Visoka poljoprivredno-prehrambena škola strukovnih studija

u Prokuplju

SEMINARSKI RAD

Profesor: Student:

Dr Jelica Zivkovic Milica Marjanović ZB 100/09

Miloš Dimitrijević ZB 101/09

Miloš Grujić ZB 113/09

Prokuplje, Maj, 2012.

Visoka poljoprivredno-prehrambena škola strukovnih studija

u Prokuplju

SEMINARSKI RAD

KULTURA BILJNIH TKIVA

IN VITRO

Profesor: Student:

Dr Jelica Zivkovic Milica Marjanović ZB 100/09

Miloš Dimitrijević ZB 101/09

Miloš Grujić ZB 113/09

Prokuplje, Maj, 2012.

KULTURA BILJNIH TKIVA

IN VITRO

Sadržaj:

1.Uvod……………………………………………………………………………………..1

2.Teorijski deo……………………………………………………………………………..2

2.1.Različiti tipovi biljnih kultura in vitro................................................................2

2.2.Principi gajenja biljaka u kulturi in vitro………………………………………3

2.3.Postavljanje kulture na medijum……………………………………………….5

2.4.Sterilizacija biljnog materijala…………………………………………….……5

2.5.Mikropropagacija u užem i širem smislu…………………………………….....8

2.5.1.Faze mikropropagacije…………………………………………………...9

2.6.Prednosti vegetativnog razmnožavanja u uslovima in vitro..............................12

2.7.Nedostaci vegetativnog razmnožavanja u uslovima in vitro.............................12

2.8.Organogeneza ………………………………………………………………………..13

2.8.1.Indirektna i direktna Organogeneza……………………………...……..13

2.9.Kultura kalusa…………………………………………………………...…….14

2.9.1.Organogeneza iz kalusa –Embriokultura…………………..……………15

2.10.Kultura meristema……………………………………………………………16

3.Zaključak........................................................................................................................17

4.Literatura........................................................................................................................18

1.Uvod

In vitro kultura biljnih ćelija, tkiva i organa je posebna grana biotehnologije biljaka koja

predstavlja skup tehnika za aseptično (sterilno) gajenje i vegetativno razmnožavanje biljaka,

biljnih organa, tkiva i ćelija, u hranljivom medijumu definisanog sastava i pod kontrolisanim

uslovima sredine.

Biljne ćelije i tkiva imaju sposobnost da rastu i da se razvijaju kada se izoluju iz organizma i

gaje na sintetičkoj podlozi.

• Totipotencija - Sposobnost biljnih ćelija da se in vitro dediferenciraju, dele i da

regenerišu pojedine organe, embrione ili celu biljku

• Plastičnost – sposobnost biljke da menja svoj program rasta, razvića i metabolizma, u

zavisnosti od uslova i signala iz spoljašnje sredine.

Kulture se klasifikuju kao kulture haploida, kulture korenova, kulture za mikropropagaciju, in

vitro propagacija, somatska embriogeneza, somaklonalno variranje...

1

2.Teorijski deo

2.1.Različiti tipovi biljnih kultura in vitro

• Prema tipu eksplantata – za pokretanje kulture in vitro se mogu koristiti gotovo svi

delovi biljke tj. različiti eksplantati, počev od embriona, preko delova klijanaca - korena,

kotiledona, epikotila i hipokotila (kod dikotila), odnosno mezokotila i koleoptila (kod

monokotila) i svih delova odrasle biljke, uključujući listove, lisne peteljke i delove cveta.

• Prema nameni, kulture se klasifikuju kao kulture haploida, kulture korenova, kulture za

mikropropagaciju, in vitro propagacija, somatska embriogeneza, somaklonalno variranje...

• Prema tome kakav je rast: organizovan, neorganizovan i mešovit rast. 2

2.2.Principi gajenja biljaka u kulturi in vitro

Gajenje in vitro kultura podrazumeva kontrolu svih relevantnih činilaca (faktora), počev

od izbora eksplantata i uspostavljanja aseptičnih (sterilnih) uslova, preko manipulacie razvića u

kulturi putem definisanja sastava medijuma, prvenstveno balansa hormona, do kontrole

spoljašnjih faktora sredine kao što su svetlost, vlažnost i temperatura.

Kultura in vitro se uvek uspostavlja u aseptičnim uslovima, kako ne bi došlo do razvoja

gljiva i bakterija, koje sprečavaju rastenje i razviće biljaka.

