Embed Size (px)
Citation preview
UNIVERZITET U NIŠU
PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET
DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU
Jovana S. Spasić
“Mikropropagacija Micromeria pulegium (Benth.)”
Master rad
Niš, 2013
UNIVERZITET U NIŠU
PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET
DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU
“Mikropropagacija Micromeria pulegium (Benth.)”
Master rad
Student: Mentor:
Jovana S. Spasić Dr Dragana D. Stojičić, docent
Br. indeksa 7
Niš, 2013
UNIVERSITY OF NIŠ
FACULTY OF SCIENCES AND MATHEMATICS
DEPARTMENT OF BIOLOGY AND ECOLOGY
“Micropropagation of Micromeria pulegium (Benth.)”
Master thesis
Student: Mentor:
Jovana S. Spasić Dr Dragana D. Stojičić
Nbr. of index: 7 Assistant professor
Niš, march 2013
Najsrdačnije se zahvaljujem svom mentoru prof. Dr Dragani Stojičić na
dragocenoj pomoći, strpljenju i podršci tokom izrade ovog master rada.
Takođe se zahvaljujem asistentu Svetlani Tošić na ukazanoj pomoći pri
realizaciji eksperimentalnog dela ovog master rada. Ovaj master rad je
rađen u okviru doktorske disertacije asistenta Svetlane Tošić i sadrži još
uvek nepublikovane rezultate. Za analizu je korišćen materijal
sakupljan za potrebe izrade disertacije.
Najveću zahvalnost dugujem svojoj majci i bratu na motivaciji,
nesebičnoj pomoći i razumevanju.
Najlepše hvala Danijelu na razumevanju, podršci i ljubavi.
Hvala svima koji su bili uz mene.
Ovaj rad posvećujem svom ocu, osobi kojoj bih prvo pokazala ovaj rad
da mogu ...
APSTRAKT
Micromeria pulegium (Benth.) je endemična vrsta južnih Karpata, takođe je i
ugrožena vrsta na Crvenoj listi vaskularne flore Srbije i Crne Gore. U ovom radu
ispitana je mogućnost regeneracije biljaka putem indukcije aksilarnih pupoljaka na
nodalnim eksplantatima M. pulegium korišćenjem različitih regulatora rastenja.
Najefikasnije kombinacije hormona bile su: 3 μM BA i 0,57 μM IAA; i 10 μM BA i
0,57 μM IAA. Dobijeni aksilarni pupoljci su izduživani a zatim i ožiljeni delovanjem
auksina 0,1 μM NAA
Ključne reči: Micromeria pulegium, mikropropagacija.
ABSTRAKT
Micromeria pulegium (Benth.) is an endemic species of southern Karpats, it is, as
well, endangered species on the Red list of vascular flora in Serbia and Montenegro.
In this article we examine the possibility of plant regeneration through induction of
axillary buds on nodal explants M. pulegium by using different growth regulators. The
most efficient hormone combinations were 3 μM BA and 0,57 μM IAA; and 10 μM
BA and 0,57 μM IAA. Produced axilary buds are extended and later tendrilled by
auxin 0,1 μM NAA.
Keywords: Micromeria pulegium, micropropagation.
SADRŽAJ
1. UVOD 1
1. 1. Micromeria pulegium Benth 2
1.2. Vegetativno razmnožavanje in vitro – opšte karakteristike 6
2. CILJ RADA 13
3. MATERIJAL I METODE 15
3.1. Biljni materijal 16
3.2. Metode sterilizacije 16
3.2.1. Sterilizacija biljnog materijala 16
3.2.2. Sterilizacija hranljivih podloga, rastvora i pribora 16
3.3. Hranljiva podloga 17
3.3.1. Hranljive podloge za indukciju aksilarnih pupoljaka M. pulegium 18
3.3.2. Hranljive podloge za razviće aksilarnih pupoljaka M. pulegium 19
3.3.3.Hranljive podloge za indukciju korenova na aksilarnim izdancima
M. pulegium 19
4. REZULTATI 20
4.1. Uvođenje M. pulegium u kulturu in vitro 21
4.2. Indukcija aksilarnih pupoljaka na nodalnim eksplantatima
M. pulegium 21
4.3.Indukciju korenova na aksilarnim izdancima M. pulegium 28
5. DISKUSIJA 30
6. ZAKLJUČAK 33
7. LITERATURA 35
SKRAĆENICE
BA - 6-benzil-aminopurin IAA - indol-3-sirćetna kiselina NAA – α - naftil- sirćetna kiselina
1. UVOD
1. 1. Micromeria pulegium Benth.
