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Hämolymphe
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Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung...............................................................3
1.1. Blut und Hämolymphe..............................................3
1.2. Informationsübertragende Moleküle.......................3
1.2.1. Hormone......................................................................3
a) Einteilung nach chemischer Struktur
b) Molekulare Wirkungsmechanismen von Hormonen
1.2.2. Pheromone..................................................................6
1.2.3.Kairomone....................................................................6
1.2.4.Neurotransmitter..........................................................7
1.3. Hormonell gesteuerte Insektenentwicklung...........8
1.4. Photometer.................................................................9
1.5. Chromatographie.....................................................10
1.6. Aufgabenstellung des Versuches..........................13
2. Material und Methoden...........................................14
3. Ergebnisse...............................................................16
4. Diskussion...............................................................19
5. Quellenangaben......................................................21
Hämolymphe
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1. Einleitung
1.1. Blut und Hämolymphe
Als Blut wird die transportierende Flüssigkeit bezeichnet, welche in einem
geschlossenen Kreislaufsystem getrennt von der interstitiellen Flüssigkeit zirkuliert.
Blut besteht aus einer proteinhaltigen Lösung, dem Blutplasma, in welchem
Nährstoffe, Enzyme Antikörper, Hormone und Stoffwechselprodukte transportiert
werden, sowie aus zellulären Bestandteilen. Die Zellen des Blutes werden in drei
Gruppen eingeteilt:
Die Erythrocyten (rote Blutkörperchen) sind für den O2-Transport zuständig, die
Leukocyten (weiße Blutkörperchen) spielen eine wichtige Rolle bei der Immunabwehr
und die Thrombocyten (Blutplättchen) dienen dem Wundverschluss.
Im Gegensatz zum Blut, zirkuliert die Hämolymphe, welche aus Blut und interstitieller
Flüssigkeit besteht innerhalb eines offenen Kreislaufsystems. Durch das Herz wird
die Hämolymphe durch Arterien in ein Netzwerk aus Lakunen und Spalten gepumpt,
wo ein Stoffaustausch mit den Körperzellen stattfinden kann und über Ostien gelangt
sie wieder in das Herz zurück. Die Hämolymphe besitzt keine Erythrocyten,
Hämoglobin schwimmt also frei im Plasma, was einen ineffizienteren
Sauerstofftransport zur Folge hat. Insekten z.B. kompensieren dies mit einem
Tracheensystem, das die Sauerstoffversorgung zum größten Teil übernimmt.
1.2. Informationsübertragende Moleküle
1.2.1. Hormone
a) Einteilung nach chemischer Struktur Einleitende Worte wären nicht schlecht.
Obwohl alle Hormone eine unterschiedliche chemische Wirkung aufweisen, kann
man sie aufgrund ihrer chemischen Abstammung in verschiedene Hormonklassen
einteilen:
Hämolymphe
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Amine (Aminosäureabkömmlinge) lassen sich von Aminosäuren ableiten. Beispiele
hierfür sind Adrenalin, Thyroxin.
Fettsäureabkömmlinge sind cyclisch ungesättigte Fettsäuren, die meistens aus
Lipiden der Plasmamembran gebildet werden, z.B.: Prostaglandin.
Steroide sind cyclische Kohlenwasserstoffderivate, die aus Cholesterin synthetisiert
werden, z. B.: Östrogen, Testosteron, Cortison.
Proteo – und Peptidhormone bestehen aus kurzen oder längeren Amino-
säureketten, darunter zählen: Insulin, Glukagon, Releasing-Hormone.
b) Molekulare Wirkungsmechanismen von Hormonen
Hydrophobe (fettlösliche) Hormone:
Hydrophobe Hormone, wie z.B. Steroide und Schilddrüsenhormone können
ungehindert die Zellmembran durchdringen und an die cytoplasmatischen
Rezeptoren der Zielzellen binden. Sie werden im Blutstrom von Trägerproteinen
transportiert. Löst sich ein Hormon von seinem Trägerprotein kann es an einen
spezifischen Rezeptor in der Zielzelle binden wodurch ein Hormon-Rezeptor-
Komplex entsteht. Dieser wandert in den Zellkern und aktiviert oder deaktiviert die
Transkription eines Gens indem er an die DNA bindet. Dieser Vorgang ist in
Abbildung 1 dargestellt.
Abb. 1: Genaktivierungsprinzip
Campbell, Biologie, S.1002, 2.Auflage
Hämolymphe
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Hydrophile (fettunlösliche) Hormone:
Im Gegensatz zu den hydrophoben Hormonen können hydrophile Hormone, wie z.B.
