Intérêt de la cytogénétique

conventionnelle et moléculaire

dans les hémopathies malignes

Dr C. Lefebvre

Laboratoire de Génétique Onco-Hématologique

EC Génétique _ janvier 2011

Généralités

Rappel des techniques utilisées : Caryotype et FISH

Impact des données cytogénétiques dans les hémopathies :

- diagnostique,

- pronostique,

- thérapeutique

Modèles :

- la leucémie aiguë promyélocytaire,

- la leucémie myéloïde chronique,

- le lymphome à cellules du manteau,

- la LLC

L’Hématopoïèse normale

Autorenouvellement Colonies, Progéniteurs

Divisions, puis Différenciation / Maturation

Transformation maligne -> lymphoma

Transformation

maligne

->leucémie

Origine cellulaire des hémopathies malignes

2%

Diagnostic pluridisciplinaire d’une hémopathie

Histologie

Immunohistochimie

Cytologie

Phénotypage

Caryotype

FISH

Biologie moléculaire

Objectifs Technique complémentaire

Intérêt dans les hémopathies

Cytologie Aspect détaillés des cellules tumorales

Cytochimie : lignée (enzyme), fer

Diagnostic+++,

Suivi++

Histologie Aspect tissulaire, environnt, et cellulaires

Immunohistochimie : lignée, index de prolifération, classification

Diagnostic+++

Phénotypage (suspension)

Marqueurs de surface ou intracytopl.

Marquage multicouleur, IF sur lame,

Diagnostic+++,

Suivi++ (maladie résiduelle ou MRD),

Cytogénétique Caryotype

Génome tumoral Anomalies Iaires et IIaires

FISH : précisions ou détection d’anomalies cryptiques

Diagnostic+++,

Suivi+, pronostic+++

Biologie moléculaire

Recherche et quantification de transcrit pathologiques, clonalité T/B, mutations acquises oncogéniques

PCR nichée, Séquençage…

Diagnostic,

Suivi+++ (MRD)

Pronostic++,

Hémopathies malignes : diagnostic biologique

- Cytologie : aspect des cellules / coloration Giemsa : diagnostic, suivi

- Histologie : aspects tissulaire et cellulaire, environnement, extension,

marquages complémentaires par immunohistochimie : diagnostic

- Phénotypage : en cytométrie de flux (suspension) : Marqueurs /Ag de

surface, intracytoplasmique, intensité d’expression : identification d’un

clone, lignée d’origine, suivi de la maladie résiduelle (MRD)

- Cytogénétique conventionnelle : caryotype : anomalies qui corroborent le

diagnostic -> cytogénétique moléculaire : FISH pour explorations

complémentaires, dictées par le type d’hémopathie, l’intérêt diagnostique

ou pronostique ou thérapeutique ++++

- Biologie Moléculaire : identification d’un transcrit anormal : RT-PCR,

clonalité (lymphocytes B/T), quantification du taux d’expression d’un gène

(non remanié ou hybride): RT-Q-PCR, …

Diagnostic pluridisciplinaire

Caryotype

• Définition et objectifs

• Indications

• Matériel

• Étapes

• Apports et limites

• Exemples

• Intérêt

Caryotype

Obtention et interprétation

des chromosomes en

métaphase

Analyse morphologique

Diagnostic des anomalies

chromosomiques

• Objectif technique

Cytogénétique conventionnelle

Le cycle cellulaire

• Indications

Caryotype constitutionnel pré-natal (signes,atcd…)

liquide amniotique (16è-19è SA), villosités choriales (10è SA)

Caryotype constitutionnel post-natal (phénotype d’un enfant, retard mental, anomalies cardiaques…)

lymphocytes du sang périphérique, fibroblastes

Anomalies constitutionnelles vs acquises

Caryotype de cellules/tissus tumoraux : leucémie, lymphomes… = recherche d’anomalies chromosomiques acquises et présentes uniquement ds le(s) tissu(s) tumoral(aux) : sang : si cellules leucémiques > 20% moelle osseuse ganglions/rate et tumeurs solides: fragment tissulaire

• Matériel

Prélèvements

- tube hépariné… identifié !

sang (7 ml)

moelle osseuse (1 ml)

fragment tissulaire

- ou tube sec stérile ( pour liquide pleural, d’ascite…)

- renseignements cliniques et pathologie suspectée ++++

Stérilité +++, acheminement rapide à t

ambiante

• Étapes

Culture cellulaire

Capacité proliférative des cellules in vitro : selon l’hémopathie !

