ISOLASI SENYAWA ANTIBAKTERI Staphylococcus aureus dan E. Coli DARI EKSTRAK BUAH BLIMBING WULUH (Averrhoa blimbi. L)

SKRIPSI

Oleh :

Cicik Milyasari NIM. 03530002

JURUSAN KIMIA FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI UNIVERSITAS ISLAM NEGERI (UIN)

MAULANA MALIK IBRAHIM MALANG

2010

ISOLASI SENYAWA ANTIBAKTERI Staphylococcus aureus dan E. Coli DARI EKSTRAK BUAH

BLIMBING WULUH (Averrhoa blimbi. L)

SKRIPSI

Diajukan kepada:

Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Islam Negeri (UIN) Maulana Malik Ibrahim Malang

Untuk Memenuhi Salah Satu Persyaratan Dalam Memperoleh Gelar Sarjana (S.Si)

Oleh:

CICIK MILYASARI NIM. 03530002

JURUSAN KIMIA

FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI

UNIVERSITAS ISLAM NEGERI (UIN)

MAULANA MALIK IBRAHIM

MALANG

2010

SURAT PERNYATAAN ORISINALITAS PENELITIAN

Saya yang bertanda tangan dibawah ini:

Nama : Cicik Milyasari

NIM : 03530002

Fakultas / Jurusan : Sains dan Teknologi / Kimia

Judul Penelitian : Isolasi Senyawa Antibakteri Staphylococcus Aureus dan

E. Coli Dari Ekstrak Buah Blimbing Wuluh (Averrhoa

blmbi. L)

Menyatakan dengan sebenar-benarnya bahwa skripsi yang saya tulis ini

benar-benar merupakan hasil karya saya sendiri, bukan merupakan pengambil

alihan data, tulisan atau pikiran orang lain yang saya akui sebagai hasil tulisan

atau pikiran saya sendiri.

Apabila di kemudian hari terbukti terdapat unsur-unsur jiplakan, maka

saya bersedia untuk mempertanggung jawabkan, serta diproses sesuai paraturan

yang berlaku.

Malang, 6 Juli 2010

Yang membuat pernyataan

Cicik Milyasari NIM. 03530002

ISOLASI SENYAWA ANTIBAKTERI Staphylococcus aureus dan E. Coli

PADA EKSTRAK BUAH BLIMBING WULUH (Averrhoa blimbi.L)

SKRIPSI

Oleh:

CICIK MILYASARI

NIM: 03530002

Telah disetujui oleh:

Pembimbing Utama

Eny Yulianti, M. Si NIP: 197606112005012006

Pembimbing Pendamping

Anton Prasetyo, M. Si NIP: 197709252006041003

Mengetahui,

Ketua Jurusan Kimia

Fakultas Sains dan Teknologi

Universitas Islam Negeri (UIN)

Maulana Malik Ibrohim

Malang

Diana Candra Dewi, M. Si NIP: 197707202003122001

ISOLASI SENYAWA ANTIBAKTERI Staphylococcus aureus DAN E. Coli DARI EKSTRAK BUAH BLIMBING WULUH (Averrhoa blimbi. L)

SKRIPSI

Oleh:

Cicik Milyasari NIM. 03530002

Telah Dipertahankan di Depan Dewan Penguji Skripsi dan Dinyatakan Diterima Sebagai Salah Satu

Persyaratan untuk Memperoleh Gelar Sarjana Sains (S. Si)

Tanggal 2010

Susunan Dewan Penguji

Tanda Tangan

1. Penguji Utama : Rini Nafsiati Astuti, M.Pd NIP. 19750531 200312 2 003

( ................................. )

2. Ketua Penguji : Tri Kustono Adi, M.Sc NIP. 19710311 200312 1 002

( ................................. )

3. Sekr. Penguji : Eny Yulianti, M.Si NIP. 197606112005012006

( ................................. )

4. Anggota Penguji : Anton Prasetyo, M.Si NIP. 19770925 200604 1 003

( ................................. )

Mengetahui dan Mengesahkan Ketua Jurusan Kimia

Diana Candra Dewi, M.Si NIP. 19770720 200312 2 001

ABSTRAK Milyasari, Cicik, 2010, Isolasi Senyawa Antibakteri Staphylococcua aureus dan E. coli Dari Ektrak Buah Blimbing Wuluh (Averrhoa blimbi,l). Pembimbing : Eny Yulianti, M. Si, Anton Prasetyo, M. Si Kata Kunci: Buah Belimbing Wuluh (Averrhoa bilimbi L), Flavonoid,

Antibakteri, Kromatografi Lapis Tipis (KLT), Spektrofotometer FTIR

Telah dilakukan penelitian tentang isolasi senyawa anti bakteri dari ekstrak

buah blimbing wuluh, dengan tujuan untuk mengetahui potensi dari senyawa flavonoid dan triterpenoid yang terdapat pada buah blimbing wuluh (Averhoa blimbi,l) yang efektif sebagai antibakteri alami.

Metode yang digunakan dalam penelitian ini meliputi maserasi, pemisahan dengan KLT analitik dengan variasi eluen yaitu untuk flavonoid menggunakan eluen butanol-asam asetat glasial-air (BAA) dan metanol–kloroform, dengan komposisi meliputi BAA (4:1:5), BAA (6:1:2), dan metanol-kloroform (1:9), (1:19) dan (1:39), sedangkan eluen triterpenoid yang digunakan adalah n-heksana-etil asetat (1:1) dengan pereaksi Lieberman-Burchard, untuk mencari eluen terbaik yang selanjutnya digunakan untuk KLT preparatif. Selanjutnya hasil dari KLT preparatif digunakan untuk uji antibakteri dan diidentifikasi dengan spektrofotometer FTIR.

Hasl isolasi senyawa antibakteri Staphylococcus aureurs dan E. coli pada fraksinasi buah blimbing wuluh (Averhoa blimbi, l). Sebanyak 14 gr ekstrak pekat ethanol diperoleh dari 50 gr buah blimbing wuluh yang telah dkeringkan. Hasil KLT Analitik menunjukkan bahwa eluen terbaik untuk KLT Preparatif adalah methanol-clorofrm (1:9). Hasil identifikasi menunjukkan bahwa isolat merupakan senyawa golongan flavonid dengan kemungkinan memiliki gugus fungsi –OH, C-H, C=O, C-O, =C-H dan C=C (cincin benzena). Isolat dapat menghambat pertumbuhan bakteri Staphylococcus aureus dan E. coli pada konsentrasi 450 mg/ml.

ABSTRACT Milyasari, cicik, 2010, Antibactery Staphylococcua Aureus Compound Isolation and E. Coly on Sour Carambola extract (Averrhoa blimbi,l). Advisor : Eny Yulianti, M. Si. And Anton Prasetyo. Key Words : Sour Carambola (Averrhoa bilimbi L), Flavonoid, Antibakteri, Cromatography Thin Lining (KLT), Spectrofotometer FTIR.

Having done research about antibactery staphylococcua aureus compound isolation from sour carambola fruit extract, by the objective is to know the potency of flavonoid compound and triterpenoid exid in sour carambola fruit(Averhoa Blimbi,l) which is efective as natural antibactery.

The research method of this research are maserasi, separating by KLT analysis by eluen variation, for flafonoid by using eluen asetat sour-butanol water-glacial (BAA) and cloroform-metanol (1:9), by the composition is included BAA (4:1:5), BAA (6:1:), and cloroform-metanol (1:9), (1:19) dan (1:39), whereas triterpenoid eluen which is used is n-heksana-etil asetat (1:1) by the reactor is Lieberman-Burchard, to look for the best eluen for preparative KLT. Then the result of Preparative KLT is used for antibactery evaluation and identified by spectrofotometer FTIR.

The result of Antibactery Staphylococcua Aureus Compound Isolation and E. Coly on fractination Sour Carambola fruit (Averrhoa Blimbi,l). Concentrated ethanol extract 14 gr from 50 gr Sour Carambola fruit which was draed. The result of KLT Analysis shows that the best eluen for Preparative KLT is methanol-chloroform (1:9). The result identification shows that isolat is compound kind of flavonod by the possibility has function cluster –OH, C-H, C=O, C-O, =C-H and C=C (benzena ring). Isolat can impede the growing of Staphylococcus Aureus and E. Coly on 450mg/ml concentration.

BAB I

PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Tumbuh-tumbuhan memiliki peranan penting dalam kehidupan manusia.

Tumbuhan dapat bermanfaat sebagai makanan dan juga obat-obatan. Hal ini

menunjukkan bahwa segala apa yang tercipta ada manfaatnya dan itu semua

merupakan tanda-tanda kekuasaan Allah. Sebagaimana pada ayat-ayat Allah Q.S

Adz-Dzariyaat [51] ayat 20-21:

’ Îûuρ ÇÚ ö‘ F{$# ×M≈tƒ#u tÏΖÏ%θçΗø>Ïj9 ∩⊄⊃∪ þ’ Îûuρ ö/ ä3 Å¡ à�Ρr& 4 Ÿξ sùr& tβρç�ÅÇ ö7è? ∩⊄⊇∪

“Dan di bumi itu terdapat tanda-tanda (kekuasaan Allah) bagi orang-orang yang yakin. Dan (juga) pada dirimu sendiri. Maka Apakah kamu tidak memperhatikan?

Salah satu tanda kebesaran Allah adalah buah blimbing wuluh dapat

dimanfaatkan sebagai antibakteri dan air belimbing wuluh dapat dimanfaatkan

sebagai alternatif untuk mengawetkan ikan dan daging.

Sejak zaman Rasulullah telah dikenal pengobatan dengan memanfaatkan

tanaman, antara lain adalah minyak zaitun (Kustoro, 2007). Pemanfaatan tanaman

untuk pengobatan tradisional tersebut sampai sekarang terus berkembang dan

berlangsung di masyarakat. Jenis tanaman yang dipakai sebagai obat tradisional

sangat banyak macamnya, namun pemanfaatannya masih terbatas.

Al-Qur’an telah menyebutkan sejumlah buah-buahan yang oleh ilmu

pengetahuan modern ditegaskan memiliki khasiat untuk mencegah beberapa jenis

penyakit. Allah memerintahkan manusia supaya memperhatikan keberagaman dan

keindahan ciptaan-Nya disertai seruan agar merenungkan ciptaan-ciptaan-Nya

yang amat menakjubkan.

uθ èδ uρ ü“Ï% ©!$# tΑt“Ρr& zÏΒ Ï !$yϑ ¡¡9 $# [!$ tΒ $ oΨô_t�÷zr' sù ϵÎ/ |N$t7tΡ Èe≅ ä. &óx« $ oΨ ô_t�÷zr' sù çµ÷Ψ ÏΒ

#Z�ÅØyz ßlÌ�øƒ �Υ çµ÷Ψ ÏΒ $ {6ym $Y6 Å2#u� tI•Β zÏΒuρ È≅÷‚ ¨Ζ9$# ÏΒ $yγÏè ù= sÛ ×β# uθ÷Ζ Ï% ×πuŠ ÏΡ#yŠ ;M≈̈Ψ y_uρ ôÏiΒ 5>$ oΨ ôã r& tβθ çG÷ƒ ¨“9$#uρ tβ$̈Β ”�9$# uρ $YγÎ6 oKô± ãΒ u�ö�xîuρ >µÎ7≈t± tF ãΒ 3 (#ÿρ ã�ÝàΡ$# 4’ n< Î) ÿÍν Ì�yϑ rO !#sŒÎ) t�yϑøO r& ÿ ϵÏè÷Ζ tƒuρ

4 ¨βÎ) ’ Îû öΝä3Ï9≡ sŒ ;M≈tƒUψ 5Θ öθ s)Ïj9 tβθ ãΖÏΒ÷σ ム∩∪

Artinya: "Dan Dialah yang menurunkan air hujan dari langit, lalu Kami tumbuhkan dengan air itu segala macam tumbuh-tumbuhan, maka Kami keluarkan dari tumbuhan-tumbuhan itu tanaman yang menghijau. Kami keluarkan dari tanaman yang menghijau itu butir yang banyak; dan dari mayang kurma menguraitangkai- tangkai yang menjulai, dan kebun-kebun anggur, dan

Kami keluarkan pula zaitun dan delima yang serupa dan yang tidak serupa. Perhatikanlah buahnya di waktu pohonnya berbuah, dan (perhatikan pula) kematangannya. Sesungguhnya, pada yang demikian itu ada tanda-tanda (kekuasaan Allah) bagi orang-orang yang beriman." (QS. Al-An'am [6]: 99)

Allah menciptakan beragam jenis buah, setiap jenis memiliki rasa dan

aroma tersendiri meskipun semuanya tumbuh di tanah yang sama dan diairi

dengan air yang sama. Sebagaimana penciptaannya, kenyataan bahwa buah-

buahan dan sayur-sayuran merupakan sumber-sumber vitamin dan nutrisi esensial

yang melimpah, juga menggugah manusia berakal untuk berpikir. Buah-buahan

yang tumbuh dalam tanah hanya menyerap unsur-unsur gizi yang diperlukan

(mineral-mineral) yang bermanfaat bagi kesehatan manusia.

Belimbing wuluh merupakan salah satu tumbuhan yang dapat

dimanfaatkan sebagai obat. Hasil dari penelitian latifah (2008) menunjukkan

bahwa ekstrak kasar buah belimbing wuluh mampu menghambat pertumbuhan

bakteri Staphylococcus aureus dan E. coli penyebab diare.

Berdasarkan penelitian Rita (2008), diketahui bahwa buah pare

mengandung saponin, flavonoid, polifenol dan beberapa senyawa triterpenoid.

Sejak lama buah pare digunakan juga sebagai anti kanker, antiinfeksi, dan dalam

tahun-tahun belakangan terungkap bahwa buah pare berkhasiat sebagai anti AIDS.

Efek buah pare sebagai anti virus HIV terletak pada kandungan protein

momorcharin alfa dan beta atau pada protein (Manitto, 1981).

Setiawan (2008), menjelaskan bahwa salah satu tumbuhan yang

mengandung senyawa obat yaitu Bungur (Lagerstroemia Speciosa Pers,). Bagian

tumbuhan ini yang sering digunakan sebagai obat yaitu biji, daun, dan kulit kayu.

Biji dapat digunakan untuk mengobati tekanan darah tinggi dan kencing manis.

Daunya digunakan untuk mengobati kencing batu, kencing manis, dan tekanan

barah tinggi, sedangkan bagian kulit kayu digunakan utuk mengobati diare,

disentri, dan kencing darah (Dalimartha, 2003). Daun bunga diketahui

mengandung senyawa saponin, flavonoid, dan tannin. Biji mengandung senyawa

plantisul, sedangkan kulit kayu dan akar dari tumbuhan ini belum diketahui secara

pasti dan belum ditemukan penelitian yang mengandung senyawanya (Dalimartha,

2003).