Amine, Peptid- und Proteohormone die Cytoplasmamembran nicht passieren. Sie
binden an Rezeptoren an der Zelloberfläche, wodurch ein Umwandler-/
Überträgerprotein (Transducer) aktiviert wird. Dieses wiederum aktiviert ein
Verstärkerprotein, welches die Bildung eines Second messengers bewirkt. Der
Second messenger bindet an Regulatorproteine, welche eine Zellantwort hervorrufen
indem sie verschiedene Effektoren kontrollieren.
Um dies zu verdeutlichen wird die Bildung des Second messengers cAMP
(zyklisches Adenosinmonophosphat) näher betrachtet, was auch in Abbildung 2
gezeigt wird.
Durch die Bindung des Hormons an den membranständigen Rezeptor wird das G-
Protein aktiviert. G–Proteine sind molekulare Überträgerstoffe, die eine aktivierende
oder eine hemmende Wirkung ausüben können. Durch die Bindung des Hormons an
den Rezeptor wird die Bindung von GTP an das G-Protein stimuliert und dadurch
aktiviert. Aktivierung wird das am G–Protein vorhandene GDP zu GTP
(Guanintriphosphat) phosphoryliert (das stimmt nicht! Woher habt ihr das??) Das G-
Protein aktiviert daraufhin durch Bindung an das Enzym Adenylatcyclase diese. Die
Adenylatcyclase setzt nun ATP zu cAMP um, welches ein weiteres Enzym, die
cAMP-abhängige Proteinkinase (A-Kinase) beeinflusst. A-Kinasen bestehen aus
einer regulatorischen und einer katabolischen Untereinheit. Sie werden aktiviert,
indem cAMP die regulatorische Untereinheit entfernt, woraufhin die katalytische
Untereinheit frei wird und anschließend eine Enzymkaskade in Gang setzt.
Weitere Second messenger sind Diacylglycerin (DAG), Inositoltriphosphat (IP3),
zyklisches Guanosinmonophosphat (cGMP) und Calcium-Ionen, welche auch als
third messenger wirken können.
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Abb. 2: Second messenger Prinzip
Campbell, Biologie, S.1003, 2.Auflage
1.2.2. Pheromone
Pheromone sind chemische Botenstoffe, die der Kommunikation zwischen Individuen
gleicher Art dienen. Sie werden von exokrinen Drüsen gebildet und nach außen
abgegeben. Pheromone können z.B. in Form von Sexuallockstoffen auftreten oder
bei staatenbildenden Insekten der Erkennung der Mitglieder der eigenen Kolonie
dienen.
1.2.3.Kairomone
Kairomone sind exokrine Botenstoffe, die der Kommunikation zwischen Individuen
verschiedener Arten dienen. Ein Beispiel für Kairomone ist u.a. das Häutungshormon
Ecdyson, das vom Körper synthetisiert wird und der Frasshemmung dient.
Kairomone sind aber oftmals auch mit der Nahrung aufgenommene sekundäre
Pflanzenstoffe, die ebenfalls eine Frasshemmung hervorrufen.
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1.2.4.Neurotransmitter
Neurotransmitter wie z.B. Acetylcholin (ACh), Adrenalin und Noradrenalin sind
chemische Botenstoffe, die der Signalübertragung zwischen Nervenzellen dienen,
wie in Abbildung 3 verdeutlicht wird. Sie werden in der präsynaptischen Membran
eines Neurons gebildet und werden durch ein Aktionspotential angeregt aus der Zelle
über den synaptischen Spalt zur Membran des postsynaptischen Neurons zu
diffundieren. Dort leiten sie das Signal weiter indem sie an membranständige
Rezeptoren binden. Neurotransmitter wirken sehr schnell, haben aber nur einen
kleinen Wirkungsradius, da sie rasch abgebaut werden.
Abb.3: Erregungsübertragung durch Transmitter an einer Synapse
aus: Linder, Biologie, 20.Auflage, Hannover, Schroedel Schulbuchverlag GmbH
Hämolymphe
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1.3. Hormonell gesteuerte Insektenentwicklung
Insekten lassen sich anhand ihrer Entwicklung in zwei Gruppen einteilen, in
hemimetabole und holometabole Insekten.
