Isolasi dan pemisahan protein

ISOLASI ISOLASI

DAN DAN

PEMISAHAN PROTEINPEMISAHAN PROTEIN

Pendahuluan

Protein adalah molekul organik yang terbanyak di dalam sel. Lebih dari 50% berat kering

sel terdiri atas protein. Selain itu, protein adalah biomolekul yang sesungguhnya,

karena senyawa ini yang menjalankan berbagai fungsi dasar kehidupan, antara lain

proses berkontraksi melakukan gerak, menjalankan berbagai proses metabolisme dalam

bentuk enzim. Protein dapat pula berperan membawa informasi dari luar ke dalam sel dan

di dalam bagian-bagian sel sendiri. Protein juga mengendalikan dapat tidaknya, serta

waktu yang tepat untuk pengungkapan informasi yang terkandung di dalam DNA, yang

diperlukan untuk sintesis protein itu sendiri. Jadi secara tidak langsung protein mengatur

perbanyakan diri sendiri dengan mengatur DNA, yang merupakan alat perekam informasi

untuk protein, sehingga dengan demikian operasinya di bawah kendali protein.

Secara kimia, protein adalah heteropolimer dari asam-asam amino, yang terikat satu

sama lain dengan ikatan peptida. Ada suatu universalisme di dalam molekul protein.

Protein apapun dan berasal dari makhluk apapun juga ternyata hanya tersusun dari

20 macam asam amino saja. Perbedaan protein yang satu dengan yang lain disebabkan

oleh jumlah dan kedudukan asam-asam amino tersebut di dalam tiap-tiap molekul. Kedua

puluh asam-amino itu mempunyai ciri umum sebagai berikut. Pertama, semuanya

mempunyai konfigurasi L. Kedua, sama-sama mempunyai 1 gugus COOH dan 1 gugus

NH2 yang terikat ke atom C. Perbedaan individual dari asam-asam amino ini disebabkan

oleh perbedaan rantai samping. Yang menyebabkan perbedaan kimia antara asam-asam

amino tersebut, pada gilirannya akan menyebabkan perbedaan sifat kimia dan biologis dari

molekul protein yang disusunnya. Rantai samping R ini tidak ikut membentuk ikatan

peptida. Muatan suatu protein dalam suatu larutan ditentukan oleh gugus NH2 bebas di

suatu ujung dan gugus COOH bebas di ujung yang lain serta jumlah rantai yang

bermuatan.

Molekul protein, melalui ikatan hidrogen, berinteraksi dengan molekul air membentuk

mantel air. Karena molekulnya besar, di dalam air protein membentuk larutan koloid.

Adanya sejumlah elektrolit dengan konsentrasi encer sanat meningkatkan kelarutan suatu

protein (salting in). Sifat ini, yaitu kelarutan dalam bentuk larutan koloid yang dipermudah

oleh mantel air dan elektrolit encer, dimanfaatkan untuk pemisahan protein. Selain itu, sifat

lain, yaitu ukuran molekul yang berbeda sebagai akibat dari jumlah asam amino yang

menyusun dan muatan yang tidak sama antar protein yang satu dengan yang lain karena

perbedaan jenis asam amino yang menyusunnya, menjadi dasar dari pemisahan protein

yang akan dilakukan pada praktikum berikut ini.

Tujuan Praktikum :

1. Mengenal reaksi umum berdasarkan adanya beberapa ikatan peptida pada suatu

protein dan mampu menggunakannya untuk melacak protein dalam suatu bahan

2. Melakukan pemisahan suatu protein dari kelompok protein lain secara reversibel

dengan menggunakan larutan garam divalen konsentrasi tinggi (salting out) dan

menerangkan mekanisme pemisahan tersebut.

3. Melakukan pemisahan protein secara reversibel, dengan menggunakan bahan

higroskopis dan menerangkan mekanisme pemisahan tersebut.

4. Melakukan pemisahan protein secara denaturasi ireversibel dengan menggunakan

pereaksi alkaloid, menerangkan mekanisme kerjanya dan mampu menggunakan

untuk melacak protein.

5. Memperlihatkan kemampuan logam berat dalam mengendapkan dan mendenaturasi

protein dan menjelaskan masalah yang ditimbulkan oleh logam berat sebagai

pencemar lingkungan.

6. Mengetahui cara pemisahan suatu protein dari protein lain ataupun senyawa lain,

berdasarkan perbedaan berat molekul, dengan menggunakan cara kromatografi gel

penyaring molekul sederhana.

