INHIBIČNÝ ÚČINOK RASTLINNÝCH MACERÁTOV NA …

Nova Biotechnologica (2004) 83

INHIBIČNÝ ÚČINOK RASTLINNÝCH MACERÁTOV NA FYTOPATOGÉNNE BAKTÉRIE

FRANTIŠEK GAGO, MARTIN PAJTINKA, EVA ŰRGEOVÁ

Katedra biotechnológií, Fakulta prírodných vied Univerzity sv. Cyrila a Metoda

v Trnave, Nám. J. Herdu 2, 917 01 Trnava ––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– Súhrn: Bolo skúmaných 26 metanolových macerátov častí siedmich rastlín zbieraných počas celého ich vegetačného obdobia. Išlo o rastliny: orech kráľovský (Juglans regia), chmeľ obyčajný (Humulus lupulus), ľuľok zemiakový (Solanum tuberosum), paprika ročná (Capsicum annuum), rajčiak jedlý (Lycopersicon esculentum), cesnak kuchynský (Allium sativum) a cibuľa kuchynská (Allium cepa), teda rastliny, u ktorých bola preukázaná prítomnosť antimikrobiálnych látok. Tieto maceráty boli testované difúznou platňovou metódou na troch kmeňoch fytopatogénnych baktérií: Acidovorax avenae subsp. avenae CCM 2761, Erwinia mallotivora CCM 2890 a Xanthomonas sp. CCM 2888. U Acidovorax avenae subsp. avenae CCM 2761 bol najúčinnejší macerát zo stonky sadenice rajčiaku. U Erwinia mallotivora CCM2890 bol najúčinnejší macerát zo zelenej šupy plodu orecha a u Xanthomonas sp. CCM 2888 macerát z listov kvitnúcej papriky a z klíčkov cibule.

Kľúčové slová: antimikrobiálne látky, cesnak, cibuľa, chmeľ, orech, paprika, rajčiak, zemiak –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––

1. Úvod

Mnohé rastliny produkujú metabolity s antibakteriálnymi alebo antifungáknymi vlastnosťami. Prítomnosť, obsah a množstvo týchto látok závisí od vegetačného obdobia, v ktorom sa daná rastlina nachádza, rovnako jako aj od časti, orgánu a druhu pletiva rastliny (MASAROVIČOVÁ a REPČÁK, 2002). Cesnak, cibuľa, chmeľ, paprika, orech, rajčiak a zemiak sú producenti významných antimikrobiálnych látok.

V orechu sa nachádza hydrojuglón-4-glukozoid, ktorý sa pri mikrobiálnom napadnutí buniek mení na antimikrobiálny juglón (MASAROVIČOVÁ a REPČÁK, 2002). Juglón vykazoval silnú toxicitu proti rozličným hubám a baktériám (MASAROVIČOVÁ a REPČÁK, 2002; MURRISSEY a OSBOURNE, 1999). Boli testované vodné, metanolové a chloroformové extrakty orechu (Juglans regia) na vybrané druhy mikroorganizmov (MEHRABIAN a kol., 2000). Tieto extrakty boli účinné na rast Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Bacillus mycoides, Aspergilus niger, Penicillium expansum a Geotrichum candidum, pričom najvyššiu účinnosť mali vodné a najnižšiu chloroformové extrakty mikroorganizmov. Extrakty z kôry orecha inhibovali rast Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Streptococcus mutans a Candida albicans (ALKHAWAJAH, 1997). Okrem juglónu (5-hydroxy-1,4-naftochinón) nachádzajúcom sa predovšetkým v žilnatine starých listov orechu, sú prítomné plumbagín a hydroplumbagín, ktoré sa nachádzajú hlavne v šupke plodu a v kôre stromu, a flavonoidy ako sú kvercetín, hyperozid, kvercetrín a kyseliny galová, kávová a neochlorogénová (DWECK, 1999). V orechu je prítomný aj lawsón (2–hydroxy–1,4-naftochinón), červené farbivo príbuzné s juglónom a s antibakteriálnymi vlastnosťami (DWECK, 2002). Juglón, plumbagín a lawsón inhibovali široké spektrum orálnych baktérií. Najnižšie inhibičnú aktivitu vykazoval plumbagín. Bol dokázaný synergický efekt medzi lawsónom a juglónom

84 Gago, F. et al. (DIDRY a kol., 1994). Podobne ako juglón aj hydrojuglón, ďalší metabolit nachádzajúci sa v orechu, je väčšinou prítomný vo forme monoglukozidov (DWECK, 1999). Juglón reaguje s keratínovými proteínmi prítomnými v koži za vzniku sklerojuglónových zložiek (DWECK, 2002).

Chmeľ obyčajný (Humulus lupulus) produkuje rôzne metabolity, napr.: horké kyseliny, humulón, lupulón a lupulín, ktoré majú antimikrobiálne vlastnosti. Bolo zistené, že antibakteriálna aktivita horkých kyselín testovaných na baktérii Lactobacillus brevis IFO3960 stúpa s klesajúcim pH. Pri testovaní ďalších látok nachádzajúcich sa v chmeli sa zistilo, že antibakteriálna aktivita izohumulónu bola 20 krát vyššia než humulónu, 11 krát vyššia než kolupulónu a 9 krát vyššia než trans-humulínových kyselín. (SIMPSON A SMITH, 1992). Éterické oleje získané z 11 kultivarov chmeľu ihibovali rast Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus a Trichophyton mentagrophytes var. interdigitale, nemali však skoro žiaden účinok na rast Escerichia coli a Candida albicans (LANGEZAAL a kol., 1992). Z chmeľu boli izolované oligomérne proantokyanidíny pozostávajúce z polyfenolových tanínov, katechínu a epikatechínu s antimikrobiálnymi účinkami (STEVENS a kol., 2002; TAYLOR a kol., 2003). Niektorí autori študovali biosyntézu humulónu (GOESE a kol., 1999) a akumuláciu α-kyselín, β-kyselín a xantohumolu v rastline počas kvitnutia (DE KEUKELEIRE a kol., 2003).