Rad sa in vitro kulturom podrazumeva i neke od vidiva sterilizacije kao što su:

• Sterilizacija autoklaviranjem (na ovaj način se sterilišu medijumi za gajenje biljaka, kao i

posude u kojima se biljke gaje npr. teglice, erlenmajeri, boce, tegle, epruvete, petri

kutije,...)

• Sterilizacija iskuvavanjem ( na ovaj način najčešće se sterilišu instrumenti za rad koji su

neophodni pri manipulativnim tehnikama u laminaru)

• Sterilizacija biljnog materijala ( koja je još označena i kao dezinfestacija). Za ovu

sterilizaciju se najčešće koristi razblažena NaClO (varikina ili domestos).

• Sterilizacija filtriranjem, gde se pomoću specijalnih filter papira vrši sterilizacija

nestabilnih jedinjenja kao što je npr. ABA, GA3, antibiotici ili neki vitamini. Ove

komponente se naknadno dodaju u prohlađeni medijum.

Medijumi za gajenje biljaka mogu biti čvrsti, polučvrsti ili tečni.

Za većinu kultura optimalan pH podloge je 5.8 ± 0.2. Tečni medijum za razliku od

čvrstog ne sadrži agar. Vrlo bitna komponenta svakog medijuma jesu i makro i mikro soli, kao i

vitamini.

3

Metoda kulture tkiva i biljnih stanica “in vitro”, koristi se za vegetativno razmnožavanje

brojnih biljnih vrsta, posebno onih koje stvaraju malu količinu semena, čije seme ima slabu

klijavost ili onih koje se teško razmnožavaju vegetativnim putem. Orhideje je moguće razmnožiti

jedino na ovaj način (iz semena). One stvaraju velike količine semena ali u prirodi njihovo seme

može klijati samo u simbiozi s gljivama. Simbioza im je potrebna zbog toga, što seme orhideja

nema ili ima vrlo mali endosperm te pomoću gljiva dobijaju hranjiva potrebna za klijanje. In vitro

metodom im hranljiva podloga može nadoknaditi potebne hranjive stvari.

Ovom tehnologijom razmnožavanju se razne ukrasne biljke poput gerbera, ruža, ukrasnog

drveća i grmlja, sobnog i akvarijskog bilja i voćaka, a može služiti i za dobivanje nekih

kompleksnih spojeva, koje je teško i skupo dobiti kemijskim putem.

4

2.3.Postavljanje kulture na medijum

Prema vrsti upotrijebljenog materijala, odnosno segmenta biljnog tkiva za regeneraciju,

danas  je prihvaćena podela kulture biljnih tkiva na pet grupa:

kultura ćelija

kultura kalusa

kultura meristema

kultura organa

kultura protoplasta

Svi ovi tipovi kulture biljnih tkiva izvode se na relativno maloj površini, gde se uslovi

sredine optimiziraju u odnosu na fizičke, hranidbene i hormonalne činioce i gde se isključuju svi

mikroorganizmi (gljivice, bakterije, virusi) kao i druge štetočine (insekti i nematode).

2.4.Sterilizacija biljnog materijala

Kada se izabere početni biljni materijal pristupa se pripremi za dalji rad. Najpre treba

izvršiti sterilizaciju i izolaciju, a potom inokulaciju i subkulturu tj. dalje razmnožavanje. Za

uspešan rad veoma je bitno da biljni materijal pre njegove izolacije in vitro bude dobro sterilisan.

Pre početka sterilizacije svaki ostatak pre ostalog zemljišta ili mrtvih delova biljke treba ukloniti.

Ako je spoljašnja kontaminacija vrlo uočljiva i velika najbolje je da se delovi biljaka speru u

vodi. U određenim slučajevima može se vršiti i ljuštenje ili guljenje pojedinih delova biljke, što

nije dobro jer ono dovodi do gubitka najvećeg dela spoljašnjih slojeva kao npr. pokožice i dr.

Nakon toga vrši se sterilizacija na sledeći način. Biljni organ se prvo potapa u 70%

alkohol u toku nekoliko sekundi da se odstrane mehurići vazduha čime se osigurava

da sterilzovana tečnost ima veći pristup biljnom materijalu. Potapanje se ne vrši u 96% alkoholu

jer je on suviše jak i izaziva izuzetno veliku dehidrataciju. Sterilizacija se nastavlja 10-30’ u 1%

natrijum hipohloritu (NaClO) kome se dodaje nekoliko kapi Tween-a 20 ili 80. Dodavanjem

Tween-a (vlažećeg agensa) smanjuje se površinska tenzija, čime se dopušta jači površinski

kontakt. Posle ovoga vrši se ispiranje u vodi sa česme obično tri puta u toku 2,5 odnosno 15’.