Percobaan Protein

1. Uji Biuret

Tujuan :

Memperlihatkan bahwa protein mempunyai ikatan peptida yang bereaksi positif dengan uji

biuret. Reaksi ini tidak terjadi pada makromolekul lain.

Dasar :

Ikatan-ikatan peptida yang menyusun protein dan polipeptida, dalam larutan bersuasana

alkali akan berwarna lembayung bila direaksikan dengan Cu++.

Bahan dan Pereaksi :

1. Larutan albumin atau putih telur

2. Air liur

3. Larutan pati 1%

4. Human serum

5. Aquades

6. NaOH 10%

7. Larutan CuSO4 0,1%

Cara Kerja dan Hasil :

Menyiapkan 5 tabung reaksi yang bersih. Mempipetkan ke dalam tabung reaksi, seperti

pada tabel 1.

Tabel 1. Prosedur Reaksi biuret

Tabung 1 2 3 4 5

Larutan albumin

(putih telur)

1 mL - - - -

Air liur - 1 mL - - -

Larutan pati - 1 mL - -

Air suling - - - 1 mL -

Serum sapi - - - - 1ml

NaOH 10% 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1ml

Larutan CuSO4 * 1 tetes 1 tetes 1 tetes 1 tetes 1 tetes

Warna lembayung Ya Ya Tidak Tidak Ya

* Bila belum terbentuk warna lembayung, CuSO4 dapat ditambahkan lagi, sampai 10 tetes.

Kesimpulan :

Dari hasil percobaan di atas menunjukkan bahwa yang membentuk warna lembayung/ungu adalah tabung yang berisi larutan albumin (putih telur), air liur, dan serum sapi. Protein akan bereaksi positif pada uji biuret karena protein mengandung ikatan peptida. Ikatan peptida akan bereaksi dengan Cu++ dan menghasilkan warna lembayung (ungu) dalam suasana alkali. Dari percobaan diatas dapat disimpulkan bahwa larutan albumin dan air liur mengandung protein, sedangkan larutan pati dan air suling tidak mengandung protein.

Jawaban Pertanyaan :

1. Apakah uji ini akan positif untuk asam amino?

=Ya, uji ini akan positif terhadap asam amino yang mengandung protein dengan

memiliki ikatan peptida.

2. Asam amino apa saja yang menyusun protein?

=Asam amino yang menyusun protein antara lain : Glisin, Alanin, Valin, Leusin,

Isoleusin, Fenilalanin, Metionin, Prolin, Triptofan, Serin, Treonin, Tirosin,

Asparagin, Glutamin, Sistein, Aspartat, Glutamat, Arginin, Lisin, Histidin.

3. Bagaimana pengelompokan asam amino?

=Pengelompokan asam amino adalah: Asam amino dengan gugus R nonpolar,

Asam amino dengan gugus polar R netral, Asam amino dengan gugus R

bermuatan,yang terdapat dalam pengelompokan Simple dan Conjugated.

4. Apa yang dimaksud dengan asam amino essensial? Asam amino apa saja yang

essensial?

=Asam Amino esensial adalah asam amino yang dibutuhkan oleh tubuh tapi tidak

diproduksi oleh tubuh. Contohnya : Arginin, Histidin, Isoleusin, Methionin,

Phenylalanine, Threonin, Triptofan, Valin, Leusin. Sedangkan asam amino non

esensial adalah asam amino yang tidak begitu dibutuhkan oleh tubuh.

Contohnya : Hydroxiproline, Hydroxilisine, Glysine, Proline, Serin, Tyrosin,

Aspargin, Glutamat, Glisin, Cystein, Alanine.

5. Gambarkan ikatan peptida!

O O

H2N CH-C H CH C OH

N R2

Residu N R1 Residu C

Ikatan peptida

2. Pengendapan Protein Dengan Larutan Garam

Konsentrasi Tinggi (Salting Out)

Tujuan :

Memperlihatkan bahwa sebagai makromolekul yang larut dalam bentuk larutan koloid,

protein dapat dipisahkan satu dari yang lain, dengan menggunakan larutan garam divalent

konsentrasi tinggi.

Dasar :

Untuk larutan dalam air, suatu molekul harus dapat berinteraksi dengan molekul air

dengan cara membentuk ikatan hidrogen sehingga molekul tersebut tersebar rata

diantara molekul-molekul air. Adanya muatan listrik pada molekul terlarut sangat

membantu kelarutan, karena muatan yang sama saling menjauhi, sehingga agregasi

molekul tidak terjadi.