Celý rod Capsicum, druh Capsicum annuum nevynímajúc, produkuje široké spektrum sekundárnych metabolitov, medzi ktorými sa nachádzajú karotenoidové pigmenty (kapsantín, kapsorubín), karotén, luteín, zeaxantín, kukurbitaxantín a kapsaicín (DWECK, 2002). Najznámejším sekundárnym metabolitom nachádzajúcim sa v paprike je kapsaicín. Antimikrobiálny účinok kapsaicínu je spôsobený poškodením bunkovej membrány mikroorganizmu. Práve tento terpenoid spôsobuje charakteristickú vôňu papriky (COWAN, 1999). Antimikrobiálne vlastnosti paprikových extraktov, resp. samotného kapsaicínu boli testované na Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Clostridium sporogenes, Clostridium tetani a Streptococcus pyogenes (CHICHEWICZ a THORPE, 1996), Helicobacter pylori (JONES a kol., 1997), Salmonella typhimurium, Pseudomonas aeruginosa (CAREAGA a kol., 2003). Zo semien papriky ročnej (Capsicum annuum L. var. Acuminatum) boli získané tri nové furostanolové saponíny: kapsikozid E, kapsikozid F a kapsikozid G. Tieto mali vyššiu antimikrobiálnu aktivitu proti kvasinkám než proti vláknitým hubám (IORIZZI a kol., 2002). Niektorí autori sledovali produkciu kapsaicínu imobilizovanými bunkami druhov Capsicum sp., Capsicum frutescens a Capsicum annuum, ako aj pôsobenie nutričného stresu na túto produkciu (MULABAGAL a kol., 2004; RAMACHANDRA a RAVISHANKAR, 2002; RAVISHANKAR a kol., 1988).

Rajčiak jedlý (Lycopersicon esculentum) obsahuje najmä fenolové látky, fytoalexíny, nízkomolekulové peptidy, inhibítory proteáz a glykoalkaloidy (FRIEDMAN, 2002). Lykopén je červené až oranžové farbivo (DWECK, 2002) nachádzajúce sa v zrelých alebo dozrievajúcich plodoch rajčiaku. Tomatín je steroidný glykoalkaloid, ktorý má antifungálne a antibakteriálne vlastnosti (FRIEDMAN, 2002; KOZUKUE a kol., 2004; PERÉZ-ESPINOZA a kol., 2001). Niektoré fytopatogénne mikroorganizmy však produkujú enzým tomatinázu, ktorý štiepi aktívny α-tomatín za vzniku na mikroorganizmy neúčinných látok. Medzi takéto mikroorganizmy patria Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici štiepiaca α-tomatín na aglykón tomatidín a tertrasacharid lykotetraózu (ITO a kol., 2004), Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici


(ROLDAN-ARJONA a kol., 1999) a Septoria lycopersici štiepiaca α-tomatín za vzniku neúčinného β2-tomatínu (BOUARAB a kol., 2002). PAL-5 je rastlinný gén, kódujúci syntézu fenylalanínamoniaklyázy účinkujúcej na Erwinia carotovora (YI, 2004). Obsah α-tomatínu a dehydrotomatínu v rajčiaku sa podľa výskumov pohybuje v rozpätí 521 µg/g až 16285 µg/g, resp. 42 µg/g až 1498 µg/g rastliny, pričom pomer zastúpenia α-tomatínu a dehydrotomatínu je v rozmedzí 10.9 : 1 až 12.5 : 1 (KOZUKUE a kol., 2004). Pri skúmaní antibakteriálneho účinku éterických olejov získaných z pukov rajčiaku proti Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 5638-P, Candida albicans ATCC 885-653 a rôznym mikroorganizmom z rodov Enterobacter, Streptococcus, Staphylococcus, Klebsiella a Escherichia sa zistila spojitosť medzi antimikrobiálnou účinnosťou a prítomnosťou organických kyselín (VOROBEV a kol., 1998).

Medzi najznámejšie antimikrobiálne látky v zemiaku patrí alkaloid solanín (OSBOURN, 1999). Zemiaky (Solanum tuberosum), pri napadnutí baktériou Agrobacterium rhizogenes, produkujú štyri seskviterpénové fytoalexíny – rišitín, lubimín, fytuberín a fytuberol. Najviac prevládal lubimín 171 µg/g a rišitín 213 µg/g. Bola tiež produkovaná kyselina 9-hydroxyoktadekadienová a kyselina 9-hydroxy-oktatrienová. Pri testovaní týchto látok bol pozorovaný ich synergický účinok (KOMARAIAH a kol., 2003). Niektoré fytopatogénne druhy húb sú proti týmto fytoalexínom intaktné. Giberrella pulicaris parazitujúca na zemiakových hľuzách je rezistentná voči pôsobeniu rišitínu a lubimínu (FLEISSNER a kol., 2002). Zo zemiakových listov Solanum tuberosum var.MS-42.3 (FENG a kol., 2003) sa izoloval proteín označený ako AP(1), ktorý inhiboval rast piatich kmeňov baktérie Ralstomia solanacearum a dvoch hubových patogénov Rhizoctonia solani a Alternaria solani izolovaných zo zemiakov (FENG a kol., 2003). Zo zemiaku bol izolovaný polypeptid pseudotionín St 1 (PTH-St 1), ktorý bol aktívny proti Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus (MORENO a kol., 1994). Tento polypeptid bol taktiež účinný proti Pseudomonas solanacearum a Fusarium solani. Koncentrácia mRNA pre tento polypeptid bola najvyššia v zemiakových hľuzách a v kvetoch, najnižšia v koreňoch a listoch. Zo zemiaku (Solanum tuberosum) a rajčiakovca repového (Cyphomandra betacea Sendt.) bol izolovaný proteín, ktorý vykazoval inhibičnú aktivitu proti Xanthomonas campestris pvar. vesicatoria CECT 124, Pseudomonas solanacearum CECT 125, Pseudomonas corrugata CECT 124, Pseudomonas syringae a Erwinia carotovora var. carotovora (ISLA a kol., 2002). V zemiakoch je tiež prítomná kyselina chlorogénová, antimikrobiálny terpenoid toxický pre Streptomyces scabies, spôsobujúci strupovitosť zemiakov.