Pemanfaatan buah belimbing wuluh sebagai obat merupakan ikhtiar untuk

memperoleh kesembuhan dari Allah yang Maha penyembuh, karena merupakan

kewajiban kita untuk berikhtiar mengobati penyakit. Sungguh tidak ada yang

dapat memberikan kesembuhan kecuali Allah SWT semata. Allah berfirman

dalam surat Asy-Syu’ara ayat 80:

#sŒÎ) uρ àMôÊÌ�tΒ uθ ßγ sù ÉÏ�ô± o„ ∩∇⊃∪

Artinya: ”Dan apabila Aku sakit, dialah yang menyembuhkan aku” (QS. Asy-Syu’ara [26]: 80)

Ayat di atas menunjukkan bahwa sesungguhnya kesehatan merupakan

suatu nikmat besar yang Allah berikan kepada manusia, akan tetapi nikmat

tersebut kadang kurang disyukuri. Sakit merupakan musibah dan ujian yang

ditetapkan Allah SWT. Segala penyakit yang diberikan oleh Allah tentunya sudah

tersedia obat yang juga diberikan olehNya. Buah blimbing wuluh misalnya, dapat

berfungsi sebagai antibakteri, karena di dalamnya terdapat senyawa aktif antara

lain flavonoid dan triterpenoid (Latifah, 2008).

Penjelasan di atas diperkuat dengan penelitian Latifah (2008), yang

menunjukkan bahwa hasil spektra FTIR ekstrak kasar buah belimbing wuluh

yakni adanya vibrasi ulur OH dari ikatan hidrogen intermolekuler pada daerah

bilangan gelombang 3425,34 dan 3341,44 cm-1. Pita serapan pada bilangan

gelombang 1731,96 dan 1692,42 cm-1 merupakan akibat dari vibrasi ulur C=O

keton alifatik dan aldehid, sedangkan serapan pada bilangan gelombang 1655,77

cm-1 merupakan akibat dari vibrasi ulur C=C pada cincin aromatik fenol. Vibrasi

ulur R-O-Aromatik terdapat pada daerah bilangan gelombang 1266,18 dan

1214,11 cm-1, vibrasi ulur C-O dari aromatik dan alkohol sekunder pada daerah

1076,21 dan 1057,88 cm-1, vibrasi tekuk dari C-H aromatik di luar bidang terdapat

pada daerah 816,80 dan 778,22 cm-1, sedangkan vibrasi tekuk C-O-C dari eter

terdapat pada daerah 504,35 cm-1 dan vibrasi tekuk C-OH dalam bidang aromatik

fenol terdapat pada daerah 421,42 cm-1 (Latifah, 2008).

Berdasarkan hasil pengamatan spektra FTIR dapat diketahui bahwa pada

ekstrak kasar buah belimbing wuluh terdapat gugus OH, C=O, C=C, CH, dan

C-OH yang didukung adanya cincin aromatik tersubstitusi dan C-O dari alkohol

sekunder, sehingga diperkirakan bahwa golongan senyawa aktif pada ekstrak

kasar buah belimbing wuluh merupakan senyawa aromatik atau fenolik yaitu

suatu jenis dari golongan senyawa flavonoid dan triterpenoid (Latifah, 2008).

Ekstrak kasar buah belimbing wuluh masih kurang efektif sebagai

antibakteri terhadap bakteri Staphylococcus aureus dan E. Coli karena zona

hambatnya masuk dalam kategori sedang (masuk dalam kisaran 5-10 mm), hal ini

diduga karena kandungan senyawa yang berpotensi sebagai antibakteri pada

ekstrak tersebut sudah cukup banyak, sehingga cukup mampu untuk menghambat

pertumbuhan bakteri, maka tetap dianggap berpotensi sebagai antibakteri (Latifah,

2008).

Berdasarkan latar belakang di atas, peneliti ingin melakukan penelitian

tentang fraksinasi senyawa aktif flavonoid dan triterpenoid buah belimbing wuluh,

dengan tujuan untuk mengetahui eluen terbaik dari ekstrak kasar dan mengetahui

fraksi aktif yang berpotensi sebagai anti bakteri alami sehingga diharapkan dapat

memberikan informasi ilmiah kepada masyarakat mengenai pemanfaatan buah

blimbing wuluh bagi kesehatan.

1.2. Rumusan Masalah

Berdasarkan latar belakang di atas, maka rumusan masalah dari penelitian

ini adalah:

1. Eluen apakah yang terbaik dari ekstrak kasar buah blimbing wuluh yang

berpotensi sebagai anti bakteri Staphylococcus aureus dan E. Coli ?

2. Fraksi aktif manakah yang berpotensi sebagai anti bakteri Staphylococcus

aureus dan E. Coli pada buah blimbing wuluh ?

1.3. Tujuan Penelitian

1. Untuk mengetahui Eluen terbaik dari ekstrak kasar buah blimbing wuluh

(Averrhoa bilimbi L.) yang berpotensi sebagai anti bakteri Staphylococcus

aureus dan E. coli.

2. Untuk mengetahui fraksi aktif yang berpotensi sebagai anti bakteri

Staphylococcus aureus dan E. coli pada buah blimbing wuluh (Averrhoa

bilimbi L.).

1.4. Batasan Masalah

Batasan penelitian ini meliputi:

1. Sampel yang digunakan adalah buah belimbing wuluh varietas berbuah

hijau dewasa (panjang ± 5 cm) segar yang diperoleh dari daerah lowok

waru kota Malang.

2. Uji antibakteri dilakukan secara in vitro terhadap bakteri Staphylococcus

aureus dan E. coli .

3. Eluen Flavonoid yang digunakan adalah butanol-asam asetat glasial-air

(BAA) dan metanol–kloroform, dengan komposisi meliputi BAA (4:1:5),

BAA (6:1:2), dan metanol-kloroform (1:9), (1:19) dan (1:39), sedangkan

eluen triterpenoid yang digunakan adalah heksana-etil asetat (1:1),

metanol-kloroform (1:10), n-heksana-diklorometana (1:9) dengan pereaksi

Lieberman-Burchard.

1.5. Manfaat

Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi ilmiah kepada

masyarakat mengenai pemanfaatan buah belimbing wuluh bagi kesehatan serta

dapat mengetahui senyawa aktif yang berpotensi sebagai antibakteri alami yang

lebih aman sebagai alternatif pengganti antibakteri sintetik.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Buah Belimbing Wuluh (Averrhoa bilimbi L.)

Belimbing wuluh merupakan salah satu spesies dalam keluarga belimbing

(Averrhoa). Diperkirakan tanaman ini berasal dari daerah Amerika tropik.

Tanaman ini tumbuh baik di negara asalnya sedangkan di Indonesia banyak

dipelihara di pekarangan dan kadang-kadang tumbuh secara liar di ladang atau

tepi hutan (Thomas, 2007).

Gambar 2.1 Belimbing Wuluh (Averrhoa bilimbi L.)

Klasifikasi ilmiah buah belimbing wuluh adalah:

(http://www.nbbnet.gov.my/directories/papercut/detail.php?id= 728S, 2007)

Kerajaan : Plantae Divisio : Magnoliophyta Kelas : Magnoliopsida Ordo : Oxalidales Familia : Oxalidaceae Genus : Averrhoa Species : Averrhoa bilimbi

Aroma khas buah belimbing wuluh varietas hijau merupakan interaksi

antara senyawa nonanal, asam nonanoat dan (E)-2-Nonenal, sedangkan senyawa

yang bertanggung jawab terhadap rasa pada buah belimbing wuluh adalah (Z)-3-

heksenol (Pino et al., 2004).

Terdapat dua varietas dari tumbuhan belimbing wuluh yaitu yang

menghasilkan buah berwarna hijau dan kuning muda atau sering pula dianggap

berwarna putih (Thomas, 2007). Pemeliharaan tanaman ini cukup mudah, yang

terpenting ditanam ditempat terbuka, kelembaban tanah selalu dijaga, dan pohon

diberi cukup air (Salsa, 2007). Masyarakat Aceh memanfaatkan air belimbing

wuluh sebagai alternatif untuk mengawetkan ikan dan daging (Irwan, 1999).

2.2. Kandungan Kimia Buah Belimbing Wuluh (Averrhoa bilimbi L.)

Latifah (2008), menjelaskan bahwa ekstrak buah belimbing wuluh

mengandung golongan senyawa flavonoid, tannin, saponin, triterpen dan steroid.

Senyawa terpenoid adalah senyawa hidrokarbon isometrik yang juga terdapat

pada lemak/minyak esensial (essential oils), yaitu sejenis lemak yang sangat

penting bagi tubuh. Zat-zat terpenoid membantu tubuh dalam proses sintesa

organik dan pemulihan sel-sel tubuh.

Buah belimbing wuluh mengandung banyak vitamin C alami yang

berguna sebagai penambah daya tahan tubuh dan perlindungan terhadap berbagai

penyakit (http://www.nbbnet.gov.my/directories/papercut/detail.php?id= 728,

2007). Belimbing wuluh mempunyai kandungan unsur kimia yang disebut asam

oksalat dan kalium (Iptek, 2007), sedangkan berdasarkan hasil pemeriksaan

kandungan kimia buah belimbing wuluh yang dilakukan Herlih (1993)

menunjukkan bahwa buah belimbing wuluh mengandung golongan senyawa

oksalat, minyak atsiri, fenol, flavanoid dan pektin.

Secara umum tumbuhan alam mengandung aglikon flavonoid (yaitu

flavonoid tanpa gula terikat) yang terdapat dalam berbagai bentuk struktur.

Semuanya mengandung 15 atom karbon dalam inti dasarnya, dan tersusun dalam

konfigurasi 636 CCC −− , yaitu dua cincin aromatik yang dihubungkan oleh satuan

tiga karbon yang dapat atau tak dapat membentuk cincin ketiga (Markham,1988).

Flavonoid merupakan senyawa polifenol yang tersebar luas di alam, sesuai

struktur kimianya yang termasuk flavonoid yaitu flavonol, flavon, flavanon,

katekin, antosianidin dan kalkon (Harborne, 1984). Golongan flavonoid dapat

digambarkan sebagai deretan senyawa C6-C3-C6. Artinya, kerangka karbonnya

terdiri atas dua gugus C6 (cincin benzen tersubstitusi) disambungkan oleh rantai

alifatik tiga-karbon. Pengelompokan flavonoid dibedakan berdasarkan cincin

heterosiklik-oksigen tambahan dan gugus hidroksil yang tersebar menurut pola

yang berlainan pada rantai C3 (Robinson, 1995).

Flavonoid biasanya terdapat sebagai flavonoid O-glikosida pada senyawa

tersebut satu gugus hidroksil flavonoid (atau lebih) terikat pada satu gula (atau

lebih) dengan ikatan hemiasetal yang tak tahan asam (Markham, 1988).

Zakaria et al. (2007), memperkirakan bahwa senyawa flavonoid yang

terkandung dalam belimbing wuluh adalah tipe luteolin dan apigenin.

O

O

OH

OH

HO OH

O

O

OH

OH

HO

Luteolin Apigenin

Gambar 2.2 Struktur Luteolin dan Apigenin (Robinson, 1995)

Hasil identifikasi Wong dan Wong (1995) menunjukkan bahwa 47,8%

total senyawa volatil yang terdapat dalam buah belimbing wuluh merupakan asam

alifatik, asam heksadekanoat (20,4%), dan asam yang paling dominan adalah (Z)-

9-oktadekanoat. Senyawa ester yang dominan adalah butil nikotinat (1,6%) dan

heksil nikotinat (1,7%). Pino et al. (2004) dalam buah belimbing wuluh

terkandung sekitar 6 mg/kg total senyawa volatile.

2.3. Manfaat Buah Belimbing Wuluh (Averrhoa bilimbi L.)

Belimbing wuluh banyak mengandung senyawa kimia yang bermanfaat

untuk menyembuhkan beberapa penyakit. Sifat kimiawi dan efek farmakologis

pada belimbing wuluh antara lain menghilangkan rasa sakit (analgetik),

memperbanyak pengeluaran racun, antiradang, peluruh kencing, astringent

(Dalimartha, dkk, 2005).

Berdasarkan hasil penelitian Latifah (2008), menunjukkan bahwa

belimbing wuluh dapat dimanfaatkan sebagai penghambat pertumbuhan bakteri

Staphyloccocus aureus dan E. coli.

Perasan air buah belimbing wuluh sangat baik untuk asupan kekurangan

vitamin C. Ada yang memanfaatkan buah belimbing wuluh untuk dibuat manisan

dan sirup, sebagai obat untuk sariawan, sakit perut, gondongan, rematik, batuk

rejang, gusi berdarah, sakit gigi berlubang, memperbaiki fungsi pencernaan, untuk

membersihkan noda pada kain, menghilangkan karat pada keris, membersihkan

tangan yang kotor, mencuci botol, menghilangkan bau amis, sebagai bahan

kosmetika serta mengkilapkan barang-barang yang terbuat dari kuningan

(http://www.nbbnet.gov.my/directories/papercut/detail.php?id= 728, 2007).

2.3.1. Manfaat Buah Blimbing Wuluh (Averrhoa bilimbi L.) Dalam

Perspektif Islam

Orang yang mau mendalami ayat-ayat Al-Qur`an akan menyadari bahwa

Allah sudah merentangkan segala penjelasan di dalam Kitab-Nya dan

menunjukkan kepada manusia cara-cara untuk memudahkan hidup baik di dunia

ini maupun di alam berikutnya (akhirat). Subjek lain yang menarik perhatian

manusia adalah yang diutarakan Al-Qur`an tentang makanan-makanan khas yang

baik untuk kesehatan manusia, seperti buah kurma.

’ Îûuρ ÇÚ ö‘F{ $# Óì sÜ Ï% ÔN≡u‘Èθ≈yf tG•Β ×M≈̈Ζy_ uρ ôÏiΒ 5=≈uΖôãr& ×í ö‘y—uρ ×≅ŠÏƒwΥuρ ×β# uθ÷ΖϹ ç�ö� xîuρ 5β# uθ ÷ΖϹ 4’ s+ ó¡ç„

& !$ yϑÎ/ 7‰Ïn≡uρ ã≅ ÅeÒx� çΡ uρ $pκ|Õ÷è t/ 4† n?tã <Ù ÷è t/ ’ Îû È≅à2 W{ $# 4 ¨βÎ) ’Îû š�Ï9≡sŒ ;M≈tƒUψ 5Θ öθs) Ïj9 šχθè=É) ÷è tƒ

"Dan di bumi ini terdapat bagian-bagian yang berdampingan dan kebun-kebun anggur, tanaman-tanaman dan pohon kurma yang bercabang dan yang tidak bercabang, disirami dengan air yang sama. Kami melebihkan sebagian tanaman-tanaman itu atas sebagian yang lain tentang rasanya. Sesungguhnya, pada yang demikian itu terdapat tanda-tanda (kekuasaan Allah) bagi kaum yang berpikir." (QS. Ar-Ra'd [13]: 4)

Kurma, buah-buahan yang disebut dalam surah Maryam, pohonnya

tumbuh di padang gersang bersuhu panas dan banyak manfaatnya. Allah

mengindentifikasikan khasiat penyembuhan dari buah ini dengan menceritakan

pada Maryam, yang sedang menghadapi persalinan, supaya makan daging buah

kurma.

