8/3/2019 J.F. Cassell & Elspeth M. McLachlan- Muscarinic agonists block five different potassium conductances in guinea-pig s

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B r . J . P h a r m a c . ( 1 9 8 7 ) , 9 1 , 2 5 9 - 2 6 1

M u s c a r i n i c a g o n i s t s b l o c k f i v e d i f f e r e n t p o t a s s i u mc o n d u c t a n c e s i n g u i n e a - p i g s y m p a t h e t i c neuronesJ . F . C a s s e l l & ' E l s p e t h M. M c L a c h l a nB a k e r M e d i c a l R e s e a r c h I n s t i t u t e , C o m m e r c i a l R o a d , P r a h r a n , V i c . 3 1 8 1 , A u s t r a l i a

M u s c a r i n i c e x c i t a t i o n o f s y m p a t h e t i c g a n g l i o n c e l l s h a s u s u a l l y b e e n t h o u g h t t o r e s u l t f r o m i n h i b i t i o no f an o u t w a r d K+ c u r r e n t , t h e Mc u r r e n t , a l t h o u g h i n o t h e r neurones s e v e r a l c o n d u c t a n c e s h a v e b e e ns h o w n t o b e b l o c k e d b y m u s c a r i n i c a g o n i s t s . We r e p o r t t h a t , as w e l l as r e s t i n g K+ c o n d u c t a n c e , a l l o ff o u r d i f f e r e n t K+ c o n d u c t a n c e s , two v o l t a g e - d e p e n d e n t (M c u r r e n t s a n d A c u r r e n t s ) a n d two c a l c i u m -d e p e n d e n t ( r e s p o n s i b l e f o r s l o w a n d very s l o w a f t e r h y p e r p o l a r i z a t i o n s ) , p r e s e n t i n d i f f e r e n t s u b - t y p e so f g u i n e a - p i g s y m p a t h e t i c neurones, are i n h i b i t e d b y t h e m u s c a r i n i c a g o n i s t s , b e t h a n e c h o l a n dm u s c a r i n e . A l l o f t h e s e e f f e c t s i n c r e a s e neurone e x c i t a b i l i t y a n d can l e a d t o r e p e t i t i v e d i s c h a r g e .

I n t r o d u c t i o n M a m m a l i a n s y m p a t h e t i c g a n g l i o n c e l l se x h i b i t p r o l o n g e d r e s p o n s e s t o a c e t y l c h o l i n e ( A C h )t h a t a r e i n s e n s i t i v e t o ( + ) - t u b o c u r a r i n e , b u t s e n s i t i v et o a t r o p i n e ( e . g . K o b a y a s h i & L i b e t , 1 9 7 0 ) . AChr e l e a s e d n a t u r a l l y ( e . g . b y r e f l e x e s f r o m c h e m o r e c e p -t o r s , J i n i g e t a l . , 1 9 8 3 ) c a n a c t i v a t e m u s c a r i n i cr e c e p t o r s , e v o k i n g d i s c h a r g e s i n s o m e p o s t g a n g l i o n i cn e u r o n e s . We p r e s e n t e v i d e n c e t h a t e x c i t a t i o np r o d u c e d b y m u s c a r i n i c a g o n i s t s i n t h r e e d i f f e r e n ts u b - t y p e s o f g u i n e a - p i g s y m p a t h e t i c g a n g l i o n c e l lo c c u r s b y b l o c k a d e o f f i v e d i f f e r e n t K+ c o n d u c t a n c e s .M e t h o d s P a r a v e r t e b r a l g a n g l i a L 4 - L 6 , d i s t a l l o b e so f i n f e r i o r m e s e n t e r i c g a n g l i a ( I M G ) o r c o e l i a c g a n g l i aw e r e d i s s e c t e d f r o m y o u n g g u i n e a - p i g s ( 1 8 0 - 2 5 0 g ) ,a n d i n t r a c e l l u l a r r e c o r d i n g s m a d e i n v i t r o a s d e s c r i b e di n d e t a i l p r e v i o u s l y ( C a s s e l l e t a l . , 1 9 8 6 ) . T e t r o d o t o x i na n d t e t r a e t h y l a m m o n i u m ( T E A ) w e r e n o t u s e d , s ot h a t s u p r a t h r e s h o l d d e p o l a r i z a t i o n s i n v o l t a g e c l a m -p e d c e l l s i n i t i a t e d b r i e f ' a c t i o n c u r r e n t s ' c o r r e s p o n d i n gt o u n c o n t r o l l e d a c t i o n p o t e n t i a l s ( s e e C a s s e l l e t a l . ,1 9 8 6 ) . S o l u t i o n s c o n t a i n i n g m u s c a r i n e ( 1 O 0 M , S i g m a )o r b e t h a n e c h o l ( 1 0 - 1 0 0 t M , S i g m a ) w e r e n o r m a l l y l e f ti n c o n t a c t w i t h t h e p r e p a r a t i o n f o r a t l e a s t 1 5 m i n .L o w e r c o n c e n t r a t i o n s p r o d u c e d b a r e l y d e t e c t a b l ee f f e c t s .R e s u l t s I n a l l n e u r o n e s , t h e f i r s t e f f e c t o f t h e d r u g sw a s a d e c r e a s e i n t h e amount o f i n j e c t e d c u r r e n tn e e d e d t o i n i t i a t e a n a c t i o n p o t e n t i a l , a c c o m p a n i e d b y' A u t h o r f o r c o r r e s p o n d e n c e a t : S c h o o l o f P h y s i o l o g y &P h a r m a c o l o g y , U n i v e r s i t y o f New S o u t h W a l e s , K e n s i n g t o n ,NSW 2 0 3 3 , A u s t r a l i a .