Bei den hemimetabolen Insekten findet eine unvollständige Metamorphose durch
Larvalhäutungen statt und sie besitzen kein Puppenstadium. Larve und Imago
ähneln sich phänotypisch während sich bei holometabolen Insekten das Aussehen
des adulten Tiers von dem der Larve unterscheidet. Die vollständige Metamorphose
der holometabolen Insekten beinhaltet drei Stadien:
Larve (Fressstadium), Puppe (morphologische Neuorganisation) und Imago
(reproduktives Stadium).
Da Insekten ein starres Exoskelett besitzen, müssen während dem Larvenstadium
Häutungen erfolgen damit eine Körpervergrößerung stattfinden kann. Hierzu wird in
neurosekretorischen Zellen im Gehirn das prothoracotrope Hormon (PTTH) gebildet,
welches über die Hämolymphe zur Prothoraxdrüse gelangt und dort die Synthese
und Ausschüttung des Hormons α-Ecdyson bewirkt. α-Ecdyson wird in den Zielzellen
in seine aktive Form 20-Hydroxy-Ecdyson (20-EOH) umgewandelt, welches die
Häutung induziert. Nachdem die alte Cuticula abgestoßen wurde, wird durch das
neurosekretorische Hormon Bursicon die Gerbung der neuen Cuticula, welche
bereits gebildet wurde, induziert.
Die Entwicklung zu den einzelnen Stadien wird über das Juvenilhormon (JH)
reguliert, welches im Neurohämalorgan Corpora allata synthetisiert wird. Ist die
Konzentration des Juvenilhormons hoch wird die Entwicklung zum adulten Tier
verhindert und die Häutung führt zu einem weiteren Larvenstadium. Die
Metamorphose wird also durch das Juvenilhormon unterdrückt. Sinkt die
Konzentration des JH unter einen bestimmten Schwellenwert entsteht nach der
Häutung eine Puppe. Während dem Puppenstadium wird die Larve an sich
enzymatisch aufgelöst und durch embryonale Stammzellen morphologisch neu
organisiert. Am Ende der Puppenphase wird durch das Eclosionshormon, welches in
neurosekretorischen Zellen gebildet wird, das Schlüpfen des Imagos initiiert.
Im Adultstadium steigt die Konzentration des Juvenilhormons wieder an und fördert
beim Männchen die Bildung akzessorische Geschlechtsorgane, beim Weibchen die
Eidottersnythese. Der Weg der Hormone und ihre Bildungsweise werden in Abb. 4
genauer gezeigt.
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Abb. 4: Zusammenhang zwischen JH-Titer und Entwicklungsstadien [Verändert Aus Campbell; Biologie; 2. korrigierter Nachdruck 2000; Heidelberg - Berlin - Oxford: Spektrum Akad. Verlag]
1.4. Photometer
Ein Photometer misst wie viel Licht durch eine Lösung dringt bzw. von ihr absorbiert
wird. Dazu wird Licht aus einer Lampe auf ein Prisma fallen gelassen, welches das
Licht in unterschiedliche Wellenlängen, also in monochromatisches Licht aufspaltet.
Bei einem Einstrahlphotometer wird dieses dann direkt durch die Probe geschickt.
Der durchgelassene Anteil wird von einer Photozelle registriert, die die
Lichtenenergie in elektrischen Strom umwandelt, den im Anschluss ein
Galvanometer misst. Das Galvanometer zeigt an, welcher Teil des Lichtes absorbiert
(Extinktion) wurde bzw. welcher Teil durch gelassen wurde (Transmission). Es kann
also nur eine Lösung entweder die Probe oder die Referenz gemessen werden.
Bei einem Zweistrahlphotometer wird das Licht durch einen Strahlenteiler geteilt
und dann über Spiegel sowohl in die Probe, wie auch in die Referenz gesendet. Der
durchgelassene Anteil wird entweder über zwei Detektoren gemessen oder über
Spiegel wieder zusammengeführt und dann von einem Galvanometer kurz
hintereinander gemessen.
