Upload
others
View
15
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
ANALIZA SEKUNDARNIH METABOLITA
Hromatografija na tankom sloju (TLC)
Volatilni sekundarni metaboliti
GC/MS analizom Rt, RI, upoređivanjem spektara
Nevolatilni sekundarni metaboliti
HPLC uz upotrebu različitih detektora
“ukupni” spektrofotometrijski, fluorimetrijski...
2
3
TLC
Sracionarna faza – silika gel, celuloza, Al2O3.....
Mobilna faza - Npr - toluen:etilacetat (97:3) za EO
Detekcija - UV 365 nm i 254 nm
- anisaldehid/sulfatna kiselina
- vanilin/sulfatna kiselina
- jod/škrob
- fosfomolibdenska kiselina
4
TLC
Hromatografirani su slijedeći uzorci navedenim redoslijedom:
1. esencijalno ulje uzorka 2 (dvp)
2. esencijalno ulje uzorka 2 (hd)
3. headspace uzorka 2
4. headspace uzorka 3
5. geraniol
6. nerol
7. linalil acetat
6
Detekcija - Detekcija -
anisaldehid/sulfatna kiselina vanilin /sulfatna kiselina
TLC - HROMATOGRAMI
8
DVODIMENZIONALNA TLC - HROMATOGRAMI
EO-destilacija vodenom parom headspace tehnika
Detekcija - anisaldehid/sulfatna kiselina
Glavni cilj svih hromatografskih metoda je što bolje
razdvajanje komponenata uzorka u što kraćem vremenu.
Da bi se postigao ovaj efekat potrebno je izabrati
odgovarajuću kolonu, (dimenzija, stacionarna faza) i primjeniti
adekvatne hromatografske parametre kako bi se stvorili uslovi
za što niži limit detekcije.
9
Gasna hromatografija omogućava visoku rezoluciju,
analizu spojeva u tragovima
Upotrebljava se u analizi Esencijalnih ulja
Pesticida
Droga
Polutanata
...
10
GASNA HROMATOGRAFIJA (GC)
Kapilarne kolone,
(dužina 25-50 m sa unutrašnjim dijametrom 0.20– 0.32 mm i debljinom filma stacionarne faze od 0.25 mm).
Stacionarna faza može biti
polarna- spojevi se razdvajaju na osnovu njihove polarnosti, što rezultira različitim vremenom zadržavanja komponenata u koloni
nepolarna - dolazi do separacije zbog različitih tačaka ključanja
Esencijalna ulja sastoje od terpena i njihovih derivata koji imaju slične tačke ključanja, eluiraju se u vrlo uskom rasponu na nepolarnim kolonama. Da bi se prevazišao ovaj limit, analitička metoda se modificira primjenom sporijeg rasta temperature u pećnici, kako bi se proširio eluacioni opseg komponenata ulja.
11
GC Osnovni kriterij za identifikaciju kada se koriste detektori koji ne daju
informaciju o strukturi jesu retencioni indeksi. Sistem retencionih indeksa baziran je na činjenici da je svaki analit definisan pozicijom između dva susjedna alkana u homolognom nizu.
Metoda računanja RI bazira se na logaritamskoj jednačini koju je razvio Kovats 1958. godine za izotermalne uslove, kao i na jednačini koju su objavili Van den Dool i Kratz 1963. godine koja nema logaritamsku formu, a uzima u obzir temperaturno programirane uslove.
Zavisno od funkcije f(tR), koriste se različiti RI sistemi:
Logaritamska [f(tR) = log tR`], prema Kovatsu
Linearna [f(tR) = tR], što odgovara prijedlogu van den Doola i Kratza.