Protein merupakan makromolekul karena memiliki BM (berat molekul) besar. Pada

umumnya,protein mudah larut dalam air karena protein mempunyai kedua sifat berikut.

Gugus -CO- dan –NH- yang ada pada iktan peptida dapat berinteraksi dengan molekul air

melalui ikatan hidrogen, sedangkan berbagai rantai samping, yang diantaranya ada yang

hidrofilik,bahkan juga bermuatan, sangat mudah berinteraksi dengan molekul air. Selain

itu, muatan listrik yang sama dalam 2 partikel molekul protein yang sama, akan bertolakan,

sehingga membantu meningkatkan kelarutan protein (salting in).

Setiap keadaan yang menyebabkan ditariknya air yang mengelilingi molekul protein,

sangat mengurangi kelarutan protein, sehingga protein mengendap. Larutan garam

berkonsentrasi tinggi bersifat demikian. Selain itu, larutan garam berkonsentrasi tinggi

akan menetralkan muatan listrik, sehingga kelarutan akan makin berkurang.

Oleh karena pengendapan dengan cara ini hanya bersifat menarik air di sekeliling protein,

sedangkan molekul protein sendiri tidak mengalami perubahan kimia, maka perubahan

tersebut bersifat reversible. Kelarutan dan fungsi protein pada umumnya akan pulih

kembali bila dikembalikan ke keadaan semula.

Larutan garam divalent lebih efisien dalam mengendapkan protein, karena di dalam air

garam tersebut akan berdisosiasi menjadi 3 ion, yang masing-masing berinteraksi

sempurna dengan air. Sebagai contoh, globulin dapat diendapkan oleh (NH4)2SO4

setengah jenuh, sedangkan NaCl baru dapat mengendapkan protein tersebut bila berada

dalam larutan jenuh. Albumin, yang baru akan mengendap oleh (NH4)2SO4 jenuh, tidak

dapat diendapkan oleh NaCl jenuh, kecuali dengan penambahan asam mineral dalam

jumlah yang sangat kecil. Pada gambar 2.1 diperlihatkan mekanisme terjadinya

pengendapan protein oleh garam dalam konsentrasi tinggi.

H O H O H H H H O O O

R- R- O H H

N C N C C + (NH4)2SO4

NH3+ R+ O Protein terlarut

NH3+ COO-

COO- NH3+

NH3+ COO-

COO- NH3+

Protein beragregasi / mengendap

Gambar 1. Pengendapan Protein Dengan Cara Salting Out


1. Serum sapi

2. Larutan ammonium sulfat (NH4)2SO4 jenuh dan1/2 jenuh

3. Larutan NaOH 10%

4. Larutan CuSO4 0,1%

5. Kertas saring+ corong


Menyiapkan 3 tabung reaksi yang bersih dan kering. Melakukan prosedur seperti yang

tertera dalam tabel 2 :

Tabel 2. Percobaan salting out

Tabung 1

Serum sapi 1 ml

Amonium sulfat jenuh : tetes demi tetes 1 ml

Endapan : ada / tidak ada Ada endapan

Amonium sulfat ½ jenuh: tetes demi tetes* 1ml

Endapan: ada / tidak ada Ada endapan

Pisahkan endapan dengan menyaring

Lakukan uji biuret terhadap:

Filtrat Amonium sulfat jenuh

Endapan Amonium sulfat jenuh

Filtrat Amonium sulfat 1/2 jenuh

Endapan Amonium sulfat 1/2 jenuh

- (tidak berwarna lembayung)

+ (warna lembayung)

+ (warna lembayung)

+ (warna lembayung)

* Amonium sulfat ½ jenuh dibuat dengan cara mengencerkan Amonium sulfat jenuh dan

aquades dengan perbandingan 1:1

*Amonium sulfat jenuh warna biru muda

*Amonium sulfat ½ jenuh warna ungu/lembayung

Kesimpulan :

Protein dapat diendapkan dengan menggunakan garam konsentrasi tinggi melalui proses

salting out. Dengan penambahan ammonium sulfat yang jenuh akan mengendapkan serum

sapi sehingga larutan menjadi bersifat reversibel. Hal ini dikarenakan garam berdivalent

tinggi lebih kuat menarik mantel air daripada protein dalam serum.

Serum mengandung 2 jenis protein, yaitu globulin dan albumin. Setelah

penambahan ammonium sulfat jenuh, ternyata terbentuk endapan. Dan setelah

diuji dengan biuret, baik filtrat maupun endapan yang dihasilkan, sama-sama

terbentuk warna ungu. Jadi, endapan yang dihasilkan adalah albumin, sedangkan

filtrat adalah globulin, karena albumin akan mengendap pada penambahan

ammonium sulfat jenuh.