Carstvo: Plantae
Razdeo: Magnoliophyta
Klasa: Magnoliopsida
Red: Lamiales
Fam: Lamiaceae (Labiatae)
Rod: Micromeria
Micromeria pulegium (Rochel) Bentham
Rod Micromeria Benth. (Lamiaceae, Nepetoidae) je taksonomski složen i
kompleksan rod. Predstavljen je sa 54 vrste, 32 podvrste i 13 sorti. Rod Micromeria
je distribuiran iz Makaronezijsko – Mediteranskog regiona u Južnu Afriku, Indiju i
Kinu (Brauchler i sar., 2008).
Rod je prvi opisao Bentham (1829). On pripada familiji Lamiaceae. Rod Micromeria
smatra se delom nejasno definisanog “Satureja kompleksa”. Da bi se prilagodili
očiglednim morfološkim raznolikostima, mnogi taksonomisti su podelili ovaj
kompleks u nekoliko rodova: Satureja L., Clinopodium L., Calamintha Mill., Acinos
Mill. i Micromeria Benth. (Bentham 1848; Boissier 1879; Ball i Getliffe 1972; Davis
1982). Međutim, ostali taksonomisti spajaju ove grupe u jedan rod Satureja s.l.
(Briquet 1896; Brenan 1954; Greuter i sar. 1986; Seybold 1988).
Na osnovu morfoloških karakteristika i filogenetskih odnosa, vrste roda Micromeria
su grupisane u tri sektora (Boisser 1879): Cymularia, Eumicromeria i Pseudomelissa.
Boisner je koristio termin sektor za klasifikaciju vrsta iz roda Micromeria (Flora
orientalis, 1879, str. 568 - 575). U flori Srbije i Crne Gore ovaj rod je predstavljen sa
10 vrsta, od kojih su čak 7 endemične (Silić, 1979). Vrste ovog roda koje naseljavaju
Srbiju pripadaju sektorima Eumicromeria (M. croatica, M. juliana, M. cristata i M.
parviflora) i Pseudomelissa (M. thymifolia, M. albanica, M. dalmatica i M.
pulegium). Vrsta Micromeria pulegium koja je predmet našeg istraživanja pripada
rodu Micromeria, sekciji Pseudomelissa.
Vrsta Micromeria pulegium je rasprostranjena na teritoriji Rumunije, Srbije,
Federacije Bosne i Hercegovine (Višegrad, Međeđe). Na području Srbije, zabeležena
su staništa na području planine Tare (Zaovine), kao i u istočnoj Srbiji u klisuri
Svrljiškog Timoka: Knjaževac (Orešac, EP91). Rasprostranjenje ove vrste u Srbiji
prikazano je na slici 1. gde su sivim kružićem predstavljeni podaci o rasprostranjenju
na teritoriji klisure Svrljiškog Timoka, a crni kružić predstavlja rasprostranjenje vrste
na osnovu literaturnih i herbarijumskih podataka.
Slika 1. Distribucija vrste Micromeria pulegium (Rochel) Bentham u Srbiji (prema:
Bogosavljević S., Zlatković B., Ranđelović V. 2007)
Na preliminarnoj Crvenoj listi vaskularne flore Srbije i Crne Gore (Stevanović i sar.