Hämolymphe
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1.5. Chromatographie
Chromatographie ist eine Trennmethode, bei der eine Substanzmischung (=Analyt)
mit Hilfe eines Laufmittels (=mobile Phase) durch eine Säule geleitet wird. Diese
Säule ist mit einem Füllmaterial (=stationäre Phase, Matrix) gefüllt. Beim Transport
des Analyten (Elution) durch die Säule geht dieser Wechelwirkungen mit der
stationären Phase ein, was bewirkt dass der Analyt, je nach Bindungsstärke und
Molekülgöße von der stationären Phase zurückgehalten wird (=Retention). Das Eluat
benötigt also eine bestimmte Zeit um die Trennstrecke zu durchlaufen, diese wird als
Retentionszeit bezeichnet. Die Trennung kann isokratisch ablaufen, was bedeutet,
dass die Zusammensetzung der mobilen Phase während der Trennung konstant
bleibt, so wie es bei unserem Versuch durchgeführt wurde. Im Gegensatz hierzu gibt
es die Gradiententrennung, bei der die Laufmittelzusammensetzung während der
Trennung in ihrer Konzentration geändert wird.
Grundlegend unterscheidet man, in Abhängigkeit vom Trägermaterial, Papier-,
Dünnschicht- und Säulenchromatographie, von denen hier nur die unterschiedlichen
Methoden der Säulenchromatographie betrachtet werden. Diese sind die Gel-,
Ionenaustausch-, Affinitäts-, Absorptions- und Hochleistungsflüssigkeits-
chromatographie.
Ausschlusschromatographie (Gelchromatographie)
Bei dieser Form der Chromatographie werden die Moleküle des Analyten nach ihrer
Größe getrennt. Die stationäre Phase ist hierbei ein poröses Trägermaterial mit einer
bestimmten, definierten Porengröße, die abhängig von der Art des Trägermaterials
ist. Passiert die mobile Phase mit dem Analyten die stationäre Phase können große
Moleküle nicht in die Poren der Matrix eindringen und eluieren zusammen mit dem
Lösungsmittel. Sind die Moleküle klein, können sie ungehindert in die Poren
eindringen, wodurch sie festgehalten werden. Dies bewirkt, dass sie länger brauchen
um die Trennstrecke zu passieren und somit als letztes eluiert werden.
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Ionenaustauschchromatographie
Grundlage für die Ionenaustauschchromatographie sind die Wechselwirkungen
zweier gegensätzlich geladener Ionen. Diese Methode ist vor allem für die Trennung
von Proteinen wichtig. Diese besitzen eine Aminogruppe und eine Carboxylgruppe,
die in Abhängigkeit vom pH-Wert ionisiert vorliegen (Aminogruppe positiv geladen,
Carboxylgruppe negativ geladen), so dass sie an Moleküle mit kationischem bzw.
anionischem Charackter (z. B. -NR3+, -SO3
-, -COO-) in der stationären Phase binden
können. Dabei gilt: je stärker dabei die Proteine geladen sind, desto stärker ist die
Bindung an den Ionenaustauscher. Die mobile Phase wird durch die Säule gespült,
wobei die amphoteren Proteine binden, die restlichen Moleküle passieren die
Trennstrecke. Später kann man nun durch eine Erhöhung der Salzkonzentration oder
eine pH-Wert Veränderung die Proteinmoleküle von der stationären Phase lösen
bzw. verdrängen: Durch schrittweise Erhöhung der Salzkonzentration werden zuerst
die schwächer ionisierten Proteine von den dazu gegebenen Salzen verdrängt, da
die zugegebenen Salzionen eine größere Affinität zu den Ladungen auf der Matrix
aufweisen, als die dort festgehaltenen Moleküle. Somit kann man durch stetiges
erhöhen der Salzkonzentration die Substanz je nach Affinität auswaschen.
Affinitätschromatographie
Die Affinitätschromatographie ist eine sehr spezifische und selektive Methode der
Chromatographie. Hierbei werden auf der stationären Phase Moleküle gebunden, die
eine spezifische Bindungsstelle zu dem gesuchten Molekül (Adsorbent) haben.
Beispiele hierfür sind Antigen und Antikörper oder Enzym und Substrat, folglich
bedeutet das im Allgemein eine Wechselwirkung zwischen Rezeptor und Ligand. Um
einen Rezeptor aus einem Proteingemisch zu isolieren, stellt man synthetische den
Liganden her, so dass dieser kovalent an die stationäre Phase binden kann. Wenn
nun die mobile Phase mit dem Analyten durchläuft, binden die Rezeptoren an den
Ligand. Um den Adsorbenten wieder von der Matrix zu lösen, benutzt man entweder
Moleküle die den Rezeptor kompetitiv verdrängen oder man verändert den pH-Wert
oder die Ionenstärke, so dass der Rezeptor in seiner Konformation geändert wird und
somit vom Liganden gelöst wird.