$ yγ1yŠ$ oΨ sù ÏΒ !$pκÉJ øtrB āωr& ’ÎΤt“ øtrB ô‰ s% Ÿ≅ yèy_ Å7š/ u‘ Å7tG øtrB $ wƒÎ�|� ∩⊄⊆∪ ü“Ìh“ èδ uρ Å7ø‹s9 Î) Æíõ‹ Åg¿2 Ï's# ÷‚ ¨Ζ9 $# ñÝÉ)≈|¡è@

Å7ø‹n=tæ $ Y7sÛâ‘ $wŠ ÏΖy_ ∩⊄∈∪ ’ Í? ä3sù ’Î1 u� õ°$# uρ “Ìh� s%uρ $YΖøŠtã ( $ ¨ΒÎ*sù ¨ É t�s? zÏΒ Î�|³ u; ø9$# # Y‰tn r& þ’ Í<θ à)sù ’ÎoΤÎ) ßN ö‘x‹ tΡ

Ç≈uΗ÷q§�=Ï9 $ YΒöθ |¹ ôn=sù zΝÏk=Ÿ2é& uΘöθ u‹ø9 $# $ |‹Å¡ΣÎ) ∩⊄∉∪

"Maka Jibril menyerunya dari tempat yang rendah: 'Janganlah kamu bersedih hati, sesungguhnya Tuhanmu telah menjadikan anak sungai di bawahmu. Dan goyanglah pangkal pohon kurma itu ke arahmu, niscaya pohon itu akan menggugurkan buah kurma yang masak kepadamu, maka makan, minum, dan bersenang hatilah...." (QS. Maryam [19]: 24-26).

Ayat al-qur’an surah (ar-ra’d 13:4) di atas menjelaskan bahwa betapa

besar manfaat buah kurma bagi kehidupan manusia di bumi ini. Kurma, dengan

kandungan 50% gula, sungguh sangat bergizi karena daging buahnya terdiri atas

fruktosa dan glukosa yang keduanya berkalori tinggi, dan mudah serta cepat

dicerna. Kandungan gulanya menenangkan saraf yang gelisah serta memberikan

rasa aman pada kejiwaan. Kurma segar memberikan manfaat besar kepada otak.

Kurma, dengan kandungan 2.2% protein, juga berisi banyak jenis vitamin A, B1,

dan B2. Protein-protein ini melindungi tubuh dari serangan penyakit dan infeksi,

menunjang sel-sel tubuh memperbaharui diri, dan menyeimbangkan cairan-cairan

tubuh (www. Harunyahya.com/indo).

Buah-buahan selain kurma yang juga memberikan manfaat bagi tubuh

ialah blimbing wuluh. Batang buah belimbing wuluh mengandung beberapa

senyawa kimia yaitu saponin, tanin, glukosida, kalsium oksalat, sulfur, asam

format, peroksidase dan kandungan kimia pada daun yaitu tanin, sulfur, asam

format, peroksidase, kalsium oksalat, kalium sitrat (Dalimartha, S., dkk,

2005).

Batang belimbing wuluh selama ini belum pernah dimanfaatkan sebagai

obat ataupun yang lainnya oleh masyarakat. Ditinjau dari sisi agama, batang

tanaman berfungsi sebagai penopang supaya tetap tegak dan sebagai tempat untuk

mentransfer air dan mineral dari akar ke daun. Firman Allah SWT dalam surat

Ibrahim ayat 24:

öΝs9 r& t� s? y#ø‹x. z>u�ŸÑ ª!$# WξsWtΒ ZπyϑÎ=x. Zπ t6ÍhŠsÛ ;ο t�yf t± x. Bπ t7Íh‹sÛ $yγè=ô¹r& ×MÎ/$ rO $ yγãã ö� sù uρ ’Îû Ï !$ yϑ¡¡9 $# ∩⊄⊆∪

Artinya:“Tidakkah kamu perhatikan bagaimana Allah telah membuat perumpamaan kalimat yang baik seperti pohon yang baik, akarnya teguh dan cabangnya (menjulang) ke langit .(QS Ibrahim 14: 24)

Ayat di atas menjelaskan bahwa setiap bagian dari makhluk hidup

mempunyai manfaat seperti batang, kalau batang tumbuhan diambil maka

tumbuhan itu tidak akan bisa berdiri tegak dan akan mati.

Semenjak zaman Rasulullah telah banyak dipraktikkan terapi dengan

tumbuh-tumbuhan yang mengandung obat atau dikenal dengan terapi herba. Pada

zaman Rasulullah belimbing wuluh belum dikenal dan ditemukan, sehingga

belum dimanfaatkan sebagai obat. Pemanfaatan tanaman obat itu terus

berkembang seiring dengan berkembangnya industri jamu atau obat tradisional,

farmasi, kosmetik, makanan dan minuman.

2.4. Flavonoid

Flavonoid merupakan senyawa metabolit sekunder yang terdapat pada

tanaman hijau,kecuali alga. Flavonoid yang sering ditemukan pada tumbuhan

tingkat tinggi (Angiospermae) adalah flavon dan flavonol dengan C- dan O

glikosida, isoflavon C- dan O-glikosida, flavanon C dan O-glikosida, khalkon

dengan C- dan O-glikosida, dan dihidrokhalkon, proantosianidin dan antosianin,

auron O-glikosida, dan dihidroflavonol O-glikosida. Golongan flavon, flavonol,

flavanon, isoflavon, dan khalkon juga sering ditemukan dalam bentuk aglikonnya

(Markham, 1988).

Efek flavonoid terhadap macam-macam organisme sangat banyak dan

dapat menjelaskan mengapa tumbuhan yang mengandung senyawa ini digunakan

dalam pengobatan tradisional. Flavonoid dapat bekerja sebagai inhibitor kuat

pernapasan, menghambat fosfodieterase, menghambat aldoreduktase, protein

kinase, sebagai pereduksi yang baik dan beberapa fungsi lain. Aktivitas

antioksidasinya mungkin dapat menjelaskan bahwa flavonoid sebagai komponen

aktif dalam tumbuhan dapat digunakan sebagai obat tradisional untuk mengobati

gangguan fungsi ginjal (Robinson, 1995).

Gambar 2.3 Struktur inti senyawa flavonoid (Robinson, 1995)

Pada kebanyakan tumbuhan, flavonoid terikat pada gula sebagai glikosida

dan aglikon flavonoid yang mungkin terdapat dalam satu tumbuhan dalam bentuk

kombinasi glikosida (Harbone, 1987). Aglikon flavonoid (yaitu flavonoid tanpa

gula terikat) terdapat dalam berbagai bentuk struktur (Markham, 1988).

Golongan flavonoid dapat digambarkan sebagai deretan senyawa

636 CCC −− artinya kerangka karbonnya terdiri atas dua gugus 6C (cincin

benzena) disambungkan oleh rantai alifatik tiga karbon. Kelas-kelas yang

berlainan dalam golongan flavonoid dibedakan berdasarkan cincin heterosiklik-

oksigen tambahan dan gugus hidroksil yang tersebar menurut pola yang berlainan

(Robinson, 1991).

Flavonoid merupakan senyawa pereduksi yang baik, menghambat banyak

reaksi oksidasi, baik secara enzim maupun non enzim. Flavonoid bertindak

sebagai penampung yang baik radikal hidroksi dan superoksida dengan demikian

melindungi lipid membran terhadap reaksi yang merusak. Aktivitas

antioksidannya dapat menjelaskan mengapa flavonoid tertentu merupakan

komponen aktif tumbuhan yang digunakan secara tradisional untuk mengobati

gangguan fungsi hati (Robinson, 1995).

Flavonoid merupakan golongan terbesar senyawa fenol alam (Harbone,

1987). Flavonoid tergolong senyawa polar karena mempunyai sejumlah gugus

hidroksil yang tak tersulih atau suatu gula, sehingga akan larut dalam pelarut polar

seperti etanol, metanol, butanol, aseton, dimetilsulfoksida, dimetilformamida, dan

air. Adanya gula yang terikat pada flavonoid cenderung menyebabkan flavonoid

lebih mudah larut dalam air dan dengan demikian campuran pelarut di atas dengan

air merupakan pelarut yang lebih baik untuk glikosida. Sebaliknya, aglikon yang

kurang polar seperti isoflavon, flavanon, dan flavon serta flavonol yang

termetoksilasi cenderung lebih mudah larut dalam pelarut seperti eter dan

kloroform (Markham, 1988).

Analisa flavonoid lebih baik dengan memeriksa aglikon yang terdapat

dalam ekstrak tumbuhan yang telah dihidrolisis sebelum memperhatikan

kerumitan glikosida yang ada dalam ekstrak asal (Harbone, 1987).

2.4.1 Potensi Flavonoid Sebagai Anti Bakteri

Antibakteri adalah suatu zat yang mencegah terjadinya pertumbuhan dan

reproduksi bakteri. Mikroorganisme dapat dihambat atau dibunuh dengan proses

fisik atau bahan kimia. Bahan antimikroba diartikan sebagai bahan yang

mengganggu pertumbuhan dan metabolisme mikroba, sehingga bahan tersebut

dapat menghambat pertumbuhan atau bahkan membunuh mikroba. Apabila

mikroorganisme yang dimaksud adalah bakteri, maka antimikroba lebih sering

disebut dengan bahan antibakteri (Ardiansyah, 2007).

Uji efektifitas senyawa aktif antibakteri pada penelitian yang dilakukan

Latifah (2008), ekstrak yang digunakan adalah ekstrak etanol. Berdasarkan hasil

uji golongan senyawa aktif diketahui bahwa ekstrak etanol mengandung senyawa

aktif flavonoid dan triterpenoid. Flavonoid dapat berefek antibakteri melalui

kemampuan untuk membentuk kompleks dengan protein ekstraseluler dan protein

yang dapat larut serta dengan dinding sel bakteri (Robinson, 1995).

Latifah (2008), menjelaskan bahwa senyawa flavonoid dalam ekstrak

etanol lebih dominan daripada triterpenoid. Flavonoid merupakan senyawa yang

cenderung bersifat polar, kepolaran senyawa inilah yang mengakibatkan senyawa

lebih mudah menembus dinding sel bakteri Staphyloccocus aureus karena struktur

dinding sel bakteri ini berlapis tunggal dan tersusun atas peptidoglikan (protein

dan gula) serta lipid dengan kadar rendah (1-4 %), sehingga ekstrak etanol lebih

mudah menembus dinding sel bakteri ini. Dinding sel bakteri E. coli lebih sulit

ditembus senyawa yang bersifat polar karena struktur dinding sel bakteri ini

berlapis tiga yang tersusun atas peptidoglikan dan lipid dengan kadar yang tinggi

(11-22 %), sehingga ekstrak etanol lebih sulit menembus dinding sel bakteri ini.

Sjahid (2008), telah melakukan penelitian, menunjukkan bahwa senyawa

aktif flavonoid yang terkandung pada daun dewandaru memiliki aktivitas

antibakteri, antioksidan, penangkal radikal bebas, penghambat hidrolisis dan

oksidasi enzim, serta antiinflamasi.

2.4.2. Teknik Pemisahan

2.4.2.1. Ekstraksi dengan Metode Maserasi

Ekstraksi merupakan peristiwa pemindahan massa zat aktif yang semula

berada dalam sel ditarik oleh pelarut sehingga terjadi larutan zat aktif dalam

pelarut tersebut. Pada umumnya ekstraksi akan bertambah baik bila permukaan

serbuk simplisia yang bersentuhan dengan pelarut makin luas. Pada dasarnya

semakin halus serbuk simplisia makin baik pula ekstraksinya, tetapi dalam

pelaksanaannya tidak selalu demikian karena ekstraksi masih tergantung juga

pada sifat fisik dan kimia simplisia yang bersangkutan (Ahmad, 2006).

Metode ekstraksi bahan alam, dikenal suatu metode maserasi. Maserasi

merupakan suatu metode ekstraksi menggunakan lemak panas, akan tetapi

penggunaan lemak panas ini telah digantikan oleh pelarut-pelarut organik yang

volatil. Penekanan utama pada maserasi adalah tersedianya waktu kontak yang

cukup antara pelarut dan jaringan yang diekstraksi (Guether, 1987).

Berdasarkan penelitian Latifah (2008) diketahui bahwa pelarut akuades

menghasilkan ekstrak pekat terbesar diikuti oleh etanol, metanol, kloroform dan

terakhir petroleum eter. Berat ekstrak pekat yang dihasilkan oleh pelarut polar

lebih besar daripada pelarut nonpolar, sehingga diduga bahwa senyawa yang

terdapat pada buah belimbing wuluh cenderung bersifat polar seperti flavonoid.

Hal ini didukung oleh warna filtrat , warna dan tekstur ekstrak pekat serta prinsip

like dissolve like yaitu senyawa polar cenderung larut dalam pelarut polar dan

senyawa nonpolar cenderung larut dalam pelarut nonpolar.

Hasil penelitian yang sama, Latifah (2008) menambahkan bahwa pelarut

terbaik untuk memperoleh ekstrak kasar senyawa antibakteri pada buah belimbing

wuluh adalah etanol. Hal ini didukung oleh berat ekstrak pekat, uji golongan

senyawa aktif dan uji efektifitas antibakteri. Hasilnya menunjukkan bahwa daya

hambat ekstrak kasar etanol lebih tinggi terhadap bakteri Staphylococcus aureus

(gram positif) dibandingkan E. coli (gram negatif), hal ini ditunjukkan oleh nilai

diameter zona hambat terhadap bakteri Staphylococcus aureus yang secara umum

lebih besar dari pada bakteri E. coli. Zakaria et al. (2007) juga menyatakan bahwa

ekstrak buah belimbing wuluh lebih efektif untuk bakteri gram positif

dibandingkan bakteri gram negatif.

2.4.2.2. Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

Kromatografi adalah suatu nama yang diberikan untuk teknik pemisahan

tertentu. Pada dasarnya semua cara kromatografi menggunakan dua fase yaitu fase

diam dan fase gerak. Pemisahan-pemisahan ini bergantung pada gerakan relatif

dari dua fase ini (Sastrohamidjojo, 2005). Prinsip dari pemisahan adalah adanya

perbedaan sifat fisik dan kimia dari senyawa yaitu kecenderungan dari molekul

untuk melarut dalam cairan (kelarutan), kecenderungan molekul untuk menguap

(keatsirian), kecenderungan molekul untuk melekat pada permukaan serbuk labus

(adsorpsi, penyerapan). Salah satu cara pemisahan adalah Kromatografi Lapis

Tipis.

Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dapat digunakan untuk tujuan analitik

dan preparatif. KLT analitik digunakan untuk menganalisa senyawa-senyawa

organik dalam jumlah kecil misalnya, menentukan jumlah komponen dalam

campuran dan menentukan pelarut yang tepat untuk pemisahan dengan KLT

preparatif. KLT preparatif digunakan untuk memisahkan campuran senyawa dari

sampel dalam jumlah besar berdasarkan fraksinya, yang selanjutnya fraksi-fraksi

tersebut dikumpulkan dan digunakan untuk analisa berikutnya (Townshend, A.,

1995).

Identifikasi dari senyawa-senyawa yang terpisah dari lapisan tipis

menggunakan harga Rf. Harga Rf didefinisikan sebagai berikut (Sastrohamidjojo,

2005):

Harga Rf = asal titik daripelarut oleh digerakkan yangJarak

asal titik dari senyawaoleh digerakkan yangJarak .....(2.1)

Harga-harga Rf untuk senyawa-senyawa murni dapat dibandingkan

dengan harga-harga standart. Harga-harga Rf yang diperoleh hanya berlaku untuk

campuran tertentu dari pelarut dan penyerap yang digunakan, meskipun demikian

daftar dari harga-harga untuk berbagai campuran dari pelarut dan penyerap dapat

diperoleh (Sastrohamidjojo, 2005).