Milieux synthétiques de culture:

éléments nutritifs+ maintien des constantes physico-chimiques

Reproduction la plus fidèle des conditions in vivo

Dilacération des tissus (peau, villosités, tumeurs): scalpel

-> suspension cellulaire,

Concentration cellulaire de culture variable

1 à 2x106 cellules / ml: sang, moelle, fibroblastes…

1 à 4x106 cellules / ml: ggl, rate, tumeur

• Étapes

Culture cellulaire

Hématologie : Culture de durée variable

- courte (24h) sans agents mitogènes pour les hémopathies

myéloïdes (aiguës, chroniques), Sd myéloprolifératifs,

- longue (72h) avec mitogènes pour les leucémies lymphoïdes

chroniques, les lymphomes à petites cellules : issus de cellules plus

« matures » avec capacité naturelle de division limitée

(Oligo-CpG et Interleukine-2)

Mise en culture à l’étuve à 37

C

Constitutionnel Post-natal

Sang : Agent mitogène PHA (Phytohémagglutinine)

72h : lymphocytes T

Peau : cellules adhérentes, fibroblastes

cultures + longues, surveillance +++ microscope

• Étapes

Blocage des mitoses

- Colchicine: bloque la cellule au stade de métaphase

Interrompt la formation des fibres du fuseau

Libère les chromosomes de la plaque équatoriale

Mais induit une contraction des chromosomes

Concentration et temps d’exposition +++

Exposition Colchicine :

Variable : 30 min à 17 H, avec

concentration adaptée

• Étapes

Choc hypotonique

Solution pauvre en sels KCl 0.075 M : pénétration par osmose

Gonflement de la cellule, étirement de la membrane cytoplasmique

Lyse des hématies 37

C (10 ml) sur vortex, 20 min 37

Fixation

Préserve la morphologie de la cellule

Stoppe les fonctions cellulaires

Perte d’une partie des protéines +++

Fixateur Méthanol / Acide acétique 3:1 (4

C) sur vortex x3

Culot cellulaire fixé conservé qqs jours à 4

C

• Étapes

Étalement

Qualité de l’étalement +++

t

et degré d’humidité évaporation du fixateur

Contrôle au microscope : mitoses, densité, amas

Dénaturation

Marquage en bandes

Bandes chromosomiques non visible dans l’ADN isolé

replis résultants de l’interaction entre ADN et protéines

Marquages en bandes G, R, C, NORs:

G: digestion enzymatique /protéolytique, coloration au Giemsa

R: trt thermique en milieu salin puis coloration par Giemsa

Caryotype • Étapes

Dénaturation

Technique de marquage en bandes R (Dutrillaux et Lejeune, 1971)

Solution saline Earle (tampon phosphaté, pH4,2) 87

C, BM

pdt 12 à 17 min, ajustement nécessaire

Coloration Giemsa 4%

Alternance bandes sombres « riches en gènes »

G-C: 3H

A-T: 2H

Lecture au microscope optique

Acquisition et classement

Interprétation

Culot cellulaire conservé à –20

C

• Caryotype en bande R 46,XY

• Caryotype en bande G 46,XY

R

• gain d’un chromosome

-> trisomie

• perte d’un chromosome

-> monosomie

• Anomalie de la ploidie (normal = diploïde à 46 chrs)

hypodiploidie : 35-45

hyperdiploidie : 47-57

triploidie : # 69

tétraploidie : # 92

haploidie : # 23

/ (lot de 23)

