in einem guten Zustand

% E

Na

C P

rote

ine

xp

ress

ion

Inkubation mit Dexamethason

60 Ergebnisse

waren, konnte durch die Untersuchung mittels eines spezifisch gegen α-Tubulin

gerichteten Antikörpers, gezeigt werden. Zusammenfassend kann aus diesen

Ergebnissen keine Aussage über die Proteinexpression der δ-ENaC UE getroffen werden.

Abbildung 25: Darstellung der δ-ENaC UE und α-Tubulin in 16HBE14o--Zellen durch

Immunoblotanalysen

In der Abbildung A wird die Western Blot Analyse mit dem spezifisch gegen δ-ENaC gerichteten Antikörper H-230 gezeigt. δ-ENaC besitzt laut dem Hersteller (Santa Cruz) ein Molekulargewicht von ca. 110 kDa. Diese Bande ist in der Abbildung A dargestellt, jedoch sind noch weitere Banden auf dem Blot zu sehen. In der Abbildung B sind spezifische Banden für die δ-ENaC UE detektiert, jedoch ist ein sehr starker Hintergrund auf diesem Blot zu erkennen. Die Detektion von α-Tubulin (ca. 60 kDa) diente zum Abgleich der Proben und zum Nachweis der Qualität der Zellen.

4.3.2 Vergleich der Immunoblotanalysen der Zelllinien CFBE41o- und 16HBE14o-

Im folgenden Abschnitt sind die α-ENaC UE Proteinkonzentrationen der verschieden mit

Dexamethason behandelten Zellen beider Zelllinien dargestellt. Dies lässt eine Aussage

über eine eventuell unterschiedliche Stimulation des Dexamethasons, der beiden

Zelllinien, treffen. Die unbehandelten Zellen wurden für diesen Vergleich wieder auf 100%

gesetzt, um die 3 h und 24 h mit Dexamethason inkubierten Zellen in Relation zu den

Kontrollen zu normalisieren. Innerhalb der Zelllinien hat man einen gegenteiligen Effekt

des Dexamethasons auf die 3 h und 24 h inkubierten Zellen gesehen. So ist bei den 3 h

mit Dexamethason behandelten CFBE41o--Zellen ein Absinken der Proteinkonzentration

A) B)

Ergebnisse 61

von 12,08 ± 16,82 zu erkennen. Im Gegensatz dazu zeigt sich bei den 16HBE14o--Zellen

ein Anstieg der Proteinkonzentration von 15,52 ± 13,1%. Bei den 24 h mit Dexamethason

behandelten Zellen steigt die Proteinexpression der CFBE41o--Zellen um 10,94 ± 22,35%

und bei den 16HBE14o--Zellen um nur 0,51 ± 15,62%. In der folgenden Abbildung sind

die prozentualen ENaC Proteinkonzentrationen der beiden Zelllinien aus den beiden

Abbildungen 21 und 24 dargestellt.

Abbildung 26: Gegenüberstellung der unterschiedlichen Expressionsraten von α-ENaC bei CFBE41o

-- und 16HBE14o

--Zellen

In der Abbildung ist die gemittelte prozentuale α-ENaC Proteinexpression der Kontrollen und der 3 h und 24 h mit Dexamethason inkubierten, CFBE41o

-- und 16HBE14o

--Zellen, dargestellt. Die

Kontrollen wurden für beide Zelllinien auf 100% normalisiert. Der Unterschied bei den 3 h mit Dexamethason inkubierten Zellen liegt bei 27,6% und bei den 24 h mit Dexamethason behandelten Zellen bei 10,43%. Dabei ist zu beachten, dass bei den 3 h mit Dexamethason behandelten Zellen, die 16HBE14o

--Zellen in der α-ENaC Proteinexpression steigen und die CFBE41o

--Zellen in dieser

sinken. Bei den 24 h mit Dexamethason behandelten CFBE41o-- Zellen steigt die α-ENaC-

Proteinexpression mehr als bei den 16HBE14o--Zellen.

% E

Na

C P

rote

ine

xp

ress

ion

Inkubation mit Dexamethason

62 Diskussion

5 Diskussion

Seit der Entdeckung des CFTR-Gens 1989 ist die Forschung für die Krankheit

Mukoviszidose weit voran geschritten [Riordan et al., 1989b]. Zu Anfang wurde das

Hauptaugenmerk auf den gestörten Cl--Ionenkanal CFTR gelegt. Heute weiß man, dass

die Symptome vermehrt auch durch die Na+-Hyperabsorption durch den ENaC auftreten

[Mall et al., 2004; Bangel et al., 2008]. Durch die Dysfunktionen des epithelialen

Transportes wird dem Mukus Wasser entzogen und der Abtransport des ASL ist nicht

gewährleistet. Der Schutzmechanismus MCC kann nicht weiter erfolgen und es kommt zu

schwerwiegenden Folgeerkrankungen wie schwere Lungenentzündungen und

Lungenödeme [Hirche et al., 2005; Thelin und Boucher, 2007]. Zurzeit wird an

vielzähligen Therapieansätzen geforscht. Die Gentherapie ist nur ein Ansatz in der

Forschung, diese setzt bei der grundlegenden Ursache dieser Krankheit an. Es gibt viele

Forschungsansätze, die die auftretenden Begleiterkrankungen und Symptome lindern

sollen. Zum einen durch Einnahme von Amilorid, zum anderen durch das Einbringen von

Antisense Oligonukleotidsequenzen oder siRNA Sequenzen, die zum Abbruch oder

Inhibieren des ENaC-Kanals führen sollen [Hofmann et al., 1998; Sobczak et al., 2009;

Clark et al., 2013]. Somit wäre auch die Na+-Hyperabsorption reduziert und der

Schutzmechanismus MCC könnte wieder funktionieren. Um solche Forschung zu

betreiben, werden oftmals humane Zelllinien verwendet, da diese dem Organismus der

menschlichen Zelle am nächsten und zudem leicht kultivierbar sind. Aus diesem Grund

wurde in dieser Arbeit versucht, zwei humane Bronchialepithelzellen, CFBE41o- und

16HBE14o-, für diese Forschungen zu optimieren. Die CFBE41o-- und 16HBE14o--

Zelllinien sind humane Bronchialepithelzelllinien, wobei die CFBE41o--Zellen aus einem

Mukoviszidosepatienten und die 16HBE14o--Zellen aus einem gesunden Patienten

stammen. Die CFBE41o--Zellen weisen die am häufigsten auftretende Mutation ΔF508

auf [Gruenert et al., 2004; Ehrhardt et al., 2006]. Beide Zelllinien sind etablierte

Modellsysteme für die Mukoviszidoseforschung. Sie sind in der Lage polarisierte

Monolayer und tight junctions auszubilden, was eine elektrophysiologische Messung an

der Ussing-Kammer zulässt. Jedoch besitzen die Zellen keinen stabilen ENaC-Strom, der

über die Ussing-Kammer gemessen werden kann [Rubenstein et al., 2010; Lemke, 2012].

Damit die Zellen als Modellsystem für Mukoviszidose besser geeignet sind, indem sie

auch die Ionentransporteigenschaften im Hinblick auf ENaC erfüllen, wird in der

Diskussion 63

vorliegenden Masterarbeit untersucht, welchen Einfluss verschiedene Inkubationszeiten

des Glucocortikoids Dexamethason auf die funktionale Expression und die

Proteinexpression des ENaC ausübt.

Im ersten Teil der Diskussion wird genauer auf die funktionale ENaC-Expression, die

durch die verschiedenen Inkubationszeiten mit Dexamethason stimuliert werden sollte,

eingegangen. Der zweite Teil der Diskussion behandelt die Einwirkung der verschiedenen

Inkubationszeiten des Dexamethasons zur Stimulierung der α- und δ- ENaC UE

Proteinexpression.

5.1 Untersuchungen zur funktionalen ENaC Expression durch elektrophysiologische Messungen

Mittels Ussing-Kammer Messungen wurde die Wirkung des Dexamethasons (1 µM), nach

verschiedenen Inkubationszeiten, auf die funktionale ENaC Expression der CFBE41o- und

16HBE14o--Zellen untersucht. Zudem sollte der ENaC-Strom, welcher von der δ-ENaC

UE generiert wird, ermittelt werden. Da in diesen beiden Zelllinien der Amilorid-sensitive

Na+-Strom über den ENaC nicht zuverlässig konstant ist, wurde in dieser Arbeit versucht

die funktionale Expression mittels des Dexamethasons zu erhöhen. Für diese Versuche

wurden beide Zelllinien zunächst auf spezielle Zellkulturfilter ausgesät. Nach 8 Tagen

waren die Zellen zu einem konfluenten Monolayer auf den Filtern herangewachsen und

konnten gemessen werden. 3 h und 24 h vor der Messung wurden die Zellen mit

Dexamethason inkubiert.