Cesnak (Allium sativum) obsahuje viac ako 33 síru obsahujúcich látok, ako napr. allicín, alliín, ajoén, alylpropyldisulfid, dialyltrisulfid, s-alylcysteín, vinylditiín, S-alylmerkaptocysteín (KEMPER, 2000; DIDRY a kol., 1987). Surové extrakty inhibujú rast G- baktérií Escherichia coli, Proteus spp, Salmonella, Serratia, Citrobacter, Enterobacter, Pseudomonas, Klebsiella a G+ baktérií Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus sanguis, Streptococcus skupiny A, Bacillus anthracis baktérií. Extrakty zo starších rastlín inhibovali rast Helicobacter pylori (SIVAM, 2001, KEMPER, 2000). Ajoén inhiboval rast Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Mycobacterium smegmatis, Streptomyces griseus, Staphylococcus aureus, Lactobacillus plantarum, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, a Xanthomonas maltophilia. Inhiboval tiež rast kvasiniek. Pri Salmonella typhimurium

86 Gago, F. et al. allicín rušil syntézu RNA. Cesnak inhiboval rast 20 rôznych kmeňov Mycobacterium avium intracellulare izolovaných od HIV pozitívnych i negatívnych pacientov. Vodné extrakty a cesnakové oleje vykazovali aktivitu proti druhom Microsporum canis, M. gypseum, M. audouinii, Trichophyton rubrum, T.mentagrophytes, T. violaceum, T. simii, T. verrucosum, T. erinacei a Epidermophyton floccosum, rovnako ako aj proti kvasinkám rodov Candida, Cryptococcus, Rhodotorula,Torulopsis a Trichosporum. Allicín inhiboval rast Candida albicans, Cryptococcus, Trichophyton, Histoplasma capsulatum a Cryptococcus neoformans. Dialyltrisulfid inhiboval rast C. neoformans a ajoén inhiboval rast Aspergillus niger a Candida albicans (KEMPER, 2000).

Cibuľa obsahuje tiopropanal-S-oxid, síru obsahujúce oleje, allicín a rôzne voľné aldehydy (BOELENS a kol., 1971). Prekurzorom pre tieto látky je S-1-propenyl-L-cysteínsulfoxid, ktorý má veľmi podobnú štruktúru ako alliín (VIRTANEN, 1965). Nedávno bol z cibule izolovaný antifungálny peptid, allicepín, s inhibičnou aktivitou proti Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum, Mycosphaerella arachidicola a Physalospora piricola (WANG a NG, 2004). Éterické oleje z cibule boli skúšané proti štyrom G+, štyrom G- baktériám a proti deviatim dermatofytom (ZOHRI a kol., 1995). Testoval sa tiež účinok cesnakových a cibuľových éterických olejov, dialyltrisulfidu, dialyltetrasulfidu a dimetyltrisulfidu na rôzne mikroorganizmy (KIM, 2004). Chen a kol. (CHEN a kol., 1985) testovali antimikrobiálne vlastnosti niektorých druhov zeleniny a korenín ako aj ich častí. Medzi skúmané zaradili jadro a vonkajšie listy cibule, biele a zelené časti zelenej cibuľky, cesnakové buľvy, zázvor a jeho korene, sladké korenie, chilli korenie, hnedé korenie a horčicu. Ako testované mikroorganizmy boli použité Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Vibrio paraahemolicus, Pseudomonas aeruginosa, Proteus vulgaris, Staphylococcus aureus, Mycobacterium phlei, Streptococcus faecalis, Bacillus cereus a Micrococcus luteus. Surový cesnak inhiboval rast všetkých kmeňov. Antibakteriálna aktivita zelenej cibuľky (inhibícia baktérií Pseudomonas aeruginosa a Micrococcus luteus) bola nepatrne nižšia ako bielej cibule (inhibícia druhov Escherichia coli, Proteus vulgaris, Streptococcus vulgaris a Bacillus cereus). V tej istej práci sa tiež skúmal dopad tepelnej úpravy spomenutých korenín a rastlín na ich antimikrobiálne vlastnosti. Bolo jednoznačne dokázané, že tepelnou úpravou pri 100°C po dobu 20 min uvedené koreniny strácajú svoje antimikrobiálne schopnosti.

2. Materiál a metódy 2.1. Použité mikroorganizmy

V práci boli použité baktérie Acidovorax avenae subsp.avenae CCM 2761, Erwinia mallotivora CCM2890 a Xanthomonas sp. CCM 2888, získané z Českej zbierky mikroorganizmov Masarykovej univerzity v Brne. Tieto boli udržiavané v chlade pri 1 až 4°C. 2.2. Použitý rastlinný materiál

Ako rastlinný materiál slúžili jednotlivé časti siedmich druhov rastlín, ktoré sú po potravinárskom využití považované za odpad (stonky, listy, šupy,…) (Tab. 1). Boli


taktiež použité kvety a klíčky rastlín. Rastlinné časti boli zbierané v rôznom vegetačnom období, v roku 2004, za účelom sledovania ich antimikrobiálnej účinnosti v závislosti od vegetačného obdobia. U všetkých rastlín boli v literatúre dokázané antimikrobiálne vlastnosti. Z rastlinných častí boli získané do sucha odparené metanolové extrakty rozpustené v DMSO.

Tab. 1: Zoznam rastlín a ich častí použitých na prípravu metanolových macerátov.