Tabel berikut merupakan sifat flavonol dan flavon umum:

Tabel 2.1 Sifat flavonol dan flavon umum Flavonoid Rf (x100) dalam BAA

Flavonol

Kemferol

Kuersetin

Mirisetin

Flavon

Apigenin

Luteolin

Krisoeriol

Trisin

83

64

43

89

78

82

73

Sumber: Harborne, 1984

Flavonoid berupa senyawa polifenol dan warnanya ak an berubah bila

bereaksi dengan basa sehingga flavonoid mudah dideteksi pada kromatogram.

Flavon 7-glikosida berwarna coklat pudar, kuning atau hijau dengan sinar UV dan

berubah menjadi hijau-kuning terang dengan uap NH3. Isoflavon sukar dicirikan

karena reaksinya yang tidak khas dengan pereaksi warna manapun. Beberapa

isoflavon (misalnya daidzein) memberikan warna biru muda cemerlang dengan

sinar UV bila diuapi amonia, tetapi kebanyakan yang lain (misalnya genestain)

tampak sebagai bercak lembayung pudar dengan amonia berubah menjadi coklat

pudar (Harborne, 1987).

Kromatografi lapis tipis (KLT) merupakan cara analisis cepat yang

memerlukan bahan yang sedikit. Penelitian pendahuluan kandungan flavonoid

suatu ekstrak, sudah menjadi kebiasaan umum untuk menggunakan pengembang

beralkohol pada pengembangan pertama dengan kromatografi lapis tipis, misalnya

butanol-asam asetat-air (BAA) (Markham, 1988). Surayya (2000), menggunakan

eluen BAA (6:1:2) untuk memisahkan flavonoid dari biji kapas. Purwaningsih

(2003) menggunakan BAA (4:1:5) untuk memisahkan senyawa flavonoid dari biji

kacang tunggak, sedangkan Dani (2005), menggunakan BAA (4:1:5), BAA

(6:1:2), metanol-kloroform dengan variasi komposisi (7:3), (6:4), (5:5), (4:6),

(3:7), (2:8), (1:9), (1:19), dan (1:39) untuk memisahkan senyawa flavonoid dari

daun kelor.

Robinson (1995), mengatakan bahwa jika tidak ada pigmen yang

menggangu, jaringan tumbuhan (misalnya daun bunga putih), maka dapat

diidentifikasi adanya flavon dan flavonol dengan diuapi uap amonia. Warna

kuning menunjukkan adanya senyawa ini. Kalkon dan auron berubah dari kuning

menjadi merah pada uji ini. Jika ekstrak pigmen dalam air dibasakan, berbagai

perubahan warna dapat terlihat, meskipun perubahan pada pigmen yang satu dapat

menutupi perubahan pada pigmen lain.

Tabel berikut merupakan perubahan warna yang terjadi pada suatu

senyawa setelah diuapi dengan amonia:

Tabel 2.2 Perubahan warna yang terjadi pada senyawa setelah diuapi amoniak Nama Senyawa Perubahan Warna

antosianin flavon, flavonol, xanton flavanon kalkon dan auron flavanonol

lembayung → biru kuning tanpa warna, menjadi merah jingga (terutama jika dipanaskan) lembayung merah coklat-jingga

Sumber: Robinson, 1995

Rohyami (2008), mengatakan pada buah mahkota dewa dilakukan

optimasi eluen yang akan digunakan untuk mendapatkan isolat murni dengan

menggunakan plat KLT kresgel G 60 F 254 (Carollo, 2006; Urzua, 2004) 3 x 10

cm. Eluen yang digunakan adalah fase atas n-butanol : asam asetat : air, 9 : 2 : 6

(v/v) atau BAA (Rohyami, 2007). Elusi dilakukan setelah chamber KLT penuh

dengan uap eluen, didiamkan sekitar 5 – 10 menit. Untuk mendeteksi bercak

dilakukan dengan menggunakan lampu UV pada panjang gelombang 254 nm.

Bercak ditandai dengan menggunakan pensil. Pembuktian kemurnian isolat

flavonoid dilakukan dengan kromatografi lapis tipis dua dimensi. Elusi dilakukan

pada plat KLT 6 x 6 cm. Ekstrak kloroform ditotolkan 1 cm dari tepi bawah

kanan. Eluen yang digunakan pada pengembangan pertama adalah eluen terbaik

yang telah diperoleh dari hasil identifikasi pendahuluan. Pengembangan kedua

menggunakan pelarut asam asetat 15 %. Posisi plat yang dielusi adalah posisi 90o

dari kondisi mula-mula.

Jika sudah diperoleh isolat murni pada tahapan di atas, kemudian

dilakukan fraksinasi dengan KLT preparatif. Deteksi dilakukan dengan

menggunakan lampu UV 366 nm. Bercak yang berupa pita diberi tanda dengan

pensil. Setiap bercak yang diperoleh dikerok dan dilarutkan dalam methanol

(Rohyami, 2008).

Identifikasi pendahuluan flavonoid dengan KLT berguna dalam pemisahan

flavonoid menggunakan KLT preparatif. Eluen terbaik pada identifikasi

pendahuluan digunakan untuk pemisahan flavonoid dari fraksi metanol daging

buah mahkota dewa. Prinsip pemisahan pada KLT preparatif tidak berbeda

dengan pemisahan pada KLT. Ukuran plat yang ideal adalah 20 x 20 cm, tetapi

ukuran ini dapat disesuaikan dengan kebutuhan (Rohyami, 2008).

2.4.3. Metode Analisis

2.4.3.1. Spektrofotometri IR

Spektroskopi inframerah merupakan spektroskopi vibrasi. Penggunaan

spektroskopi inframerah pada bidang kimia organik hampir menggunakan daerah

di 650-4000 cm-1. Daerah dengan frekuensi lebih rendah dari 650 cm-1 disebut

inframerah jauh dan daerah dengan frekuensi lebih tinggi dari 4000 cm-1 disebut

inframerah dekat. Ikatan-ikatan yang berbeda (C-C, C=C, C-O, O-H, N-H)

mempunyai serapan yang berbeda dan ikatan-ikatan tersebut dalam molekul

organik dapat dideteksi dengan mengidentifikasi frekuensi-frekuensi

karakteristiknya sebagai pita serapan dalam spektrum IR (Sastrohamidjojo, 1991).

Frekuensi serapan C=O dari beberapa flavonoid dapat dilihat pada tabel

2.2 (Geissman, 1969).

Tabel 2.3 Frekuensi serapan C=O dari beberapa flavonoid Jenis flavonoid Frekuensi (cm-1)

Flavon

3-hidroksiflavon

5-hidroksiflavon

7-hidroksiflavon

Flavanon

5-hidroksiflavanon

5,7,3’,4’-tetrahidroksiflavanon

5,7,3’,4’-tetraacetoksiflavanon

3,5,7,3’,4’-pentamethoksiflavon

3,5,7,3’,4’-pentaacetoksiflavon

1649

1615

1652

1625

1648

1620

1680

1627

1640

Sumber : Geissman, 1969

Senyawa flavonoid jika dianalisis dengan spektrofotometri inframerah

akan mempunyai serapan yang spesifik, yaitu serapan di daerah frekuensi 3150-

3050 cm-1 dengan intensitas tajam akibat rentangan C-H aromatic, serapan lebar

antara 3500-3200 cm-1 akibat rentangan O-H, C=O keton pada 1725-1705 cm-1

dan C-O eter pada 1300-1000 cm-1(Sastrohamidjojo, 1991).

2.5. Triterpenoid

Triterpenoid merupakan komponen tumbuhan yang mempunyai bau dan

dapat diisolasi dari bahan nabati dengan penyulingan sebagai minyak atsiri.

Triterpenoid terdiri dari kerangka dengan 3 siklik 6 yang bergabung dengan siklik

5 atau berupa 4 siklik 6 yang mempunyai gugus pada siklik tertentu (Lenny,

2006).

Triterpenoid adalah senyawa yang kerangka karbonnya berasal dari 6

satuan isoprena dan secara biosintesis diturunkan dari hidrokarbon C30 asiklik

yaitu skualena. Senyawa ini berstruktur siklik yang kebanyakan berupa alkohol,

aldehida, atau asam karboksilat (Harborne, 1987). Senyawa ini paling umum

ditemukan pada tumbuhan berbiji, bebas dan sebagai glikosida. Triterpenoid

alkohol monohidroksi dalam tumbuhan tidak bersamaan dengan pigmen,

sedangkan triterpenadiol berada bersama-sama dengan karotenoid dan triterpenoid

asam dengan flavonoid (Robinson, 1995).

Skualena

Oleanana

Gambar 2.4 Senyawa Triterpenoid (Robinson, 1995)

Triterpenoid biasanya terdapat dalam daun dan buah, seperti apel dan buah

per, yang berfungsi sebagai pelindung untuk menolak serangga dan serangan

mikroba. Triterpenoid juga terdapat dalam damar, kulit batang dan getah.

Triterpenoid tertentu dikenal karena rasanya, terutama kepahitannya. Pereaksi

Lieberman-Burchard secara umum digunakan untuk mendeteksi triterpenoid

menghasilkan warna violet (Harborne, 1987).

2.5.1. Potensi Triterpenoid Sebagai Anti Bakteri

Berdasarkan penelitian yang dilakukan Juwita (2006), tentang tanaman

jahe bahwa Kandungan senyawa metabolit sekunder yang terdapat pada tanaman

jahe terutama golongan flavonoid, fenol, triterpenoid, dan minyak atsiri

(Benjelalai, 1984). Umumnya dapat menghambat pertumbuhan mikroorganisme

patogen yang merugikan kehidupan manusia.

Gunawan (2008), juga melakukan penelitian tentang Herba meniran

(Phyllanthus niruri Linn) yang mengandung metabolit sekunder flavonoid,

terpenoid, alkaloid dan steroid (Kardinan dan Kusuma, 2004). Beberapa hasil

penelitian menunjukkan bahwa senyawa terpenoid memiliki aktivitas sebagai

antibakteri yaitu monoterpenoid linalool, diterpenoid (-) hardwicklic acid, phytol,

triterpenoid saponin dan triterpenoid glikosida (Grayson, 2000; Bigham et al.,

2003; Lim et al., 2006).

Selain penelitian di atas, terdapat penelitian lain tentang isolasi dan

identifikasi golongan senyawa triterpenoid pada biji pepaya. Hasilnya

menunjukkan bahwa senyawa triterpenoid pada biji pepaya dapat berfungsi

sebagai antibakteri E. coli dan bakteri Staphyloccocus aureus (Sukadani, dkk.,

2008).

2.5.2. Teknik Pemisahan

2.5.2.1. Ekstraksi dengan Metode Maserasi

Maserasi merupakan cara ekstraksi yang sederhana. Maserasi dilakukan

dengan cara merendam serbuk simplisia (serbuk halus hasil ekstraksi tanaman

obat) dalam pelarut. Pelarut akan menembus dinding sel dan masuk ke dalam

rongga sel yang mengandung zat aktif sehingga zat aktif akan larut, adanya

perbedaan konsentrasi antara larutan zat aktif di dalam sel, maka larutan yang

terpekat di desak keluar. Pelarut yang digunakan dapat berupa air, etanol, air-

etanol, atau pelarut lain. Keuntungan cara ekstraksi ini, adalah cara pengerjaan

dan peralatan yang digunakan sederhana dan mudah diusahakan, sedangkan

kerugiannya adalah waktu pengerjaannya lama dan ekstraksi kurang sempurna

(Ahmad, 2006).

Metode ekstraksi bahan alam, dikenal suatu metode maserasi. Maserasi

adalah metode perendaman. Penekanan utama pada maserasi adalah tersedianya

waktu kontak yang cukup antara pelarut dan jaringan yang diekstraksi (Guether,

1987 ).

Latifah (2008), menambahkan bahwa hasil uji golongan senyawa aktif

pada ekstrak kasar buah blimbing wuluh mengandung senyawa flavonoid dan

terpenoid. Flavonoid dapat berefek antibakteri melalui kemampuan untuk

membentuk kompleks dengan protein ekstraseluler dan protein yang dapat larut

serta dengan dinding sel bakteri (Robinson, 1995 dalam Ardananurdin dkk, 2004).

Terpenoid dapat menghambat pertumbuhan atau mematikan bakteri dengan

mengganggu proses terbentuknya membran dan atau dinding sel, membran atau

dinding sel tidak terbentuk atau terbentuk tidak sempurna (Ajizah, 2004).

2.5.2.2. Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

Kromatografi Lapis Tipis (KLT) merupakan salah satu kromatografi yang

berdasarkan proses adsorpsi. Lapisan yang memisahkan terdiri atas fase diam,

sebagai fase diam dapat digunakan silika atau alumina yang dilapiskan pada

lempeng kaca atau aluminium. Jika fase diam berupa silika gel maka bersifat

asam, jika fase diam alumina maka bersifat basa. Fase gerak atau larutan

pengembang biasanya digunakan pelarut organik atau bisa juga campuran pelarut

organik anorganik (Gritter, 1991).

Pada pemeriksaan triterpena dalam tumbuhan, KLT dilakukan pada silika

gel memakai pengembang seperti heksana-etil asetat (1:1) dan kloroform-metanol

(10:1), pada Rf (75, dan 50) (Harborne, 1984).

Hasil penelitian Sukadani (2008), menjelaskan bahwa biji pepaya,

dilakukan Uji fitokimia triterpenoid lebih lanjut terhadap ekstrak kental n-heksana

menggunakan pereaksi Liebermann–Burchard untuk menentukan ada tidaknya

triterpenoid. Ekstrak kental positif triterpenoid dipisahkan dengan kromatografi

kolom. Sebelum dilakukan pemisahan dengan kromatografi kolom, terlebih

dahulu dilakukan pemilihan eluen dengan teknik KLT. Hasil pemisahan

kromatografi kolom (silika gel 60, n-heksana : eter : etilasetat : etanol (2:3:3:2))

yang sama digabungkan dan dikelompokkan menjadi kelompok fraksi. Masing-

masing kelompok fraksi tersebut diuji untuk triterpenoid. Fraksi yang positif

mengandung triterpenoid dengan noda tunggal dilanjutkan dengan uji kemurnian

secara KLT dengan beberapa campuran eluen. Bila tetap menghasilkan satu noda

maka fraksi tersebut dapat dikatakan sebagai isolat relatif murni secara KLT.

Isolat relatif murni ini kemudian dianalisis dengan Spektrofotometer Ultra violet-

tampak dan Inframerah.

Masih dari penelitian Sukadani (2008) pada biji pepaya, setelah diuji

triterpenoid dengan pereaksi Liebermann-Burchard menunjukkan reaksi positif

untuk triterpenoid dengan perubahan warna dari kuning menjadi merah ungu.

Pemisahan dengan kromatografi kolom terhadap ekstrak kental n-heksana

menghasilkan 0,05 g isolat yang menunjukkan positif untuk triterpenoid (F3) yang

berwarna kuning. Hasil identifikasi menggunakan spektroskopi inframerah

menunjukkan bahwa isolat kemungkinan termasuk senyawa golongan triterpenoid

aldehida. Spektrum inframerah mengindikasikan adanya -C-H alifatik stretching,

–CH2

bending,

–CH3

bending, dan C=O. Spektrum ultra violet - visibel

memberikan dua pita serapan pada panjang gelombang (λmaks

) 228,5 nm dan pita

dengan serapan yang landai pada panjang gelombang 287,7 nm. Hasil uji aktivitas

antibakteri terhadap isolat triterpenoid menunjukkan bahwa isolat dapat

menghambat pertumbuhan bakteri Escherichia coli dan Staphylococcus aureus

pada konsentrasi 1000 ppm.