Die unbehandelten Zellen (Kontrollmessungen) wiesen einen prozentualen ENaC-

Stromanteil gemessen am Gesamt-Na+-Strom von etwa 21,67 ± 2,56% auf. Da die Zellen

keinen stabilen ENaC-Strom besitzen, ist dieses verglichen zu früheren Arbeiten mit

gesunden humanen Nasenepithelzellen, wo der Amilord-sensitive Na+-Strom 39,1 ± 2,3%

betrug, noch sehr hoch [Bangel-Ruland et al., 2010]. Die Arbeitsgruppe um Rubenstein

untersuchte inwieweit das Glucocorticoid Dexamethason die funktionale Expression

erhöht. Für die Versuche verwendeten sie unter anderem die CFBE41o--Zellen. Diese

wurden wie in dieser Arbeit auf Zellkulturfilter ausgesät, damit die Zellen eine polarisierte

Monolayer bilden konnten. 24 h vor der Messung wurden Zellen mit 1 µM Dexamethason

inkubiert. Auch die Arbeitsgruppe um Rubenstein untersuchte den ENaC-Strom mittels

der Ussing-Kammer. Dabei war in den Kontrollmessungen kaum Amilord-sensitiver Na+-

Strom durch den ENaC gemessen worden [Rubenstein et al., 2010]. Dies zeigt noch

deutlicher, wie hoch der hier gemittelte Amilorid-sensitive Na+-Strom ist. Betrachtet man

64 Diskussion

die einzelnen prozentualen Werte des Amilorid-sensitiven Na+-Stroms, kann

geschlussfolgert werden, dass dieser in den Zellen nicht zuverlässig konstant ist (siehe

Tabelle 27 in den Anlagen). Die 3 h und 24 h mit Dexamethason behandelten Zellen

besitzen einen prozentualen ENaC-Strom von 25,17 ± 3,02% und 25,21 ± 2,29%. Durch

die Stimulation des Glucocorticoids Dexamethason wurde ein höherer Anstieg des ENaC-

Stroms erwartet. Da das Glucocorticoid Dexamethason nicht nur an den

Mineralcorticoidrezeptor (MR), wie das Aldosteron, sondern auch an den

Glucocorticoidrezeptor (GR) bindet, sollte eine Steigerung der funktionalen Expression

des ENaC-Kanals in der Ussing-Kammer messbar sein. Dadurch, dass das

Dexamethason am GR bindet, gelangt dieses in den Zellkern und kann dort an

Glucocorticoid-responsive Elemente auf der DNA binden und so die Transkription der

Zielgene bewirken [Chow et al., 1999; Buttgereit, 2000; Reul et al., 2000; Gold et al.,

2001; Buttgereit und Scheffold, 2002; Kellendonk et al., 2002]. Eines dieser Proteine ist

die SGK1, die mit PKA Nedd4 durch Phosphorylierung inhibiert und die Endozytose mit

folgender Degradation des ENaC-Kanals verhindert. Aus diesem Grund sollten die ENaC-

Kanäle nicht aus der Zellmembran entfernt werden und in einem aktiven Zustand

vorliegen. Durch diesen Effekt sollte eine sichtliche Steigerung des Amilord-sensitiven

Na+-Stroms über den ENaC vorhanden sein. Die Steigerung bei den Zellen, die 3 h mit

Dexamethason behandelt wurden betrug in dieser Arbeit ca. 3,5%. Dies könnte an dem

sehr hohen Amilorid-sensitiven Na+-Strom liegen, der schon ohne die Behandlung des

Dexamethasons vorhanden war (siehe Kontrollmessungen). So könnten die vorhandenen

ENaC-Kanäle überwiegend aktiv in der Zellmembran eingebaut gewesen sein, sodass

durch das Zugeben des Dexamethasons, Nedd4 zwar inhibiert wurde, jedoch nur ein

kleiner Anteil der ENaC-Kanäle vorher in einen inaktiven Zustand überführt wurde. Die

geringe Steigerung des Amilorid-sensitiven Stroms könnte aber auch Aufgrund der kurzen

Inkubationszeit entstanden sein. Das Hinzugeben des Dexamethasons 3 h vor der

Messung könnte für die Regulation in der Zelle ein zu kurzer Zeitraum gewesen sein. Die

untersuchten Zellen, die 24 h mit Dexamethason behandelt wurden, weisen eine

3,54%ige Erhöhung des Amilorid-sensitiven Na+-Stroms auf. Auch bei dieser

Inkubationszeit erwartete man einen stärkeren Anstieg des untersuchten Amilorid-

sensitiven Na+-Stroms. Auch hier könnte die Möglichkeit bestehen, dass die vorhandenen

ENaC-Kanäle schon aktiv in der Zellmembran eingebaut waren. Jedoch kann bei dieser

Inkubationszeit nicht darauf geschlossen werden, dass die Zeit für die ablaufenden

Mechanismen in der Zelle zu kurz waren, da in früheren Arbeiten eine optimale

Inkubationszeit von 24 h ermittelt worden war [Dagenais et al., 2001]. In dieser Studie von

der Arbeitsgruppe um Dagenais wurde an alveolaren Rattenepithelzellen untersucht,

Diskussion 65

welche Auswirkungen das Dexamethason nach verschiedenen Inkubationszeiten auf die

funktionale ENaC Expression besitzt. Sie untersuchten die funktionale ENaC Expression

an 1 h, 4 h, 8 h, 24 h, und 48 h mit Dexamethason behandelten Zellen in der Ussing-

Kammer. Die optimalsten Ergebnisse stellten die 24 h mit Dexamethason inkubierten

Zellen dar [Dagenais et al., 2001]. Zudem wird vermutet, dass das Glucocorticoid

Dexamethason im Mechanismus ähnlich wie das Mineralcorticoid Aldosteron auf die

funktionale ENaC Expression einwirkt. Bei Aldosteron existieren zum einen der langsame

genomische und zum anderen der schnelle nicht genomische Weg, um die funktionale

ENaC Expression zu erhöhen. Bei dem langsamen genomischen Weg kann wie einleitend

erklärt, Aldosteron durch Bindung an ein Mineralcorticoidrezeptor an empfängliche

Elemente der DNA binden und durch Transkription und Translation die Expression der

Zielproteine erhöhen oder vermindern. Bei diesem Vorgang werden sowohl die Na+/K+-

ATPase als auch der ENaC und die SGK1 vermehrt exprimiert [Chen et al., 1999]. Durch

SGK1 wird die Ubiquitin-Ligase Nedd4-2 phosphoryliert und somit inhibiert [Snyder et al.,

2004]. Nedd4-2 ubiqitiniert im aktiven Zustand ENaC und dieser gelangt über Endozytose

ins Zytoplasma, wo ENaC kurz vor der Degradation steht [Staub et al., 1997]. Bei dem

kurzen nicht genomischen Weg wird vermutet, dass die funktionale ENaC Expression

durch posttranslationale Modifikationen, z.B. Phosphorylierungen, wieder hergestellt wird

[Eaton et al., 2001]. Bei dem genomischen Weg wurde gezeigte, dass die funktionale

ENaC Expression in zwei Phasen stattfindet. So wurde der ENaC-Strom um das 4 bis 6

fache in den ersten 2-6 h und in der späten Phase zwischen 12-48 h zusätzlich nochmal

um das 3 bis 4 fache erhöht [Eaton et al., 2001]. Im Gegensatz zu dem genomischen

Weg, zeigte der nicht genomische Weg eine Erhöhung des ENaC-Stroms nach weniger

als 2 min [Zhou und Bubien, 2001]. Aus diesen Studien wird die Vermutung für die

Ergebnisse in dieser Arbeit unterstützt, dass eine Inkubationszeit von 24 h besser

geeignet ist, als eine von 3 h. Zudem ist die Überlegung, ob die in dieser Arbeit

verwendete Konzentration von 1 µM des Dexamethasons, für die Inkubationszeiten von 3

h und 24 h, zu gering war. Da mit Zellen gearbeitet wurden, deren Amilorid-sensitive

Strom nicht zuverlässig mittels der Ussing Kammer gemessen werden konnte, könnte die

Konzentration von 1 µM, welches Verglichen zu anderen Zellen, z.B. H441 Zellen, eine

hohe Konzentration darstellt, zu gering sein. So wurden in anderen Studien mit anderen

