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Introduction – Thérapie génique. José CORTES. 09/09/2004. Mise au point d’une technique de cartographie à haut débit des sites d’intégration d’un vecteur rétroviral. José CORTES. 09/09/2004. Cependant. 2 enfants ont développé une Leucémie. Introduction – Essai clinique d’Alain FISHER. - PowerPoint PPT Presentation
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Introduction – Thérapie génique
09/09/2004
José CORTES
Mise au point d’une technique de cartographie à haut débit des sites d’intégration d’un
vecteur rétroviral
09/09/2004
José CORTES
Introduction – Essai clinique d’Alain FISHER
09/09/2004
José CORTES
11 enfants atteints de X-SCID
Cependant
2 enfants ont développé une Leucémie
Introduction – Etudes des sites d’intégrations (1)
09/09/2004
José CORTES
L’équipe de Bushman
Virus HIV-1 : Intégration préférentielle au niveau de gènes transcriptionnellement actifs
L’équipe de Burgess
Vecteurs HIV-1 : Intégration préférentielle à l’intérieur de l’unité transcriptionnelle.Vecteurs MLV : Intégration préférentielle aux alentours du +1 de la transcription .
Introduction – Etudes des sites d’intégrations (2)
09/09/2004
José CORTES
Technique utilisée : Vecteur ou VirusADN génomique
Digestion enzymatique (site de coupure fréquent)
Ajout d’adaptateurs
PCR
Nested PCR
Clonage et séquençage
Introduction – Objectif de mon stage
09/09/2004
José CORTES
Réalisation de la technique
Résultats – 1ère partie (1)
09/09/2004
José CORTES
Analyse des jonctions vecteur-ADN génomique
NlaIII
5’5’
MmeI
catg
PVIPartie Vecteur
Côté Reverse
Séquence à analyserPLI3Côté Universel
Séquence cible de l’insertion
Site d’insertion du vecteur
schéma d’un contig réalisé par le logiciel BioEdit
Résultats – 1ère partie (2)
09/09/2004
José CORTES
211 clones bactériens séquencés
182
209
jonctions vecteur-ADNgénomique
contamination
séquences de mauvaisequalité
Résultats – 1ère partie (2)
09/09/2004
José CORTES
182
209
jonctions vecteur-ADNgénomique
contamination par HIV-1
séquences de mausaisequalité
11711
37
17
positonnées une fois
positonnées + d'1 fois
< 20 pb
non positionnables
182 jonctions
Sur 117 jonctions positionnables sans ambiguïté, 111 jonctions sont différentes.
Résultats – 1ère partie (3)
09/09/2004
José CORTES
Positions des insertions détectées sur leurs chromosomes respectifs D’après le site http://genome.ucsc.edu Les traits rouges représentent la position des intégrations détectées Les chromosomes encadrés en rouge n’ont subit aucune modification par le vecteur
Résultats – 1ère partie (4)
09/09/2004
José CORTES
Nombre de gènes et d'insertions par chormosome
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 x y
0
2
4
6
8
10
12
14
nb de gène
nb d'insertion
Résultats – 2ème partie (1)
09/09/2004
José CORTES
102 pb
1 2
100 pb
44 pb
30 pb
bPLI
bPLNPCR bPLN/bPLN
NlaIII NlaIII
Digestion NlaIII
Ligation LN2
NlaIII5’
5’
NlaIII5’
5’
MmeI
MmeI
Digestion par MmeI
NlaIIINlaIII
NlaIII
MmeI
58 pb
1 2
100 pb
20 pb
Résultats – 2ème partie (1)
09/09/2004
José CORTES
bPLI
bPLNPCR bPLN/bPLN
NlaIII NlaIII
Digestion NlaIII
Ligation LN2
NlaIII5’
5’
NlaIII5’
5’
MmeI
MmeI
Digestion par MmeI
NlaIIINlaIII
NlaIII
MmeI
100 pb
20 pb
1 2 3 4
1 : PCR bPLN/bPLI
2 : Fragment digéré par NlaIII 4 : Fragment de 26 pb purifié
3 : Purification sur billes
Puits n°4
Résultats – 2ème partie (1)
09/09/2004
José CORTES
bPLI
bPLNPCR bPLN/bPLN
NlaIII NlaIII
Digestion NlaIII
Ligation LN2
NlaIII5’
5’
NlaIII5’
5’
MmeI
MmeI
Digestion par MmeI
NlaIIINlaIII
NlaIII
MmeI
500 pb
1000 pbrégion 600-1200 pb
Résultats – 2ème partie (2)
09/09/2004
José CORTES
Analyse des concatémères
NlaIII NlaIII NlaIII NlaIII NlaIII NlaIII NlaIII NlaIII
Résultats – 2ème partie (3)
09/09/2004
José CORTES
Étiquettes obtenues :
Sur 40 séquences de concatémères, 1002 étiquettes on été extraites.
Etiquettes obtenues par extract_tag
100
609
étiquettes utilisables
étiquettes non-utilisables
Moyenne de 25 étiquettes par concatémère
Résultats – 2ème partie (4)
09/09/2004
José CORTES
Comparaison des étiquettes sur le génome
Résultats – 2ème partie (5)
09/09/2004
José CORTES
Comparaison des étiquettes sur le génome
224
96
82207
étiquettespositionnablesétiquettes à positionmultipleétiquettes nonpositionnablesétiquettes vecteur
224
96
82207
étiquettespositionnablesétiquettes à positionmultipleétiquettes nonpositionnablesétiquettes vecteur
Résultats – 2ème partie (5)
09/09/2004
José CORTES
redondance des étiquettes positionnables sur le génome
181
21 0
1 fois
2 - 5 fois
> 5 fois
Conclusion
09/09/2004
José CORTES
Objectif atteint
211 séquences -> 111 jonctions différentes sur le génome
40 séquences de concatémères -> 207 étiquettes différentes, positionnables sans ambiguïté sur le génome
Remerciements
09/09/2004
José CORTES
Olivier DANOS
Équipe Ciblage
Javier PEREA
Nathalie HOLIC-BARLET
Julie MANTOVANI
Service Séquençage
Sabine Dubus
Service Informatique
Kelly MARTINEZ
Aux Généthoniens…