Slovenský názov

Latinský názov

Odobratá časť rastliny

Dátumzberu

Charakteristika rastliny v dobe zberu

Lokalita zberu

puky listu 30. 4. nekvitnúca., tvorba pukov Trenčín

puky kvetu 30. 4. tvorba pukov Trenčín šupa 2. 7. plodiaca Trenčín list 14. 7. plodiaca Trenčín

orech kráľovský

Juglans regia

šupa 29.8. plodiaca Trenčín list 29. 7. nekvitnúca Chocholná list 19. 8. kvitnúca Chocholná

šištice 29. 8. plodiaca Chocholná chmeľ

obyčajný Humulus lupulus

list 29. 8. plodiaca Chocholná

list + stonka 21. 4. nekvitnúca, sadenica Trnava

list 2. 7. kvitnúca Trnava list 12. 8. plodiaca Trnava

paprika ročná

Capsicum annuum

list 19. 8. plodiaca Trnava list 19. 4. nekvitnúca,

sadenica Trnava rajčiak jedlý

Lycopresicon sculentum stonka 19. 4. nekvitnúca,

sadenica Trnava

list 2. 7. kvitnnúca Trnava list 12. 8. plodiaca Trnava rajčiak

jedlý Lycopresicon

sculentum list 19. 8. plodiaca Trnava klíčky 5. 4. nekvitnúca,

hľuzaTrnava

list 2. 7 kvitnúca Chocholná ľuľok

zemiakový Solanum

tuberosum plod 19. 8. plodiaca Chocholná list 26. 4. nekvitnúca Chocholná kvet 2. 7. kvitnúca Chocholná cibuľa

kuchynská Allium cepa list 29. 7. kvitnúca Chocholná

cesnak Allium klíčky 25.4. nekvitnúca Chocholná kuchynský sativum list 2. 7. nekvitnúca Chocholná

2.3. Príprava rastlinných macerátov

Množstvo 5 g čerstvej rastlinnej hmoty sa po mechanickom rozdrvení maceroval pri 4°C počas 72 h v 125 ml metanolu (80 %, v/v). Prefiltrovaný macerát sa odparil

88 Gago, F. et al. do sucha v rotačnej vákuovej odparke a rozpustil v 20 ml metanolu (20%, v/v). Biologicky účinné látky macerátu sa zachytili metódou extrakcie do tuhej fáze na kolónke silikagélu (Solid Phase Extraction SPE C18) a eluovali s 25 ml metanolu (75 %, v/v). Eluát sa odparil za zníženého tlaku do sucha, rozpustil v 5 ml DMSO a uskladnil v uzavretých liekovkách pri 1 až 4°C.

2.5. Sledovanie antimikrobiálneho účinku rastlinných macerátov

Bola použitá difúzna platňová metóda merania veľkosti inhibičných zóny okolo

diskov s priemerom 5 mm, napustených 5 µl rastlinného macerátu. Do sterilných Petriho misiek bol vnesený 1 ml suspenzie mikroorganizmu, s obsahom buniek 105 až 106. V práci sme použili kultivačné médium MPA. Médiom ochladeným asi na 45 až 50°C sme inokulum zaliali. Po stuhnutí média boli na povrch v pravidelnej vzdialenosti vložené 4 papierové disky, na ktoré sa v sterilných podmienkach mikropipetou nanieslo 5 µl macerátu. Ako štandard slúžili papierové disky napustené oxychloridom medi ako účinnou látkou pesticídu KUPRIKOL 50. Ako slepý pokus slúžili disky napustené DMSO. Naočkované pôdy sa inkubovali v termostate 24, 48 a 72 hodín pri teplote 35°C. Po ukončení inkubácie boli zmerané inhibičné zóny, ich veľkosť bola meraná v 4 bodoch a za inhibičnú zónu sa považoval priemer meraní.

3. Výsledky a diskusia

Cieľom tejto práce bolo zistiť prítomnosť antibakteriálnych metabolitov

v rastlinách počas vegetačného obdobia a otestovať potenciálnu antibakteriálnu účinnosť na troch druhoch rastlinných patogénoch. Zistená inhibičná účinnosť sa porovnávala s inhibičnou účinnosťou komerčne dostupného prípravku Kuprikol-50, obsahujúceho oxychlorid medi ako biologicky účinnú látku. Prípravok sa vyznačuje širokou účinnosťou proti fytopatogénnym hubám i baktériám a bol vybraný z dôvodu neexistencie komerčného, čisto baktericídneho prípravku.

Pri kmeňoch fytopatogénnych baktérií Acidovorax avenae subsp. Avenae CCM 2761, Erwinia mallotivora CCM 2890 a Xanthomonas sp. CCM 2888 bol použitý pesticíd značky KUPRIKOL 50, slúžiaci ako štandard. Tento nebol účinný ani pri najvyššej doporučenej koncentrácii (0,5 %). Preto bol u každého mikroorganizmu použitý ako štandard najúčinnejší macerát. Účinnosť tohto macerátu bola potom považovaná za 100% a účinky všetkých ostatných rastlinných macerátov boli vztiahnuté k najúčinnejšiemu extraktu. Papierové disky napustené čistým DMSO, slúžiace ako slepý pokus boli mikroorganizmami prerastené. V Tabuľkách 2, 3 a 4 sú uvedené iba účinné maceráty. 3.1. Účinok rastlinných macerátov na rast Acidovorax avenae subsp. avenae CCM 2761

Tabuľka 2 zobrazuje inhibičný účinok rastlinných metanolových macerátov na rast

kmeňa Acidovorax avenae subsp. avenae CCM 276. Kultivácia prebiehala pri 35°C počas 72 hodín.


Z tabuľky vyplýva, že najúčinnejší je macerát zo stonky sadenice rajčiaku (Lycopersicon sculentum), ktorého inhibičná zóna u Acidovorax avenacae subsp. avenae bola 2,1 mm. Maceráty z listov rajčiaku odobratých v rôznom vegetatívnom období mali minimálnu inhibičnú aktivitu, rovnako ako maceráty zo zemiaku, papriky, orecha a chmeľu. Z cesnaku a cibule nebol voči Acidovorax avenae subsp. avenae účinný ani jeden macerát. Účinnosť macerátu zo stonky sadenice rajčiaku sme po prvých 24 hodinách pôsobenia na Acidovorax avenae subsp. avenae považovali za 100 %, účinnosť ostatných macerátov bola v rozmedzí od 48 % do 71 %. Maceráty z listov sadenice rajčiaku, listov nekvitnúceho chmeľu, resp. listov kvitnúcej papriky najmenej inhibovali rast baktérií. Popri maceráte zo stonky sadenice rajčiaku boli byť účinnejšie maceráty z listu kvitnúceho rajčiaku, resp. zelenej šupy plodu orechu (71 %) a z klíčkov zemiakovej hľuzy (57 %).