Konzentrationen gearbeitet um den Amilorid-sensitiven Na+-Strom zu erhöhen. So zeigte

die Arbeitsgruppe um Richard in H441 Zellen, wie sich unterschiedliche Konzentrationen

des Dexamethasons auf den Amilorid-sensitiven Na+-Strom auswirken. So fanden sie

heraus, dass die unterschiedlichen Konzentrationen des Dexamethasons von 10 nM, 30

nM und 100 nM, einen jeweils gesteigerten Amilorid-sensitiven Na+-Strom der Zellen in

66 Diskussion

Ussing-Kammer Messungen aufwiesen. Der gemessene Strom lag bei den Zellen mit 10

nM bei 2,7 ± 0,7 µA/cm2, bei denen mit 30 nM bei 6,8 ± 1,6 µA/cm2 und denen mit 100 nM

bei 12,9 ± 2,0 µA/cm2 [Richard et al., 2004]. Aus diesen Arbeiten kann geschlussfolgert

werden, dass der Amilorid-sensitive Na+-Strom umso stärker ist, je höher die

Konzentration an Dexamethason ist. In der vorliegenden Arbeit kann durch die

gemessene Anzahl der Filter und der geringen Standardfehler bei den unterschiedlich

behandelten Zellen von einem aussagekräftigen Ergebnis ausgegangen werden. Auch die

gemittelten Widerstände bei den Zellen, 213,15 ± 11,99 Ω*cm2 (Kontrollen), 264,73 ± 18,1

Ω*cm2 (3 h) und 256,95 ± 21,1 Ω*cm2 (24 h), sind denen der Literaturangaben

entsprechend und besitzen keinen niedrigeren als 100 Ω*cm2 [Gruenert et al., 2004]. Dies

gibt Aufschluss darüber, dass der Amilorid-sensitive Na+-Strom überwiegend durch die

Zellen, transzellulär, erfolgt ist. Jedoch ist den gemittelten Initialwerten des

Kurzschlussstroms (ISC) unter Ringerlösung zu entnehmen, dass dieser, umso höher

wurde, je niedriger der Widerstand war. Das könnte geringe Auswirkungen auf die hier

ermittelten Werte haben, da der Widerstand bei den Kontrollmessungen am geringsten

war und somit der Ionenfluss zwar überwiegend transzellulär stattfand, jedoch eventuell

mehr parazelluläre Ströme auftraten, als bei den inkubierten Zellen. Die gemittelten

Initialwerte der Kapazität (Ct) zeigten keine großen Veränderungen. Eine

Schlussfolgerung der gemittelten Ergebnisse der Kapazität ist schwierig, da sich die

Kapazität während einer Messung verändert und Aufschluss über die endo- und

exozytotischen Prozesse in der Zellmembran gibt. Somit kann keine Aussage, aus den

gemittelten Werten der Kapazität, getroffen werden, ob durch die Stimulation des

Dexamethasons ENaC-Kanäle in die Zellmembran eingebaut wurden.

Die Messungen der 16HBE14o--Zellen sahen ähnlich aus wie die der CFBE41o--Zellen.

Der gemittelte Amilorid-sensitive Na+-Strom der Kontrollzellen lag bei 23,85 ± 2,48%. Da

diese Zellen wie die CFBE41o--Zellen keinen stabilen Amilorid-sensitiven Strom

aufweisen ist der gemittelte ENaC-Strom sehr hoch im Vergleich zu gesunden humanen

Nasenepithelzellen, wo dieser bei 39,1 ± 2,3% lag [Bangel-Ruland et al., 2010]. Betrachtet

man den Amilorid-sensitiven Strom der 3 h und 24 h mit Dexamethason behandelten

Zellen, der bei 25,79 ± 2,99% und 25,88 ± 2,40% liegt, ist dieses wie bei den CFBE41o--

Zellen, nicht den Erwartungen entsprechend. So ist bei diesen Zellen nach 3 h

Dexamethasonbehandlung nur eine 1,94%ige und bei den mit 24 h

Dexamethasonbehandlung eine 2,03%ige Erhöhung des Amilorid-sensitiven Stroms zu

erkennen. Da bei beiden Zelllinien ein ähnliches Ergebnis auftritt, kann für die 16HBE14o--

Zellen die gleichen Vermutungen getroffen werden wie bei den CFBE41o--Zellen. So

Diskussion 67

könnte auch hier die Konzentration des Dexamethasons (1 µM) zu gering für diese

Zelllinie gewesen sein.

Auch die Widerstände der unterschiedlich behandelten 16HBE14o--Zellen betrugen bei

den Kontrollmessungen 785 ± 5,91 Ω*cm2, bei den 3 h und 24 h mit Dexamethason

behandelten Zellen 786,83 ± 71,34 Ω*cm2 und 979,81 ± 90,17 Ω*cm2 und unterschritten

einen Literaturwert von 200 Ω*cm2 nicht [Gruenert et al., 2004]. Dieses lässt wieder darauf

schließen, dass überwiegend transzellulärer Ionenfluss stattfand. Auch die gemittelten

Initialwerte der Kapazität weisen kaum Veränderungen auf.

Vergleicht man nun die Ergebnisse der beiden Zelllinien untereinander, sieht man, dass

der gesamte Amilorid-sensitive Na+-Strom der 16HBE14o--Zellen höher ist als bei den

CFBE41o--Zellen. So ist bei den Kontrollzellen ein Unterschied von 1,75% und bei denen

mit 3 h und 24 h mit Dexamethason behandelten Zellen von 0,59% und 0,67% zu sehen.

Jedoch ist der durch Dexamethason hervorgerufene Effekt bei den CFBE41o--Zellen

geringfügig höher als bei den 16HBE14o--Zellen. Dies kann an dem hohen vorhandenen

Amilorid-sensitiven Na+-Strom vor der Dexamethasonbehandlung liegen, der bei den

16HBE14o--Zellen um 1,75% höher war als bei den CFBE41o--Zellen. Die minimale

Erhöhung des gemessenen Amilorid-sensitiven Na+-Stroms bei den 16HBE14o--Zellen

kann daran begründet sein, dass die Zellen nicht desselben Ursprungs wie die CFBE41o--

Zellen sind. So bestehen beide Zelllinie aus humanen Bronchialepithelzellen, aber die

16HBE14o--Zellen stammen aus einem gesunden Herz-Lungentransplantat [Cozens et

al., 1994] und die CFBE41o--Zellen wurden aus Bronchialepithelzellen eines 1jährigen

Mukoviszidosepatienten generiert [Gruenert et al., 2004; Ehrhardt et al., 2006].

In früheren Arbeiten mit humanen Nasenepithelzellen, konnte ein 50%iger Amilorid-

sensitiver Na+-Strom, der durch die δ-ENaC UE generiert wurde, festgestellt

werden[Bangel-Ruland et al., 2010]. Diese Studie ließ darauf schließen, dass ein sehr

hoher Anteil des Amilorid-sensitiven ENaC-Stroms durch die δ-ENaC UE generiert wird.

Dieses veranlasste, dass die in dieser Arbeit untersuchten CFBE41o-- und 16HBE14o--

Zellen, auch auf ihre funktionale Expression der δ-ENaC UE erforscht wurden. In dieser

Arbeit wurde hierfür der Azofarbstoff Evans Blue, der als Antagonist zu der δ-ENaC UE

wirkt, verwendet. Die Arbeitsgruppe um Yamamura untersuchte die Auswirkungen des

Evans Blue an hENaCαβγ- und hENaCδβγ-injizierten Xenopus leavis Oozyten. Hierfür

verwendeten sie verschiedene Konzentrationen des Evans Blue. Sie stellten fest, dass

Evans Blue mit einer Konzentration von 100 µM und höher, als Antagonist zur δ-ENaC UE

wirkt. Hierbei wird nur der Amilorid-sensitive ENaC-Strom, der durch die δ-ENaC UE

generiert wird blockiert und der Amilorid-sensitive Strom über die α-ENaC UE kann weiter

68 Diskussion

erfolgen [Yamamura et al., 2005]. Bei der Untersuchung der Filter in der vorliegenden

Arbeit wurde beobachtet, dass nach Hinzugeben des Evans Blue sowohl die Leitfähigkeit

als auch der Strom der Zellen extrem Anstieg, so dass die Filter nicht messbar waren. Es

lag während der Untersuchungen die Vermutung nahe, dass der Wirkstoff Evans Blue

sich auf den Elektroden ablagert. Evans Blue ist ein organisches Salz und besitzt ein

Molekulargewicht von 960,8 g/mol [Freedman und Johnson, 1969]. Wegen dieser

Vermutungen wurde eine weitere Messmethode (2.) mit anderen Filtern und einem

anderen Aufbau der Ussing-Kammer ausprobiert. So wurden in der vorherigen Methode

(1.) Filter verwendet, die eine Membran mit einer Fläche von 0,33 cm2 besaßen und mit

Fibronektin und Kollagen beschichtet wurden. Die 2. Filter hatten einen Durchmesser von

1,54 cm2 und bestanden aus einer Kollagenmatrix. Bei der 1. Methode war die Ussing-

Kammer senkrecht gestellt, sodass die Lösungen oben (apikal) und unten (basolateral)

hinzugegeben wurden. Bei der 2. Methode war die Ussing-Kammer waagerecht und die

Lösungen wurden links (apikal) und rechts (basolateral) hinzugegeben. Die Elektroden

wurden bei der 1. Methode in die Lösungen der apikalen und basolateralen Seite

hineingesteckt, sodass ein direkter Kontakt der Lösungen mit den Elektroden auftrat. Bei

der 2. Methode wurden die Elektroden in einen Agar gesteckt, der mit einer 1 M KCL-

Lösung hergestellt worden war und sollten daher nicht so anfällig für den Azofarbstoff

Evans Blue sein.