5

Ako su biljke osetljive na beljenje onda se umesto Na-hipohlorita može koristiti Ca-hipohlorit,

koji u biljna tkiva ulazi sporije. Jedna od mana Ca-hipohlorita je to što se može čuvatis samo

ograničeno vreme jer je higroskopan. Izbor vremena sterilizacije i koncentracije belila zavisi

prvenstveno od toga da li površinski slojevi koji se sterilišu treba da ostanu (blaga sterilizacija) ili

treba da budu sasečeni pre inokulacije (jaka sterilizacija). Ponekad je moguće da se sterilizacija

postigne samo pet minuta posle tretiranja na Na-hipohloritom, a u drugim slučajevima potrebno

je i 30’.

Duža sterilizacija može imati štetne uticaje na eksplantat, pa pravilno određivanje vremena

ikoncentracije beljenja treba podesiti za svaki pojedinačni materijal.

Uprkos dobroj hemijskoj sterilizaciji početnog biljnog materijala do infekcije može doći i kasnije, a

uzroci za to su:

tzv. unutrašnje infekcije. One mogu biti veoma ozbiljan problem, jer su prouzrokovane

mikroorganizmima koji su u samoj biljci i ne mogu se eliminisati spoljnom sterilizacijom.

U principu  postoje dva načina za savladavanje ovog problema:

kultura meristema (većina mikroorganizama ne naseljava meristem), ili

dodavanje antibiotika hranljivoj  podlozi.

Pošto je kultura meristema veomasložena a dodavanje antibiotika podlogama u najvećem

broju slučajeva neefikasno (može usporiti rast biljke i voditi selekciji otpornog mikroorganizma),

najbolje je rešenje da se koriste interno sterilne biljke.

neprecizan rad (neoprane ruke, nesterilisana površina stola, nesterilisane pincete ili

skalpeli,nedovoljno sterilisane čaše, papir ili hranljiva podloga itd.). Upotreba maski

preko lica, pokrivanjekose i upotreba sterilnih rukavica mogu doprineti smanjenju broja

infekcija.

neispravna laminarna komora. Treba da se kontroliše svake godine od strane proizvođača,

ačeoni filtri da se povremeno obnavljaju.

zaprljan alkohol u koji se umaču instrumenti pred opaljivanje, tako da ga treba obnavljati

u pravilnim intervalima.

nesterilni kontejneri po spoljnjoj površini, u kojima se nalaze hranljive podloge.

6

prljavi podovi koji se ne peru redovno i ne vrše dezinfekciju. Kada se ulazi u

inokulacionu prostoriju preko cipela treba imati plastični pokrivač ili stopala treba da se

potope u sterilišuću tečnost. U inokilacionu prostoriju ne treba puštati ni mnogo

nepotrebnih posjetilaca.

insekti (grinje) koje prenose naročito gljivične infekcije, a koji se javljaju ako se

prostorija u kojoj se vrši kultura tkiva ne održava čisto. Pošto ovi prenosioci mogu lako

proći kroz pamučne zatvarače i plastični film, ozbiljnost ovog načina infekcije ne sme se

zanemariti.

nesterilna prostorija u kojoj je laminarna komora. Ovo se može izbeći uduvavanjem

sterilnog vazduha i izračivanjem UV svetlom u toku noći.

infekcije koje se često događaju prilikom izolovanja vrhova biljnih izdanaka, jer se oni

teško sterilišu. Da bi se ovo izbeglo izdanci se često sterilišu postupno tj. u više faza.

Izdanak se najprije opere, speriliše, ukloni nekoliko listova, ponovo steriliše itd. Šanse za

infekciju vrhova izdanaka su manje ako se oni izoluju dok su mali.

7

2.5.Mikropropagacija u užem i širem smislu

Sl. Mikropropagacija u užem i širem smislu

1а -sakupljanje bočnih I vršnih pupoljaka;

2а – uvođenje pupoljaka u kulturu;

3а -rast izdanaka;

4а – multiplikacija izdanaka;

6 – ožiljavanje izdanaka;

7 – adaptacija u staklari.