Berdasarkan penelitian Yusuf (2007), dijelaskan bahwa pada tanaman

krisan hasil ekstrak bunga krisan (Chrysanthemum cinerariaefolium) diduga

berupa triterpenoid yang memiliki gugus ester, gugus karbonil, gugus asam, gugus

C-H siklik, gugus C=H alkena. Pemisahan senyawa dilakukan dengan

menggunakan kromatografi lapis tipis yang disinari dengan sinar UV λ365 nm,

sedangkan eluen yang digunakan adalah metanol : kloroform = 1:15. Analisis

senyawa dan elusidasi strukturnya dilakukan dengan spektrometer IR.

Prasetya (2007), menjelaskan pada tumbuhan Beilschmiedia

Roxburghiana (medang) memberikan hasil positif terhadap pereaksi Lieberman

Burchard, dengan munculnya warna merah yang diindikasikan mengandung

senyawa terpenoid. Penelitian ini menggunakan metode kromatografi cair kolom

vakum (KCKV) dengan eluen n-heksana dan diklorometana (1 : 9).Hasil

identifikasi menggunakan spektrum ultra violet menunjukkan adanya dua puncak

pada panjang gelombang (λ) 229 nm dan 272 nm. Puncak maksimum (λmax) pada

229 nm dan 272 nm menunjukkan adanya transisi elektron π → π*. Puncak-

puncak serapan pada spektrum UV ini khas untuk senyawa terpenoid yang

memiliki kromofor berupa ikatan rangkap (C=C) yang tidak terkonjugasi. Pada

spektrum IR menunjukkan adanya pita serapan pada bilangan gelombang 3422,8

cm-1; 2938,8 cm-1; 2864,5 cm-1; 1632,4 cm-1; 1460,0 cm-1; 1376,5 cm-1 dan

1055,5 cm-1. Pita serapan pada bilangan gelombang 3422,8 cm-1 menunjukkan

adanya vibrasi ulur gugus hidroksi (OH) yang diperkuat dengan adanya vibrasi

ulur ikatan C-O pada bilangan gelombang 1055,5 cm-1. Kedua serapan tersebut

mengindikasikan adanya gugus hidroksi (OH) yang terikat pada atom karbon.

Munculnya vibrasi ulur C-H alifatik pada 2938,8 cm-1 dan 2864,5 cm-1 memberi

petunjuk kemungkinan adanya gugus metil (CH3) dan metilena (CH2). Data ini

diperkuat dengan adanya vibrasi tekuk C-H pada bilangan gelombang 1460,0 cm-

1 dan 1376,5 cm-1 yang mengindikasikan adanya gugus gem dimetil sebagai ciri

khas senyawa triterpenoid.

Golongan senyawa triterpenoid: menggunakan pengembang heksana-etil

asetat (1:1) dengan pereaksi Lieberman-Burchard menghasilkan warna merah

ungu (violet) (Harborne, 1987).

2.5.3. Metode Analisis

2.5.3.1. Spektrofotometri IR

Peneltian Sukadani (2008), menjelaskan bahwa hasil analisis senyawa

triterpenoid pada biji pepaya menggunakan spektrofotometri inframerah

menunjukkan adanya serapan tajam pada daerah bilangan gelombang 2923,8 cm-1

dan 2852,2 cm-1

yang diduga serapan dari gugus C-H alifatik stretching. Dugaan

ini diperkuat oleh adanya serapan pada daerah bilangan gelombang 1464,4 cm-1

dan 1206,5 cm-1

yang merupakan serapan dari -CH2

dan –CH3

bending. Pita

serapan yang tajam pada daerah bilangan gelombang 1710,4 cm-1

dengan

intensitas kuat mengidentifikasikan gugus karbonil (C=O) (Sastrohamidjojo,

1985).

Masih dari penelitian Sukadani (2008) bahwa isolat kemungkinan

termasuk senyawa golongan triterpenoid aldehida. Spektrum inframerah

mengindikasikan adanya -C-H alifatik stretching, –CH2

bending, –CH

3 bending,

dan C=O.

BAB III

METODE PENELITIAN

3.1. Pelaksanaan Penelitian

Penelitian dilakukan pada bulan November-Maret 2010. Penelitian

dilaksanakan di Laboratorium Kimia Universitas Islam Negeri (UIN) Malang.

3.2. Alat dan Bahan Penelitian

3.2.1. Alat

Alat yang digunakan untuk proses identifikasi dalam penelitian ini adalah

kertas saring, neraca analitik, seperangkat alat gelas, corong pisah, rotary

evaporator, sentrifuge, seperangkat alat KLT, lampu UV dan seperangkat alat

FTIR merek Varian 1000 scimitar series.

Alat yang digunakan untuk uji antibakteri adalah cawan petri, tabung

reaksi, jarum ose, inkubator, pinset, autoklaf, bunsen, erlenmeyer, beaker glas,

dan penggaris.

3.2.2. Bahan

Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah buah belimbing

wuluh kering. Bahan kimia yang digunakan adalah etanol, ammonia, hidrogen

klorida (HCl) 15%, akuades, asam asetat, n-butanol, kloroform (CHCl3), etil

asetat, methanol, diklorometana.

Uji antibakteri digunakan bahan-bahan sebagai berikut: nutrien agar,

kertas wathman, akuades steril serta biakan bakteri Staphylococcus aureus dan E.

coli

.

3.3. Rancangan Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan dengan rancang bangun penelitian eksperimental

laboratorik. Proses ekstraksi dilakukan dengan pelarut etanol. Ekstrak yang

diperoleh dipisahkan dengan KLTP yang sebelumnya dicari eluen terbaik untuk

dipisahkan dengan KLT analitik. Eluen yang memberikan pemisahan yang baik

(jumlah spot dan pola pemisahan) digunakan sebagai eluen untuk KLTP,

dilanjutkan uji efektivitas antibakteri terhadap fraksi hasil KLTP dan identifikasi

senyawa buah belimbing wuluh dengan FTIR.

3.4. Tahapan-Tahapan Penelitian

Penelitian ini dilakukan dengan tahapan-tahapan sebagai berikut:

Tahapan Penelitian

1. Preparasi sampel

2. Penentuan kadar air

3. Ekstraksi buah belimbing wuluh dengan metode maserasi

4. Pemisahan ekstrak kasar buah belimbing wuluh dengan Kromatografi

Lapis Tipis (KLT)

a. Kromatografi Lapis Tipis Analitik (KLTA)

b. Kromatografi Lapis Tipis Preparatif (KLTP)

5. Uji efektivitas antibakteri terhadap fraksi hasil KLTP

6. Identifikasi senyawa buah belimbing wuluh dengan FTIR

7. Analisis data

3.5. Cara Kerja

3.5.1. Preparasi Sampel

Sebanyak 5 kg buah belimbing wuluh dicuci bersih, diiris tipis dan

dikeringkan dalam oven pada suhu 37-40 oC sampai diperoleh berat konstan.

Kemudian buah belimbing wuluh dihaluskan menjadi serbuk, hasil yang diperoleh

digunakan sebagai sampel penelitian (Zakaria, et al., 2007).

3.5.2. Penentuan Kadar Air

Analisa kadar air dilakukan dengan metode thermografi yaitu dengan

pemanasan. Analisa ini dilakukan sebanyak 3 kali pengulangan. Cawan yang

digunakan dipanaskan dahulu dalam oven pada suhu 100-105º C sekitar 15 menit

untuk menghilangkan kadar airnya, kemudian cawan disimpan dalam desikator

sekitar 10 menit. Cawan tersebut selanjutnya ditimbang dan dilakukan perlakuan

yang sama sampai diperoleh berat cawan yang konstan. Sampel buah blimbing

wuluh dipotong kecil-kecil, dimasukkan ke dalam cawan yang telah diketahui

beratnya. Sampel ditimbang sekitar 5 g, selanjutnya dikeringkan di dalam oven

pada suhu 100-105º C selama sekitar 1 jam. Sampel kering didinginkan dalam

desikator dan ditimbang. Sampel tersebut dipanaskan kembali dalam oven ± 20

menit, didinginkan dalam desikator dan ditimbang kembali. Perlakuan ini diulangi

sampai tercapai berat konstan. Kadar air dalam tanaman dihitung menggunakan

rumus berikut:

Kadar air = %100)(

)( ×−−

ab

cb

Keterangan: a= berat konstan cawan kosong

b= berat cawan + sampel sebelum dikeringkan

c= berat konstan cawan + sampel setelah dikeringkan

Faktor koreksi =airkadar%100

100

−

% Kadar air terkoreksi = Kadar air- Faktor koreksi

3.5.3. Ekstraksi Buah Belimbing Wuluh dengan Metode Maserasi

Sampel ditimbang seberat 50 gram dimaserasi dengan pelarut etanol

sebanyak 250 mL. Dibiarkan pada suhu kamar selama 72 jam (± 3 hari) dan

sesekali dikocok. Penambahan etanol dilakukan secara bertahap (setiap 12 jam)

sampai filtrat tidak berwarna. Ekstrak etanol disaring kemudian filtratnya

dipekatkan dengan rotary evaporator. Ekstrak pekat yang diperoleh selanjutnya

dihidrolisis dengan HCl 15% kemudian diekstraksi cair-cair dengan pelarut air :

kloroform (1:1), ekstraksi dilakukan secara bertahap (3X35 mL). Fasa air dan fasa

organik yang diperoleh masing-masing dipisahkan. Masing-masing lapisan yaitu

lapisan atas (fasa air) dan lapisan bawah (fasa organik), dipekatkan dengan rotary

evaporator kemudian ditentukan nilai rendemennya, dan dilakukan identifikasi

senyawa flavonoid dan triterpenoid yang terdapat dalam ekstrak dengan KLT

(Markham, 1988).

3.5.4. Pemisahan Senyawa Flavonoid dan Triterpenoid

Pada tahap ini dilakukan pemisahan senyawa flavonoid dan triterpenoid

dengan KLT analitik dan preparatif. KLT analitik bertujuan untuk mencari eluen

terbaik untuk pemisahan senyawa flavonoid dan triterpenoid dari ekstrak buah

blimbing wluh, hasil yang diperoleh digunakan sebagai eluen untuk KLT

preparatif.

3.5.4.1. Pemisahan Senyawa Flavonoid dan Triterpenoid dengan KLT

Analitik

Pemisahan dengan KLT analitik menggunakan plat silika gel 60 GF254

dengan ukuran 2 x 10 cm. Dalam Markham (1988) disebutkan bahwa pada

umumnya eluen yang digunakan untuk memisahkan komponen-komponen dalam

bahan alam yang diduga mengandung flavonoid adalah campuran n-butanol-asam

asetat glasial-air (BAA) dan metanol–kloroform, dengan komposisi meliputi BAA

(4:1:5), BAA (6:1:2), dan metanol-kloroform (1:9), (1:19) dan (1:39).Sedangkan

yang diduga mengandung triterpenoid adalah heksana-etil asetat (1:1), metanol-

kloroform (1:10), n-heksana-diklorometana (1:9) dengan pereaksi Lieberman-

Burchard (Harborne, 1987).

Ekstrak pekat flavonoid dan triterpenoid dilarutkan dalam etanol,

kemudian ditotolkan (10-15) pada plat KLT pada jarak 1 cm dari garis bawah

menggunakan pipa kapiler. Kemudian dikeringkan di udara dan dielusi sejauh 8

cm. Hasil pemisahan pada KLT analitik untuk flavonoid diidentifikasi

menggunakan uap amonia sedangkan untuk triterpenoid menggunakan pereaksi

Lieberman-Burchard. Noda yang terbentuk diperiksa dengan lampu UV,

flavonoid diperiksa pada panjang gelombang 254 nm, triterprnoid diperiksa pada

panjang gelombang 365 nm.

Eluen yang memberikan pemisahan paling baik akan digunakan dalam

pemisahan dengan KLT preparatif.

3.5.4.2. Pemisahan Senyawa Flavonoid dan Triterpenoid dengan KLT

Preparatif

Pemisahan dengan KLT preparatif menggunakan plat silika gel 60 GF254

dengan ukuran 10 x 20 cm. Ekstrak pekat flavonoid dan triterpenoid dilarutkan

dalam etanol, kemudian ditotolkan (8-10) sepanjang plat pada jarak 1 cm dari

garis bawah dan 1 cm dari garis tepi dan jarak satu sama lainnya 1 cm.

Selanjutnya dielusi dengan menggunakan pelarut yang memberikan pemisahan

terbaik hasil KLT analitik. Masing-masing senyawa flavonoid dan triterpenoid

akan membentuk noda yang terpisah berdasarkan harga Rf nya. Kemudian

masing-masing noda yang diperoleh dikerok dan dilarutkan dalam etanol.

Masing-masing noda yang telah dikerok dan dilarutkan dalam etanol,

disentrifuge untuk mengendapkan silikanya. Masing-masing supernatant yang

diperoleh dipekatkan dengan desikator vacum sehingga diperoleh isolat dari

masing-masing noda berdasarkan harga Rf nya.

3.5.5. Uji Efektifitas Antibakteri

3.5.5.1. Sterilisasi Alat

Sterilisasi alat dan bahan dengan cara menutup alat-alat yang akan

disterilkan dengan alumunium foil atau kapas, kemudian dimasukkan ke dalam

autoklaf pada suhu 121 0C dengan tekanan 15 psi (per square inchi) selama 15

menit.

3.5.5.2. Penyiapan Media

Pembuatan media dilakukan dengan cara 1 g nutrien agar dilarutkan dalam

50 ml akuades. Suspensi yang dihasilkan dipanaskan sampai mendidih, kemudian

dimasukkan dalam beberapa tabung reaksi masing-masing sebanyak 10 mL dan

ditutup dengan kapas. Proses ini dilakukan di dekat nyala api. Tabung-tabung

tersebut kemudian disterilkan dalam autoklaf pada 121 oC dengan tekanan 15 psi

selama 15 menit kemudian diletakkan dalam posisi miring selama 24 jam pada

suhu ruang (Volk dan Wheeler, 1993).

3.5.5.3. Peremajaan Biakan Murni

Biakan murni bakteri diremajakan pada media padat agar miring dengan

cara menggoreskan jarum ose yang mengandung bakteri Staphylococcus aureus

dan bakteri E. coli secara aseptis yaitu dengan mendekatkan mulut tabung pada

nyala api saat menggoreskan jarum ose. Kemudian tabung reaksi ditutup kembali

dengan kapas dan diinkubasi selama 48 jam pada suhu 37 oC dalam incubator.

3.5.5.5. Pembuatan Biakan Aktif

Satu ose hasil peremajaan biakan murni bakteri dibiakkan dalam 10 mL

akuades steril dan dihomogenkan. Larutan ini berfungsi sebagai biakan aktif .