Nach dem Verändern der Methode wurden ein paar Testmessungen durchgeführt um zu

untersuchen, ob auch bei dieser Methode die Leitfähigkeit und der Kurschlussstrom an-

stieg. Es war zu beobachten, dass zwar sowohl die Leitfähigkeit als auch der

Kurzschlussstrom anstieg, nach einer geringen Zeit die Leitfähigkeit auf die vorherigen

Werte wieder sank und der Kurzschlussstrom noch weiter sank als er zuvor mit

Zellkulturringer gemessen wurde. Dies wiederlegt zum größten Teil die Vermutung, dass

der Farbstoff sich auf den Elektroden ablegt, da auch bei diesen Messungen die

Leitfähigkeit und der Kurzschlussstrom leicht anstiegen und der Farbstoff nicht in

Berührung mit den Elektroden kam. Doch könnte der Farbstoff die Elektroden indirekt

über den Agar berührt haben, da dieses aber nur in kleinen Mengen geschehen könnte,

könnten sich die Leitfähigkeit nach kurzer Zeit wieder auf den vorherigen Wert stabilisiert

haben und der Kurzschlussstrom noch weiter gesunken ist. Näher liegt die Vermutung,

dass der Farbstoff sich bei der 1. Methode, bei der die Ussing-Kammer senkrecht steht,

auf die Zellen legt und die Zellen einen Schock erleiden. Bei der neuen Methode

reagieren die Zellen auch mit einem kleinen Schock, da aber die Ussing-Kammer

waagerecht steht, legt der Farbstoff sich nicht auf die Zellen und kann im System

Diskussion 69

zirkulieren. Da diese Methode erst in einer späteren Phase dieser Arbeit verändert wurde,

sind nicht genügend Messungen vorhanden, um ein klares Ergebnis darzustellen.

Zusammenfassend zu der funktionalen Expression, die mit Dexamethason stimuliert

werden sollte, ist zu sagen, dass der Amilorid-sensitive Na+-Strom in beiden Zelllinien

eine steigernde Tendenz bei beiden Inkubationszeiten gezeigt hat. Es konnte in dieser

Arbeit jedoch keine Aussage des zu messenden Amilorid-sensitive ENaC-Stroms, der von

der δ-ENaC UE generiert wird, getroffen werden.

5.2 Untersuchungen zur quantitativen ENaC Expression durch Western Blot Analysen

Mittels Western Blot Analysen mit anschließender Immunodetektion wurde die Wirkung

des Dexamethason (1 µM), nach verschiedenen Inkubationszeiten auf die Expression von

α- und δ- ENaC UE in den CFBE41o-- und den 16HBE14o--Zellen getestet. Zunächst

wurden die Zellen für 3 h und 24 h mit Dexamethason inkubiert. Anschließend wurden

Proteinlysate von den unbehandelten (Kontrollen), den 3 h mit Dexamethason und den

24 h mit Dexamethason behandelten Zellen gewonnen. Danach wurden die Proteine

mittels SDS-Gelelektrophorese aufgetrennt und auf eine PVDF-Membran transferiert. Die

Untersuchten α- und δ- ENaC Proteine konnten mit spezifisch gegen α- und δ- ENaC

gerichteten Antikörpern nachgewiesen werden.

Sowie bei den CFBE41o--Zellen, als auch bei den 16HBE14o--Zellen konnten zwei

spezifische Banden für α-ENaC bei ca. 120 und 125 kDa detektiert werden. Dass hier

zwei spezifische Banden detektiert wurden, kann an posttranslationalen Modifikationen,

z.B. Phosphorylierungen, liegen. Die Phosphorylierungen werden durch die Proteinkinase

A (PKA) induziert [Garty und Palmer, 1997]. Durch frühere Arbeiten konnte die α-ENaC

UE in verschiedenen Größen nachgewiesen werden. Von den Arbeitsgruppen um Hughey

und Rubenstein wurde α-ENaC mit einem Molekulargewicht von 95 als auch von 65 kDa

nachgewiesen [Hughey et al., 2004; Rubenstein et al., 2010]. Eine weitere Arbeitsgruppe

detektierte die α-ENaC UE mit einem Molekulargewicht von 125 kDa. Bei dieser

Untersuchung wurde ein spezifisch gegen Ubiquitin gerichteter Antikörper verwendet, was

Aufschluss über den in dieser ermittelten α-ENaC UE gibt [Ruffieux-Daidié et al., 2008].

Ubiquitin ist ein kleines, hochkonserviertes, Protein, bestehend aus 76 Aminosäuren. Das

Protein ist in jeder Zelle ubiquitär vorhanden und an verschiedenen Prozessen in der Zelle

beteiligt [Hershko und Ciechanover, 1998]. So bewirkt es, z.B. bei dem Renin-

Angiotensin-Aldosteron System, durch Bindung an den ENaC, das dieser über

70 Diskussion

Endozytose in Vesikeln im Zytoplasma vorliegt und kurz vor der Degradation steht. Die in

dieser Arbeit detektierten Banden können eine ubiquitinierte, somit inaktive Form der α-

ENaC UE darstellen. Da bei den Immunoblotanalysen ein Gesamtproteinlysat der Zellen

verwendet wurde, kann keine Aussage darüber getroffen werden, ob die Proteine in der

Zellmembran eingebaut waren oder durch Endozytose in Vesikeln im Zytosol vorlagen. Es

könnte also eine inaktive Form der α-ENaC UE sein, die in der Zellmembran liegt und

noch durch die Proprotein-Konvertase Furin in seine aktive Form gebracht werden muss.

In früheren Arbeiten wurde gezeigt, dass die α- und γ- ENaC UE proteolytisch durch Furin

gespalten werden können und dadurch die α-ENaC UE um ca. 85% und der γ-ENaC UE

um ca. 90% gesteigert werden konnte. Das Furin wurde im trans-Golgi Netzwerk

lokalisiert und schneidet α-ENaC UE während des Reifeprozesses in der extrazellulären

Domäne [Hughey et al., 2004]. Es könnten in dieser Arbeit aber auch α-ENaC UE

detektiert worden sein, die in Vesikeln im Zytosol vorliegen. Diese wurden zuvor durch

Nedd4-2 ubiquitiniert. Durch die Bindung des Ubiquitins an die α-ENaC UE könnten diese

kurz vor der Degradation stehen [Staub et al., 1997; Malik et al., 2005].

Die detektierten Banden wurden densiometrisch mittels des Programms ImageJ 1.45s auf

ihre Farbdichte hin analysiert. In den CFBE41o--Zellen wurde nach einer 3-stündigen

Inkubation mit dem Glucocorticoid Dexamethason (1 µM) eine Inhibierung, also

Verringerung der Proteinkonzentration im Vergleich zu den Kontrollen, der α-ENaC UE

Proteinexpression von ca. 12,09 ± 16,82% festgestellt. Nach einer Inkubation von 24 h

wurde die α-ENaC UE Proteinexpression um ca. 10,94 ± 22,35% erhöht. Durch die

Inkubation mit Dexamethason bei den 16HBE14o--Zellen konnte die Proteinexpression

der α-ENaC UE nach 3 h um ca. 15,52 ± 13,1% und nach 24 h um ca. 0,51 ± 15,62%

gesteigert werden. Da für diese Versuche nur drei Proteinisolationen mit je einer

Immunoblotanalyse, durchgeführt wurden und der Standardfehler sehr hoch ist, sind die

Ergebnisse nicht aussagekräftig. Analysiert man diese Ergebnisse unter der Betrachtung

des hohen Standardfehlers, kann geschlussfolgert werden, dass durch die Inkubation des

Dexamethasons keine gesteigerte Proteinexpression der α-ENaC UE stattfand. Dieses