Desno su osnovni koraci razmnožavanja in vitro putem regeneracije izdanka iz kalusa:

1б- izolovanje delova listova i stabla kao primarnih eksplantata;

2б – uvođenje eksplantata u kulturu;

3б – indukcija kalusa na eksplantatima;

4б – kultura nediferenciranih kalusa;

5б- indukcija izdanaka u kalusu;

6– ožiljavanje izdanaka;

7– adaptacija u staklari.

8

2.5.1.Faze mikropropagacije:

Postoje četiri osnovne faze mikropropagacije:

Faza I – uspostavljanje eksplantata u kulturi

Faza II – umnožavanje

Faza III – regeneracija korena

Faza IV – aklimatizacija

Faza I

U fazi I se prethodno sterilisani i obrađeni pupoljci uvode u kulturu. Nakon sterilizacije

I ispiranja može se započeti izolacija tj. sečenje biljnih komadića u sterilnim uslovima (laminarna

komora) i uz upotrebu sterilnih instrumenata. Eksplantati se pažljivo prihvataju pincetom i

prenose na hranljivu podlogu razlivenu u malim epruvetama. Smeštaj ovih primarnih eksplantata

je pojedinačan, odnosno u jednu epruveticu se stavlja jedan pupoljak. U ovoj fazi eksplantati se

mogu razvijati bilo u pojedinačne izdanke ili u masu umnoženih izdanaka, pa čak i u ožiljene

biljke. Prva dva slučaja se koriste u mikropropagaciji dok se u trećem slučaju, regeneraciji u

jednom koraku, obično daje prednost pri stvaranju bezvirusnih biljaka putem kulture meristema.

Rastenje apikalnog meristema odnosno rastenje i grananje izdanaka uslovljeno je odgovarajućim

odnosom auksina i citokinina u hranljivoj podlozi. Koncentracije regulatora rasta zavise od biljne

vrste koja se gaji, od faze u kojoj se biljke nalaze i drugih činilaca. Kod masline se odseče vršni

deo grančice dužine oko 20 cm. Odstrane se listovi sa delom peteljke. Eksplantati su delovi

vršnih grančica dužine 1,5 – 2 cm sa vršnim ili bočnim pupoljcima koji se pre postavljanja na

hranljivu podlogu sterilišu 70% etanolom ili Na hipohloritu. Eksplantati tkiva se ne smeju

direktno dotaći rukom već pincetom ili drugim priborom koji je prethodno sterilisan potapanjem

u 96% alkohol, a potom opaljivanjem tj. provlačenjem kroz plamen. Eksplantati u principu mogu

biti isecani na dva načina: na staklenoj ploči (podlozi) sterilsanoj sa 96% alkoholom (ovde se kao

problem javlja brzo tupljenje noževa), ili između sterilnog filter papira (noževi ostaju duže oštri).

Veoma je lako raditi sa dva tabaka filter papira: jedan se koristi u isecanju eksplantata (redovno

se zamenjuje), a jedan za postavljanje sterilnih instrumenata (na njemu ili između).

9

Kada se eksplantat postavi pomoću sterilnih pinceta na filter papir ili staklenu ploču pristupa

se sečenju. Ako su površine sečenja bile u dodiru sa belilom, ovi delovi se uklanjaju pomoću

sterilisanog skalpera. Sterilisana semena (ako ne treba izolovati klicu) mogu se direktno

inokulisati bez ikakvog dodatnog tretmana.

Faza II – Umnožavanje

 

Glavni cilj ove faze je da se proizvede maksimalan broj jedinica za umnožavanje. Kada se

apikalni meristem organizuje u lisnu rozetu ili izduženi izdanak subkultivira se na hranljivu

podlogu za umnožavanje. Iz aksilarnih pupoljaka lisne rozete formiraju se novi izdanci. Od

formiranog izduženog izdanka izoluju se nodalni segmenti i gaje na podlozi za umnožavanje.

Stopa umnožavanja u ovoj fazi je različita za različite biljne vrste i sa svakom narednom

subkulturom broj aksilarnih izdanaka se povećava logaritamski. Tako se u toku godine broj

izdanaka može povećati do milionskih cifara.