3.5.5.6. Uji Antibakteri

Media padat (tahap 3.5.5.2) yang telah dipanaskan hingga mencair,

didinginkan sampai suhu ± 40 oC, dan dituang dalam cawan petri steril. Kemudian

ditambahkan 0,1 mL larutan biakan aktif bakteri dan dihomogenkan kemudian

dibiarkan hingga memadat. Kertas cakram (diameter 5 mm) diresapkan dalam

ekstrak dan kontrol. Proses peresapan dilakukan dengan cara meneteskan 20 µL

kontrol positif (penisilin dan streptomisin), kontrol negatif (pelarut) dan ekstrak

(Zakaria et al., 2007). Kertas cakram tersebut kemudian diletakkan di atas

permukaan media bakteri menggunakan pinset dan ditekan sedikit. Media bakteri

yang sudah dipasangi bahan antibakteri diinkubasi pada suhu 37 oC selama 18-24

jam. Pembacaan awal dapat dilakukan setelah 6-8 jam. Diameter zona hambatan

yang terbentuk diukur menggunakan penggaris untuk menentukan efektifitas

antibakteri (Volk dan Wheeler, 1993). Zona hambatan diukur dengan cara

mengurangi diameter keseluruhan (cakram + zona hambatan) dengan diameter

cakram.

Fraksi aktif tersebut diuji untuk mengetahui efektifitas senyawa antibakteri

pada buah belimbing wuluh (kosentrasi 450 mg/mL) (Latifah, 2008). Pada

penelitian ini kontrol positif penisilin (konsentrasi 10 mg/mL) digunakan untuk

bakteri Staphylococcus aureus dan kontrol positif streptomisin (konsentrasi 10

mg/mL) untuk bakteri E. Coli.

3.5.6. Identifikasi Senyawa Buah Blimbing Wuluh dengan FTIR

Isolat hasil KLTP yang memberikan efektivitas antibakteri terbaik

kemudian diidentifikasi dengan menggunakan spektrofotometer FTIR merk

Shimadzu. Isolat diteteskan pada pelet KBr, dikeringkan, kemudian dianalisis

dengan spektroskopi FTIR pada rentang bilangan gelombang 4000-600 cm-1.

3.5.7. Analisis Data

3.5.7.1. Analisis Data KLT

Data yang diperoleh dianalisis secara deskriptif yaitu dengan

memperhatikan pola pemisahan pada kromatogram dari berbagai eluen yang

digunakan.

3.5.7.2. Analisis Data FTIR

Data yang diperoleh dari hasil spektrum FTIR berupa informasi gugus-

gugus fungsional yang menyusun suatu struktur senyawa. Data tersebut

diidentifikasi dengan tabel korelasi yang memuat informasi dimana gugus

fungsional menyerap.

3.5.7.3. Analisis Data Uji Antibakteri

Data diperoleh dari hasil zona hambat berupa kemampuan isolat ekstrak

buah blimbing wuluh dalam menghambat bakteri. Data tersebut dianalisis untuk

menguji adanya pengaruh sampel dari isolat hasil KLTP terhadap pertumbuhan

bakteri.

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

Hasil penelitian dan pembahasan ini disusun berdasarkan tahapan

penelitian yang telah dilakukan yaitu : Pertama, Preparasi sampel, Kedua,

Penentuan kadar air, Ketiga, Isolasi senyawa anti bakteri pada buah blimbing

wuluh. Isolasi meliputi isolasi dengan metode ekstraksi, metode kromatografi

lapis tipis, Keempat, Uji antibakteri dan Kelima, Identifikasi senyawa flavonoid

dengan metode spektrofotometri inframerah.

4.1. Preparasi Sampel

Buah blimbing wuluh (Averrhoa bilimbi L.) yang segar ditimbang

sebanyak 5 kg, kemudian dicuci dengan air bersih, diiris tipis dan dikeringkan

dalam oven selama 3 hari pada suhu 37-40 oC sampai diperoleh berat konstan.

Pengeringan dilakukan terkait dengan sifat fisik dari buah belimbing wuluh yang

mudah busuk, dengan pengeringan diharapkan buah belimbing wuluh akan lebih

awet dan tahan terhadap mikroba, kemudian dihaluskan dan diperoleh 179 g

sampel berupa serbuk, perlakuan ini bertujuan untuk memperluas permukaan

sehingga mudah dalam pengekstraksian. Hasil yang diperoleh digunakan sebagai

sampel penelitian.

Selama proses pengeringan terdapat perubahan warna, tekstur dan berat.

Buah belimbing wuluh segar berwarna hijau dan masih segar atau keras, setelah

dioven berwarna kuning kecoklatan dan agak lunak, sedangkan setelah benar-

benar kering buah blimbing wuluh berwarna coklat dan kaku. Perubahan warna

tersebut disebabkan oleh terjadinya foto-oksidasi pada buah belimbing wuluh,

sedangkan perubahan tekstur dan berat disebabkan buah belimbing wuluh

kehilangan beberapa persen kandungan airnya (Halimah, 2010).

4.2. Penentuan Kadar Air

Penetapan kandungan air dapat dilakukan beberapa cara, tergantung pada

sifat bahannya. Pada umumnya penentuan kadar air dilakukan dengan

pengeringan bahan dalam oven pada suhu 105-110 oC selama 3 jam atau sampai

diperoleh berat konstan (Winarno, 2002). Sebagaimana dalam penelitian ini untuk

mendapatkan berat konstan dilakukan dengan cara pengeringan sampel dalam

oven pada suhu 105-110 oC selama 7 jam. Pengovenan dilakukan setiap 30 menit

dilanjutkan dengan pendinginan di dalam desikator selama 10 menit sampai

diperoleh berat konstan yang menunjukkan kandungan air dalam buah sudah

teruapkan secara maksimal.

Untuk mempercepat penguapan air serta menghindari terjadinya reaksi

yang menyebabkan terbentuknya air ataupun reaksi yang lain karena pemanasan

maka dapat dilakukan pemanasan dengan suhu rendah dan tekanan vakum.

Dengan demikian akan diperoleh hasil yang lebih mencerminkan kadar air yang

sebenarnya (Suhardi, 1989).

Kandungan air pada buah blimbing wuluh sangat tinggi, yaitu sebesar 78,9

% (78,9% air dan 21,1% daging buah blimbing wuluh), oleh karena itu perlu

adanya pengeringan sebelum sampel buah blimbing wuluh dimaserasi agar tidak

mengganggu proses ekstraksi. Pengeringan ini bertujuan untuk proses

penyimpanan agar kerusakan akibat degradasi oleh mikroorganisme maupun

penguraian oleh enzim dapat diminimalkan. Sampel yang telah dihilangkan kadar

airnya cenderung mudah menyerap air sehingga perlu dilakukan penyimpanan

dalam tempat yang kedap udara.

4.3. Ekstraksi Buah Belimbing Wuluh dengan Metode Maserasi

Ekstraksi merupakan peristiwa pemindahan massa senyawa aktif yang

semula berada dalam sel ditarik oleh pelarut, sehingga terjadi larutan senyawa

aktif dalam pelarut tersebut (Ahmad, 2006). Metode ekstraksi yang digunakan

dalam penelitian ini adalah maserasi. Pemilihan metode maserasi dikarenakan

metode ini murah dan mudah dilakukan selain itu dikhawatirkan senyawa

flavonoid dan triterpenoid adalah golongan senyawa yang tidak tahan panas,

sehingga proses ekstraksi ini tidak dilakukan dengan metode soxhlet. Penggunaan

ekstraksi dengan metode soxhlet dapat menurunkan konsentrasi senyawa polifenol

(Cheong, et.al, 2005 dalam Hukmah, 2007).

Proses ekstraksi dilakukan dengan menggunakan pelarut etanol. Menurut

(Markham, 1988), aglikon flavonoid adalah polifenol dan karena itu mempunyai

sifat kimia senyawa fenol. Adanya sejumlah gugus hidroksil atau mempunyai

suatu gula, flavonoid juga bersifat polar dan karenanya cukup larut dalam pelarut

polar seperti etanol.

Proses maserasi dilakukan dengan cara sampel ditimbang kemudian

direndam dalam pelarut ethanol selama 72 jam (± 3) hari karena proses ekstraksi

akan berlangsung optimal dengan tersedianya waktu kontak yang cukup antara

pelarut dan sampel. Selama proses perendaman dilakukan beberapa kali

pengocokan menggunakan shaker dengan kecepatan 150 rpm selama 14 jam (±2)

hari, agar kontak antara sampel dan pelarut semakin sering terjadi, sehingga

proses ekstraksi lebih sempurna. Larutan kemudian disaring dan diperolah filtrat

dari pelarut etanol dengan warna coklat tua. Robinson (1995) mengatakan bahwa

warna coklat tersebut merupakan indikasi adanya senyawa flavonoid yang larut

dalam pelarut polar.

Filtrat hasil penyaringan dipekatkan dengan rotary evaporator. Tujuannya

untuk menghilangkan pelarut yang digunakan selama maserasi. Hasil dari

pemekatan adalah ekstrak pekat yang berwarna coklat tua dan tekstur ekstrak

pekat berupa cairan kental.

Ekstrak pekat yang diperoleh selanjutnya dihidrolisis dengan HCl 15%

dengan tujuan untuk merubah flavonoid glikosida menjadi aglikonnya. Reaksi

yang mungkin terjadi adalah seperti Gambar 4.1.

Gambar 4.1. Reaksi dugaan hidrolisis flavonoid glikosida dengan HCl

Ekstrak pekat yang telah dihidrolisis ini selanjutnya diekstraksi cair-cair

menggunakan corong pisah dengan pelarut air : kloroform (1:1) yakni untuk

mengambil senyawa-senyawa yang bersifat nonpolar (triterpenoid), ekstraksi di

ulangi hingga jernih untuk memaksimalkan proses pengambilan senyawa yang

bersifat non polar (Ata, 2010).

Penambahan pelarut air : kloroform (1:1) menyebabkan terbentuknya dua

fasa yaitu fasa air dan fasa organik. Masing-masing lapisan yaitu lapisan atas (fasa

air yang mengandung senyawa flavonoid) karena densitas air adalah 1kg/L dan

OHO

O

OH

OH

O

H+OHO

OH

O

O

OH

G

H

OHO

OH

OH

OH

O

+

H

H

GO

OHO

OH

OH

O

OH

+

H O

H

G-H+

OHO

OH

OH

O

OH

HO-G+

lapisan bawah (fasa organik yang mengandung senyawa triterpenoid) karena

densitas klorofm adalah 1,475-1,481 kg/L, kemudian dipekatkan dengan rotary

evaporator sehingga diperoleh ekstrak pekat yang di duga mengandung senyawa

flavonoid dan senyawa triterpenoid. Penambahan pelarut air:klorofm (1:1) ini

karena senyawa flavonoid yang ada dalam belimbing wuluh merupakan senyawa

yang bersifat polar. Suatu molekul bersifat polar apabila tersusun atas atom-atom

yang berbeda dan strukturnya tidak simetris. Kepolaran suatu molekul ditentukan

oleh harga momen dipolnya (µ). Suatu molekul bersifat polar bila µ > 0 atau µ ≠ 0

dan nonpolar bila µ = 0 (Effendy, 2006). Robinson (2005) menyatakan semakin

banyak gugus hidroksil suatu senyawa fenol memiliki tingkat kelarutan dalam air

dan pelarut polar semakin besar. Struktur senyawa flavonoid tersusun atas atom-

atom yang berbeda dan bentuknya tidak menyebabkan flavonoid bersifat non

polar, dan flavonoid memiliki gugus hidroksi lebih dari satu dan memiliki momen

dipol tidak sama dengan nol (µ ≠ 0) yang menyebabkan flavonoid bersifat polar,

sehingga harus dilarutkan dengan pelarut yang bersifat polar. Kemudian

ditentukan nilai rendemennya yang bisa dilihat pada lampiran dan dilakukan

identifikasi senyawa flavonoid dan triterpenoid menggunakan Kromatografi Lapis

Tipis (Sa’adah, 2010).

4.4. Pemisahan Senyawa Flavonoid dan Triterpenoid dengan Kromatografi

Lapis Tipis (KLT)

Pendugaan secara kualitatif senyawa flavonoid dan triterpenoid dari buah

blimbing wuluh (Averrhoa bilimbi L.) dilakukan dengan metode Kromatografi

Lapis Tipis (KLT). KLT merupakan metode pemisahan senyawa kimia dengan

menggunakan fasa diam (selulosa) dan fasa gerak (eluen).

Pemisahan menggunakan plat silika gel 60 F254 karena fasa diam

(adsorben) yang terdapat dalam plat ini berupa silika yang umumnya digunakan

untuk memisahkan senyawa alkaloid, zat warna, fenol, steroid, vitamin-vitamin,

karoten dan asam-asam amino. Sebelum digunakan plat silika gel 60 F254

diaktifasi terlebih dahulu pada suhu 100o C selama ± 15 menit. Penggunaan

berbagai macam komposisi eluen diharapkan mampu memisahkan komponen-

komponen senyawa flavonoid yang terkandung dalam buah blimbing wuluh.

Ekstrak pekat flavonoid (fase air) dan triterpenoid (fase organik)

dilarutkan dalam etanol agar tidak terlalu pekat sehingga dapat terbawa eluen

dengan baik, kemudian ditotolkan (5-10) pada plat KLT pada jarak 1 cm dari garis

bawah menggunakan pipa kapiler, setelah itu diidentifikasi menggunakan uap

amonia untuk senyawa flavonoid karena dengan diuapi amonia berbagai

perubahan warna dapat terlihat seperti : flavon kelihatan berwarna kuning, kalkon

dan auron kelihatan berwarna merah jingga (Robinson, 2005) dan liebermen-

burchard untuk senyawa triterpenoid akan menghasilkan warna violet (Harborne,

1987). Noda yang terbentuk diperiksa dengan lampu UV pada panjang gelombang

254 nm untuk mengetahui secara jelas ada tidaknya spot yang terbentuk.

Hasil pemisahan ekstrak flavonoid dengan KLT menggunakan eluen

butanol-asam asetat glasial-air (BAA) dan metanol–kloroform, dengan komposisi

meliputi BAA (4:1:5), BAA (6:1:2), dan metanol-kloroform (1:9), (1:19) dan

(1:39), sedangkan eluen triterpenoid yang digunakan adalah n-heksana-etil asetat

(1:1), metanol-klorofrm (1:10), n-heksana-diklorometana (1:9) dengan pereaksi

Lieberman-Burchard.sesuai pada Lampiran 3.9.

Penggunaan berbagai macam komposisi eluen ini diharapkan mampu

memisahkan senyawa flavonoid dan senyawa triterpenoid yang terkandung dalam

buah blimbing wuluh. Hasil pemisahan dengan KLT kualitatif menunjukkan

bahwa eluen dengan campuran metanol-kloroform (1:9) untuk senyawa flavonoid

mampu memberikan resolusi (pemisahan) terbaik, hal ini dapat dilihat dengan

adanya noda yang terpisah dengan baik dan warnanya sangat jelas dibandingkan

dengan campuran metanol-cloroform (1:19) dan metanol-cloroform (1:39) yang

warnanya kurang jelas. Pada eluen metanol-kloroform, metanol mempunyai sifat

yang polar dan efek elusinya kuat sedangkan kloroform mempunyai efek elusi

cukup kuat dengan sifat kurang polar. Laju rambat tergantung kepada sifat pelarut

(fase gerak) dan struktur lapisan (fase diam). Fase gerak yang digunakan

mempunyai sifat kurang polar dan sampel yang akan dipisahkan adalah aglikon

flavonoid yang juga bersifat kurang polar, sehingga kesamaan sifat antara fasa

gerak dan sampel dapat memberikan pemisahan terbaik.