1 , ,
, 1 ,
n n R x R n
n
R n tR n
R I R I f t f t
R I
f t f
12
Općenito sistem retencionih indeksa bazira se
na vezi struktura-retenciono vrijeme
(n-alkani i metilni ili etilni esteri masnih kiselina, tj
svaka homologna serija koja predstavlja linearnu
vezu između retencionih vremena i broja
karbonovih atoma)
13
Uz identične uslove se kroz kolonu propušta i smjesa standarda
Komercijalno dostupne serije standarda su definisane
kvalitativno i kvantitativno
14
RI su mnogo korisniji u kombinaciji sa masenom
spektrometrijom, jer ova kombinacija može biti korisna za
identifikaciju izomera, što je teško kada se upotrebljava
samo spektar masa.
16
Npr.
Razlike u strukturi stereoizomera često imaju jako slične
spektre masa pa je upotreba RI neophodna
Korištenjem RI možemo suziti izbor i odbaciti “pogrešne
pozitivne identifikacije”
17
18
20
40
60
80
100
40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240
41
55
69
79
93
107
120
133
147
161
170189
204
Farnesene<(E)-beta->
20
40
60
80
100
40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240
41
55
69
79
93
105
109
120
127
133
147
161
179 189204
Farnesene<(Z)-beta->
(Z) b- Farnesen RI 1440 (E) - b- Farnesen RI 1454
m/z (%) = 41 (100), 55 (24), 69 (96), 79 (25),
93 (54), 105 (10), 109 (7), 120 (22), 127 (1),
133 (26), 147 (5), 161 (21), 179 (1), 189 (2),
204 (4)
m/z (%) = 41 (98), 55 (21), 69 (100), 79
(25), 93 (59), 107 (9), 120 (21), 133 (28),
147 (5), 161 (20), 170 (1), 189 (2), 204 (6)
Brza gasna hromatografija, fast gas chromatography (FGC), koja ima dovoljnu moć razdvajanja u kraćem vremenu, upotrebom adekvatnih kolona i instrumentacije u kombinaciji sa optimiziranim uslovima koji omogućavaju 3-10 puta brže analize. Ova vrsta hromatografije izvodi se u kratkim kolonama 5-10 m, promjera kolone 0.10-0.18 mm, uz hidrogen kao gas nosač, i bržim temperaturnim programom.
S obzirom na brzinu izvođenja analize ovaj vid gasne hromatografije može se podijeliti na
brzu u trajanju 3–12 min,
veoma brza 1–3 min,
ultrabrza manje od 1 min.
19
Najčešće upotrebljavani detektor kod analize volatilnih spojeva
je spektrometar masa
Kombinovani sistem gasna hromatografija/masena
spektrometrija GC/MS, predstavlja najefikasniju tehniku za
separaciju, detekciju i karakterizaciju komponenata u
kompleksnim organskim smjesama.
Spektrometar masa predstavlja osjetljiv i specifičan analitički
instrument, a ujedno i jednu vrstu hemijskog reaktora u kome
se dešava različita razgradnja molekula.
Primjena spektrometrije masa je neophodna pri ispitivanju
strukture supstanci dobijenih sintezom ili izolacijom iz
biljnog materijala,
praćenju metabolizma,
određivanju strukture metabolita.
20
Headspace; 37 komponentata
Esencijalno ulje; 66 komponenata
Satureja montana L.
20
40
60
80
100
40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240
39 51 65
77
91
107
115
121128
135
150
+ +
20
40
60
80
100
40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240
41 5165 77
91
103
119
134
+
10.00 20.00 30.00 40.00 50.00
0.25e6
0.50e6
0.75e6
1.25e6
0.25e6
0.50e6
0.75e6
1.25e6
[SM-HS] TIC #1 [8P07SM] TIC #2
C H3
C H3
CH3
C H3
CH3
C H3
O H
Headspace
Esencijalno ulje
p-cimen
20
40
60
80
100
40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240
41 51 65
77
91
107 115
121
135
150
+
C H3
O H
CH3
C H3
karvakrol
timol
(37.1 %)
(15.5%)
(59.1%)
(20.1%)
21
HPLC
Analiza sekundarnih metabolita koji nisu
volatilni najčešće se izvodi HPLC tehnikom uz
upotrebu odgovarajućih kolona i detektora
To su najčeće
Fenoli
Flavonoidi
Kumarini
Antocijanini ....