Anomalies du caryotype

Anomalies de structure Anomalies de nombre

équilibrées

déséquilibrées

Anomalies de structure

équilibrées déséquilibrées

inversion

délétion duplication

translocation

réciproque isochromosome

E

Effets oncogéniques des translocations

Ex : effets pathologiques induits par la protéine de fusion BCR/ABL

Ex : effets pathologiques induits par la dérégulation du gène c-Myc par la t(8;14) IGH/cMyc

Les mécanismes « oncogéniques » sont beaucoup moins clairs et moins précisés concernant les anomalies de nombre (gains, pertes)

• Apports et limites

Approche pangénomique : visualisation du génome ds sa totalité

détection des anomalies numériques & structurales

détection de clone(s) apparentés ou non

détections de cassures « figures » ex: Fanconi

Apports

Echecs de culture: peu ou pas de mitoses,

Qualité du prélèvement et de la préparation,

Caryotype normal: nature des cellules en mitose ?

Sélection d’un clone possible (culture),

Pouvoir de résolution de détection des anomalies : 5-10 Mb

(1 bande = 107 pb)

Limites

• Intérêt du caryotype

- diagnostic : Lymphomes, leucémies…

concordance avec anapath, cytologie, immunophénotypage

- pronostic : LAM : t(8;21)(q22;q22), t(15;17)(q22;q21), inv(16)(p13q22)

LAM à caryotype complexe

LAL: hyperdiploïdie, t(9;22)

MDS: -5/5q, -7/7q, complexité

-suivi cytogénétique:

LMC sous traitement et suivi du contingent avec t(9;22)

Greffe de moelle osseuse allogénique : sexe, clone

Hémopathies +++

Tumeurs solides

- diagnostic: Sarcome d’Ewing – t(11;22)

FISH: Hybridation Fluorescente in situ

• Définition et objectifs

• Principe

• Matériel

• Apports et limites

• Indications

• Exemples

FISH • Définition

Cytogénétique moléculaire

Détection in situ de séquences d’acides nucléiques sur

métaphases

noyaux interphasiques

Ré-association moléculaire spécifique ADN-ADN :

cible = ADN chromosomique

sonde = ADN complémentaire

Hybridation moléculaire

Sonde Préparation chromosomes cellules…

marquage

dénaturation dénaturation

HYBRIDATION

détection directe détection

indirecte

FISH • Principe

• Matériel

Sondes: types de sonde

Séquences répétitives : centromère (séq alphoïde)

dénombrement des chrs

Séquences uniques -> vecteur

sondes spécifiques / locus

translocation, gène de fusion

délétion, amplification

ADN de tout ou partie d’un chromosome

microdissection -> banques

peinture chromosomique

Plasmide 0-10 Kb

Phage 10-25 Kb

Cosmide 20-50 Kb

PAC 130-150 Kb

BAC 150-300 Kb

YAC 200-2000 Kb

• Matériel

Cible

Préparations cytogénétiques

noyaux : interphase

métaphases

Préparations cytologiques (pas de culture)

frottis, cytospins

appositions

Préparations histologiques

coupes congelées

coupes en paraffine

+/- extraction des noyaux

FISH • Apports et limites

Apports

Etude in situ rapide, sensible, spécifique (locus)

Faible quantité de matériel biologique

Pouvoir de résolution // taille de sonde

Détection directe, sondes double-couleur

Détection des réarrangements géniques, délétion, amplification,

aneuploïdies…en interphase si échec du caryotype,

Nombre de fluorochromes (5)

Limites

Travail à l’échelle du gène -> informations partielles

Interprétation des résultats -> caryotype !