Tab. 2: Inhibičný účinok rastlinných metanolových macerátov na rast Acidovorax avenae subsp. avenae CCM 2761 na MPA pri 35°C.

Priemerná šírka inhibičnej zóny [mm] Čas kultivácie [h] Rastlinný

macerát Časť

rastliny Dátum zberu

24 48 72 rajčiak sadenica stonka 19.4. 2,1 1,0 0,5 rajčiak sadenica list 19.4. 1,0 1,0 1,0 rajčiak kvitnúci/

plodiaci list 12.8. 1,5 1,0 1,0

zemiak hľuza klíčky 5.4. 1,2 1,0 0,5 orech plodiaci šupa 30.8. 1,5 1,2 0

chmeľ nekvitnúci list 27.9. 1,0 1,0 1,0 paprika kvitnúca list 2.7. 1,0 1,0 1,0

3.2. Účinok rastlinných macerátov na rast Erwinia mallotivora CCM 2890

U Erwinia mallotivora CCM 2890 bol po prvých 24 h. pôsobenia najúčinnejší macerát z orechovej šupy z 30.8.2004, s priemernou inhibičnou zónou 4,5mm (Tab.3).

Z tabuľky ďalej vidno, že inhibičná zóna macerátu z listu papriky (19.8.2004) sa ani po 72 hodinách nezmenila, hoci jej veľkosť bola zo všetkých najmenšia. Minimálny pokles účinnosti zaznamenal tiež macerát zo stonky sadenice rajčiaku (19.4.2004) a macerát z puku orechového kvetu (30.4.2004).

Najmenšie percento relatívnej účinnosti po 24 hodinách mal macerát získaný z listu sadenice rajčiaku. Rovnako aj macerát z pukov listov orechu, šištíc divo rastúceho chmeľu, listov kvitnúceho divo rastúceho chmeľu, nekvitnúceho chmeľu a listov sadenice, resp. dospelej rastliny papriky dosahovali hodnotu len 22 % relatívnej účinnosti v porovnaní so štandardom. Naopak najvyššie percento účinnosti mal popri macerátu z orechovej šupy aj macerát z mladých cesnakových výhonkov (67 %), ktorý zároveň ako jediný prekročil hranicu 50 % účinnosti. Účinnosť macerátu z paprikového listu (19.8.2004) ani po 72 hodinách neklesla a macerát z kvetného puku orecha (30.4.2004) a zo stonky sadenice rajčiaku (19.4.2004) poklesla len minimálne.

90 Gago, F. et al.

Tab. 3: Inhibičný účinok rastlinných metanolových macerátov na rast Erwinia mallotivora CCM 2890 na MPA pri 35°C.


macerát Časť rastliny Dátum zberu

24 48 72 rajčiak stonka 19. 4. 2,2 2,0 2,0 rajčiak list 12. 8. 2,0 1,5 1,2 rajčiak list 19. 4. 1,0 1,0 0,5 orech šupa 30. 8. 4,5 4,0 2,0 orech šupa 2. 7. 2,0 1,5 1,0 orech puk kvetu 30. 4. 2,2 2,0 2,0 orech puk listy 30. 4. 1,0 1,0 0 chmeľ šištice 29. 8. 1,0 1,0 0

chmeľ plodiaci list 29. 8. 2,2 2,0 1,5 chmeľ kvitnúci list 19. 8. 1,0 0,5 0

chmeľ list 29. 7. 1,0 0,5 0 paprika sadenica list 21. 4. 1,0 0 0

paprika list 19. 8. 1,0 1,0 1,0 cesnak list 2. 7. 2,0 1,5 1,5 cesnak výhonky 25. 4. 3,0 2,5 2,0

3.3. Účinok rastlinných macerátov na rast Xanthomonas sp. CCM 2888

Pri skúmaní účinnosti rastlinných metabolitov, vo forme metanolových macerátov získaných z vybraných druhov rastlín, proti baktérii Xanthomonas sp. CCM 2888, boli najúčinnejšie maceráty z listu kvitnúcej papriky a z klíčka bielej cibule, ktoré inhibovali rast baktérie na vzdialenosť 4 mm od okraju papierového disku (Tab. 4).

Účinok macerátu z cibule, resp. z papriky po 24 hodinovom pôsobení na baktériu sme považovali za 100 %. K nemu sme vztiahli všetky percentuálne prepočty účinnosti ostatných macerátov. Popri maceráte z cibule a kvitnúcej papriky má najväčšiu účinnosť macerát pripravený z listov kvitnúceho, divo rastúceho chmeľu (87,5 %), z kvetu (80 %) a listu (75 %) cibule, resp. zo šištíc chmeľu (62,5 %). 50 % hranicu účinnosti prekročili, resp. dosiahli ešte maceráty z listu plodiaceho chmeľu (55 %) a z plodu zemiaku (50 %). Najmenšiu účinnosť v prvej fáze pôsobenia, t.j. po prvých 24 hodinách, dosiahol macerát z listu zemiaka zo dňa 2. 7. 2004 (25 %).