 U fazi umnožavanja citokinin se koristi da bi se savladala apikalna dominacija izdanaka i da bi

se povećalo grananje lateralnih pupoljaka iz lisnih pazuha. Tokom 4-8-12 nedelja prati se rastenje

kulture u epruvetama I vrši umnožavanje. U fazi umnožavanja, materijal dobijen postavljanjem

kulture se presađuje na svežu hranljivu podlogu onoliko puta koliko je potrebno da bi se dobio

željeni broj izdanaka.

Faza III- Regeneracija korena

Cilj ove faze je regeneracija adventivnih korenova iz izdanaka dobijenih u fazi II ili u

nekim slučajevima u fazi I i formiranje kompletnih biljaka. Obično in vitro dobijeni izdanci od

10 mm ili duži se seku i koriste za ožiljavanje. Za ožiljavanje izdanaka ne mora uvek da se

primenjuje in vitro metoda. Umesto rastvora auksina koji se koriste in vitro mogu se koristiti I

komercijalno pripremljeni hormoni za ožiljavanje potapanjem ili uranjanjem osnove izdanka pre

sadnje. Postoje tri faze uključene u rizogenezu: a) indukcija, b) inicijacija i c) elongacija korjena.

S obzirom da je teško izdvojiti fazu indukcije u mnogim eksperimentima ova faza se uključuje u

fazu inicijacije. Odavno je poznato da inicijacija korena zavisi od odnosa visoke koncentracije

auksina i niske koncentracije citokinina. Pošto u izdancima iz faze II ima dosta rezidualnih 10

citokinina potrebno je malo ili uopšte nije potrebno dodati citokinin u medijum faze III. Negde je

dovoljno redukovati samo citokinine ili pak sve hormone, a negde je ta redukcija radikalnija i ide

do smanjenja i mikro- i makroelemenata. Nasuprot citokininima, auksini su esencijalni za

inicijaciju korena. Najčešće se koriste auksini kao što su NAA, 1BA, IAA i 2,4-D. Kod mnogih

vrsta auksin nije potrebno dodavati u medijum faze III, jer su mladi izdanci bogati auksinom.

Kada je koncentracija auksina suviše visoka, u bazalnom delu izdanka formira se kalus

koji inhibira normalan razvoj korena. Visoka koncentracija auksina inhibira elongaciju korena.

Da bi se ovo izbeglo, izdanci se prvo gaje na podlozi sa auksinom 4-8 dana da bi se inicirao

koren a zatim subkultivišu na podlogu bez auksina da bi on porastao.

U literaturi postoje različita mišljenja u vezi uticaja giberelina na ožiljavanje I njihove upotrebe u

ovoj fazi, ali se može reći da se oni veoma retko koriste za ožiljavanje izdanaka. Ožiljavanje traje

u proseku 4 nedjelje s tim što se inicijale korenova zapažaju 4-14 dana nakon postavljanja na

podlogu za ožiljavanje. Brzina rasta i eventualno grananje korenova su varijabilni i zavise od

same biljne vrste kao i od metodike i uslova ožiljavanja.

Faza IV – Aklimatizacija

 Nakon ožiljavanja, in vitro regenerisane biljke se prenose iz aseptičnih kontejnera u saksijeradi

aklimatizacije. Pre same sadnje u staklari korenov sistem se vodom ispira od zaostalih čestica

agara, a cela biljka se potapa u rastvor nekog fungicida na bazi kaptana. Faktori koji utiču na

presađivanje su infekcija i desikacija. Ozbiljni problemi infekcije mogu se eliminisati

sterilizacijom zemljišne mešavine, a da bi se novo presađene biljke adaptirale na spoljne uslove

potreban je period humidne aklimatizacije, zato što je odmah nakon presađivanja ustanovljen

preterano visok gubitak vode iz listova biljaka. Visok nivo gubitka vode pripisuje se redukovanoj

količini epikutikulamog voska, visokom volumenu intercelularnih prostora u mezofilu I

usporenoj reakciji stoma na vodni stres. Tokom aklimatizacije, vlažnost se postepeno redukuje u

periodu od 2-3 nedelje. U međuvremenu, biljke podležu morfološkim i fiziološkim adaptacijama

koje im omogućuju da razviju normalan vodni režim.