Ergebnis würde mit den Ergebnissen der Arbeitsgruppe um Rubenstein übereinstimmen,

die zwar durch die Inkubation des Dexamethasons eine Erhöhung der funktionalen

Expression des ENaC-Kanals in der Ussing-Kammer messen konnten, jedoch keine

erhöhte Proteinexpression ermittelten [Rubenstein et al., 2010]. In weiteren Arbeiten

dieser Arbeitsgruppe wurde gezeigt, dass der Glucocorticoidrezeptor in beiden Zelllinien

exprimiert wird und eine Tendenz einer erhöhten α-ENaC mRNA Expression vorhanden

ist. So wurde bei den CFBE41o-- und 16HBE14o--Zellen nach einer 24-stündigen

Inkubation mit Dexamethason im Vergleich mit den Kontrollen eine 2,5 ± 0,11 und

Diskussion 71

2,11 ± 0,84 fache Erhöhung der α-ENaC mRNA Expression ermittelt. Die CFBE41o--

Zellen, die 3 h mit Dexamethason inkubiert waren, zeigten verglichen mit den Kontrollen

eine 0,12 ± 1,5 fache Inhibierung. Bei den 16HBE14o--Zellen wurde wieder eine kleine

Tendenz von einer 1,29 ± 0,62 fachen Erhöhung zu den Kontrollen ermittelt. Die Werte

wurden von jeweils 3 mRNA Isolierungen mit je einer PCR ermittelt. Die Standardfehler

sind, wie bei der Ermittlung der Proteinexpression der α-ENaC UE, sehr hoch [Höben,

2013]. Eine Tendenz in der mRNA Expression der α-ENaC UE ist zu erkennen, jedoch

sind die Ergebnisse, wie bei der Proteinexpression der α-ENaC UE dieser Arbeit durch die

hohen Standardfehler nicht aussagekräftig. Die Arbeitsgruppe um McTavish hat in

Atemwegsepithelzellen herausgefunden, dass der Promotor für die α-ENaC UE

unabhängig zu der SGK1 aktiviert werden kann, da in der α-ENaC-Sequenz ein

Glucocorticoid-Response-Element vorhanden ist [McTavish et al., 2009]. Das

Glucocorticoid-Response-Element ist eine kurze Nukleotidsequenz, die im Bereich des

Promotors des Zielgens liegt. An dieses Element kann das Glucocorticoid Dexamethason

binden und die Expression von z.B. α-ENaC erhöhen. Unter dieser Betrachtung sollte eine

Steigerung der Proteinexpression der α-ENaC UE stattfinden. Jedoch könnte eine

Konzentration des Dexamethasons von 1 µM für die proteinbiochemischen

Untersuchungen zu gering sein. Zudem zeigte die Arbeitsgruppe um McTavish, dass die

Einwirkung auf die Bindung an das Glucocorticoid-Response-Element innerhalb der α-

ENaC-Sequenz konzentrationsabhängig ist und verwendeten daher in ihren Versuchen

4 µM Dexamethason [McTavish et al., 2009]. Eine weitere Studie aus dem Jahre 2000

zeigte an adulten Alveolarepithelzellen, dass durch die Zugabe von Dexamethason (1 µM)

die Expression der β- und γ-ENaC UE mRNA um das 1,6 und 17 fache gesteigert werden

konnte. Die Expression der α-ENaC UE mRNA konnte jedoch nur um das 0,5 fache

gesteigert werden [Lazrak et al., 2000]. Dies bestätigt die Annahme, dass Dexamethason

in einer höheren Konzentration bessere Ergebnisse erzielen könnte.

In dieser Arbeit wurde zu der stimulierten Proteinexpression durch Dexamethason der α-

ENaC UE auch die der δ-ENaC UE untersucht. Jedoch waren die Ergebnisse der

Immunoblotanalysen nicht auswertbar. In dieser Arbeit wurden zwei verschieden

spezifisch gegen δ-ENaC UE gerichtete Antikörper verwendet. Beide stammen von der

Firma Santa Cruz. Der δ-ENaC (H-320) Antikörper wurde aus einem Kaninchen

gewonnen und der δ-ENaC (N-20) aus einer Ziege. Beide Antikörper binden an eine

Epitopkartierung in der Nähe des N-Terminus von humanen δ-ENaC. Der erste Antikörper

ist der δ-ENaC (H-230) Antikörper. Nach der Immunodetektion mit diesem Antikörper

waren auf der Membran wiederholt 4 - 5 Banden detektiert. Dies lässt auf eine

Unspezifität des Antikörpers schließen. Nachdem wiederholten Auftreten der vielen

72 Diskussion

Banden, wurde ein weiterer 1. Antikörper (N-20) verwendet. Nach der Immunoblotanalyse

wurde zwar nur eine Bande detektiert (ca.110 kDa), doch war der Hintergrund auf der

Membran so stark, dass die leicht sichtbaren Banden nicht densiometrisch auszuwerten

waren. Der starke Hintergrund liegt höchstwahrscheinlich an dem 2. Antikörper (donkey

anti-goat IgG-HRP), der an die Membran bindet. Aus diesem Grund wurden verschiedene

Methoden untersucht, um den Hintergrund zu reduzieren. Als erstes wurde die

Blockierungslösung von 5% auf 1% Magermilch in TBST reduziert. Die Antikörper (1. AK,

1:200; 2. AK, 1:10000 verdünnt) wurden in dieser Blockierungslösung angesetzt. Nach

der Umstellung der Methode hatte sich der Hintergrund nicht verändert. Im nächsten

Schritt wurden die Verdünnungen der Antikörper verändert, vom 1. AK auf 1:100 und der

2. AK 1:5000 und der 2. AK nur in TBST angesetzt. Dies brachte ebenfalls keine

Besserung. Auch verschiedene Inkubationszeiten, Blockierung über Nacht bei 4 °C oder

2 h bei RT und 1. Antikörper über Nacht bei 4°C oder 2 h bei RT, ergaben keinen

sichtbaren Unterschied des Hintergrundes. Jedoch waren die Banden am stärksten bei

einer 2-stündigen Blockierung bei RT und der Inkubation des 1. Antikörpers in 1%

Blockierungslösung über Nacht bei 4°C. Im nächsten Schritt wurden die

Proteinkonzentrationen von 40 µg auf 60 µg erhöht, dieser Ansatz zeigte ebenfalls keine

positiven Auswirkungen. Nach diesen Veränderungen der Methoden wurde vom

Hersteller ein neuer 2. Antikörper (rabbit anti-goat IgG-HRP) (1:5000 verdünnt) zur

Verfügung gestellt, der wie der andere 2. Antikörper, einen starken Hintergrund auf der

Membran darstellte. Bei allen Versuchen die Methode zu etablieren wurde eine

Positivkontrolle, MIA PaCa II, mit untersucht, um auszuschließen, dass das Problem an

den beiden untersuchten Zelllinien, CFBE41o- und 16HBE14o-, lag.

Ausblick 73

6 Ausblick

Die hier untersuchte funktionale Expression des ENaC-Kanals ergab eine tendenzielle

Steigerung für die 3 h und 24 h mit Dexamethason inkubierten Zellen. Um den Amilorid-

sensitiven Na+-Strom, der über den ENaC mittels Ussing-Kammer gemessen wird, stärker

zu erhöhen, sollten die Inkubationszeiten der Zellen beibehalten werden und eine

Konzentrationsänderung des Dexamethasons vorgenommen werden. So wurde in

anderen Studien gezeigt, dass eine Erhöhung des Dexamethasons auch zu einer

Erhöhung des Amilorid-sensitiven Na+-Stroms führt. Sie verwendeten hierfür eine

Konzentration des Dexamethasons von 10 nM, 30 nM und 100 nM [Richard et al., 2004].

In den folgenden Versuchen sollte Beispielsweise auch eine Steigerung der Konzentration

um das 3 fache und 10 fache erfolgen. So sollten die Zellen zum Vergleich mit 1 µM, 3 µM

und 10 µM Dexamethason inkubiert werden. Zudem sollten Wiederholungen der Ussing-

Kammer Messungen mit der gleichen Methodik durchgeführt werden, da in früheren

Arbeiten ein größerer Anstieg des Amilorid-sensitiven Na+-Stroms der inkubierten Zellen

zu beobachten war als bei den Messungen in dieser Arbeit. Dies könnte aber auch an

dem vorhandenen hohen Amilorid-sensitiven Na+-Stroms liegen, der bereits ohne eine

Behandlung mit Dexamethason vorhanden war. In den früheren Arbeiten war nicht so ein

hoher Amilorid-sensitiver Na+-Strom in den Kontrollmessungen zu beobachten

[Rubenstein et al., 2010; Lemke, 2012]. Zudem konnte in dieser Arbeit keine Aussage

über die funktionale Expression der δ-ENaC UE getroffen werden, da die Methode

zunächst optimiert werden musste. Da die Zellen auf anderen Filtern und nach einer

anderen Methodik mit dem Farbstoff Evans Blue messbar waren, sollten diese Versuche,

wie in der Diskussion beschrieben, durchgeführt werden.