Zo všetkých sledovaných 26 macerátov získaných z rastlinných častí (stonka, listy, puky, plody) v rôznom vegetačnom období (rast, kvitnutie, plodenie) inhibovalo rast baktérií na vzdialenosť väčšiu ako 1mm 22 rôznych macerátov, čo predstavuje 84,61% z celkového množstva skúšaných macerátov. Z toho macerát zo stonky sadenice rajčiaku (Lycopersicon sculentum L.) z dňa 19.4.2004 bol schopný inhibovať rast všetkých troch skúmaných baktérií (2,1 mm u Acidovorax avenae subsp.avenae CCM 2761, 2,2 mm u Erwinia mallotivora CCM 2890 a 1,5 mm u Xanthomonas sp. CCM 2888). Na dve z celkového počtu troch baktérií malo účinok sedem macerátov. Išlo o maceráty z listu rajčiaku, 2. 7 .2004 (Acidovorax avenae subsp. avenae CCM 2761 a Erwinia mallotivora CCM 2890) a 19.4.2004 (Acidovorax avenae subsp. avenae CCM 2761 a Xanthomonas sp. CCM 2888), zelené šupy z plodu orecha, 30.8.2004 (Acidovorax avenae subsp. avenae CCM 2761 a Erwinia mallotivora CCM 2890), listov chmeľu, 29.7.2004 (Acidovorax avenae subsp. avenae CCM 2761 a Erwinia


Tab. 4: Inhibičný účinok rastlinných metanolových macerátov na rast Xanthomonas sp. CCM 2888 na MPA pri 35°C.


macerát Časť rastliny Dátum

zberu

24 48 72 rajčiak stonka 19. 4. 1,5 1,5 0 rajčiak list 19. 4. 1,5 1,5 0 zemiak list 2. 7. 1 1 0 zemiak plod 30. 8. 2 1 0 chmeľ šištice 29. 8. 2,5 2 2

chmeľ plodiaci list 29. 8. 2,2 2 1,5 chmeľ kvitnúci list 19. 8. 3,5 1 0

paprika kvitnúca list 2. 7. 4 2,5 2 paprika list 12. 8. 1,4 0 0 paprika list 19. 8. 1,5 1,2 0 cibuľa list - výhonok 26. 4. 4 2 0 cibuľa list 29. 7. 3 2,3 0 cibuľa kvet 2. 7. 3, 2 1 cesnak list 2. 7. 1,8 1 1

mallotivora CCM 2890), listov papriky, 2.7.2004 (Acidovorax avenae subsp. avenae CCM 2761 a Xanthomonax sp. CCM 2888), listov papriky, 19.8.2004 (Erwinia mallotivora CCM 2890 a Xanthomonas sp. CCM 2888) a z listových klíčkov cesnaku, 25.4.2004 (Erwinia mallotivora CCM 2890 a Xanthomonas sp. CCM 2888). Najsilnejší účinok mala zelená šupa z plodu orecha kráľovského (Juglans regia) z dňa 30.8.2004, a to 4,5 mm širokú inhibičnú zónu u baktérii Erwinia mallotivora CCM 2890. V mnohých prípadoch však boli maceráty proti baktériám neúčinné. To možno vysvetliť absenciou účinných sekundárnych metabolitov v macerátoch, rezistenciou použitých mikroorganizmov voči jednotlivým aktívnym zložkám macerátov alebo termolabilitou účinných látok obsiahnutých v rastlinných macerátoch.

4. Záver

Aj napriek intenzívnemu záujmu v oblasti nových technológií a ich zavádzaní

do poľnohospodárstva, je stále ešte veľa nejasností aj v takých základných otázkach, akými nepochybne choroby kultúrnych plodín spôsobené mikroorganizmami sú. Pri boji proti týmto fytopatogénnym mikroorganizmom sa používajú rôzne syntetické látky. Je všeobecne známe, že pesticídy, ktoré ľudstvo používa proti fytopatogénom sú nielen voči prostrediu škodlivé ale mnoho krát proti mikroorganizmom neúčinné. Jednou z možností ako bojovať proti pôvodcom rastlinných chorôb sú rastlinné metabolity s antibakteriálnymi a antifungálnymi vlastnosťami.

Na základe výsledkov uvedených vyššie možno predpokladať, že rastlinné pesticídy budú schopné v budúcnosti aspoň čiastočne nahradiť syntetické pesticídy. Ich účinnosť možno dokázať tým, že zatiaľ čo všeobecne účinný pesticíd KUPRIKOL 50 neinhiboval rast žiadnej testovanej baktérie, rastlinné maceráty boli proti testovaným baktériám účinné. Do budúcnosti je potrebný intenzívnejší výskum v tejto oblasti, ako aj v oblasti molekulovej biológie, génovej expresie a taktiež v oblasti

92 Gago, F. et al. symbiózy baktérií a rastlín a v oblasti možnej indukcii antimikrobiálnych látok pomocou mikroorganizmov. Poďakovanie Táto práca vznikla za finančnej podpory ŠP VaV „Využitie domácich surovín a zdrojov“, úlohy Komplexné využitie rastlinných surovín, VE 5.4. Sekundárne metabolity rastlín s biocídnym účinkom.

Literatúra

ABDEL-NASSER, M., SAFWAT, M. S., ALI, M. Z.: Detection of antibacterial substances in some plant residues and their effect on certain microorganisms. Zentralbl. Mikrobiol., 138, 1983 s. 63-69.

ALI-SHTAYEH, M. S., ABU GHDEIB, S. I.: Antifungal activity of plant extracts against dermatophytes. Mycoses, 42, 1999, s. 665-672.

ALKHAWAJAH, A. M.: Studies on the antimicrobial activity of Juglans regia. Am. J. Chin. Med., 25, 1997, s. 175-180.

AUERBACH, R. H., KENAN, D., DAVIDSON, G.: Characterization of varietal differences in essential oil components of hops (Humulus lupulus) by SFC-FTIR spectroscopy. J. AOAC Int., 83, 2000, s. 621-626.

BOELENS, M., de VALOIS, P.J., WOBBEN, H.J. van der GEN, A.: Volatile flavor compounds from onions. J. Agric. Food Chem., 19, 1971, s. 984-991.

BOUARAB, K., MELTON, R., PEART, J., BAULCOMBE, D., OSBOURN, A. A.: saponin-detoxifying enzyme mediates suppression of plant defences. Nature., 418, 2002, s. 889-892.