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Adsorptionschromatographie
Adsorptionschromatographie ist der Affinitätschromatographie sehr ähnlich. Der
Grundlegende Unterschied besteht in der stetigen und reversiblen Anlagerung der
Trennsubstanzen an der Oberfläche der stationären Phase. Je nach stärker der
Bindung (oftmals Dipol-Dipol-Wechselwirkungen) zu mobiler und stationärer Phase
werden die Substanzen stärker adsobiert, also festgehalten, oder stärker eluiert,
sprich mit der mobilen Phase weiter getragen, so dass eine Trennung der
Komponenten erreicht wird. Diese Chromatographiemethode wird vorwiegend für
polare, nicht-ionische organische Substanzen genutzt.
Reversed-Phase-Chromatographie (RPC)
Die Reversed-Phase-Chromatographie ist vor allem eine Trennmethode für Peptide,
da die stationäre Phase als Trägermaterial keine polare Hydroxygruppen besitzt, wie
bei Cellulose, Papier oder porösem Kieselgel. Anstatt dessen besteht das
Trägermaterial aus polaren Hydroxygruppen, welche mit unpolaren
Kohlenwasserstoffen (Umkehrphase) verethert sind. Somit bindet der Analyt, der sich
in einem polaren, wässrigen Lösungsmittel befindet, über hydrophobe
Wechselwirkungen an die stationäre Phase. Die Elution erfolgt durch die
Veränderung der mobilen Phase, der ein unpolares, organisches Lösungsmittel
verstärkt hinzu gegeben wird. Dies bewirkt, dass die an die stationäre Phase
gebundenen Moleküle mit dem Lösungsmittel um die Bindungsstelle konkurrieren
und bei steigender Konzentration des Lösungsmittels verdrängt werden.
Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC)
Die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (high performance/pressure liquid
chromatography) ist ein Verfahren der Säulen-Flüssigkeitschromatographie, bei der
die Matrix sehr dicht gepackt ist. Die mobile Phase würde die stationäre Phase
aufgrund ihrer hohen Dichte nur sehr langsam passieren, deshalb wird Druck
angelegt, um die Flussrate zu erhöhen. Dies geschieht mittels einer Pumpe, die das
Lösungsmittel kontinuierlich mit einer bestimmten Flussrate, (in unserem Versuch
1ml/min) durch die Säule transportiert.
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1.2. Aufgabenstellung
Das Thema unseres Versuches sind Stoffe, die bestimmte Tiergruppen zur Abwehr
von Fressfeinden benutzen. Diese werden in der Hämolymphe transportiert und
wirken bei den Angreifern über spezifische Rezeptoren im Mundbereich.
Ein Beispiel für solche Stoffe sind Ecdysteroide, zu denen das α-Ecdyson und das β-
Ecdyson (20-OH-Ecdyson) gehören.
In unserem Versuch sollen diese beiden Stoffe nun über die HPLC- Methode und
das Zweistrahl-Photometer nachgewiesen und charakterisiert werden. In einem
weiteren Teilversuch wird diese Fraßhemmung am Beispiel der Strandkrabbe
Carcinus maenas untersucht. Dabei verwendet man Futterpellets, die verschiedene
Konzentrationen an α-Ecdyson und β-Ecdyson enthalten.
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2. Material und Methoden
Versuch 1: HPLC-Trennung und Fraktionierung
Im folgenden Abschnitt wird allgemein das Funktionsprinzip der HPLC erläutert:
Zuerst werden die unterschiedlichen Laufmittelkomponenten in die Ent-
gasungseinheit geführt und dort entgast, das bedeutet, dass die im Laufmittel
vorhandene Luft entweicht. Anschließend werden sie in der Mischereinheit gemischt.
Von dort werden sie zu den Pumpen geleitet, die im Gegentakt arbeiten, um so einen
kontinuierlichen, nicht pulsierenden Druck zu erzeugen.
Danach wird manuell der Analyt über den Injektor in eine Probenschleife (Loop)
injiziert. Der Loop schüttet dann bei Programmstart eine genau definierte Menge des
Analyten in die Säule. Dort wird der Analyt mit Hilfe der mobilen Phase durch die
stationäre Phase geleitet und getrennt. Die getrennten Substanzen fließen über eine
Mikroküvette in das Photometer, wo die Absorption der Teilsubstanzen gemessen
wird. Danach werden die noch übrigen Substanzen fraktioniert oder in das
Abfallgefäß geleitet. Die vom Photometer gemessenen Werte werden anschließend
von einem Analog/Digital-Wandler umgewandelt, so dass das anschließende
Steuergerät die Daten auswerten kann. Das Steuergerät war bei unserem Versuch
ein Computer, der das Absorptionsspektrum aufzeichnet und speichert, so dass es
ausgedruckt werden kann.