a n i n c r e a s e i n c e l l i n p u t r e s i s t a n c e . T h e n , o v e r a f e wm i n u t e s , t h e m e m b r a n e d e p o l a r i z e d ( 1 - 1 8 mV) a n do f t e n a c t i o n p o t e n t i a l s w e r e i n i t i a t e d s p o n t a n e o u s l y .T h e n e u r o n e s w e r e t h e n r e p o l a r i z e d a n d m a i n t a i n e d a tt h e i r o r i g i n a l r e s t i n g p o t e n t i a l s (-57 - 6 8 mV) b yp a s s i n g s t e a d y c u r r e n t ( 0 . 0 1 - 0 . 2 5 n A ) . U n d e r t h e s ec o n d i t i o n s , c e l l r e s i s t a n c e t e n d e d t o r e t u r n t o w a r d sc o n t r o l v a l u e s . A l l e f f e c t s o f a g o n i s t s w e r e c o m p l e t e l yr e v e r s e d i n c o n t r o l s o l u t i o n w i t h i n 1 0 m i n . B e t h a n e -c h o l w a s a p p l i e d to>4 c e l l s o f e a c h t y p e , a n dm u s c a r i n e > l . A t r o p i n e ( O . 1 I M) c o m p l e t e l y a b o l i -s h e d a l l d r u g e f f e c t s w i t h o u t d e t e c t a b l e d i r e c t a c t i o n s .R e s t i n g c o n d u c t a n c e w a s d e c r e a s e d b y 1-63%( n = 3 2 ) . T h e e f f e c t d o u b l e d w i t h b e t h a n e c h o l c o n c e n -t r a t i o n b e t w e e n W 0 p s M ( - 25 % 3 % s . e . m e a n , n = 6 )a n d l 0 0 f M (-53% + 4 % , n = 7 ) . S t e a d y s t a t e I / Vr e l a t i o n s i n c o n t r o l s o l u t i o n s a n d i n t h e p r e s e n c e o fm u s c a r i n i c a g o n i s t s a l w a y s i n t e r s e c t e d c l o s e t o-90 m V , i m p l y i n g a d e c r e a s e d K+ c o n d u c t a n c e .T h e r e w a s n o s i g n i f i c a n t e f f e c t o n a n o m a l o u s r e c t i f i c a -t i o n ( w h e n p r e s e n t ) ( n = 2 3 ) , o r o n t h e T E A - s e n s i t i v er e c t i f i e r ( n = 4 ) .N e u r o n e s o f a l l t y p e s b e c a m e m o r e e x c i t a b l e , t h es a m e c u r r e n t i n i t i a t i n g more a c t i o n p o t e n t i a l s ( F i g u r e1 ) , a n d t h e d i s c h a r g e p a t t e r n o f p h a s i c n e u r o n e sb e c a m e t o n i c ( F i g u r e I A , D ; s e e Brown & C o n s t a n t i ,1 9 8 0 ; C a s s e l l e t a l . , 1 9 8 6 ) . H o w e v e r , r e s p o n s e s e l i c i t e du n d e r v o l t a g e c l a m p i n d i c a t e d t h a t t h e u n d e r l y i n gc o n d u c t a n c e c h a n g e s d i f f e r e d b e t w e e n n e u r o n e t y p e s .I n p h a s i c n e u r o n e s o f t h e k i n d i n p a r a v e r t e b r a lg a n g l i a ( C a s s e l l e t a l . , 1 9 8 6 ) , a m a j o r e f f e c t w a s ad e c r e a s e i n I M ( C o n s t a n t i & B r o w n , 1 9 8 1 ; s e e F i g u r eI A ) . T h e r e d u c t i o n i n o u t w a r d c u r r e n t a t t r i b u t a b l e t oI M w a s t h e s a m e i n b e t h a n e c h o l 1 0 t o 1 0 0 i M .I n t o n i c n e u r o n e s o f t h e I M G , a d o m i n a n t c o n d u c -