1. Pada penambahana satu volume ammonium sulfat jenuh ke dalam satu volum serum

terjadi pengendapan protein. Apakah nama protein tersebut?

= Protein yang mengendap pada penambahan satu volume amonium sulfat jenuh

ke dalam satu volume serum adalah protein Albumin.

2. Apa nama protein serum yang tidak dapat diendapkan pada penambahan ammonium

sulfat jenuh tersebut?

= Yang tidak dapat diendapkan pada percobaan tersebut adalah Globulin.

3. Apa fungsi protein dalam darah dan di mana disintesis?

= Fungsi Albumin adalah mengikat Ligand, albumin disintesis di hati. Fungsi

Protein dalam darah = sebagai transport dan storage. Contoh : CO2 dan O2

dalam darah / eritrosit.

4. Pada keadaan apa saja terjadi defisiensi protein tersebut dan apa gejala utamanya?

= Alkaptonuria, defisiensi enzim homogentisic acid dioxygenase.Ditandai dengan

perubahan warna urine yang menjadi gelap kalau didiamkan.

3. Pemisahan Protein Dengan Etanol

Absolut

Tujuan :

Memperlihatkan, bahwa sebagai makromolekul yang larut, protein dapat dipisahkan

dengan mengendapkannya dengan penambahan etanol absolut.

Dasar :

Etanol absolut bersifat sangat kuat menarik air (higroskopis). Penambahan etanol absolut

pada suatu larutan protein, akan menyebabkan molekul air yang berinteraksi dengan

molekul protein melalui ikatan hidrogen ditarik oleh etanol. Akibatnya molekul-molekul

protein beragregasi satu sama lain sehingga mengendap. Bila agregat partikel protein

tersebut dibiarkan bersentuhan dengan etanol untuk waktu yang lama endapan yang

terbentuk tidak dapat dilarutkan lagi sehingga denaturasi yang terjadi irreversibel.

Dengan menggunakan etanol berbagai konsentrasi dan suhu yang rendah, Cohn

pada tahun empat puluhan telah berhasil memisahkan protein serum dalam 5 fraksi, dan

fraksi V yang diperoleh sebagian besar terdiri atas albumin.

Protein tidak dapat mengendap disebabkan oleh karena protein tersebut memiliki

muatan listrik, gerak Brown, dan mantel air yang mempengaruhi pengendapan protein

tersebut dalam larutan tertentu.


1) Serum

2) Larutan albumin telur

3) Etanol absolut

4) Larutan NaOH encer

5) Larutan CuSO4

6) Kertas saring dan corong


Menyiapkan 3 tabung reaksi yang bersih dan kering. Lakukan prosedur yang tertera pada

tabel 3 :

Tabel 3. Percobaan Pengendapan Protein Dengan Etanol Absolut

Tabung 1 2

Serum 1 ml -

Larutan albumin telur - 1 ml

Etanol absolut 1 ml 1 ml

Endapan: ada/tidak ada Ada endapan Ada endapan

Pisahkan endapan dengan menyaring

Uji biuret terhadap:

Filtrat

Endapan

-

+

-

+

Kesimpulan :

Protein dapat dipisahkan dengan mengendapkannya dengan penambahan etanol absolut.

Kemudian dipisahkan antara endapan dan supernatan, lalu dites biuret tetap memberikan

hasil positif. Demikian juga serum dan etanol absolut, ditandai dengan warna ungu.


1. Sebutkan secara garis besar protein utama dari fraksi Cohn I sampai V.

Fraksi I : Fibrinogen α,β,γ

Fraksi II : β,γ- Globulin (Antibodi)

Fraksi III : α+A, β1, γ+β2- Globulin (Kolesterol, Fosfatida, Karotenoid,

VitaminA, Estrogen ), Isoaglutinin

Fraksi IV : β1,α2, α1, Α, β, α2, α+Α (Kolesterol, Fosfatida, Fosfatase,

Esterase serum, Hipertensinogen )

Fraksi V : Albumin

2. Apakah fungsi tiap-tiap protein tersebut?

Fraksi I banyak berperan dalam koagulasi darah

Fraksi II berperan sebagai Imunitas

Fraksi III dan IV berperan sebagai Lipoprotein

Fraksi V yaitu Albumin yang merupakan bagian terbesar dari elektroforesis ini

berfungsi sebagai zat yang mempertahankan volume plasma(mencegah shock,

Hipoproteinemia dan Odem)

4. Pengendapan Protein Secara

Denaturasi Ireversibel

Pengendapan protein dengan

logam berat

Tujuan :

Memperlihatkan, bahwa logam berat mengendapkan protein secara denaturasi ireversibel.