2003) na području klisure Svrljiškog Timoka nalazi se i Micromeria pulegium
(Tab.1).
Tabela 1.Ugroženi taksoni flore klisure Svrljiškog Timoka
Takson Kategorija ugroženosti u Srbiji
Campanula sibirica subsp. divergentiformis (Jáv.) Domin VU-NT(DD) Achillea grandifolia Friv. VU-NT(DD) Achillea serbica Nyman VU-NT(DD) Artemisia pontica L. EN-VU Doronicum hungaricum Reichenb. fil. VU Tragopogon pterodes Pančić ex Petrović VU Corylus colurna L. VU Scirpus lacustris L. subsp. tabernaemontani (C. C. Gmelin) Syme
CR-VU(DD)
Scabiosa columbaria L. subsp. banatica (Waldst. & Kit.) Diklić
NT-LC(DD)
Scabiosa fumarioides Vis. & Panč. NT-LC(DD) Micromeria pulegium (Rochel) Bentham VU-NT(DD) Astragalus asper Jacq. EN-VU Lathyrus pallescens (Bieb.) C. Koch VU Vicia sparsiflora Ten. VU Anacamptis pyramidalis (L.) L.C.M. Richard VU Cephalanthera rubra (L.) L. C. M. Richard VU Dactylorhiza sambucina (L.) Soo subsp. sambucina VU-LC(DD) Epipactis helleborine (L.) Crantz NT-LC(DD) Gymnadenia conopsea (L.) R. Br. NT-LC(DD) Neottia nidus-avis (L.) L.C.M. Richard NT-LC(DD) Orchis morio L. VU-NT(DD) Orchis purpurea Hudson EN-VU(DD) Orchis simia Lam. EN-VU(DD) Orchis tridentata Scop. VU-NT(DD) Platanthera chlorantha (Custer) Reichenb. EN-VU(DD) Paeonia corallina Retz. EN-VU Paeonia mascula (L.) Miller EN-VU Adonis vernalis L. VU Anemone appenina L. NT-LC(DD) Pulsatilla montana (hoppe) Reichenb. EN-VU Frangula rupestris (Scop.) Schur NT-LC(DD) Prunus tenella Batsch VU Eryngium palmatum Pančić & Vis. NT-LC(DD) Ferula heuffelii Griseb. ex Heuffel VU Parietaria serbica Pančić VU
Familija usnatica Lamiacea (Labiatae), kojoj pripada i vrsta M. pulegium koju
ispitujemo, je familija sa velikim značajem, sa velikom brojnošću i karakteristikama
samih biljaka koje ovu familiju čine. Familija Lamiaceae je predstavljena sa 200
rodova i 3200 vrsta koje su rasprostranjene po čitavoj Zemlji. Najveće bogatstvo
rodova i vrsta ove familije nalazi se u Mediteranu do male Azije.
Vrste familije Lamiaceae su kosmopolitskog rasprostranjenja, naseljavaju pretežno
suva i dobro osunčana staništa, pa iz tih razloga je mali broj vrsta koje dopiru u
hladnije predele. U flori Balkanskog poluostrva Lamiaceae su zastupljene sa 371
vrstom. U Srbiji ima 147 vrsta ove familije koje su predstavljene u okviru trideset
rodova. Od svih familija viših biljaka Lamiaceae dolaze na drugo mesto po broju
vrsta u ovom delu Evrope. Od navedenog broja vrsta iz familije Lamiaceae 84 vrste
su Balkanski endemiti.
Pripadnici familije Lamiaceae mogu biti zeljaste ili drvenaste biljke, vrlo retko šiblje,
drveće ili lijane. Listovi su dekusirani bez zalistaka, prosti ili na različite načine
deljeni. Cvetovi su grupisani u cimozne cvasti, vrlo retko su pojedinačni cvetovi. Na
nadzemnim vegetativnim organima nalaze se žlezdane dlake, često u obliku glavice ili
žlezdane ljuspice. Predstavnici familije Lamiaceae sadrže eterična ulja vrlo različitog
sastava: aromatični alkoholi, fenoli, terpeni, ketoni, aldehidi itd. I vrste roda
Micromeria su dobro poznate kao aromatične vrste, jer sadrži značajne količine
etarskog ulja.