) T h e M a c m i l l a n P r e s s L t d 1 9 8 7

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2 6 0 SHORT COMMUNICATION

t a n c e i s t h e t r a n s i e n t K+ c u r r e n t ' A ( C a s s e l l e t a l . ,1 9 8 6 ) , w h i c h w a s r e d u c e d i n e i t h e r a m p l i t u d e o r t i m ec o u r s e ( o r b o t h ) b y b o t h a g o n i s t s ( n = 8 t o n i cn e u r o n e s , F i g u r e 1 B ; n = 5 , 3 o f o t h e r t y p e s ) .T h e s e n e u r o n e s h a v e C a - a c t i v a t e d K+ c o n d u c t a n -c e s c a u s i n g a f t e r h y p e r p o l a r i z a t i o n s t h a t l a s t s e v e r a lh u n d r e d m s . A f t e r a n ' a c t i o n c u r r e n t ' , a n e x p o n e n t i a lo u t w a r d t a i l c u r r e n t , I C a K K i s r e c o r d e d a t -60 mV( T 1 0 0 i ns , C a s s e l l e t a l . , 1 9 8 6 ) . B o t h a m p l i t u d e a n dT w e r e r e d u c e d b y u p t o 50% b y e i t h e r a g o n i s t ( F i g u r eI C ) , o n a v e r a g e b y s i m i l a r p r o p o r t i o n s , t h e r e d u c t i o n sb e i n g g r e a t e r i n p h a s i c (-20% + 7 % , n = 8 ) t h a n i nt o n i c n e u r o n e s ( - 12% 4 % , n = 9 ) .A t h i r d s u b - t y p e o f n e u r o n e i n t h e c o e l i a c g a n g l i o ni s c h a r a c t e r i z e d b y a s e c o n d C a - a c t i v a t e d K c o n d u c -

Aa b W

1 0 . 2 nA..........I . . . . . . . . . . . .