11

2.6.Prednosti vegetativnog razmnožavanja u uslovima in vitro

1. In vitro razmnožavanje mnogo je brže od in vivo razmnožavanja

2. Moguće je umnožiti i one biljke koje nije moguće umnožiti u in vivo uslovima

3. Mikroklonirane biljke često rastu bolje i brže od biljaka koje rastu u in vivo uslovima

(oslobođene su od patogena i infekcija bakterijama i gljivama)

4. U in vitro kulturi se razmnožavaju samo zdrave biljke

5. Vegetativno razmnožavanje u in vitro uslovima može početi sa vrlo malo biljnog materijala

kao početnog eksplantata

6. Zahvaljujući kontrolisanim uslovima moguće je predvideti vremenski proizvodnju određenih

kultura

7. Veliki značaj ovaj vid razmnožavanja našao je u ex situ zaštiti ugroženih i retkih biljnih vrsta

(npr. Nepeta rtanjensis)

2.7.Nedostaci vegetativnog razmnožavanja u uslovima in vitro

1. U nekim kulturama koje se razmnožavaju na ovaj način genetička stabilnost je niska

2. Kod drvenastih vrsta teško je uspostaviti formiranje korenovog sistema in vitro

3. Prenos biljaka iz uslova in vitro u uslove in vivo nekada je jako težak i mukotrpan posao

4. Regenerativna sposobnost se može izgubiti nakon nekoliko subkultura kalusnog tkiva

5. U nekim slučajevima sterilizacija eksplantata koji se uvode u kulturu in vitro je izuzetno teška

12

2.8.Organogeneza

Organogeneza u najosnovnijem obliku značenja predstavlja proces obrazovanja jedinki.

U in vitro uslovima kontrolisanje organogeneze se vrši dodavanjem određenih komponenti, a

najbitnije među komponentama jesu FITOHORMONI.Skoog i Miller hipoteza (1957)

-Balans citokinina i auksina reguliše organogenezu kalusa. Ova hipoteza govori o odnosu

koncentracija auksina i citokinina u hranljivom medijumu i kako zapravo date koncentracije utiču

na morfogenezu u uslovima in vitro.

Dokazi Milerove hipoteze:

• Ako se kalusno tkivo prenese na hranljivu podlogu koja sadrži veću koncentraciju

auksina negocitokinina, pojaviće se korjenovi.

• Ako je koncentracija citokinina veća od koncentracije auksina, pojaviće se pupoljci.

2.8.1.Indirektna i direktna Organogeneza

Indirektna Organogeneza je proces u kome se pupoljci regenerišu iz ćelija kalusa.

Eksplantat indukuje nediferenciranu masu kalusnog tkiva, u kojoj se javljaju meristemski centri,

ili meristemoidi. Meristemoid se sastoji iz grupe ćelija I predstavlja inicijalni centar koji se lako

uočava, jer se udaljavanjem od njega u ćelijama značajno smanjuje mitotski indeks. Meristemoidi

postaju ili centri za proliferaciju kalusnog tkiva, ili se transformišu u nodule iz kojih će se javiti

apikalni meristemi ili korenske primordije. Direktna Organogeneza (a-d) posle faze indukcije

nema fazu proliferacije ćelije kalusa. Direktno na eksplantatu dolazi do regeneracije pupoljaka iz

epidermalnih ili subepidermalnih ćelija.

13

2.9.Kultura kalusa

Kultura tkiva odnosno kultura kalusa  je tehnika kojom se tkivo može održavati u

nediferenciranom stanju neograničeno dugo. Kalus je neorganizovana masa diferenciranih biljnih

ćelija. On može nastatii nakon povrede nekog biljnog organa kao što je stablo ili koren. Kultura

kalusa se može dobiti iz bilo kog vegetativnog tkiva dediferencijacijom, tako da kalusna tkiva

najčešće nisu fotosintetička. Kalusi se često gaje u mraku jer svetlost može podstaći

diferencijaciju. Kalusi se, generalno, mogu podeliti na dva tipa: kompaktne i rastresite.

Najveći značaj kalusa je u tome što ima sposobnost da se iz njega začne pupoljak, koren ili embrion.

Inicijacija i rast kalusa zavisi od biljne vrste (genotipa), vrste i koncentracije hormona i

nekihorganskih supstanci kao i od uslova kulture. Prilikom inokulacije podloge bitno je da

inokulum ne bude isuviše mali, jer je tada i slab rast kalusa. Najbolja veličina inokuluma je 5-

10mm u prećniku ili 20-100 mg. Znatno je lakše raditi subkulturu sa kompaktnim kalusom, jer se

on lako seče na manje dolove, dok se rastresit kalus raspada i mora se direktno prebaciti na novu

podlogu.