23
HPLC
Najčešće korištene kolone pri analizi prirodnih produkata su
kolone obrnutih faza gdje su porozne čestice silika gela
presvučene nepolarnim materijalom, a najčešće korištena
otapala za eluiranje su polarne prirode kao što su voda,
metanol, acetonitril, izopropanol.
Dodatkom mravlje, sirćetne kiseline, trifluoroacetatne kiseline,
amonijum acetata ili fosfatnog pufera u mobilnu fazu moguće
je optimizirati separaciju.
Uobičajeno kolone imaju dijametar 1.0–4.6 mm i dužinu 30–
250 mm, dok veličina čestica stacionarne faze varira od 2–7
mm.
24
HPLC
Čestice u slučaju obrnutih faza su presvučene ugljikovodicima
čija dužina lanca može biti od C4–C18. Separacija na obrnutim
fazama je najefikasnija tehnika za separaciju fenolskih spojeva
i to na C18 stacionarnim fazama.
Razdvajanje je moguće izvršiti u izokratskom i gradijentnom
režimu.
Izokratski režim podrazumjeva ravnomjernu mobilnu fazu tokom
razdvajanja, a separacija je dobra za polarnije spojeve.
Gradijentno eluiranje se bazira na modifikaciji organskog otapala, a
najčešće acetonitrila i metanola tokom analize. Ovakav režim rada je
pogodan kada se fenoli nalaze u širokom rasponu polarnosti. Obično je
potrebno više vremena da se stabilizira kolona i može doći do promjena
na baznoj liniji usljed promjena sastava mobilne faze.
25
HPLC
Mora se voditi računa i o pH vrijednosti mobilne faze, gdje
može doći i do parcijalne disocijacije, što rezultira dodatnim
pikovima, širenju i asimetriji pikova, zbog koeluiranja kisele
forme i baznog konjugovanog oblika.
Najčešće korišten pH otopine za razdvajanje fenolskih spojeva
je 2.5–3, kada se razdvajaju kisele forme, a 5–7, kada se
fenolski spojevi razdvajaju u disociranom obliku.
Detekcija komponenata se vrši upotrebom različitihh detektora
26
Određivanje ukupnih fenola
Folin-Dennis (redukcija smjese fosfovolframatno-fosfomolibdatnog
reagensa u prisustvu fenolskih hidroksilnih grupa tirozina, što rezultira
stvaranjem plavog produkta)
Folin-Ciocalteu (Dodatak litijum sulfata sprječava formiranje
precipitata koji bi interferirali u kvantifikaciji utičući na intenzitet boje
nastalih kompleksa. Folin-Ciocalteu reagens je po hemijskom sastavu
heksavalentni fosfomolibdo/fosfovolframatni kiseli kompleks)
2 2 5 3 3 2
2 2 5 3 3 2
3 1 3 5 1 0
3 1 4 4 1 0
H O P O W O M o O H O
H O P O W O M o O H O
7 6 5M o V I žu t A rO H M o V p la v nm
27
Određivanje ukupnih flavonoida
Taloženje sa formaldehidom + Folin Ciocalteu
Metoda sa AlCl3
O
OO H
OH
O H
O H
O
Glu
Ram
O
OO
OH
O
Glu
Ram
Al
O A l+
O
AlCl3
2+
Rutin
28
Metoda sa 2,4-dinitrofenilhidrazinom
Princip ove metode zasniva se na reakciji aldehida i ketona sa
2,4-dinitrofenilhidrazinom.
Flavoni i izoflavoni sa dvostrukom vezom između C2-C3, ne
daju pozitivnu reakciju, dok flavanoni npr. naringin, naringenin i
hesperetin, formiraju hidrazone čiji je maksimum apsorpcije na
495 nm.