I I I I I ( i i O l . m

t a n c e p r o d u c i n g a n a f t e r h y p e r p o l a r i z a t i o n l a s t i n gs e v e r a l s e c o n d s ( M c L a c h l a n , 1 9 8 7 ; c f . N o r t h & T o k -i m a s a , 1 9 8 3 ) . T h e p r o l o n g e d t a i l c u r r e n t , r e c o r d e d a t- 6 0 m V f o l l o w i n g a n a c t i o n p o t e n t i a l , I C a K 2 U w a sa l m o s t c o m p l e t e l y a b o l i s h e d b y e i t h e r a g o n i s t ( 1 0 g L M ,n = 5 ) r e v e a l i n g t h e d i m i n i s h e d ' C a K I ( F i g u r e I D ) .D i s c u s s i o n I n b u l l f r o g s y m p a t h e t i c n e u r o n e s( A d a m s e t a l . , 1 9 8 2 ) , m u s c a r i n i c a g o n i s t s a l m o s te x c l u s i v e l y a f f e c t I M , b u t l i t t l e o r n o I M c a n b ed e m o n s t r a t e d i n s o m e m a m m a l i a n s y m p a t h e t i cn e u r o n e s ( G a l v a n & S e d l m e i r , 1 9 8 4 ; B e l l u z z i e t a l . ,1 9 8 5 ; C a s s e l l e t a l . , 1 9 8 6 ) . O f t h r e e s u b - t y p e s i d e n t i f i e di n g u i n e a - p i g s ( C a s s e l l e t a l . , 1 9 8 6 ; M c L a c h l a n , 1 9 8 7 ) ,

Ba

( i )

b( i ) . . 1 . . ... L 0.3nA

I

........................... . . . . . . . . . . . . . .

O O_ii) 1 0 0 1 0 .100Ms

C

a

( i )

-28.............. - 58 1 2 5 mV

. 3 nA 5 0 0 ms

( i i ) . 1 1 ! r i. . ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ O ................... -62(1l)_g-~~~~~~~~....................10m

0.3nA 10M1 0 0 ms

Db a b

( i ) 1 0 . 1 nA r( i ) . . . . . . . . . . . . 1 0 . 3 n A

I M i ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1 - It i ' l l . . . . . . . . . _ . . .

-63 1 2 5 m V( ) r J . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1- 1 0 . 3 nA 200s

1 0 0 Ms . 1 0 . 3 nA

F i g u r e 1 R e s p o n s e s o f d i f f e r e n t g u i n e a - p i g s y m p a t h e t i c neurones t o a p p l i c a t i o n o f b e t h a n e c h o l 5 0 i M ( 1 0 I L M i n D ) .R e c o r d s show membrane p o t e n t i a l ( a b o v e ) a n d i n t r a c e l l u l a r c u r r e n t ( b e l o w ) i n c u r r e n t c l a m p ( a ) , a n d c u r r e n t ( a b o v e )a n d v o l t a g e ( b e l o w ) i n v o l t a g e c l a m p ( b ) , i n c o n t r o l s o l u t i o n ( i ) a n d i n t h e p r e s e n c e of b e t h a n e c h o l ( i i ) . ( A ) P h a s i cneurone o f L 5 p a r a v e r t e b r a l g a n g l i o n . ( B , C ) T o n i c neurones o f t h e IMG. ( D ) P h a s i c ( I C a . K 2 ) neurone o f t h e c o e l i a cg a n g l i o n . V a l u e s o f h o l d i n g p o t e n t i a l i n c l a m p are shown on t h e r e c o r d s .