Dasar :

Logam berat akan mendenaturasikan dan mengendapkan protein. Peristiwa itu terjadi, bila

berbagai gugus di permukaan molekul protein bermuatan negatif, sehingga membentuk

garam dengan kation logam berat. Jumlah protein yang diendapkan sebanding dengan

jumlah logam berat yang ditambahkan. Makin banyak logam berat yang ditambahkan,

makin banyak protein yang mengendap, selama dalam larutan masih terdapat protein.

Protein tertentu memerlukan penambahan beberapa tetes alkali supaya protein tersebut

bermuatan negatif. Selain itu, kelebihan logam berat dapat pula melarutkan kembali

kompleks logam berat-protein, walaupun protein tersebut tetap dalam keadaan denaturasi.

“Protein bermuatan negatif membentuk garam dengan kation logam berat menjadikan

protein terdenaturasi dan mengendap.”


1. Putih telur( albumin)

2. larutan HgCl2 1%

3. Larutan Pb-asetat

4. Serum sapi

Cara kerja dan Hasil :

Siapkan dua buah tabung reaksi, lakukan prosedur yang tertera dalam tabel 4.

Tabel 4.B.

Pengendapan Protein Dengan logam Berat

Tabung 1 2 3 4

Putih telur (Albumin) 1 ml 1ml - -

Serum sapi - - 1ml 1ml

HgCl2 Tetes - tetes - Tetes - tetes

Pb-asetat - Tetes - tetes - Tetes - tetes

Endapan ada/tidak ada Ada Ada Ada Ada

Kesimpulan :

Pada percobaan di atas diketahui bahwa logam berat seperti HgCl2 dan Pb-asetat dapat mengendapkan albumin. Ini berarti protein terdapat pada albumin.


1. Apakah tiap kali penambahan logam berat diikuti oleh penambahan endapan

protein? Mengapa?

Ya, pada tiap kali penambahan logam berat selalu diikuti oleh penambahan

endapan protein. Hal ini dikarenakan logam berat mempunyai sifat

pendenaturasi protein dan kandungan kation logam berat akan bereaksi

dengan molekul yang bermuatan negatif yang dapat memicu pembentukan

endapan pada protein.

2. Berapa tetes setiap logam diperlukan untuk mengendapkan protein di kedua bahan

tersebut?

Masing-masing dibutuhkan 5 tetes untuk proses pengendapan kedua

kation.

3. Sebutkan logam-logam berat yang menjadi pencemar utama lingkungan, sumber

pencemaran dan jelaskan mengapa logam tersebut berbahaya. Sebutkan nama suatu

penyakit berbahaya yang terkenal yang diambil dari suatu nama teluk di Jepang,

yang disebabkan oleh keracunan logam berat. Logam berat apakah yang menjadi

penyebab dan jelaskan bagaimana logam tersebut meracuni manusia?

Logam berat yang menjadi pencemar utama lingkungan adalah Pb dan

sumber pencemaran berasal dari asap kendaraan bermotor. Logam berat ini

dapat membahayakan sirkulasi pernafasan, sehingga terjadi infeksi saluran

pernafasan.

Cystinuria. Ekskresi sistin dalam urine meningkat (bisa mencapai 30 x

nilai normalnya). Ekskresi Lysine, Arginine dan Gangguan

reabsorpsi asam amino dari

Maple Syrup Urine Disease

4. Apakah yang perlu dilakukan ,bila terjadi keracunan logam berat yang akut?

Sebutkan pula apakah yang perlu dilakukan bila terjadi pemaparan kronis. Berilah

contoh nyata pemaparan kronis.

Hal yang dapat dilakukan bila terjadi keracunan logam berat yang akut

adalah dengan meminum susu untuk menetralisirnya.

LAPORAN PRAKTIKUM

BIOKIMIA IV

ISOLASI DAN PEMISAHAN PROTEIN

Disusun Oleh :

AYU KARTIKA SARI (405080161)

ANGELA KRISTIANA INTAN (405080162)

FAKULTAS KEDOKTERAN

UNIVERSITAS TARUMANAGARA

2008

Documents

Isolasi dan pemisahan protein