CAREAGA, M., FERNANDEZ, E., DORANTES, L., MOTA, L., JARAMILLO, M. E., HERNANDEZ-SANCHEZ, H.: Antibacterial activity of Capsicum extract against Salmonella typhimurium and Pseudomonas aeruginosa inoculated in raw beef meat. Int. J. Food Microbiol., 83, 2003, s. 331-335.

CHEN, H. C., CHANG, M. D., CHANG, T. J.: Antibacterial properties of some spice plants before and after heat treatment. Zhonghua Min. Guo Wei Sheng. Wu Ji Mian. Yi Xue Za Zhi., 18, 1985, s. 190-195.

CICHEWICZ, R. H., THORPE, P.A.: The antimicrobial properties of chile peppers (Capsicum species) and their uses in Mayan medicine J. Ethnopharmacol., 52, 1996, s. 61-70.

COWAN, M. M.: Plant Products as Antimicrobial Agents. Clinic. Microbiol. Rev., 12, 1999, s. 564-582.

CURRELI, N., SOLLAI, F., MASSA, L., COMANDINI, O., RUFO, A., SANJUST, E., RINALDI, A., RINALDI, A.C.: Effects of plant-derived naphthoquinones on the growth of Pleurotus sajor-caju and degradation of the compounds by fungal cultures. J. Basic. Microbiol., 41, 2001, s. 253-259.

DE KEUKELEIRE, J., OOMS, G., HEYERICK, A., ROLDAN-RUIZ, I., VAN BOCKSTAELE, E., DE KEUKELEIRE, D.: Formation and accumulation of alpha-acids, beta-acids, desmethylxanthohumol, and xanthohumol during flowering of hops (Humulus lupulus L.). J. Agric. Food Chem., 51, 2003, s. 4436-4441.


DIDRY, N., PINKAS, M., DUBREUIL, L.: Antibacterial activity of species of the genus Allium Pharmazie., 42, 1987, s. 687-688.

DIDRY, N., DUBREUIL, L., PINKAS, M.: Activity of anthraquinonic and naphthoquinonic compounds on oral bacteria. Pharmazie., 49, 1994, s. 681-683.

DWECK, A. C.: Draft article for cosmetics toiletries Indian plants. Cosmet. J., 23, 1999, s. 280-301.

DWECK, A. C.: Natural ingrediens for colouring hair. Int. J. Cosmet. Sci., 24, 2002, s. 287-302.

FENG, J., YUAN, F., GAO, Y., LIANG, C., XU, J., ZHANG, C., HE, L.: A novel antimicrobial protein isolated from potato (Solanum tuberosum) shares homology with an acid phosphatase. Biochem. J., 376, 2003, s. 481-487.

FLEISSNER, A., SOPALLA, C., WELTRING, K. M.: An ATP-binding cassette multidrug-resistance transporter is necessary for tolerance of Gibberella pulicaris to phytoalexins and virulence on potato tubers. Mol. Plant. Microbe Interact., 15, 2002, s. 102-108.

FRIEDMAN, M.: Tomato glycoalkaloids: role in the plant and in the diet. J. Agric. Food Chem., 50, 2002, s. 5751-5780.

GOESE, M., KAMMHUBER, K., BACHER, A., ZENK, M. H., EISENREICH, W.: Biosynthesis of bitter acids in hops. A (13)C-NMR and (2) H-NMR study on the building blocks of humulone. Eur. J. Biochem., 263, 1999, s. 447-454.

IORIZZI, M., LANZOTTI, V., RANALLI, G., De MARINO, S., ZOLLO, F.: Antimicrobial furostanol saponins from the seeds of Capsicum annuum L. var.acuminatum. J. Agric. Food Chem., 50, 2002, s. 4310-4316.

ISLA, M. I., ORDONEZ, R. M., MORENO, M. I., SAMPIETRO, A. R., VATTUONE, M. A.: Inhibition of hydrolytic enzyme activities and plant pathogen growth by invertase inhibitors. J. Enzyme Inhib. Med. Chem., 17, 2002, s.37-43.

ITO, S., ETO, T., TANAKA, S., YAMAUCHI, N., TAKAHARA, H., IKEDA, T.: Tomatidine and lycotetraose, hydrolysis products of alpha-tomatine by Fusarium oxysporum tomatinase, suppress induced defense responses in tomato cells. FEBS Lett., 571, 2004, s. 31-34.

JONES, N. L., SHABIB, S., SHERMAN, P. M.: Capsaicin as an inhibitor of the growth of the gastric pathogen Helicobacter pylori. FEMS Microbiol. Lett., 146, 1997, s. 223–227.

KEMPER, K. J.: Garlic (Allium sativum).[cit.2004-02-09; 18.00 SEČ]. Dostupné z http://www.mcp.edu/herbal/garlic/garlic.cis.pdf.

KIM, J. H.: Anti-bacterial action of onion (Allium cepa L.) extracts against oral pathogenic bacteria. J. Nihon. Univ. Sch. Dent., 39, 1997, s. 136-141.

KIM, J. W., KIM, Y. S., KYUNG, K. H.: Inhibitory activity of essential oils of garlic and onion against bacteria and yeasts. J. Food Prot., 67, 2004, s. 499-504.

KOMARAIAH, P., REDDY, E. V., REDDY, P. S., RAGHAVENDRA, A. S., MAKRISHNA, S. V., REDDANNA, P.: Enhanced production of antimicrobial sesquiterpenes and lipoxygenase metabolites in elicitor-treated hairy root cultures of Solanum tuberosum. Biotechnol. Lett., 25, 2003, s. 593-597.

KOZUKUE, N., HAN, J. S., LEE, K. R., FRIEDMAN, M.: Dehydrotomatine and alpha-tomatine content in tomato fruits and vegetative plant tissues. J. Agric. Food Chem., 52, 2004, s. 2079-2083.