Zbog selektivnosti reakcija flavonoida sa
AlCl3 i 2,4-dinitrofenilhidrazinom, bilo bi dobro određivati
sadržaj specifičnih grupa flavonoida po obje metode, a njihova
suma bi dala realniju vrijednost za sadržaj ukupnih flavonoida.
29
METODE ODREĐIVANJA ANTOCIJANINA
pH - diferencijalna metoda,
bazira se na mjerenju
apsorpcije na jednoj valnoj
dužini, obično između 490-
550 nm, što je daleko od
uobičajene valne dužine na
kojoj se nalazi maksimum
apsorpcije za ostale fenole, a
koji apsorbuju u UV području.
Mjerenje se vrši pri različitom
pH; pri pH 1 su u obliku
obojenih oksonijum soli, dok
pri pH 4.5 su prisutni kao
bezbojni hemiketali
30
VANILINSKI TEST
Ovaj test specifičan je za proantocijanine, flavan-3-ol i
dihidrokalkone koji imaju jednostruku vezu na pozicijama
C2-C3.
O
OH
O
CH3
+
OOH
O H
O H
O H
O H
O
OH
O H
CH 3
OOH
O H O H
O H
O H
O H
O
OH
CH 3
OOH
O H O H
O H
O H
O H
H+
Flavan-3-olvanilin
prelazni spoj crveno obojeni produkt reakcije
31
U zdravom organizmu postoji ravnoteža između nastajanja
slobodnih radikala i antioksidativne odbrane samog organizma
Slobodni radikali nastaju pucanjem veza unutar molekula u
stanicama našeg organizma, pod uticajem različitih faktora, kao
što su: pušenje, izloženost ionizirajućem zračenju, UV zrakama,
zagađenom zraku, kao posljedica metaboličkih procesa te upala
Slobodni radikali u lančanoj reakciji stvaraju nove nestabilne molekule, što
rezultira stvaranjem sve većeg broja slobodnih radikala koji oštećuju
stanice organizma.
ANTIOKSIDATIVNA AKTIVNOST
32
Antioksidansi neutraliziraju slobodne radikale donirajući
im svoj elektron te na taj način prekidaju lančanu
reakciju «krađe» elektrona drugim molekulama,
donirajući im svoj elektron, antioksidansi ne postaju
nestabilni
33
Oksidativni stres predstavlja pretjeran debalans reaktivnih
oksigenovih ili nitrogenovih vrsta, npr. superoksid anion,
hidrogen peroksid, hidroksil radikal ili peroksinitrit, u odnosu na
antioksidativni kapacitet, što vodi oksidaciji različitih
biomolekula, kao što su enzimi, proteini, DNA i lipidi.
Antioksidativni ˝kapacitet˝ označava učinkovitost, snagu,
potencijal i aktivnost neke čiste hemijske supstance da spriječi
oksidaciju neke druge supstance.
ANTIOKSIDATIVNA AKTIVNOST
34
Pro-oksidans je supstanca koja može izazvati oksidativna
oštećenja na različitim biološkim biomakromolekulama kao što
su nukleinske kiseline, lipidi, proteini itd.
Antioksidans je supstanca koja može efikasno reducirati pro-
oksidans, pri čemu kao produkti nastaju supstance koje
nemaju štetno djelovanje.
Antioksidansi se definišu kao spojevi koji mogu odgoditi,
inhibirati ili spriječiti oksidaciju „hvatanjem“ slobodnih radikala
i smanjiti oksidativni stres.