14

2.9.1.Organogeneza iz kalusa -Embriokultura

Embriokultura je postupak gajenja embriona ili njegovih pojedinih delova na veštačkoj

hranljivoj podlozi pod aseptičnim uslovima. Ova metoda se može primeniti u svim onim situacijama

kada dođe do oplodnje ali embrion počne da degeneriše tj. abortira u određenom stadijumu

razvitka pre pune zrelosti. Degeneracija embriona nastupa zbog:

- nesposobnosti endosperma da odigra svoju normalnu ulogu u snabdevanju embriona hranivima,

- zbog antagonizma materinskog tkiva prema embrionu.

Embrion obično abortira 5 do 35 dana nakon oplodnje, što najčešće zavisi od vrsta koje se

međusobno ukrštaju.

U principu postoje dve vrste embriokulture: kultura nezrelih embriona poreklom iz nedozrelih

semena i kultura zrelih embriona poreklom iz zrelih semena.

- kultura nezrelih embriona uglavnom se koristi da bi se izbegla rana smrt klice (abortus), sa

ciljem da se razvije normalna biljka. Ovaj tip kulture je izuzetno težak ne samo zbog zamorne

disekcije klice već i zato što je neophodna složena hranljiva podloga.

- kultura zrelih embriona je relativno laka i koristi se da bi se eliminisala apsolutna inhibicija

klijanja semena. Za ovaj tip kulture u većini slučajeva dovoljno je korišćenje jednostavne

hranljive podloge sa agarom, šećerom i mineralima.

  Mehanizam embriokulture

Kada se pripremi odgovarajuća hranljiva podloga pristupa se njenom razlivanju u epruvete do

visine od 2-3 cm. Zatim se epruvete zatvore zapušačima i stave u autoklav radi sterilizacije u

vremenu 20-35’, a pod pritiskom 1,5-2,0 atm i temperature od 100ºC.

15

Sl. Organogeza iz kalusa

2.10.Kultura meristema

Eliminacija virusnih oboljenja kulturom meristema je jedna od mnogih interesantnih

primena kulture tkiva.

U suštini postoje dva tipa meristemskog eksplantata:

 - apikalni meristem izdanka - nediferencirano tkivo, locirano unutar apeksa izdanka, koji se

pojavljuje kao sjajna pupolika struktura distalno u odnosu na najmlađu lisnu primordiju, veličine

manje od 0,1 mm u dužini.

 - apeks izdanka - struktura koja se sastoji od apikalnog meristema izdanka i jedne do nekoliko

lisnihprimordija, obično veličine od 0,1-1 mm u dužinu. U slučaju da je u apeks uključeno više

odraslih listova struktura može iznositi i do nekoliko centimetara u dužini. Ako se koristi

eksplantat veći od 0,1 mmdužine šanse za rast i razvoj u kulturi in vitro su veće. Lokacija

meristema. Kod biljaka su razlikuju meristemi koji se nalaze u vršnim I aksilarnim pupoljcima.

Eksplantati uzeti sa vrha izdanka nalaze se u mlađem razvojnom stadijumu nego oni iz bazalnog

dela. Za regeneraciju izdanka optimalan je mlađi razvojni stadijum eksplantata.

Terminalni pupoljci imaju  jači potencijal rasta nego lateralni. Zato je, kod većine biljnih vrsta,

bolje koristiti terminalne eksplantate. Ukoliko ima samo jedan terminalni pupoljak po izdanku,

mogu se koristiti i aksilarni.

16

3.Zaključak

Gajenje in vitro kultura podrazumeva kontrolu svih relevantnih činilaca (faktora), počev

od izbora eksplantata i uspostavljanja aseptičnih (sterilnih) uslova, preko manipulacie razvića u

kulturi putem definisanja sastava medijuma, prvenstveno balansa hormona, do kontrole

spoljašnjih faktora sredine kao što su svetlost, vlažnost i temperatura.

Prema tipu eksplantata – za pokretanje kulture in vitro se mogu koristiti gotovo svi delovi

biljke tj. različiti eksplantati, počev od embriona, preko delova klijanaca - korena, kotiledona,

epikotila i hipokotila (kod dikotila), odnosno mezokotila i koleoptila (kod monokotila) i svih

delova odrasle biljke, uključujući listove, lisne peteljke i delove cveta.

17

4.Literatura

-www.wikipedija.org

18