1 2 5 mV

1 -60 1 2 5 mV2 5

I

/

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SHORT COMMUNICATION . 2 6 1

o n l y p h a s i c p a r a v e r t e b r a l n e u r o n e s e x h i b i t s i g n i f i c a n tI M , b u t m u s c a r i n i c a g o n i s t s i n c r e a s e e x c i t a b i l i t y o f a l l ,i n c l u d i n g t o n i c n e u r o n e s w h i c h n o r m a l l y s h o w l i t t l ea c c o m m o d a t i o n d u r i n g m a i n t a i n e d d e p o l a r i z a t i o n .M u s c a r i n i c b l o c k a d e o f r e s t i n g a n d C a - d e p e n d e n tK c o n d u c t a n c e s h a s p r e v i o u s l y b e e n d e s c r i b e d i n o t h e rn e u r o n e s ( N o r t h , 1 9 8 6 ) , b u t n o t t h e d e p r e s s i o n o f I A .I n t h e p r e s e n t e x p e r i m e n t s , a l l o f t h e s e e f f e c t s a p p e a rt o b e i n d e p e n d e n t . E a c h o f t h e c o n d u c t a n c e s d e s c r i b e di s d i s c r e t e . Tw o o f t h e c o n d u c t a n c e s a r e v o l t a g e -d e p e n d e n t ( I M a n d ' A ) , b u t h a v e d i f f e r e n t k i n e t i c s a n do p e r a t e o v e r d i f f e r e n t v o l t a g e r a n g e s . Two a r e d e p e n -d e n t o n c a l c i u m i n f l u x d u r i n g t h e a c t i o n p o t e n t i a l , b u td i f f e r i n t i m e c o u r s e ; b o t h a r e p r e s e n t i n t h e t h i r dn e u r o n e s u b t y p e i n t h e c o e l i a c g a n g l i o n ( F i g u r e I D ) .F u r t h e r m o r e , t h e d e g r e e o f b l o c k a d e v a r i e d a td i f f e r e n t a g o n i s t c o n c e n t r a t i o n s . R e s t i n g c o n d u c t a n c ew a s d e c r e a s e d p r o g r e s s i v e l y a s c o n c e n t r a t i o n w a s

r a i s e d a b o v e 1 0 g M . I M a n d I C a K 2 w e r e a l m o s t c o m -p l e t e l y b l o c k e d b y b o t h d r u g s a t 1 O 0 M . I A a n d I C a K Iw e r e o n l y p a r t i a l l y r e d u c e d i n a m p l i t u d e a n d t i m ec o u r s e a t 1 0 - 5 0 j I M . T h e d i f f e r e n t i a l s e n s i t i v i t y o f t h et w o C a , K c o n d u c t a n c e s , d e s p i t e p r e s u m a b l y t h e s a m eC a 2 " i n f l u x d u r i n g o n e a c t i o n p o t e n t i a l , s u g g e s t s t h a to n l y s o m e C a c h a n n e l s a r e b l o c k e d b y m u s c a r i n i ca g o n i s t s ( s e e B e l l u z z i e t a l . , 1 9 8 5 ) .T h u s i n c r e a s e d e x c i t a b i l i t y o f m a m m a l i a n s y m p a t h -e t i c g a n g l i o n c e l l s i n d u c e d b y a c t i v a t i o n o f m u s c a r i n i cr e c e p t o r s may i n v o l v e a n u m b e r o f d i s t i n c t K+c h a n n e l s p r e s e n t i n t h e m e m b r a n e s o f d i f f e r e n tn e u r o n e s u b - t y p e s . W h e t h e r o r n o t t h e d i f f e r e n tm e c h a n i s m s a r e l i n k e d t o t h e s a m e r e c e p t o r ( s e eN o r t h , 1 9 8 6 ) r e m a i n s t o b e c l a r i f i e d .T h i s w o r k w a s s u p p o r t e d b y t h e NH&MRC o f A u s t r a l i a . Wet h a n k G . D . S . H i r s t f o r h e l p f u l c o m m e n t s o n t h e m a n u s c r i p t .

R e f e r e n c e sADAMS, P . R . , BROWN, D . A . & CONSTANTI, A . ( 1 9 8 2 ) . M -c u r r e n t s a n d o t h e r p o t a s s i u m c u r r e n t s i n b u l l f r o g s y m -p a t h e t i c n e u r o n e s . J . P h y s i o l . , 3 3 0 , 5 3 7 - 5 7 2 .B E L L U Z Z I , O . , S A C C H I , 0 . & WANKE, E . ( 1 9 8 5 ) . I d e n t i f i c a -t i o n o f d e l a y e d p o t a s s i u m a n d c a l c i u m c u r r e n t s i n t h e r a t