Eluen dengan campuran BAA belum mampu memisahkan senyawa

flavonoid dalam buah blimbing wuluh karena eluen dengan campuran BAA

mempunyai sifat kepolaran yang tinggi, sedangkan senyawa flavonoid yang akan

dipisahkan mempunyai sifat kurang polar maka senyawa flavonoid tidak bisa

terpisah secara sempurna. Hal ini terbukti dengan adanya noda yang belum

terpisah dengan baik dan masih berhimpit. Dengan demikian eluen dengan

campuran metanol-klorofrm (1:9) digunakan dalam pemisahan senyawa flavonoid

dengan KLT preparatif.

Hasil pemisahan senyawa triterpenoid dengan KLT kualitatif yang

menggunakan eluen n-heksana-etil asetat (1:1), metanol-klorofrm (1:10), n-

heksana-diklorometana (1:9) menunjukkan terbentuknya 1 noda yang berwarna

lembayung (sebelum di semprot dengan pereaksi Lieberman-Burchard) dan

warnanya hilang (setelah disemprot dengan pereaksi Lieberman-Burchard), hal ini

menunjukkan bahwa senyawa tersebut bukan senyawa triterpenoid melainkan

senyawa flavonoid dan diperkuat dari hasil uji reagen senyawa triterpenoid yang

memberikan warna coklat kekuningan, warna tersebut merupakan salah satu

indikator adanya senyawa flavonoid dan bukan senyawa triterpenoid, maka

ekstrak yang di duga mengandung triterpenoid ternyata tidak ditemukan adanya

senyawa triterpenoid pada uji KLT, hal ini diduga karena senyawa triterpenoid

bersifat non polar sedangkan pelarut ethanol (yang digunakan padasaat awal

maserasi) bersifat polar sehingga akan sangat sedikit senyawa triterpenoid yang

dapat terekstrak.

Hasil identifikasi dengan KLT golongan senyawa flavonoid dalam ekstrak

etanol dengan eluen metanol:klorofrm (1:9) menunjukkan terbentuknya 1 noda

yang menunjukkan bahwa pada ekstrak buah blimbing wuluh hanya terdapat satu

senyawa yakni senyawa flavonoid yang terpisah dibawah sinar UV dengan

panjang gelombang 254 nm . Hasil KLT dari pemisahan flavonoid ekstrak etanol

ini dapat ditunjukkan pada Gambar 4.1 dan Tabel 4.2

A B Gambar 4.2 Hasil pengamatan KLT senyawa flavonoid pada ekstrak etanol

dibawah sinar sinar UV pada panjang gelombang 254 nm (A) sebelum diuapi amoniak dan (B) sesudah diuapi amoniak.

Berdasarkan hasil dari KLT analitik maka eluen metanol:kloroform (1:9)

memberikan pemisahan terbaik dengan memperlihatkan satu noda, hal ini

menunjukkan bahwa senyawa isolat hanya mampu memisahkan satu senyawa

yang diduga adalah senyawa flavonoid, diperkuat dengan dilakukan uji reagen

dari hasil ekstrak cair-cair untuk fasa air (flavonoid) dan fasa organik

(triterpenoid), untuk uji flavonoid menghasilkan warna kuning yang

menunjukkan senyawa flavonoid, dan untuk uji triterpenoid menghasilkan warna

kuning yang menunjukkan bukan senyawa triterpenoid melainkan senyawa

flavonoid, hal ini di mungkinkan bahwa hasil ekstraksi pada buah blimbing wuluh

hanya mengandung satu senyawa yakni senyawa flavonoid.

Warna yang terdapat pada plat KLT menunjukkan adanya warna

lembayung dan tidak terjadi perubahan warna setelah diuapi amonia, maka

dimungkinkan pada hasil ekstrak buah blimbing wuluh terdapat senyawa

flavonoid golongan flavon, flavonol, isoflavon, dihidroflavonol, atau flavanon.

Tabel 4.1 Warna noda dengan eluen campuran metanol-clorofrm ( 1:9), dibawah sinar UV 254 nm dan golongan flavonoid yang mungkin

Warna bercak dengan sinar UV Jenis flavonoid yang mungkin Sinar UV tanpa NH3 Sinar UV dengan NH3

Lembayung gelap Perubahan warna sedikit atau tanpa perubahan warna

a Biasanya flavon atau flavonol tersulih pada 3-O mempunyai 5-OH tetapi tanpa 4’-OH bebas b Beberapa 6- atau 8-OH flavon dan flavonol tersulih pada 3-O serta mengandung 5-OH c Isoflavon, dihidroflavonol, biflavonil, dan beberapa flavanon yang mengandung 5-OH d Khalkon yang mengandung 2’- atau 6’-OH tetapi tidak mengandung 2- atau 4-OH bebas

Sumber : Markham, 1988

Dari Tabel 4.2 hal ini dipastikan bahwa buah blimbing wuluh mengandung

senyawa flavonoid golongan flavon, flavonol, isoflavon, dihidroflavonol, atau

flavanon.

Tabel 4.2 Harga Rf dan warna noda pada kromatogram hasil KLT kualitatif dengan eluen metanol-kloroform (1:9)

Noda Rf Warna noda Sinar UV Amonia+ sinar UV

1 0,70 Lembayung Lembayung Sumber: Data penelitian, 2010

Reaksi yang terjadi antara senyawa flavonoid dengan amonia dapat ditulis

sebagai berikut:

Gambar 4.3 Reaksi antara senyawa flavonoid dengan NH3

Reaksi antara senyawa flavonoid dengan NH3 menunjukkan bahwa

senyawa flavonoid mempunyai 2 cincin (cincin A dan cincin B), pada cincin B

dari senyawa flavonoid yang mengikat gugus OH lebih cenderung mengikat NH3

(amonia) membentuk ONH4+

. Karena gugus OH pada ruang cincin B lebih luas

(efek sterik) dari pada gugus O dicincin yang lain, sehingga lebih mudah mengikat

yang lain.

Hasil KLT Preparatif

Hasil pemisahan kromatografi lapis tipis preparatif hampir sama dengan

KLT kualitatif hanya berbeda pada kuantitas dari ekstrak yang digunakan. Dimana

pada KLT prepararif digunakan plat KLT silika gel dengan ukuran yang lebih

besar yaitu dengan ketebalan ± 1 mm, dan penotolan sepanjang garis plat KLT.

Pada KLTP digunakan eluen terbaik yang diperoleh dari hasil KLT sebelumnya

yaitu metanol-kloroform (1:9). Eluen tersebut mampu memisahkan ekstrak pekat

dengan baik yaitu ekstrak buah blimbing wuluh (Averrhoa bilimbi L.) terpisah

jelas. Noda yang dihasilkan pada uji KLT preparatif dikerok dan dilarutkan dalam

pelarut etnol karna hasil kerokan pada uji KLTP adalah senyawa flavonoid yang

bersifat polar . Kemudian diidentifikasi dengan spektrofotometri inframerah.

Gambar 4.4 Noda hasil KLTP ekstrak buah blimbing wuluh

Pada Gambar 4.4 ekstarak blimbing wuluh menghasilkan satu noda yang

terpisah secara sempurna. Berdasarkan perhitungan pada Lampiran 2.4 diperoleh

nilai Rf sebagai berikut

Tabel 4.3 Harga Rf dan warna noda hasil KLT preparatif dengan eluen metanol-kloroform (1:9) Noda Rf Warna noda

Sinar UV Amonia+ sinar UV

1 0,70 Lembayung Lembayung Sumber: Data penelitian, 2010

4.5. Uji Antibakteri

Uji antibakteri yang digunakan adalah ekstrak etanol yang mengandung

senyawa aktif flavonoid. Flavonoid dapat berefek antibakteri melalui kemampuan

untuk membentuk kompleks dengan protein ekstraseluler dan protein yang dapat

larut serta dengan dinding sel bakteri (Robinson, 1995).

Uji antibakteri ini bertujuan untuk mengetahui efektifitas ekstrak buah

blimbing wuluh sebagai antibakteri terhadap bakteri Staphylococcus aureus dan

E. Coli pada konsentrasi 450 mg/ml.

Pada media bakteri Staphylococcus aureus ekstrak dengan konsentrasi 450

mg/ml menunjukkan diameter zona hambat sebesar 3,60 mm, dan untuk bakteri E.

Coli menunjukkan diameter zona hambat sebesar 0,92 mm. Kenyataan ini

menunjukkan bahwa pada konsentrasi 450 mg/ml bakteri Staphylococcus aureus

mempunyai zona hambat lebih besar daripada bakteri E. Coli, karena flavonoid

merupakan senyawa yang cenderung bersifat polar, kepolaran senyawa inilah

yang mengakibatkan senyawa lebih mudah menembus dinding sel bakteri

Staphylococcus aureus karena struktur dinding sel bakteri ini berlapis tunggal dan

tersusun atas peptidoglikan (protein dan gula) serta lipid dengan kadar rendah (1-4

%), sehingga ekstrak etanol lebih mudah menembus dinding sel bakteri ini.

Dinding sel bakteri E.coli lebih sulit ditembus senyawa yang bersifat polar karena

struktur dinding sel bakteri ini berlapis tiga yang tersusun atas peptidoglikan dan

lipid dengan kadar yang tinggi (11-22 %), sehingga ekstrak etanol lebih sulit

menembus dinding sel bakteri ini (Latifah, 2008).

Tabel 4.4 Hasil Uji Efektifitas Antibakteri dari fraksi aktif flavonoid Cakram Diameter zona hambat Rata-rata zona hambat

(mm) I II III Staphylococcus aureus

4,03 3,36 3,42 3,60

Penisillin 0,38 0,25 0,36 0,33 E,coli 1,06 0,88 0,83 0,92 streptomycin 0,02 0,08 0,06 0,05

Sumber: Data hasil penelitian.

Hasil uji efektifitas antibakteri dari fraksi aktif flavonoid (Tabel 4.5)

menunjukkan zona hambat dari fraksi aktif flavonoid lebih besar daripada zona

hambat kontrol positif, hal ini menunjukkan bahwa fraksi aktif flavonoid lebih

efektif menghambat bakteri staphylococcus aureus dan E.coli dari pada kontrol

positif, diduga karena konsentrasi yang digunakan untuk uji kontrol positif kecil,

yakni pada konsentrasi 10 mg/ml sehinga zona hambat yang dihasilkan pada

kontrol positif sangat kecil.

Apabila hasil di atas (Tabel 4.5) dikaitkan dengan ketentuan kekuatan

antibakteri yang dikemukakan oleh David Scout, maka kekuatan antibakteri yang

terkandung dalam fraksi aktif flavonoid masuk dalam kategori lemah (masuk

dalam kisaran ≤ 5 mm). Hal ini diduga karena kandungan senyawa yang

berpotensi sebagai antibakteri pada ketiga ekstrak tersebut hanya sedikit, sehingga

kemampuannya untuk menghambat pertumbuhan bakteri masih sangat lemah

(latifah,2008).

Hasil penelitian menunjukkan bahwa daya hambat fraksi aktif flavonoid

lebih tinggi terhadap bakteri Staphylococcus aureus (gram positif) dibandingkan

bakteri E. Coli (gram negatif), hal ini ditunjukkan oleh nilai diameter zona hambat

terhadap bakteri Staphylococcus aureus yang secara umum lebih besar daripada

bakteri E,Coli . Zakaria et al, (2007) juga mengatakan bahwa ekstrak buah

blimbing wuluh lebih efektif untuk bakteri gram positif dibandingkan bakteri

gram negatif.

Kontrol negatif digunakan untuk mengetahui apakah pelarut yang

digunakan juga memiliki potensi menghambat bakteri. Kontrol negatif yang

digunakan adalah ethanol dan berdasarkan hasil penelitian ini ethanol tidak

memiliki sifat menghambat kedua bakteri uji karena tidak terbentuk zona bening

disekitar cakram, sehingga zona hambat yang terbentuk dari konsentrasi 450

mg/ml murni dari ekstrak flavonoid, tidak ada pengaruh dari pelarut.

4.6. Identifikasi dengan Spektrofotometer FTIR

Spektrofotometer FTIR merupakan suatu metode identifikasi gugus fungsi

dari suatu senyawa berdasarkan perbedaan momen dipol. Bilangan gelombang

yang sering digunakan dalam analisis senyawa bahan alam yaitu di daerah IR

tengah (4000-400 cm-1). Hasil spektra identifikasi senyawa flavonoid dengan

spektrofotometer FTIR dapat dilihat pada Gambar 4.5

Gambar 4.5 Spektra IR dari hasil isolasi dengan KLT preparatif

Spektra tersebut dijelaskan secara rinci pada Tabel 4.6

Tabel 4.6 Interpretasi Spektra FTIR dari Isolat Puncak Bilangan gelombang ekstrak

Flavonoid (cm-) Range (cm-1)

Jenis vibrasi Intensitas

1 3397,38 3500-3000 Rentangan asimetri OH

m-s

2 2975,96 3000-2850 Rentangan CH alifatik

m-w

3 2891,10 2900-2800 C-H simetri s 4 2413,75 3000-2900 CO2 (udara) w 5 2142,77 2250-2100 Rentangan C=C w-m 6 1925,79 2000-1660 Overtone aromatic w 7 1648,06 1670-1640 C=O vs 8 1536,20 ; 1449, 41 ; 1413,72 1630-1400 Rentangan cincin

aromatic s-m

9 1386,72 ; 1327,90 1450-1375 CH3 bending simetri

m-s

10 1275,82 1280-1220 R-O-Ar (eter aromatik)

s

11 1085,85; 1048,24 1300-1000 C-O alkohol sekunder

s

12 880,44 ; 645,14 ; 435,85 900-690 C-H out plane, p-substitusi benzen

w-m

Keterangan: vs = very strong; s = strong; m = medium; w = weak

Hasil identifikasi gugus fungsi menggunakan spektrofotometer FTIR

menunjukkan bahwa isolat hasil pemisahan dengan KLT preparatif mengandung

gugus fungsi OH dari gugus alkohol yang terikat pada gugus alifatik dan

aromatik. Puncak serapan sangat lebar terbentuk pada bilangan gelombang

3397,38 cm-1 sebagai akibat dari vibrasi ikatan hidrogen intramolekul

(Sastrohamidjojo, 2001). Gugus OH ditunjukkan dengan serapan tajam pada

daerah 3397,38 cm-1 yang didukung dengan munculnya serapan pada daerah

1085,85 cm-1: 1048,24 cm-1 untuk ikatan C-O alkohol sekunder. Rentangan C-H

alifatik muncul pada daerah 2975,96 cm-1. Vibrasi ulur C-H simetri terdapat pada

serapan tajam di 2891,10 cm-1, yang diperkuat adanya tekuk =C-H pada 1536,20

cm-1, 1449, 41 cm-1 dan 1413,72 cm-1. Gugus vibrasi ulur C=O karbonil muncul

pada serapan 1648,06 cm-1 dan vibrasi pada serapan 1648,06 cm-1 menunjukkan

adanya pita kerangka C=C yang dipekuat dengan adanya vibrasi ulur C-O eter

pada 1275,82 cm-1. Sedangkan daerah serapan 880,44 cm-1; 645,14 cm-1; 435,85

cm-1 menunjukkan C-H keluar bidang yang berarti ada benzena tersubstitusi pada

cincin aromatik. Adanya benzena ini memperkuat dugaan bahwa pada isolat hasil

pemisahan dengan KLT preparatif mengandung senyawa flavonoid.