ANTIOKSIDATIVNA AKTIVNOST
35
Određivanje (antioksidativne aktivnosti) AOA
Metode bazirane na prenosu elektrona, eng. Electron Transfer (ET)
Metode bazirane na prenosu atoma hidrogena, eng. Hydrogen Atom
Transfer (HAT)
ANTIOKSIDATIVNA AKTIVNOST
2 3
3 2
/ /
/ /
R O O A H A rO H R O O A H A rO H
A H A rO H H O A A rO H O
R O O H O R O O H H O
/ /R O O A H A rO H R O O H A A rO
36
ANTIOKSIDATIVNA AKTIVNOST
Svaki antioksidans prati različit uticaj koncentracije, pa se
antiradikalska aktivnost definiše kao količina potrebnog
antioksidansa da smanji početnu koncentraciju radikala na
50% ili kao ekvivalenti nekog standarda.
Rezultati se izražavaju kao (inhibiciona koncentracija) IC50,
minimalna koncentracija potrebna da izvrši 50%-tnu
inhibiciju radikala.
37
METODE
Neke od najčešće upotrebljavanih metoda za
određivanje antioksidacijske aktivnosti su;
DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil)
ABTS (2,2'-azino-bis(3-etilbenztiazolin-6-sulfonska kiselina)
ORAC (Oxygen radical absorbance capacity)
RP (Reducing power)
FEROZIN (helatacija)
38
ANTIOKSIDATIVNA AKTIVNOST –
DPPH
Originalna DPPH (2,2-difenilpikrilhidrazil) metoda predstavljena je prije više od 50 godina, kao metoda za mjerenje antioksidativne aktivnosti, podijeljena u dva tipa. ako je poznata hemijska priroda antioksidansa, pa se mogu
testirati specifični spojevi ili grupe,
drugi gdje je moguće posmatrati inhibiciju nekih prirodnih oksidativnih procesa
Da bi se odredila antioksidativna aktivnost specifičnih spojeva ili ekstrakata koji reaguju sa stabilnim DPPH• u metanolnom rastvoru, prati se smanjenje apsorbanse na karakterističnoj valnoj dužini.
Upotreba stabilnog slobodnog radikala DPPH je prvi put
opisana i razvijena 1958. godine ispitivajući kinetičke
parametre reakcije DPPH radikala sa cistein hidrohloridom.
Molekula DPPH je okarakterisana kao stabilni slobodni
radikal sa mogućnošću delokalizacije nesparenog elektrona
preko molekule kao cjeline, tako da molekula ne dimerizira,
kao što bi to bio slučaj kod većine drugih slobodnih
radikala.
U reakciji sa antioksidansom, DPPH radikal se
reducira do odgovarajućeg hidrazina mijenjajući boju
u žutu koja potiče od hromofornih grupa.
ANTIOKSIDATIVNA AKTIVNOST - DPPH
DPPH
(1,1-difenil-2-pikrilhidrazil)
max = 517 nm
IC50
U radikalskoj formi DPPH• apsorbuje
na 517 nm, ali nakon redukcije
antioksidansom ili nekom
radikalskom vrstom apsorpcija na toj
talasnoj dužini nestaje.
Radikal ima ljubičastu boju zbog
nesparenih nitrogenovih elektrona i
nakon reakcije sa antioksidansom
radikal se reducira u DPPH-H formu
koja je žute boje.
42
0 0% / 1 0 0
tA A A A A
ABTS (2,2'-AZINO-BIS(3-ETILBENZTIAZOLIN-6-SULFONSKA KISELINA)
ABTS je prvi put upotrebljen za određivanje antioksidativne aktivnosti 1993.
godine.
Prvostepena reakcija generisanog ABTS radikal katjona sa antioksidantom
rezultira nastankom jednoelektronski oksidiranim produktom antioksidanta. U
zavisnosti od strukture nastalog produkta moguća je dimerizacija
jednoelektronski oksidiranog produkta antioksidanta ili reakcija sa još jednom
molekulom ABTS radikal katjona.
Jako je bitno naglasiti da sličnost mehanizma ABTS radikal katjona sa
antioksidantom i DPPH radikala sa antioksidantom nije potpuna. Predloženi
mehanizam važi samo u slučajevima kada je koncentracija radikal katjona reda
mmol/L. Pored koncentracionog faktora koji determinira mehanizam reakcije, tu
je i uticaj pH medija.