s y m p a t h e t i c n e u r o n e u n d e r v o l t a g e c l a m p . J . P h y s i o l . ,3 5 8 , 1 0 9 - 1 2 9 .BROWN, D . A . & CONSTANTI, A . ( 1 9 8 0 ) . I n t r a c e l l u l a ro b s e r v a t i o n s o n t h e e f f e c t s o f m u s c a r in i c a g o n i s t s o n r a ts y m p a t h e t i c n e u r o n e s . B r . J . P h a r m a c . , 7 0 , 5 9 3 - 6 0 8 .CASSELL, J . F . , CLARK, A . L . & McLACHLAN, E . M . ( 1 9 8 6 ) .C h a r a c t e r i s t i c s o f p h a s i c a n d t o n i c s y m p a t h e t i c g a n g l i o nc e l l s o f t h e g u i n e a p i g . J . P h y s i o l . , 3 7 2 , 4 5 7 - 4 8 3 .C O N S T A N T I , A . & BROWN, D . A . ( 1 9 8 1 ) . M - c u r r e n t s i nv o l t a g e - c l a m p e d m a m m a l i a n s y m p a t h e t i c n e u r o n e s .N e u r o s c i . L e t t . , 2 4 , 2 8 9 - 2 9 4 .GALVAN, M . & S E D L M E I R , C . ( 1 9 8 4 ) . O u t w a r d c u r r e n t s i nv o l t a g e - c l a m p e d r a t s y m p a t h e t i c n e u r o n e s . J . P h y s i o l . ,3 5 6 , 1 1 5 - 1 3 3 .

J A N I G , W . , K R A U S P E , R . & W I E D E R S A T Z , G . ( 1 9 8 3 ) . R e f l e xa c t i v a t i o n o f p o s t g a n g l i o n i c v a s o c o n s t r i c t o r n e u r o n e ss u p p l y i n g s k e l e t a l m u s c l e b y s t i m u l a t i o n o f a r t e r i a lc h e m o r e c e p t o r s v i a n o n - n i c o t i n i c s y n a p t i c m e c h a n i s m si n s y m p a t h e t i c g a n g l i a . P f l u g e r s A r c h . , 3 9 6 , 9 5 - 1 0 0 .K O B A Y A S H I , H . & L I B E T , B . ( 1 9 7 0 ) . A c t i o n s o f n o r a d r e n a l i n ea n d a c e t y l c h o l i n e o n s y m p a t h e t i c g a n g l i o n c e l l s . J .P h y s i o l . , 2 0 8 , 3 5 3 - 3 7 2 .McLACHLAN, E . M . ( 1 9 8 7 ) . F u n c t i o n a l s p e c i a l i z a t i o n o fm e m b r a n e p r o p e r t i e s o f s y m p a t h e t i c p o s t - g a n g l i o n i cn e u r o n e s . I n O r g a n i z a t i o n o f t h e A u t o n o m i c N e r v o u sS y s t e m : C e n t r a l a n d P e r i p h e r a l M e c h a n i s m s . e d . P o l o s a ,C . & C a l a r e s u , F . New Y o r k : A l a n L i s s .NORTH, R . A . ( 1 9 8 6 ) . M u s c a r i n i c r e c e p t o r s a n d m e m b r a n ei o n c o n d u c t a n c e s . T . I . P . S . , 7 ( S u p p l . ) , 1 9 - 2 2 .NORTH, R . A . & T O K I M A S A , T . ( 1 9 8 3 ) . D e p r e s s i o n o f c a l -c i u m - d e p e n d e n t p o t a s s i u m c o n d u c t a n c e o f g u i n e a - p i gm y e n t e r i c n e u r o n e s b y m u s c a r i n i c a g o n i s t s . J . P h y s i o l . ,3 4 2 , 2 5 3 - 2 6 6 .

( R e c e i v e d F e b r u a r y 1 1 , 1 9 8 7 .A c c e p t e d F e b r u a r y 1 7 , 1 9 8 7 . )