Hasil analisis spektrofotometer FTIR menunjukkan bahwa isolat hasil

pemisahan dengan KLT preparatif mempunyai puncak-puncak spesifik senyawa

flavonoid seperti gugus fungsi –OH, C-H, C=O, C-O, =C-H dan C=C (cincin

benzena).

4.7. Pemanfaatan Belimbing Wuluh dalam Perspektif Islam

Manusia diberikan kesempatan yang luas untuk mengambil manfaat dari

alam semesta, salah satunya dengan memanfaatkan tumbuhan sebagai obat. Allah

berfirman:

öΝs9 uρr& (# ÷ρ t� tƒ $ ‾Ρr& ä−θÝ¡ nΣ u!$ yϑ ø9$# ’n< Î) ÇÚ ö‘F{ $# Ηã� àf ø9 $# ßl Ì� ÷‚ ãΨsù ϵ Î/ %Yæ ö‘y— ã≅ à2ù' s? çµ ÷ΖÏΒ öΝßγßϑ≈ yè ÷Ρ r& öΝåκߦà�Ρr& uρ ( Ÿξ sùr& tβρç� ÅÇ ö7ム∩⊄∠∪

"Dan apakah mereka tidak memperhatikan, bahwasanya Kami menghalau (awan yang mengandung) air ke bumi yang tandus, lalu Kami tumbuhkan dengan air hujan itu tanaman yang daripadanya makan hewan ternak mereka dan mereka sendiri. Maka apakah mereka tidak memperhatikan? ". (Q.S. Al-Sajadah: 27).

Ayat di atas menjelaskan bahwa berbagai tumbuhan diciptakan oleh Allah untuk

kepentingan manusia. Manusia tidak dibenarkan hanya menikmati apa yang

diciptakan oleh Allah tanpa mau berfikir dan berusaha untuk meningkatkan nilai

tambah ciptaan-Nya serta mengembangkannya menjadi suatu ilmu pengetahuan

Belimbing wuluh merupakan salah satu tumbuhan yang dapat

dimanfaatkan sebagai obat. Hal ini telah dibuktikan dengan hasil penelitian

(Latifah, 2008), identifikasi dan uji efektifitas senyawa aktif antibakteri pada

buah belimbing wuluh, hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak kasar buah

belimbing wuluh mampu menghambat pertumbuhan bakteri Staphylococcus

aureus dan E. Coli penyebab diare.

Hasil penelitian isolasi senyawa antibakteri menunjukkan bahwa ekstrak

buah blimbing wuluh mampu menghambat pertumbuhan bakteri Staphylococcus

aureus dengan zona hambat sebesar 3,60 mm, sedangkan untuk bakteri E. Coli

mempunyai zona hambat sebesar 0,92 mm. Efek farmologi dari buah blimbing

wuluh ini kemungkinan disebabkan oleh salah satu atau gabungan beberapa

senyawa kimia yang terkandung di dalamnya seperti: senyawa golongan

flavonoid. Hal ini ditunjukkan oleh terbentuknya warna lembayung pada uji KLT

dan didukung oleh hasil identifikasi FTIR yang menunjukkan adanya gugus

fungsi –OH, C-H, C=O, C-O, =C-H dan C=C (cincin benzena).

Blimbing wuluh mengandung senyawa flavonoid yang banyak

dimanfaatkan sebagai anti karsinogenik, anti alergi, menghambat pertumbuhan

tumor, antimikroba dan sering digunakan untuk pengobatan tradisional (Harborne,

1988), dan juga senyawa triterpenoid yang banyak dimanfaatkan sebagai obat

penyakit diabetes, gangguan menstruasi, patukan ular, gangguan kulit, kerusakan

hati dan malaria serta menunjukkan aktifitas antibakteri atau antivirus (Robinson,

1995).

Pemanfaatan buah belimbing wuluh sebagai obat bukanlah sesuatu yang

melanggar syariat Islam, bahkan hal ini merupakan suatu upaya untuk mengikuti

sunnah Nabi. Kita dianjurkan untuk mengamalkan pengobatan, sesuai sabda

Rasulullah SAW: “Wahai hamba-hamba Allah berobatlah kalian karena tidaklah

Allah Azza wa jalla menimpakan suatu macam penyakit kecuali telah Dia

ciptakan obat untuknya, kecuali satu macam penyakit. ”Mereka bartanya: “Apa

penyakit itu?” jawab Beliau: “Penyakit tua (pikun)”. (HR. Ahmad, Ibnu Majah,

Abu Daud, dan At- Tirmizi).

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1. Kesimpulan

1. Eluen terbaik dari ekstrak buah blimbing wuluh (Averrhoa bilimbi.L) yang

berpotensi sebagai anti bakteri Staphylococcus aureus dan E.coli adalah eluen

metanol-kloroform (1:9).

2. Fraksi aktif yang berpotensi sebagai antibakteri Staphylococcus aureus dan E.

coli pada buah blimbing wuluh (Averrhoa bilimbi. L) diduga adalah senyawa

flavonoid.

5.2 Saran

Perlu adanya penelitian lebih lanjut tentang isolasi menggunakan metode

pemisahan yang lain seperti HPLC dan penentuan struktur senyawa flavonoid dari

buah blimbing wuluh (Averrhoa bilimbi.L) yang efektif sebagai antibakteri

Staphylococcus aureus dan E. coli dengan metode spektroskopi lainnya seperti

MS dan NMR.

LAMPIRAN Lampiran 1. Skema Kerja

1. Diagram Alir Penelitian

Keterangan: - Uji antibakteri menggunakan konsentrasi 450 mg/ml

Isolat-isolat

Ekstrak pekat

Buah Blimbing Wuluh

- diekstraksi dengan metode maserasi - dipekatkan dengan rotary evaporator

- dilakukan KLT Analitik - dilakukan KLT Preparatif

Data

- dilakukan uji antibakteri - diidentifikasi dengan spektrofotometer FTIR

- preparasi sampel - dianalisa kadar air -

Sampel

2. Preparasi Sampel 3. Analisis Kadar Air

5 kg Buah Blimbing Wuluh

- dicuci bersih - diiris tipis - dikeringkan dalam oven pada suhu 37-40 0C - dihaluskan menjadi serbuk

Sampel

Sampel

- dipotong kecil-kecil - dimasukkan ke dalam cawan yang telah diketahui berat konstannya - ditimbang sekitar 5 g - dikeringkan di dalam oven pada suhu 100-105º C selama sekitar 1 jam - didinginkan dalam desikator - ditimbang - dipanaskan kembali dalam oven ± 20 menit - didinginkan dalam desikator dan ditimbang kembali - diulangi perlakuan ini sampai tercapai berat konstan - dihitung kadar airnya menggunakan rumus berikut:

Kadar air = %100)(

)( ×−−

ab

cb

Keterangan: a= berat konstan cawan kosong b= berat cawan + sampel sebelum dikeringkan c= berat konstan cawan + sampel setelah dikeringkan

Faktor koreksi =airkadar%100

100

−

% Kadar air terkoreksi = Kadar air – Faktor koreksi - dilakukan 3 kali pengulangan

Hasil

4. Ekstraksi Buah Blimbing Wuluh dengan Metode Maserasi

50 gr serbuk blimbing wuluh

residu filtrat

Ekstrak pekat

Lapisan klooform Lapisan air

Ekstrak pekat

- direndam dengan pelarut etanol sebanyak 250 ml - dibiarkan pada suhu kamar selama 72 jam - dikocok - disaring

- dipekatkan dengan rotary evaporator

- dipekatkan dengan rotary evaporator - ditentukan nilai rendemen

- diidrolisis dengan HCl 15 % - diekstraksi cair-cair dengan pelarut air:kloroform

(1:1) secara bertahap menggunakan corong pisah sehingga terbentuk dua lapisan

5. Pemisahan Ekstrak Buah Blimbing Wuluh dengan KLT Analitik

6. Pemisahan Ekstrak dengan KLT Preparatif

- dilarutkan dalam etanol - ditotolkan ditepi plat silika gel 2x 10 cm2 pada jarak 1 cm di tepi

bawah - dikeringkan plat dan dielusi sejauh 8 cm dengan fase gerak untuk

flavonoid adalah BAA (4:1:5), BAA (6:1:2), dan metanol-kloroform (1:9), (1:19) dan (1:39), sedangkan triterpenoid adalah n-heksana-etil asetat (1:1), metanol-kloroform (1:10), n-heksana-diklorometana (1:9)

- dikeringkan dan diuapkan dalam amoniak(flavonoid) dan pereaksi Lieberman-Burchard(triterpenoid)

- diamati kromatogram dengan lampu UV

- diamati warnanya dan nodanya

Ekstrak Pekat

Hasil

- dilarutkan dalam etanol - ditotolkan sepanjang plat silika gel 5x 20 cm2 pada jarak 1 cm di

tepi bawah. - dikeringkan plat dan dielusi sejauh 15 cm dengan fase gerak yang

memberikan pemisahan terbaik pada KLT analitik - dikeringkan dan diuapkan dengan amoniak(flavonoid) dan pereaksi

Lieberman-Burchard(triterpenoid) - diamati kromatogram dengan lampu UV - diamati warnanya dan dihitung Rf-nya - dikerok kemudian dilarutkan dalam pelarut etanol - disentrifuge - dipekatkan dengan desikator vakum

Ekstrak pekat

Hasil

7. Penyiapan Media

8. Peremajaan Biakan Murni S.aureus dan E.coli

2 g nutrient agar

Media agar padat miring

- dilarutkan dalam 100 mL akuades - dipanaskan sampai mendidih - dimasukkan dalam 7 tabung reaksi (5 tabung berisi 10 mL untuk uji

antibakteri dan 2 tabung berisi 5 mL untuk peremajaan) dan ditutup dengan kapas

- disterilkan dalam otoklaf pada suhu 121 oC selama 15 menit - diletakkan dalam posisi miring selama 24 jam pada suhu kamar

Biakan murni bakteri

Larutan biakan murni

- digoreskan jarum ose pada media padat agar miring secara aseptis

- tabung reaksi ditutup dengan kapas - diinkubasi pada suhu 25 oC selama 48 jam diambil satu

9. Pembuatan Larutan Bakteri S. Aureus dan bakteri E.coli 10. Uji Efektivitas Antibakteri

- Diambil 1 ose - Dilarutkan masing-masing dalam 10 ml akuades steril

Data hasil pengukuran

Hasil peremajaan biakan murni S. aureus dan E. coli

Media agar padat berisi 10 ml

Hasil

- dipanaskan hingga mencair - didinginkan sampai suhu ± 40 oC - ditambahkan 0,1 mL masing-masing dari larutan bakteri dan

dihomogenkan - dibiarkan hingga memadat

- dipasangi kertas cakram yang telah direndamkan dalam kontrol dan isolat

- diinkubasi pada suhu 25 oC selama masa pertumbuhan optimum masing-masing bakteri

- diamati pertumbuhan bakteri dan diukur diameter zona hambatannya

Media bakteri

11. Identifikasi Senyawa Flavonoid dan Triterpenoid dengan

Spektrofotometer FTIR

Isolat terbaik

- diteteskan pada pellet KBr - dikeringkan - dianalisis dengan spektrofotometer FTIR

Hasil

Lampiran 2. Pembuatan Reagen dan Perhitungan L.2.1. Pembuatan reagen Lieberman-Burchard

Asam sulfat pekat 5 mL

Anhidrida asetat 5 mL

Etanol absolut 50 mL

Cara pembuatannya adalah asam sulfat pekat 5 mL dan anhidrida asetat 5 mL

dicampur ke dalam etanol absolut 50 mL, kemudian didinginkan dalam

lemari pendingin. Penggunaan reagen ini digunakan langsung setelah

pembuatan (Wagner, 2001: 359-364).

L. 2.2. Pembuatan HCl 15 %

M1 x V1 = M2 x V2

37 % x V1 = 15 % x 10 mL

V1 = 4 mL

Cara pembuatannya adalah dipipet larutan HCl pekat 37 % sebanyak 4 mL

kemudian dimasukkan dalam labu ukur 10 mL yang berisi ± 5 mL aquades.

Selanjutnya ditambahkan aquades sampai tanda batas dan dikocok hingga

homogen.

L.2.3. Perhitungan Rendemen Sampel Kering

Rendemen = awalsampelbobot

ingsampelbobot ker x 100 %

= g

g

11000

179 x 100 %

= 1,63 % L.2.4 Perhitungan harga Rf

• Eluen n-butanol : Asam asetat : Air (BAA) (4:1:5)

Harga Rf = pelarutditempuh yangJarak

senyawaditempuh yangJarak

Harga Rf = 8,4

2,9

= 0,34

• Eluen n-butanol : Asam asetat : Air (BAA) (6:1:2)

Harga Rf = pelarutditempuh yangJarak

senyawaditempuh yangJarak

Harga Rf = 8,4

5,8

= 0,69

• Eluen methanol-clorofrm (1:9)

Harga Rf = pelarutditempuh yangJarak

senyawaditempuh yangJarak

Harga Rf = 8,4

3,7

= 0,44

• Eluen methanol-clorofrm (1:19)

Harga Rf = pelarutditempuh yangJarak

senyawaditempuh yangJarak

Harga Rf = 8,4

0,6

= 0,71

• Eluen methanol-clorofrm (1:39)

Harga Rf = pelarutditempuh yangJarak

senyawaditempuh yangJarak

Harga Rf = 8,4

8,0

= 0,09

Lampiran 3. Dokumentasi Penelitian

L.3.1 Gambar irisan buah blimbing wuluh segar dan yang sudah dikeringkan

L.3.2 Gambar buah blimbing wuluh yang sudah di haluskan (sampel)

L.3.3 Gambar maserasi buah blimbing wuluh menggunakan pelarut ethanol

L.3.4 Gambar maserasi dan dishaker

L.3.4 Gambar ekstrak pekat hasil rotary evaporator

L.3.5 Gambar ekstraksi cair-cair menggunakan air:klorofrm

L.3.6 Gambar ekstrak pekat hasil ekstraksi cair-cair

Flavonoid Triterpenoid

L.3.7 Gambar hasil uji kualitatif dengan reagen (uji triterpenoid)

L.3.8 Gambar hasil uji kualitatif dengan reagen (flavonoid)

L.3.9. Gambar hasil KLTA menggunakan eluen campuran yang disinari dengan lampu UV 254 nm

BAA (4:1:5) BAA (6:1:2) M-C (1:9) M-C (1:39) M-C (1:19)

L.3.10. Gambar hasil KLT preparatif menggunakan eluen methanol-clorofrm (1:9) yang disinari dengan lampu UV 254 nm

L.3.11. Gambar hasil uji efektivitas antibakteri dari ekstrak buah blimbing wuluh

- Bakteri stapyloccocus aureus

- Bakteri E. colli

L.3.12 Gambar hasil uji kontrol positif pinicillin terhadap bakteri

Stapylococcus aureus dan streptomycin terhadap bakteri E.cili

L.3.13 Gambar hasil uji kontrol negatif menggunakan ethanol

L.3.14 Gambar Hasil Spektra IR dari Hasil KLT Preparatif