Die durchgeführten quantitativen Messungen mittels Western Blot Analysen der beiden

Zelllinien, CFBE41o- und 16HBE14o-, für die α-ENaC UE waren nicht sehr aussagekräftig,

da eine zu geringe Anzahl der Versuche durchgeführt wurde und der Standardfehler sehr

hoch war. Aus diesem Grund sollten die Versuche zunächst genauso weiter durchgeführt

werden wie in dieser Arbeit beschrieben. Lässt man die geringe Anzahl der

durchgeführten Versuche außer Acht und betrachtet das Ergebnis mit einbezogenen

Standardfehler, könnten auch hier, wie bei den funktionalen Messungen, die

Konzentration des Dexamethasons erhöht werden, um eine gesteigerte Proteinexpression

der α-ENaC UE zu erlangen. So wurde in anderen Studien eine 4 µM Konzentration des

74 Ausblick

Dexamethasons eingesetzt, um die Expression der α-mRNA UE zu erhöhen [McTavish et

al., 2009]. Zu der Untersuchung der α-ENaC Proteinexpression, sollte auch die δ-ENaC

Proteinkonzentration mittels des Dexamethasons erhöht werden. Da bei den

Untersuchungen keine auswertbaren Immunoblots entstanden, kann keine Aussage über

die quantitative Expression dieser UE getroffen werden. Da bei dem zweiten 1. Antikörper

spezifische Banden für die δ-ENaC UE detektiert wurden, sollte an dieser Methode weiter

gearbeitet werden, bis der Hintergrund minimiert ist. So könnte z.B. für den 2. Antiköper

eine Lösung aus der Spezies, aus der dieser gewonnen wurde, zur Verdünnung des

Antikörpers verwendet werden. Die Versuche sollten mit 3 h und 24 h, 1 µM

Dexamethason wiederholt werden. Da aber bei den anderen Versuchen jeweils von einer

Konzentrationsänderung gesprochen wird, sollte auch hier gleichzeitig eine weitere

Konzentration, z.B. 4 µM untersucht werden.

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Anlagen, Abbildungen A-I

Anlagen, Abbildungen

Abbildung 27: Verlauf der Messungen der CFBE41o--Zelllinie mit 3 h Dexamethason-Inkubation

In der Abbildung ist der zeitliche Verlauf von einer Ussing-Kammer Messungen von CFBE41o--Zellen

mit einer 3 h Dexamethasonbehandlung dargestellt. Auf der y-Achse ist der gemessen Kurzschlussstrom (ISC) in µA/cm

2 gegen die Zeit in min auf der x-Achse aufgetragen. In der Abbildung

werden die verschiedenen Lösungen dargestellt, die den Zellen während der Ussing-Kammer Messungen apikal hinzugegeben wurden. Der prozentuale Amiloridstrom in Bezug auf den gesamt Na

+-

Strom ist in diesen Zellen im Vergleich zu den Kontrollen leicht erhöht. Im Vergleich zu den Zellen, die 24 h mit Dexamethason behandelt wurden, ist kein Unterschied im gemessenen Kurzschlussstrom zu entdecken.

Abbildung 28: Verlauf der Messungen der 16HBE14o--Zelllinie mit 3 h Dexamethason-Inkubation

Die Abbildung zeigt den zeitlichen Verlauf einer Ussing-Kammer Messung der 16HBE14o--Zellen

nach 3 h Dexamethasonbehandlung. Auf der y-Achse ist der gemessene Kurzschlussstrom (ISC) in µA/cm

2 gegen die Zeit in min auf der x-Achse aufgetragen. Der Abbildung kann entnommen

werden welche verschiedenen Lösungen den Zellen während der Ussing-Kammer Messungen apikal hinzugegeben wurden. Der prozentuale Amiloridstrom in Bezug auf den gesamt Na

+-Strom ist in

diesen Zellen im Vergleich zu den Kontrollen leicht erhöht. Im Vergleich zu den Zellen, die 24 h mit Dexamethason behandelt wurden, ist kein Unterschied im gemessenen Kurzschlussstrom zu entdecken.

A-II Anlagen, Abbildungen

Abbildung 29: Verlauf der Messungen der CFBE41o

--Zelllinie mit 24 h Dexamethason-Inkubation

In der Abbildung ist der zeitliche Verlauf von einer Ussing-Kammer Messungen von CFBE41o--Zellen

mit einer 24 h Dexamethasonbehandlung dargestellt. Auf der y-Achse ist der gemessen Kurz-schlussstrom (ISC) in µA/cm

2 gegen die Zeit in min auf der x-Achse aufgetragen. In der Abbildung

werden die verschiedenen Lösungen dargestellt, die den Zellen während der Ussing-Kammer Messungen, apikal hinzugegeben wurden. Der prozentuale Amiloridstrom in Bezug auf den gesamt Na

+-

Strom ist in diesen Zellen, im Vergleich zu den Kontrollen, leicht erhöht. Im Vergleich zu den Zellen, die 3 h mit Dexamethason behandelt wurden, ist kein Unterschied im gemessenen Kurzschlussstrom zu erkennen.

Abbildung 30: Verlauf der Messungen der 16HBE14o--Zelllinie mit 24 h Dexamethason-Inkubation

Die Abbildung zeigt den zeitlichen Verlauf einer Ussing-Kammer Messung der 16HBE14o--Zellen

nach 24 h Dexamethasonbehandlung. Auf der y-Achse ist der gemessene Kurzschlussstrom (ISC) in µA/cm

2 gegen die Zeit in min auf der x-Achse aufgetragen. Der Abbildung kann entnommen

werden welche verschiedenen Lösungen den Zellen während der Ussing-Kammer Messungen apikal hinzugegeben wurden. Der prozentuale Amiloridstrom in Bezug auf den gesamt Na

+-Strom ist in

diesen Zellen im Vergleich zu den Kontrollen leicht erhöht. Im Vergleich zu den Zellen, die 3 h mit Dexamethason behandelt wurden, ist kein Unterschied im gemessenen Kurzschlussstrom zu entdecken.

Anlagen, Messergebnisse A-III

Anlagen, Messergebnisse

Tabelle 15: Messdaten der CFBE41o--Zellen (Kontrollmessungen)

Anzahl gemessener Filter

ΔISC Amilorid ΔISC Na+-frei ΔISC ENaC [%]

1 3,47 11,15 31,12

2 4,60 19,72 23,33

3 0,96 16,14 5,95

4 1,83 9,66 18,96

5 1,25 6,34 19,79

6 3,92 10,63 36,91

7 2,88 12,91 22,28

8 1,81 7,41 24,39

9 1,35 7,97 16,98

10 2,39 10,20 23,44

11 1,77 15,91 11,11

12 0,82 14,85 5,54

13 1,12 9,37 11,95

14 2,88 23,86 12,05

15 1,86 6,17 30,23

16 1,58 7,39 21,30

17 1,63 16,57 9,84

18 1,73 6,93 24,99

19 1,44 3,65 39,33

20 0,85 18,98 4,46

21 3,13 28,55 10,96

22 5,57 10,40 53,49

23 4,64 10,72 43,32

24 2,01 10,99 18,25

Mittelwert ± SEM 2,47 ± 0,27 11,07 ± 1,22 21,67 ± 2,56

A-IV Anlagen, Messergebnisse

Tabelle 16: Messdaten der CFBE41o--Zellen mit 3 h Dexamethasonbehandlung

Anzahl gemessener Filter

ΔISC Amilorid ΔISC Na+-frei ΔISC ENaC [%]

1 2,53 9,66 26,18

2 0,73 7,33 9,97

3 8,25 15,47 53,31

4 1,68 8,11 20,70

5 3,05 11,27 27,08

6 1,09 6,26 17,43

7 1,14 9,94 11,45

8 0,50 9,38 5,33

9 3,06 14,63 20,89

10 2,56 8,31 30,85

11 0,63 5,55 11,33

12 1,14 1,86 61,10

13 0,95 6,52 14,58

14 2,17 9,76 22,28

15 1,73 5,82 29,73

16 2,96 11,95 24,79

17 0,59 2,26 26,22

18 5,95 20,49 29,02

19 4,15 18,00 23,05

20 3,47 6,68 51,92

21 2,79 9,66 28,82

22 0,59 7,59 7,77

Mittelwert ± SEM 2,35 ± 0,40 9,39 ± 0,96 25,17 ± 3,07

Anlagen, Messergebnisse A-V

Tabelle 17: Messdaten der CFBE41o--Zellen mit 24 h Dexamethasonbehandlung

Anzahl gemessener Filter

ΔISC Amilorid ΔISC Na+-frei ΔISC ENaC [%]