Cvetovi familije Lamiaceae su zigomorfni, retko aktinomorfni, dvopolni, petočlani, ili
četvoročlani. Čašica je 5 – člana ili petoperna ili dvousnata, trajna. Krunica je cevasta,
5 – perna, uvek više – manje dvousnata, retko jednousnata. Andreceum se sastoji od 4
prašnika, ili od 2 prašnika i 2 staminodije. Tučak je sinkarpan, sagrađen od dva
oplodna listića. Plodnik je nadcvetan, dvook, ili zbog sekundarno razvijene pregrade
četvorook i u svakom okcu sadrži po jedan semeni zametak. Plod se sastoji iz 4
oraščića ili usled zakržljalosti samo 3 ili jednog oraščića.
1.2. Vegetativno razmnožavanje in vitro – opšte karakteristike
Mikropropagacija predstavlja metod vegetativnog razmnožavanja čijom primenom se
iz malih delova biljaka (embrioni, seme, pupoljci, apikalni meristem, kalus,
pojedinačne ćelije) na veštačkim hranjivim podlogama, u sterilnim uslovima
regenerišu nove biljke (Nešković, i sar. 2003).
Metoda kulture tkiva omogućava regeneraciju biljaka iz izolovanih biljnih organa,
tkiva i pojedinačnih ćelija, u uslovima in vitro, na sterilnoj hranljivoj podlozi.
Uticajima promenljivog sastava hranljive podloge i drugih fizičkih faktora, razviće
tkiva, koje se gaji u sterilnim uslovima, može se usmeravati u željenom pravcu
(B o n g a, 1982).
Postavljanjem izolovanih biljnih delova na odgovarajuće hranljive podloge, dolazi do
dediferencijacije ćelija već diferenciranih tkiva, a zatim i regeneracije kompletnih
biljaka. Uspešna primena tehnika kulture tkiva zasnovana na sposobnosti ćelija i tkiva
da regenerišu kompletnu biljku, putem kontrole njihovog razvojnog puta
(A m m i r a t o, 1989). Izolovani delovi biljaka oslobođeni su korelativnih uticaja
organizma kao celine, te mogu reagovati na egzogeno dodate regulatore rastenja, i na
prisustvo različitih sastojaka hranljivih podloga.
Mikropropagacija omogućava dobijanje visokokvalitetnog i zdravog sadnog
materijala u kratkom vremenskom periodu, jer se proizvodnja odvija u kontrolisanim
uslovima, ne postoji zavisnost od godišnjih doba, velika je ušteda na prostoru i
vremenu neophodnom za gajenje, potrebna je mala količina inicijalnog biljnog
materijala zbog čega se ne moraju formirati veliki matičnjaci, a koeficijent
multiplikacije je visok. Međutim, ova metoda ima i svojih nedostataka među kojima
su najznačajniji velika početna ulaganja za opremanje laboratorije i, obzirom na
složenost celog postupka, potreba za visoko kvalifikovanom radnom snagom
(Vinterhalter, Vinterhalter, 1997).
Većina vrsta koje se razmnožavaju mikropropagacijom se mogu gajiti na standarnim
sterilnim agarnim podlogama sa makrometaboličkim i mikrometaboličkim
elementima, najčešće je to MS rastvor mineralnih soli (Murashige, Skoog, 1962), sa
odgovarajućim balansom fitohormona.