FISH • Indications

Cytogénétique Constitutionnelle

Anomalie de nombre (couples de sondes): aneuploïdie

Syndromes microdélétionnels

Cytogénétique oncohématologique

Diagnostic: - anomalie cryptique -> 11q23 / MLL; CBFB / inv(16)

- précision du point de cassure: LMC / t(9;22)

- détection d’une anomalie récurrente essentielle au

diagnostic (échec

caryotype)

Pronostic: - inv(16) / CBFB; 11q22 / ATM; 11q23 / MLL

Suivi: maladie résiduelle, allogreffe de moelle (sexe)

Caryotype et FISH

- Leucémies aiguës:

• Doit corroborer avec les données cytologiques et phénotypiques,

• Peut entraîner la modification du diagnostic cytologique de myélodysplasie en leucémie aiguë (ex t(8;21)),

- Lymphomes :

- profil cytogénétique ou signature cytogénétique ou anomalies « spécifiques » pour chaque grand sous-type de lymphome, donc

- aide à la précision du sous-type histologique

- LLC (leucémie lymphoïde chronique) : impact thérapeutique :

- délétion 17p13/TP53 : Résistance à la Fludarabine

- délétion 11q22 / ATM : intérêt d’une immunochimiothérapie

Caryotype : FISH : exemples de l’intérêt dans le cadre du diagnostic et du traitement des leucémies aiguës myéloïdes

L’hématopoïèse normale

myéloblaste promyélocyte métamyélocyte

Définition

Les leucémies aiguës (LA) sont des proliférations clonales malignes de progéniteurs ou précurseurs médullaires des cellules sanguines associées à un blocage de maturation à un stade immature :

- de la lignée myéloïde : LAM - de la lignée lymphoïde : LAL - rarement : M et L : biphénotypique Il en résulte une accumulation de ces cellules immatures

(bloquées à un stade donné), ou blastes, dans la moelle osseuse, +/- le sang, et parfois dans d'autres organes.

La prolifération des blastes engendre une insuffisance

médullaire avec déficit de production des cellules sanguines matures.

LAM avec t(15;17) :

obligatoirement LAM3 = promyélocytaire

5 à 8% des LAM, CIVD ++++

cytologie caractéristique / formes variantes

de très bon pronostic

pas d’allogreffe !

si échec caryotype ou mitoses normales : FISH

PML/RARA double couleur ; RARA dc

car insertions cryptiques, autres t 17q22 :

t(5;17)(q35;q21) : NPM ;

t(11;17)(q13;q21) : PLZF

anomalie isolée (si autres anomalies : tjs bon pronostic)

traitement spécifique

Corps d’Auer en fagots

46,XY,t(15;17)(q22;q21) PML/RARA

46,XY,t(15;17)(q22;q21) PML/RARA

Peu de modèles de cancer génétiquement simples

• Leucémie aiguë : promyélocytaire :

Translocation t(15;17) gène de fusion protéine de fusion

PML/RARA : blocage de la cellule à un stade précoce (promyélocyte)

Chimiothérapie classique (trop) efficace : libération de facteurs activant la coagulation +++

Traitement ciblé : ATRA : levée du blocage de la cellule

80% de guérison

Facteurs pronostiques des LAM de novo

• Age (>60 ans) (+état général & comorbidités)

• Caryotype et/ou biologie moléculaire (<60ans)

• Leucocytose initiale

• Réponse au traitement

(immédiat et/ou MRD : minimal residual disease)

Altérations génétiques sans anomalies CG

mutations ponctuelles Microdélétions Amplification

activation d’oncogènes inactivation FT essentiel différenciation

Mutations de gènes

Transduction du signal : FLT3, c-KIT (rec TK), RAS

Facteurs de transcription : AML1, CEBPα, EVI1,

Suppresseur de tumeur : p53

NPM1 ++++

Facteurs pronostiques des LAM de novo

Caryotype / biologie moléculaire = facteur prédictif le plus fort de la réponse initiale au traitement (rémission complète 1 : RC1) et du risque de rechute.

Les anomalies cytogénétiques et moléculaires sont classées en 3 catégories.