1 2,94 13,57 21,67

2 2,07 5,27 39,21

3 2,35 8,87 26,56

4 2,07 12,46 16,59

5 3,84 12,00 32,03

6 2,22 4,49 49,40

7 1,33 6,30 21,10

8 0,30 9,42 3,20

9 0,95 6,72 14,12

10 4,09 16,13 25,39

11 2,94 9,96 29,50

12 3,00 9,37 32,06

13 1,67 12,03 13,91

14 1,31 9,16 14,32

15 0,85 6,28 13,49

16 4,11 10,60 38,82

17 1,33 4,45 29,90

18 0,73 2,55 28,78

19 0,54 3,51 15,33

20 1,23 6,59 18,69

21 9,22 32,38 28,49

22 3,47 15,51 22,36

23 4,07 9,42 43,23

24 4,52 10,48 43,15

25 0,81 8,96 9,04

Mittelwert ± SEM 2,48 ± 0,37 9,86 ± 1,15 25,21 ± 2,29

A-VI Anlagen, Messergebnisse

Tabelle 18: Messdaten der 16HBE14o--Zellen (Kontrollmessungen)

Anzahl gemessener Filter

ΔISC Amilorid ΔISC Na+-frei ΔISC ENaC [%]

1 1,53 3,69 41,46

2 0,24 1,31 18,42

3 0,33 0,99 33,80

4 0,89 2,74 32,54

5 1,11 2,98 37,43

6 0,24 0,60 39,71

7 0,03 0,71 3,67

8 0,84 4,49 18,61

9 0,33 5,93 5,52

10 0,17 0,89 18,62

11 1,04 3,54 29,48

12 0,32 1,33 23,90

13 0,13 1,39 9,21

14 1,05 4,50 23,36

15 0,95 2,75 34,43

16 0,26 0,75 34,82

17 1,19 4,98 23,91

18 0,77 6,00 12,75

19 0,96 3,23 29,84

20 0,10 1,85 5,63

Mittelwert ± SEM 0,62 ± 0,09 2,73 ± 0,37 23,85 ± 2,48

Anlagen, Messergebnisse A-VII

Tabelle 19: Messdaten der 16HBE14o--Zellen mit 3 h Dexamethasonbehandlung

Anzahl gemessener Filter

ΔISC Amilorid ΔISC Na+-frei ΔISC ENaC [%]

1 0,56 1,34 41,32

2 0,19 0,83 23,27

3 1,99 3,88 51,23

4 1,19 3,66 32,52

5 0,76 2,82 26,81

6 0,85 1,76 48,43

7 1,25 3,12 39,97

8 0,82 1,64 49,98

9 3,62 7,81 46,33

10 0,11 2,15 5,24

11 0,53 4,12 12,80

12 0,27 2,35 11,47

13 0,55 1,88 29,42

14 0,35 1,97 17,51

15 1,31 5,74 22,80

16 0,13 1,13 11,92

17 0,19 1,25 15,33

18 0,32 1,41 23,03

19 0,96 5,91 16,19

20 1,49 3,29 45,41

21 0,16 2,11 7,62

22 0,31 1,70 18,46

23 0,26 2,02 12,76

24 0,27 3,00 9,15

Mittelwert ± SEM 0,77 ± 0,16 2,79 ± 0,34 25,79 ± 2,99

A-VIII Anlagen, Messergebnisse

Tabelle 20: Messdaten der 16HBE14o--Zellen mit 24 h Dexamethasonbehandlung

Anzahl gemessener Filter

ΔISC Amilorid ΔISC Na+-frei ΔISC ENaC [%]

1 0,86 5,23 16,52

2 1,31 3,27 40,14

3 0,61 3,56 17,23

4 0,58 2,01 29,00

5 0,27 1,46 18,52

6 0,70 1,73 40,42

7 0,17 1,66 9,99

8 0,19 0,96 19,68

9 0,78 3,82 20,42

10 0,62 2,81 21,90

11 0,21 1,43 14,36

12 1,03 2,75 37,37

13 0,23 1,18 19,65

14 0,14 1,03 13,79

15 0,23 1,02 22,65

16 0,34 0,85 39,67

17 4,92 12,04 40,88

18 0,07 1,41 4,61

19 0,99 2,02 48,94

20 0,75 2,42 30,99

21 0,45 1,29 35,06

22 0,37 1,84 19,96

23 1,19 3,55 33,41

Mittelwert ± SEM 0,74 ± 0,2 2,58 ± 0,48 25,88 ± 2,40

Anlagen, Chemikalien A-IX

Anlagen, Chemikalien

Tabelle 21: Verwendete Chemikalien

Reagenz Hersteller

3-Aminophtalhydrazid (Luminol) Sigma-Aldrich, Taufkirchen,

Deutschland

Acrylamid/Bisacrylamid (Rotiphorese Gel 30

(37:5:1))

Roth, Karlsruhe, Deutschland

Ammoniumperoxidisulfat (APS) Roth, Karlsruhe, Deutschland

Calciumchlorid (CaCl2) Roth, Karlsruhe, Deutschland

Coomassie-Brilliant-Blau R-250 Roth, Karlsruhe, Deutschland

Dexamethason Sigma-Aldrich, Taufkirchen,

Deutschland

Dimethylsulfoxid (DMSO) Roth, Karlsruhe, Deutschland

Dithiothreitol (DTT) Roth, Karlsruhe, Deutschland

Essigsäure ≥ 96 %, p.a. Roth, Karlsruhe, Deutschland

Ethanol ≥ 99,5 %, p.a. Roth, Karlsruhe, Deutschland

D (+) Glucose wasserfrei p.a. Roth, Karlsruhe, Deutschland

Glycin Roth, Karlsruhe, Deutschland

Glycerin Merck, Darmstadt, Deutschland

A-X Anlagen, Chemikalien

Kaliumchlorid p.a. (KCl) Roth, Karlsruhe, Deutschland

Magnesiumchlorid (MgCl2) Merck, Darmstadt, Deutschland

Methanol Roth, Karlsruhe, Deutschland

Milchpulver Roth, Karlsruhe, Deutschland

Natriumchlorid p.a. (NaCl) Roth, Karlsruhe, Deutschland

Natriumlaurylsulfat (SDS) Roth, Karlsruhe, Deutschland

Salzsäure 1 M (HCl) Roth, Karlsruhe, Deutschland

Tetramethylethylendiamin (TEMED) Roth, Karlsruhe, Deutschland

Tris(hydroxymethyl)-aminomethan (TRIS) Roth, Karlsruhe, Deutschland

Tween 20 Roth, Karlsruhe, Deutschland

Anlagen, Lösungen für die Zellkultur A-XI

Anlagen, Lösungen für die Zellkultur

Tabelle 22: Verwendete Medien und Zusätze

Reagenz Hersteller

BSA Fraction V solution 7,5% Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland

Fetale Bovine Serum Gold (Fötales

Kälberserum,FKS)

PAA Laboratories GmbH, Pasching, AT

Humanes Fibronektin Biochrom AG, Berlin, Deutschland

L-Glutamin (200 mM) PAA Laboratories GmbH, Pasching AT

LHC Basalmedium Invirtogen, Karlsruhe, Deutschland

MEM with Earle´s Salt (with L-Glutamine) PAA Laboratories GmbH, Pasching, AT/

Biochrom AG, Deutschland

Penicillin/ Streptomycin (100x) PAA Laboratories GmbH, Pasching, AT

Rinderkollagen Typ I (Collagen A) Biochrom AG, Berlin, Deutschland

Trypsin/ EDTA solution Biochrom AG, Berlin, Deutschland

A-XII Anlagen, Kits

Anlagen, Kits

Tabelle 23: Verwendete Kits für proteinbiochemische und molekularbiologische Methoden

Kit Hersteller

AG-aliquoted Mycoplasma Detecion Kit

for conventional PCR von Venor® GeM

Advance

Minerva Biolabs, Berlin, Deutschland

Pierce® BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific, Rockford, USA

Super Signal® West Pico

Chemiluminescent Substrat

Thermo Scientific, Rockford, USA

Anlagen, Antikörper und Marker A-XIII

Anlagen, Antikörper und Marker

Tabelle 24: Verwendete Antikörper für biochemische Methoden

Bezeichnung Firma Verdünnung für Immuno-

blotanalyse

Anti-Alpha-ENaC aus

Kaninchen (Klon: pk)

Dianova, Hamburg,

Deutschland

1:1250

Anti-Tubulin, alpha Ab-2

aus Kaninchen (Klon:)