Hämolymphe
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Eine HPLC ist wie in Abb.5 zu sehen aufgebaut:
Abb.5: Aufbau einer HPLC
Verändert nach: www.uni-ulm.de/biologie1/hämolymphe
In unserem Versuch wird ein Substanzgemisch getrennt, das 40 %iges Methanol und
die beiden Ecdysteroide enthält.
Als stationäre Phase wird eine RP-18 Absorptionssäule verwendet und als mobile
Phase H2O und Methanol, die mit einer Flussrate von 1ml/min durch die Säule
gepresst wird.
In den ersten 20 Minuten wird das Substanzgemisch über das Injektionsventil
eingespritzt, von wo aus es in die Säule gelangt. Hier werden die Stoffe voneinander
getrennt, wobei sie charakteristische Peaks erzeugen. Diese sind im
Chromatogramm (Abb.1 des Anhangs) dargestellt.
Die nächsten 10 Minuten läuft 100%iges Methanol durch das Gerät, um es zu
säubern. Dann wird weitere 15 Minuten 40%iges Methanol injiziert, um die
Ausgangsbedingungen wiederherzustellen.
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Versuch 2: Charakterisierung der getrennten Stoffe durch das
Photometer
Die zu Beginn des ersten Versuches fraktionierten Proben wurden in
Reaktionsgefäßen aufgefangen. Nun werden sie in Quarzküvetten umgefüllt und
anschließend bei einer Wellenlänge von 200 nm bis 400 nm photometriert. Dabei
dient 16 %iges Methanol als Nullabgleich.
Nun kann man mit dem Lambert-Beer`schen Gesetz die Konzentrationen von α - und
β – Ecdyson berechnen:
E = ε * c * d E = Extinktion
ε = Extinktionskoeffizient
c = Konzentration
d = Schichtdicke der Küvette
Um die Konzentration berechnen zu können, muss man die Gleichung
folgendermaßen umstellen:
c = d*ε
E
Versuch 3: Biologischer Test
Als erstes müssen die Futterpellets hergestellt werden.
Dabei werden die eingetrockneten Proben (Konzentrationen wie in Tabelle 1) mit
20µl dH2O gelöst, gut geschüttelt und kurz zentrifugiert.
Gleichzeitig erwärmt man Muschelpulver-Gelatine (MUPU-Gelatine), von der dann
40µl möglichst schnell dazugegeben werden, da sie sehr rasch wieder fest wird.
Anschließend werden die Proben erneut geschüttelt, kurz zentrifugiert und jeweils
auf eine Petrischale pipettiert. Nach dem Festwerden zerschneidet man die Pellets in
kleine Stücke, die jetzt an die Krabben verfüttert werden.
Als Leerprobe dienen Pellets aus 60 µl H2O und 120 µl MUPU.
Die Proben werden nun nacheinander an die Versuchstiere verfüttert, wobei getestet
wird, ab welcher Konzentration die Fraßhemmung eingesetzt hat. Vor dem Versuch
Hämolymphe
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und bei Verweigern der Probe wird eine Negativkontrolle mit einer Leerprobe
durchgeführt.
Teilversuch:
Bei den gleichen Tieren aus Versuch 3 wird nun die Fraßhemmung untersucht, wenn
sie statt synthetisch hergestellte Pellets Raupen zu Fressen bekommen. Diese
Raupen wurden am Anfang des Semesters mit Senfblättern gefüttert, die die
fraßhemmende Substanz Sinalbin enthalten. Vor ein paar Wochen wurde das Futter
von Senfblättern auf Cinakohl umgestellt. Nun soll anhand der Hemmung untersucht
werden, ob noch Sinalbin in den Tieren enthalten ist.
3. Ergebnisse
Versuch 1: HPCL
Im Chromatogramm sind drei unterschiedliche Peaks zu sehen.
Der erste beginnt 4 Minuten nach Versuchsbeginn, dauert ca. 3 Minuten und hat sein
Maximum knapp über 20 mV.
Der zweite Peak startet nach 9 Minuten und dauert ebenfalls ca. 3 Minuten, ist aber
im Gegensatz zum ersten deutlich schwächer. Er erreicht sein Maximum ungefähr
bei 5 mV.