Impact pronostique des anomalies chromosomiques Consensus international du risque pronostic selon le caryotype :

1) Groupe favorable : - t(15;17) des APL,

- t(8;21) AML1/ETO et inv(16) des LAM CBF,

- Caryotypes normaux/intermédiaires avec profil moléculaire FLT3wt, NPM1wt, CEBPa muté,

2) Groupe intermédiaire : redéfini selon le statut mutationnel de 3 gènes (NPM1, FLT3 +/- CEBPa)

- NPM1 wt, FLT3 wt, CEBPa wt

- NPM1 muté, FLT3 wt

3) Groupe défavorable : - Caryotypes du groupe 2 avec FLT3 muté type ITD

- caryotypes complexes (> 3 anomalies),

- anomalies 5/7,

- anomalies 3q,

- anomalies 11q23/MLL sauf t(9;11),

- t(6;9) DEK/NUP214

Normal (50% des cas)

t(9;11)

+8

Autres (2 anomalies)

Byrd et al, Blood 2002

CALGB 8461

17%

61%

22%

FLT3

C-Kit

N-Ras

K-Ras

H-Ras

CEBP

MLL

EVI1

NPM

Anomalies moléculaires des LAM

• Exemples

LAM4 - Leucémie aiguë myélomonocytaire

• Exemples

FISH MLL

der(11)

11

der(19)

-> 46,XX,t(11;19)(q23;p13)

Cytogénétique conventionnelle :

Intérêt diagnostique et pour le suivi :

Modèle de la LMC

LMC : Introduction

• syndrome myéloprolifératif chronique

• prolifération prédominante de la lignée granuleuse

• évolution clinique en 3 phases:

- chronique

- accélération

- acutisation

• présence d ’une anomalie chromosomique typique:

chromosome Philadelphie (Ph) par t(9;22)

L’Hématopoïèse normale

LMC : Historique

• 1960 : découverte d ’un marqueur spécifique de la LMC :

le chromosome Philadelphie : 22q-

• 1983 : équivalent moléculaire BCR-ABL

transcrit BCR-ABL protéine de fusion BCR-ABL

échange de matériel génétique entre les bras longs

des chrs 9 et 22

• 1973 : translocation réciproque t(9;22)(q34;q11), présent chez 95%

des patients

Clinique

• Signes d ’appels : asthénie, pesanteur abdominale

• Signes cliniques : splénomégalie +++

• Découverte fortuite (40 à 50% des cas)

• Complications inaugurales : rares

crise de goutte,

thrombose,

infarctus splénique

Épidémiologie

• incidence : 10 cas /an / 1.106 habitants

• âge moyen : 35-55 ans ; prédominance masculine

• facteurs favorisants : radiations ionisantes, benzène

Diagnostic : arguments cytologiques

sang Moelle +++

Phase : chronique,

transformation, ou

accélération

9q+

Ph

22

• Moelle

• Présence d ’un Ph

dans 95% des cas

• t(9;22)(q34;q11) « classique »

dans 95% des cas

• Translocation variante :

t(?;9;22) peu fréquente

• Banding R ou G

Diagnostic formel : caryotype

LMC : cytogénétique

• t(9;22)(q34.1;q11.2) : translocation réciproque

22

Ph

(22q-) BCR/ABL

Gène de fusion

Protéine de fusion

Caryotype 46,XY,t(9;22)(q34;q11)

Caryotype 47,XY,t(6;9;22)(p24;q34;q11),+21

FISH

• bi-couleur

• sondes spécifiques bcr et abl

• visualisation directe de la fusion bcr-abl dans les

cellules interphasiques

bcr

abl

FISH

• Précision du point de cassure, outil diagnostique :

• Pronostic : non

• Elucidation des translocations complexes

P190 , P210 ou P230

LMC LCN LAL Ph+

M-bcr m-bcr µ-bcr

FISH - sonde BCR-ABL

M-bcr

normal

m-bcr

Ph

22

9q+

9

22

Ph

9q+

9

22 22

9 9 M-bcr

m-bcr

Cassure M-bcr FISH - métaphase

1F 1V 2R

Cassure m-bcr FISH - métaphase

LMC, maladie de « la » cellule souche

Ph+

Ph+

Ph+

Ph+

Ph+

Ph+

Ph+

LMC : P210BCR/ABL, protéine hybride

BCR-ABL 3 points de cassure

P210

P190

LMC

LAL Ph+, LMC

P230

Leucémie

neutrophile

chronique

c-ABL : protéine nucléaire, expression ubiquitaire / régulation fine

= tyrosine kinase (régulation +++) , bloque le cycle cellulaire

BCR-ABL : tyrosine kinase constitutivement active, de localisation cytoplasmique,

avec propriétés « transformantes » (modèles animaux BCR/ABL+ LMC)