ABTS
Prednosti upotrebe ABTS radikal katjona u određivanju
antioksidativne aktivnosti su njegova topivost u vodi
metoda je jednostavna i ne zahtjeva skupu opremu,
ABTS radikal katjon reaguje brzo sa većinom antioksidanata,
ABTS radikal katjon se može koristiti u velikom rasponu pH,
ABTS je rastvorljiv u vodi i organskim rastvaračima, pri čemu ne utiče na jonsku
silu, omogućujući određivanje antioksidativne aktivnosti hidrofilnih i hidrofobnih
antioksidanata,
ANTIOKSIDATIVNA AKTIVNOST - ABTS
ABTS
(2,2'-azino-bis(3-etilbenztiazolin-6-sulfonska kiselina)
max = 743 nm
S
N
NH4
+ + SO
3
-
C2
H5
N N
N
SSO
3
- + NH
4
+
H5
C2
-e-
+e-
S
N
NH4
+ + SO
3
-
C2
H5
N N
N
SSO
3
- + NH
4
+
H5
C2
ABTS
O
C H3
OH
CH3
C H3
C H3
COOH
Trolox
S
N+
NH4
+ + SO
3
-
C2
H5
N N
N
SSO
3
- + NH
4
+
H5
C2
H O
C H3
O
CH3
C H3
C H3
COOH+
.+ABTS
.+ABTSH
45
0 0% / 1 0 0
tA A A A A
RP (REDUCING POWER)
Određivanje antioksidativne aktivnosti nekih spojeva redukcijom
Fe(III) jona je prvi put opisana 1989. Zasnovana je na redukciji
[Fe(CN)6]3- antioksidantom. Pri tome, antioksidant donira elektron
centralnom metalnom jonu redukujući ga prema reakciji:
Nastali produkt (redukovana forma) apsorbira u vidljivom dijelu
spektra.
Upravo praćenje promjene apsorpcije na 700 nm daje podatke o
sposobnosti antioksidanta da redukuje Fe(III) jon do dvovalentnog
jona koji obrazuje obojeni kompleks stabilizacijom sa Fe(III) jonima.
RP-MO
Redukcija Mo(VI) kao metoda evaluacije antioksidativne aktivnosti prvi put je upotrebljena 1998. godine. Mehanizam reakcije antioksidanta i Mo(VI) jona zasniva se na transferu elektrona, pri čemu se formira Mo(V) jon koji apsorbuje u vidljivom dijelu spektra.
Za razliku od fericijandine metode, nastali produkt Mo(V) jona, je već sam po sebi obojen te nije potrebno dodavati reagens koji će sa istim nagraditi kompleks koji apsorbuje u vidljivom dijelu spektra (695 nm).
Mo(VI) + AH Mo(V) + AH+
FRAP
Ova metoda spada u reakcije u kojima dolazi do prenosa elektrona, gdje se
spoj trovalentnog željeza koristi kao oksidans u reakciji sa 2,4,6-tripiridil-s-
triazinom (TPTZ). Redoks potencijal ove feri soli je ~0.70 V, što je slično
potencijalu ABTS•+ od 0.68 V, tako da nema velike razlike između ove dvije
metode, osim pH vrijednosti koja je neutralna kod ABTS•+ metode, a kisela
kod FRAP.
Pripremanje oksidansa svodi se na reakciju TPTZ u acetatnom puferu sa
FeCl3, nakon reakcije sa antioksidansom mjeri se apsorpcija na 593 nm.
N
N
N
N
N
N
Fe(III)
N
N
N N
N
NN
N
N
N
N
N
Fe(II)
N
N
N N
N
N
-e
+ antioksidans
FRAP
Nedostaci ove metode su u tome tome što se navedeni kompleks formira pri
određenoj pH vrijednosti od 3.6, što je mnogo niže od fizološkog pH,
nedovoljna je osjetljivost na antioksidanse koji imaju –SH grupu, kao npr.
glutation, ograničeno je i mjerenje antioksidacijske sposobnosti u vodenom
mediju.