Dianova, Hamburg,

Deutschland

1:200

δENaC (H-230) Antikörper

rabbit polyclonal IgG

Santa Cruz Biotechnology,

Inc., CA, USA

1:200

δENaC (N-20) Antikörper

goat polyclonal IgG

Santa Cruz Biotechnology,

Inc., CA, USA

1:100

Peroxidase AffiniPure Goat

Anti-Rabbit IgG

Jackson

ImmunoResearch, Suffolk

1:10000

Rabbit anti-goat IgG-HRP:

sc-2768

Santa Cruz Biotechnology,

Inc., CA, USA

1:5000

Donkey anti-goat IgG-

HRP: sc 2020

Santa Cruz Biotechnology,

Inc., CA, USA

1:5000

A-XIV Anlagen, Antikörper und Marker

Tabelle 25: Verwendete Größenmarker für biochemische und molekularbiologische Methoden

Bezeichnung Firma Größenangabe

Fast + RulerTM Low Range

DNA Ladder

Fermentas, St. Leon-Rot,

Deutschland

~50 bp bis ~1500 bp

PageRulerTM Prestained

Protein Ladder

Fermentas, St. Leon-Rot,

Deutschland

~10 kDa bis ~170 kDa

Anlagen, Geräte A-XV

Anlagen, Geräte

Tabelle 26:Verwendete Geräte

Gerät Hersteller

Autoklav 3850 EL Systec, Wettenberg, Deutschland

Blockthermostat BT200 Kleinfeld Labortechnik, Gehrden,

Deutschland

Blotapparatur Fastblot semi-dry B43 Biometra, Gottingen, Deutschland

Eppendorf Centrifuge 5415C Eppendorf, Hamburg, Deutschland

Eppendorf Centrifuge 5417R Eppendorf, Hamburg, Deutschland

Eppendorf Centrifuge 5702 Eppendorf, Hamburg, Deutschland

Eppendorf Centrifuge 5810R Eppendorf, Hamburg, Deutschland

Feinwaage CP124S Sartorius AG, Gottingenn,

Deutschland

Gefrierschrank Heraeus Herafreeze Kendro, Hanau, Deutschland

Gelkammer Biometra, Gottingen, Deutschland

Heizmagnetrührer RCT basic IKA® Werke GmbH & Co. KG,

Staufen,

Deutschland

Inkubator Heraeus BBD 6220 Kendro, Hanau, Deutschland

A-XVI Anlagen, Geräte

Kamera PowerShot G2 Canon Deutschland GmbH, Krefeld,

Deutschland

Milli-Q-Water Biocel Millipore, Bedford, USA

Neubauer Zahlkammer Paul Marienfeld GmbH & Co. KG,

Lauda-

Königshofen, Deutschland

pH-Meter inoLab pH Level 2 WTW GmbH & Co. KG, Weilheim,

Deutschland

Photometer WPA Biowave S2100 Biochrom AG, Berlin, Deutschland

Pipetten Typ Eppendorf-Research Eppendorf, Hamburg, Deutschland

Pipettierhilfe Pipetus Akku Hirschmann Laborgeräte, Eberstadt,

Deutschland

Rollinkubator RM5 Karl Hecht KG, Sondheim,

Deutschland

Schüttler Typ 3005 GFL®, Burgwedel, Deutschland

SDS-Page Apparatur Minigel-Twin G42 Biometra, Gottingen, Deutschland

Sicherheitsgasbrenner Schuett Flammy S schuett-biotec GmbH, Göttingen,

Deutschland

Spannungsgeber Standard Power Pack P25 Biometra, Gottingen, Deutschland

Ussing-Kammer Prof. Willy van Driessche, KU

Leuven, Belgien

Vakuumpumpe Mini-Laborpumpe N86 K.N. 18 KNF Neuberger GmbH, Freiburg,

Anlagen, Geräte A-XVII

Deutschland

Vortexer MS1 Mini Shaker IKA® Werke GmbH & Co. KG,

Staufen,

Deutschland

Waage CP4202S Sartorius AG, Gottingenn,

Deutschland

Wärmeschrank WTC Binder WTC, Tuttlingen, Deutschland

Wasserbad Thermo Haake DC10/P5 Thermo Electron, Karlsruhe,

Deutschland

Wasserbad ISOTEMP210 Fisher Scientific, Schwerte,

Deutschland

Zellkultur-Werkbank Heraeus HERASafe HS15 Kendro, Hanau, Deutschland

A-XVIII Anlagen, Verbrauchsmaterialien

Anlagen, Verbrauchsmaterialien

Tabelle 27: Verwendete Materialien

Verbrauchsmaterial Hersteller

Costar® Well Cell Culture Cluster (3524) Corning Inc., Corning, USA

Costar® Transwell® Permeable Supports Ø

6,5 mm Polyester Membrane (0,33 cm2)

Corning Inc., Corning, USA

CryoPure Tube 1,8 ml Sarstedt, Nürmbrecht, Deutschland

Parafilm® M Roth, Karlsruhe, Deutschland

Reaktionsgefäße 1,5 ml / 2 ml Sarstedt, Nürmbrecht, Deutschland

Roti®-PVDF Membran Roth, Karlsruhe, Deutschland

Filterpapiere A. Hartenstein, Würzburg,

Deutschland

Zellkulturflasche T-25 Sarstedt, Nürmbrecht, Deutschland

Zellkulturflasche T-75 Sarstedt, Nürmbrecht, Deutschland

SPL Life Sciences, Pocheon-City,

Südkorea

Zentrifugenröhrchen 15 ml Sarstedt, Nürmbrecht, Deutschland

Zentrifugenröhrchen 50 ml Sarstedt, Nürmbrecht, Deutschland

Danksagung A-XIX

Danksagung

Herrn Prof. Dr. Wolf-Michael Weber danke ich für die Überlassung des interessanten

Themas, die freundliche Aufnahme in die Arbeitsgruppe sowie die Betreuung und

Begutachtung dieser Arbeit.

Herrn Prof. Dr. Dirk Labudde danke ich für die Übernahme des Korreferats und der damit

verbundenen externen Betreuung.

Besonders möchte ich mich bei Frau Dr. Nadine Bangel-Ruland und Frau Dr. Katja

Tomczak für die engagierte, kompetente Betreuung, die hilfreiche Unterstützung und das

Korrekturlesen meiner Materarbeit bedanken.

Allen Mittarbeitern der AG Weber danke ich für ihre ständige Hilfsbereitschaft, die vielen

guten Ratschläge und das freundschaftliche Arbeitsklima. Insbesondere bedanke ich mich

bei Conny Rohe und Elena Fernández Fernández für ihre tatkräftige Unterstützung und,

dass sie immer ein offenes Ohr hatten, wenn man es brauchte. Auch Knut danke ich,

dass er mir morgens um 8.30 Uhr ein Lächeln aufs Gesicht zaubern konnte. Den Bachelor

gilt ein besonderer Dank für die sehr lustigen Momente, die wir in unserer Zeit zusammen

in der Arbeitsgruppe Weber erleben durften. Besonders hervorheben möchte ich Inga

Höben, die mich zu immer neuen Denkanstößen motiviert hat und bedanke mich herzlich

für die gute Zusammenarbeit.

Ein weiterer, besonderer Dank gilt Anika Nicolaudius, die ohne zu zögern meine Arbeit

Korrektur gelesen hat.

Mein herzlicher Dank gilt meiner Familie, besonders meinen Eltern, meiner Schwester

und meiner Oma, die mir durch ihre ausnahmslose und liebevolle Unterstützung

ermöglicht haben, weiterhin meinen eigenen Weg zu gehen und mich bei meinem

bisherigen Lebensweg, trotz vieler Komplikationen, tatkräftig unterstützt haben. Danke,

dass ihr immer für mich da seid.

Zum Schluss gilt ein besonderer Dank meinem Freund Sven, der gerade in den letzten

Zügen meiner Masterarbeit immer hinter mir stand und der Ruhepol an meiner Seite ist.

Ich danke ihm dafür, dass er mich durch seine Liebe und Geduld immer wieder auffangen

konnte und mich so tatkräftig bei allem unterstützt.

Selbstständigkeitserklärung XXI

Selbstständigkeitserklärung

Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Arbeit selbstständig und nur unter

Verwendung der angegebenen Literatur und Hilfsmittel angefertigt habe.

Stellen, die wörtlich oder sinngemäß aus Quellen entnommen wurden, sind als solche

kenntlich gemacht.

Diese Arbeit wurde in gleicher oder ähnlicher Form noch keiner anderen Prüfungsbehörde

vorgelegt.

Münster, den 14.08.2013

Ann-Katrin Woiki