94 Gago, F. et al. LANGEZAAL, C. R., CHANDRA, A., SCHEFFER, J.J.: Antimicrobial screening of

essential oils and extracts of some Humulus lupulus L. cultivars. Pharm. Weekbl. Sci., 14, 1992, s. 353-356.

MASAROVIČOVÁ, E., REPČÁK, M.: Fyziológia rastlín. 1. vyd. Bratislava: Vydavateľstvo UK, 2002. 303 s.

MEHRABIAN, S., MAJD, A., MAJD, I.: Antimicrobial effects of three plants (Rubia tinctorum, Carthamus tinctorius and Juglans regia) on some airborne microorganisms. Aerobiologia, 16, 2000, s. 456-458.

MORENO, M., SEGURA, A., GARCIA-OLMEDO, F.: Pseudothionin-St1, a potato peptide active against potato pathogens. Eur. J. Biochem., 223, 1994, s. 135-139.

MULABAGAL, VANISREE, CHEN-YUE LEE, SHU-FUNG LO, SATISH MANOHAR NALAWADE, CHIEN YIH LIN, HSIN-SHENG TSAY.: Studies on the production of some important secondary metabolites from medicinal plants by plant tissue cultures. Bot. Bull. Acad. Sin., 45, 2004, s. 1-22.

MURRISSEY, J. P., OSBOURN, A. E.: Fungal resistance to plant antibiotics as a mechanism of pathogenesis. Microb. Mol. Biol. Rev., 63, 1999, s. 708-724.

OSBOURN, A. E.: Antimicrobial phytoprotectants and fungal pathogens: A commentary. Fungal Gen. Biol., 26, 1999, s. 163-168.

PÉREZ-ESPINOSA, A., ROLDÁN-ARJONA, T., RUIZ-RUBIO, M.: Pantothenate synthetase from Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici is induced by α-tomatine. Mol. Genet. Genom., 265, 2001, s. 922-929.

RAMACHANDRA RAO, S., RAVISHANKAR, G. A.: Plant cell cultures: Chemical factories of secondary metabolites. Biotechnol. Adv., 20, 2002, s. 101-153.

RAVISHANKAR, G. A., SARMA, K. S., VENKATARAMAN, L. V., KADYAN, A. K.: Effect of nutritional stress on capsaicin production in immobilized cell cultures of Capsicum annuum. Curr. Sci., 57, 1988, s. 381-383.

ROLDAN-ARJONA, T., PEREZ-ESPINOSA, A., RUIZ-RUBIO, M.: Tomatinase from Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici defines a new class of saponinases. Mol. Plant. Microbe Interact., 12, 1999, s. 852-861.

SIMPSON, W.J., SMITH, A. R.: Factors affecting antibacterial activity of hop compounds and their derivatives. J. Appl. Bacteriol., 72, 1992, s.327-334.

SIVAM, G. P.: Protection against Helicobacter pylori and other bacterial infections by garlic. J. Nutr., 131, 2001, s. 1106-1108.

STEVENS, J. F., MIRANDA, C. L., WOLTHERS, K. R., SCHIMERLIK, M., DEINZER, M. L., BUHLER, D. R.: Identification and in vitro biological activities of hop proanthocyanidins: inhibition of NOS activity and scavenging of reactive nitrogen species. J. Agric. Food Chem., 50, 2002, s. 3435-3443.

TAYLOR, A. W., BAROFSKY, E., KENNEDY, J. A., DEINZER, M. L.: Hop (Humulus lupulus L.) proanthocyanidins characterized by mass spectrometry, acid catalysis, and gel permeation chromatography. J. Agric. Food Chem., 51, 2003, s. 4101-4110.

VIRTANEN, A.I.: Studies on organic sulphur compounds and other labile substances in plants. A review. Phytochem., 4, 1965, s. 207-228.

VOROB'EV, A., SELEZNEV, A.S., PAVLOVA, L.A., KAPITANOV, A.B., YANG, A., ERSHOVA, N. N.: Experimental evaluation of the antibacterial activity of tomato pulp oil extract. Zh. Mikrobiol. Epidemiol. Immunobiol., 6, 1998, s. 8-11.


WANG, H. X., NG, T. B.: Isolation of allicepin, a novel antifungal peptide from onion (Allium cepa) bulbs. J. Pept. Sci., 10, 2004, s. 173-177.

YI, J. Y., SEO, H. W., YANG, M. S., ROBB, E. J., NAZAR, R. N., LEE, S. W.: Plant defense gene promoter enhances the reliability of shiva-1 gene-induced resistance to soft rot disease in potato. Planta, 2004, (v tlači).

ZOHRI, A. N., ABDEL-GAWAD, K., SABER, S.: Antibacterial, antidermatophytic and antitoxigenic activities of onion (Allium cepa L.) oil. Microbiol. Res., 150, 1995, s. 167-172.

Inhibition Effect of Plant Extracts on Phytopatogenic Bacteria Abstract: There were tested 26 methanol extracts from 7 plants and their parts, which were collected during whole vegetation season. These plants were walnut (Juglans regia), hop (Humulus lupulus), potato (Solanum tuberosum), pepper (Capsicum annuum), tomato (Lycopersicon esculentum), garlic (Allium sativum) and onion (Allium cepa). The presence of antimicrobial agents was demonstrated in all these plants. These plant extracts were tested by disk diffusion method with three strains of phytopathogenic bacteria: Acidovorax avenae subsp. avenae CCM 2761, Erwinia mallotivora CCM 2890 and Xanthomonas sp. CCM 2888. Acidovorax avenae subsp. avenae CCM 2761 was the most inhibiting by extract from stalk of tomato seedling. Erwinia mallotivora CCM 2890 was the most inhibiting by extract from walnut green peel and Xanthomonas sp. CCM 2888 by extract from leaves of flowering pepper and extract from onion germinant leaves. Key words: antimicrobial agents, garlic, hop, onion, pepper, potato, tomato, walnut

Documents

INHIBIČNÝ ÚČINOK RASTLINNÝCH MACERÁTOV NA …