Sujets sains BCR/ABL+ (sang)

• Sujet normal :

• LMC:

Augmente la

prolifération

Réduit

l’adhérence

Inhibe

l’apoptose

Propriétés « oncogéniques » de la protéine P210BCR/ABL

Instabilité génétique +++

La LMC, un modèle pour l’évaluation de la maladie résiduelle

Baccarani,

Blood, 2006

Evolution naturelle de la LMC

+Ph, +8,

iso(17)(q10)

+19, +21

10 ans

Caryotype 45,XY,-2,+8, t(9;22)(q34;q11),i(17)(q10),-21

Phase chronique crise blastique

Précédée parfois d’une phase d’accélération

Apparition d’anomalies additionnelles dans 75 à 85% des cas

parfois avant toute manifestation cytologique ou clinique

p16

p53

+8

i(17)q

+Ph

+19

LMC acutisée

La phase acutisée de la LMC est marquée par une anomalie moléculaire (90% cas)

qui concerne le gène Ikaros/7p12 :

- délétion Ikaros (cryptique ou non, -7), totale ou partielle

- mutation Ikaros

protéine Ikaros aberrante…qui serait rfesponsable du blocage de la cellule à un

stade précoce de maturation (progéniteurs) d’où …leucémie aiguë

Mullighan et al. Nature Genetics, 2008

Fuxa & Skok, Curr Opin Immunol, 2007

Rôle clé de régulateurs/facteurs de transcription dans la lymphopoièse B

15 LMC acutisées

(3 LAL, 12 LAM)

4 del IKZF1

CML-7 : mutation

non-sens exon 7

La délétion de IKZF1 (Ikaros) constitue un évènement fréquent

dans le processus de transformation des LMC en LAL

Chrs 7

Mullighan et al., Nature, 2008

Caryotype 48,XY,del(7)(p12p1?5),+8,t(9;22)(q34;q11),+15

Traitement / Suivi

• Imitanib (GLIVEC*): inhibiteur de tyrosine kinase en 1ère intention (400 mg/j)

• ITK de 2è génération (Dasatinib: Sprycel* ; Nilotinb : Tasigna*) ou

Intérêt du suivi du caryotype +++

jusqu’à l’obtention de la réponse cytogénétique complète (RCyC)

RéponseCytogénétique

% de cellules médullairesPh+

Complète 0

Partielle 1 à 34%

Mineure 35 à 95%

Absence 100%

En parallèle suivi quantitatif par RT-Q-PCR

Autre modèle : le lymphome à cellules du manteau

Ontogénie B et Lymphomes

1 sous-type de lymphome = corolaire pathologique d’un compartiment physiologique

Moelle osseuse

ganglion Moelle osseuse, sang

Ontogénie B

D’après (Küppers 2005).

LMNH et Translocations Chromosomiques

t(14;18) IGH/BCL2

t(3;14) IGH/BCL6

t(8;14) IGH/cMYC

t(1;14)

IGH/BCL10

t(3;14)

IGH/BCL6

t(11;14)

IGH/CCND1

Lymphome à cellules du manteau

Particularités cliniques :

- formes disséminées (>90% st III ou IV)

- fréquentes atteintes muqueuses (intestin, ORL),

- lymphome à petites cellules « agressif »

Hétérogénéité clinique, morphologique,

Phénotype immunologique

IgS (ML), CD19+, CD5+, CD10-, CD23-

t(11;14)(q13;q32) : anomalie cytogénétique caractéristique

caryo/FISH (# 100%)

PCR (50-60%)