Beim dritten Peak befindet sich der höchste Wert bei ca. 125 mV und er dauert 15
Minuten.
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Versuch 2: Charakterisierung der Ecdysone, Berechnung der
Konzentrationen
Die mit dem Photometer ermittelten Kurven befinden sich im Anhang.
Dadurch lassen sich die Konzentrationen der beiden Ecdysteroide im Stoffgemisch
mit Hilfe des Lambert-Beer`schen Gesetzes berechnen.
a) Konzentration α-Ecdyson
Absorptionsmaximum bei Absmax = 272 nm (im Spektrum abgelesen)
Extinktionsmaximum bei Emax = 0,19 (im Spektrum abgelesen)
gegeben: log ε = 4,093 → ε = 12388 cm*mol
l
d = 1 cm
c = 1cm*
cm*mol
l12388
19,0 Einheiten?= 1,53 * 10-5
l
mol
b) Konzentration β-Ecdyson
Absorptionsmaximum bei Absmax = 270 nm (im Spektrum abgelesen)
Extinktionsmaximum bei Emax = 0,17 (im Spektrum abgelesen)
gegeben: log ε = 4,103 → ε = 12676,5 cm*mol
l
d = 1 cm
c = 1cm*
cm*mol
l12676,5
17,0 Einheiten = 1,34 * 10-5
l
mol
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Versuch 3: Biologischer Test
In der folgenden Tabelle 1 sind die Ergebnisse der Fraßhemmung bei Carcinus
maenas mit α-Ecdyson dargestellt. Hierbei wurden zwei verschiedene Versuchstiere
verwendet. Beide Krabben haben zwischendurch alle Leerwertproben gefressen, so
dass die Richtigkeit des Versuchs gewährleistet ist
Tab.1: Reaktion auf die Futterpellets mit α-Ecdyson
C7 (0,337 nmol) C6 (0,675 nmol) C5 (1,350 nmol) C4 (2,700 nmol)
5,616*10-6 µmol/µl 1,125*10-5 µmol/µl 2,25*10-5 µmol/µl 4,5*10-5 µmol/µl
Tier 1 - - - nicht
angenommen
Tier 2 Keine Angabe Keine Angabe Keine Angabe +
+ = positive Reaktion => Futterpellet wird nicht gefressen
- = negative Reaktion => Futterpellet wird gefressen
Tier 1: weiblich, adult
Tier 2: männlich, juvenil
In Tabelle 2 sind die Ergebnisse der Frasshemmung bei β-Ecdyson dargestellt.
Tab.2: Reaktion auf die Futterpellets mit β-Ecdyson
C5 (1,350 nmol) C4 (2,700 nmol) C3 (5,400nmol)
2,25 *10-5µmol/µl 4,5 *10-5 µmol/µl 9 *10-5 µmol/µl
Tier 2 - - +
Teilversuch:
Tier 1 und 2 aus Versuch 3 haben das Futter verweigert.
Ein drittes Versuchstier (männlich, adult) hat die Raupe kurz in den Mund
genommen, aber sofort wieder ausgespuckt.
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4. Diskussion
Versuch 1: HPLC
In unserem Chromatogramm (Abb. 1 des Anhangs) sind 3 Peaks zu sehen, die sich
sowohl in ihrem Maximum als auch in ihrer zeitlichen Reihenfolge unterscheiden.
Als Methode liegt dem Versuch die Reversed-Phase-Chromatographie zugrunde,
d.h. polare Stoffe passieren die stationäre Phase schneller als unpolare.
β-Ecdyson ist durch die zusätzlichen OH-Gruppen polarer als α-Ecdyson und gelangt
somit schneller durch die Chromatographiesäule. Daraus lässt sich schließen, dass
es sich beim ersten Peak um β-Ecdyson handelt. Folglich kann der zweite Peak dem
α-Ecdysons zugeordnet werden.
Beim dritten Peak handelt es sich um einen Reinigungspeak, der für unseren
Versuch keine weitere Bedeutung hat.
Versuch 2: Photometrie
Aus den ermittelten UV-Spektren (Abb. 2 und 3 des Anhangs) lassen sich nun die
Absorptionsmaxima der beiden Ecdysteroide ablesen. Laut unseren Ergebnissen
liegt das Absorptionsmaximum des α-Ecdysons bei 272 nm und das
Absorptionsmaximum des β-Ecdysons bei 270 nm. Literaturangaben zufolge beträgt
das Maximum des α-Ecdysons 242 nm und das des β-Ecdysons 240 nm.