N
N
N
N
N
N
Fe(III)
N
N
N N
N
NN
N
N
N
N
N
Fe(II)
N
N
N N
N
N
-e
+ antioksidans
FEROZIN
Za razliku od metoda redukcije jona prelaznih metala, metoda helatacije zasniva se
na konkurentskoj reakciji helatacije Fe(II) jona od strane heteroatoma antioksidanta i
bidentatnog liganda ferozina.
Kada molekula helatacijom „zarobi“ neku vrstu koja može producirati reaktivne vrste
(npr. radikale), inhibiran je proces nastajanja istih. Upravo na ovoj pretpostavci
bazirana je ova metoda. Ukoliko molekula koja je predmet istraživanja ima dobre
helatirajuće osobine, okupirat će koordinacionu sferu Fe(II) jona, te tako onemogućiti
ulazak bidentatnog liganda ferozina.
Cjelokupan proces konkurentskih reakcija molekule antioksidanta i ferozina kao
liganda moguće je pratiti spektrofotometrijski, jer kompleks Fe(II) jona sa ferozinom
apsorbuje u vidljivom dijelu spektra sa maksimumom apsorpcije na oko 562 nm.
ORAC
ORAC metoda određivanja antioksidativne aktivnosti prvi put je
opisana 1993. godine. Ova metoda mjeri oksidativnu
degeneraciju molekule koja ima sposobnost fluorescencije
nakon što se miješa sa generatorom slobodnih radikala
(AAPH za ROO˙, sistem Cu2+-H2O2 za OH˙). Ova metoda je jedinstvena
po tome što se ukupni antioksidativni kapacitet određuje nakon
kompletne reakcije oksidacije supstrata.
U mehanističkom pogledu se ORAC metoda klasificira u metode
određivanja antioskidativne aktivnosti bazirane na HAT mehanizmu, što
znači da u presudnom koraku mehanizma reakcije dolazi do transfera
protona sa molekule antioksidanta na slobodni radikal.
ORAC
Ukoliko se u prethodno opisanom sistemu nalazi molekula
antioksidanta koja ima sposobnost doniranja vodikovog atoma,
inhibira se oksidacija fluoresceina redukcijom nastalih radikala
(ROO˙ ili OH˙).
Upravo na principu kompetitivnih rekacija oksidacije FL i
redukcije slobodnog radikala, bazirano je određivanje
antioksidativne aktivnosti ovom metodom. Obično se uz analizu
potencijalnog antioksidanta ispituje i Troloks.
Iz dobivenog kinetičkog profila (kriva ovisnosti relativnog intenziteta
fluorescencije od vremena), integriranjem površine se rezultati
izražavaju u odnosu na Troloks.
ORAC
Kao prednosti ove metode određivanja antioksidativne aktivnosti navodi se prvenstveno prisustvo vještački stvorenih slobodnih radikala (ROO˙i OH˙) u živim sitemima. Ova činjenica omogućuje dobru komparaciju rezultata dobivenih u in vitro ispitivanjima sa stvarnim procesima u živom sistemu. Od ostalih prednosti ove metode pominju se:
Mogućnost ispitivanja hidrofilnih i hidrofobnih potencijalnih antioksidanata,
Mogućnost automatizacije procesa,
Postoji baza podataka za rezultate dobivene ORAC metodom za različite uzorke,
Visoka osjetljivost,
Može se primjeniti na biološke uzorke i uzorke hrane, pa postaje korisna u medicinskoj dijagnostici i terapeutici i dr.
Kao nedostaci ove metode navodi se znatno veći uticaj rastvarača u odnosu na ostale. Također, metoda znatno duže traje u odnosu na ostale.