Conséquences : Hyperexpression cycline D1 (CCND1)

LM du Manteau : pronostic péjoratif

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 6

12

18

24

30

36

42

48

54

60

66

72

78

84

90

96

102

108

114

120

Survie en mois

Pro

bab

ilit

é d

e s

urv

ie

Folliculaire

Lymphocytique

Manteau

Zone marginale (SLVL)

Facteurs pronostiques : Ki67

Architecture diffuse Petites cellules

Lymphomes à cellules du manteau 7% des lymphomes

Immunophénotype

IgM++, CD19+, CD5+, CD10-, CD23-, CCND1+

•Forme blastoïde : cellules plus grandes,

•Forme pleiomorphe,

•Forme classique

la t(11;14)(q13;q32)

La t(11;14)(q13;q32)

cen tel

Major

Translocation

Cluster

Cassures 11q13 éparpillées

dans région de #1Mb en 5’ et 3’

de CCND1,

un hot spot : MTC, 120 kb en 5’

de CCND1

Gène IGH

Hyperexpression de

la cycline D1

der(14)

IGH : Points de cassure

entre les segments D et J

Dérégulation de la transcription d’un seul gène (non tronqué) sous l’effet d’un activateur hétérologue

The translocation t(11;14)(q13;q32) in MCL. (A) Schematic representation of the germline immunoglobulin heavy

chain (IgH) locus (IGH@) on chromosome 14q32 displaying the genomic organization of the variable (V), diversity

(D), joining (J) and the constant region (only the Cl gene is shown). The breakpoint in IGH seems to occur

between the diversity and joining regions during the early steps of the V(D)J recombination. (B) Genomic

organization of the BCL-1 (B-cell lymphoma/leukaemia 1) locus on chromosome 11q13. The majority of

breakpoints (30–50%) happen at the major translocation cluster (MTC), however there is some variability and 10–

20% of the breaks occurs outside the MTC closer to CCND1. (C) The translocation leads to a 5¢-5¢ fusion of the

bcl-1 locus with sequences from the IGH@ locus and brought under the control of the IgH enhancer, CCND1.

cyclineD1

Rate - Immunohistochimie

11 14 14q+11q-

CCND1

IGH

La t(11;14)(q13;q32) détection par FISH

Sonde LSI IGH / CCND1 dual color Vysis

FISH

Le caryotype d’un lymphome du manteau est souvent complexe…

G01 210 – HU G g1314

Caryotype : mitoses anormales 4/15

FISH 87 % noyaux avec t(11;14)

Cytogénétique conventionnelle et FISH dans les LLC

Impact pronostic et thérapeutique

Cytogénétique des LLC : impact thérapeutique

Cytogénétique des LLC

Cytogénétique des LLC

S06-079

CEP17

FISH p53/CEP17

Cytogénétique des LLC

Délétion 17p 45,X,-Y,+12,-16,add(17)(p11)

S07-785

Stilgenbauer ASH, 2004

Impact pronostique péjoratif de la délétion p53

Losanski et al., Blood, 2004

Délétion 17p des LLC : Impact clinique thérapeutique

CONCLUSIONS

Intérêt de l’étude cytogénétique des hémopathies malignes

1. Impact clinique : 4 : diagnostic, pronostic, suivi, thérapeutique

2. Signification de ces anomalies pour la compréhension des mécanismes de leucémogénèse,

3. Et de ce fait mieux orienter la recherche sur le versant thérapeutique : thérapie ciblée,

4. Avancée sur le plan fondamental : mécanismes intracellulaires, ou lien avec l’environnement tumoral…

CONCLUSIONS

Identification des gènes concernés Conséquences des anomalies de structure: Translocations, inversions, délétions: DÉRÉGULATIONTRANSCRIPTIONNELLE, GENES de FUSION (quelle fusion?) Troncation génique Délétions: gènes suppresseurs de tumeurs haplo-insuffisance Isodisomie parentale acquise (puce) Amplifications: dmin, HSR contenu des amplicons, expression des gènes amplifiés