Als mögliche Fehlerquellen kommen Messfehler des Photometers in Frage, da das
Gerät schon sehr alt ist. Ein weiterer Grund für die Ungenauigkeiten könnte sein,
dass die Küvette durch Fingerabdrücke verschmutzt war. Ein weiterer Fehler könnte
eine Verunreinigung der Hormone mit Fremdstoffen sein, da wie auch in den UV-
Spektren zu sehen sich bei der Absorption zwei leichte Peaks abzeichnen. Ebenfalls
als Fehlerquelle zu nennen, sind Pipettierfehler. ...weitere Gründe??
Mit Hilfe der Absorptionsspektren lassen sich die Konzentrationen der beiden
Substanzen im Stoffgemisch berechnen. Laut unseren Ergebnissen waren 1,53 * 10-5
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mol/l α-Ecdyson und 1,34 * 10-5 mol/l β-Ecdyson enthalten. Die tatsächlichen
Konzentrationen für beide Ecdysteroide beträgt aber 2,16 * 10-4 mol/l.
Die wahrscheinlichste Fehlerquelle ist auch hier wieder eine Funktionsstörung des
Photometers.
Versuch 3: Biologischer Test
Zuerst wurden dem ersten Versuchstier Futterpellets mit steigender Konzentration an
α-Ecdyson angeboten. Bei einer Konzentration von 4,5 *10-5 µmol/µl verweigerte die
Krabbe das Futter, wobei sie danach allerdings auch keinen Leerwert mehr annahm.
Deshalb kann man aus diesem Verhalten nicht unbedingt schließen, bei welcher
Konzentration die Fraßhemmung eingesetzt hat.
Aus diesem Grund gab man einem zweiten Versuchstier die Probe mit der höchsten
Konzenration an α-Ecdyson, das die Probe aber ebenfalls verweigerte. Anschließend
wurde mit einer Leerwertprobe die Fressbereitschaft des Tieres mit einer
Leerwertprobe untersucht. Da diese aber aufgenommen wurde, kann man daraus
schließen, dass das Verweigern der α-C4-Probe nicht an fehlendem Hunger, sondern
an der zu hohen Konzentration an α-Ecdyson gelegen hat. Somit setzte die
Fraßhemmung bei einer Konzentration von 4,5 * 10-5 µmol/µl an α-Ecdyson ein.
Beim Versuch mit β-Ecdyson war zu erwarten, dass die junge Strandkrabbe das
Futterpellet schon bei einer niedrigeren Konzentration verweigern würde, da es eine
stärkere Fraßhemmung auslöst. Das Tier hat die ersten beiden Proben mit β-
Ecdyson bereitwillig gefressen. Doch bei einer Konzentration von 9*10-5 µmol/µl hat
sie das Pellet wieder ausgespuckt. Anschließend wurde durch die Aufnahme des
Leerwert-Pellets sichergestellt, dass die Fraßhemmung eingesetzt hat.
Leider mussten verschiedene Strandkrabben als Versuchstiere herangezogen
werden, da eines der Tiere während der Tests die Lust am Fressen verloren hat.
Normalerweise sollte aber pro Versuchsreihe nur ein Tier verwendet werden, da ein
Auswechseln das Ergebnis verfälscht. In diesem Falle kann dies aber vernachlässigt
werden, da es mittlerweile als erwiesen gilt, dass die Tiere nahezu gleich reagieren.
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Teilversuch:
Dass die ersten beiden Versuchstiere das Futter verweigert haben, könnte daran
liegen, dass die Raupe als Beutetier zu groß war.
Das dritte Tier dagegen nahm die Raupe in den Mund, spuckte sie aber sofort wieder
aus. Dieses Verhalten bestätigt den Verdacht, dass die Raupe noch eine zu hohe
Konzentration am fraßhemmenden Sinalbin enthielt.
5. Quellenangaben
1. Versuchsskript „Kurs Hämolymphe“, Anfängerpraktikum Tierphysiologie,
WS 2004/5
2. Zoologie Wehner Gering, Thieme Verlag, 23.Auflage, 1995
3. Biologie, Campbell, Spektrum Akademischer Verlag, 2.Auflage, 2000
4. Tierphysiologie, Eckert, Thieme Verlag, 4.Auflage, 2002
5. Penzlin H.; Lehrbuch der Tierphysiologie, 4. Auflage, 1989
6. Linder, Biologie, 20.Auflage, Hannover, Schroedel Schulbuchverlag GmbH