Mikropropagacija je postupak u kojem se za kultivisanje koriste isključivo izdanci
stabla osovinskog porekla, tj. vršni i pazušni pupoljci. Postupak se zasniva na
dodavanju egzogenih citokinina sa ciljem aktiviranja postojećih pazušnih pupoljaka,
odnosno izazivanja izduživanja njihovih internodija i formiranja listova, a zatim i
novih pupoljaka u njihovom pazuhu (Vinterhalter, Vinterhalter 1996).
Karakteristika metode je u tome da se kulture održavaju kao tzv. “kulture izdanaka”,
koje nemaju korenov sistem, sve dok se za njim ne ukaže potreba. Za indukciju
korenova koristi se podloga izmenjenog sastava, obično sa auksinima, a eksplantati su
pojedinačni izdanci koji nakon ožiljavanja predstavljaju pojedinačnu, individualnu
biljku.
Eksperimentalni radovi intenzivirani su u prvoj polovini 70-ih godina na voćnim
vrstama, posebno na jagodama i podlogama za razne vrste roda Prunus.
Mikropropagacija je bila konačan uspeh primene metoda in vitro u klonskom
razmnožavanju biljaka jer je omogućila izuzetno veliku brzinu razmnožavanja, i to
tokom cele godine, u laboratorijskim uslovima u kojima je moguće obezbediti
apsolutnu kontrolu uslova rasta i zdravstvenog stanja kultura. U kombinaciji sa
eliminacijom virusa, putem kulture meristema, mikropropagacija je ponudila skoro
savršeno rešenje za savremenu rasadničku proizvodnju.
Biljke dobijene kontinualnom kulturom meristema i pupoljaka u potpunosti
zadržavaju svoja klonska svojstva i ni na koji način se ne razlikuju od biljaka
proizvedenih klasičnim postupcima. Takođe, objavljeni su radovi za razne, posebno
voćne vrste u kojima je dokazano da su po nizu parametara koji definišu kvalitet ne
samo rasada već i plodova, biljke iz epruvete superiornije nad biljkama proizvedenim
konvencionalnim putem. Naravno, dobijeni su i suprotni rezultati, posebno kada se
radi o proizvodnji podloga koje su oslobođene od virusa (virus-free) za različite vrste,
kod kojih je primećena promena (opadanje) sposobnosti ožiljavanja nakon
oslobađanja od virusa.
Međutim, da varijabilnost koja je nastala tokom ili kao posledica korišćenja metode
kulture in vitro može biti korisna u selekciji i oplemenjivanju pokazali su Larkin i
Scowcroft (1981). Promene izazvane u kulturi in vitro koje postaju nasledne označene
su kao “somaklonalno variranje”. “Somaklonalno variranje” je rezultat promene
genotipa, a ne fenotipa.
Metode kulture in vitro dovode do različitih fenotipskih i epigenetskih promena, koje
su za klonsko razmnožavanje nepoželjne, obzirom da je potrebno kasnije detaljno
ispitivanje prirode i uzroka svog nastanka.
Osim primene u rasadničkoj proizvodnji, klonsko razmnožavanje biljaka metodama
kulture in vitro ima značajnu primenu svuda gde se radi selekcija i oplemenjivanje.
Mikropropagacija i regeneracija izdanaka su osnov za istraživanje i uspešnu primenu
genetičkog inženjeringa kod biljaka.
Mikropropagacija primenjuje se kod:
- brzog razmnožavanja novih genotipova,
- održavanja interesantnih genotipova,
- ubrzanja, skraćivanja ili dovršavanja postupaka selekcije i oplemenjivanja
- regeneracije izdanaka i celih biljaka u genetičkom inženjerstvu (Vinterhalter,
Vinterhalter 1996).
Prihvaćena su dva sistema za mikropropagaciju i klonsko razmnožavanje. Jedan od
sistema predložio je Murashige (1974) i on obuhvata mikropropagaciju u užem smislu
(samo iz aksilarnih izdanaka), i sve sisteme u kojima se kao rezultat in vitro
kultivisanja mogu dobiti izdanci. Prva faza obuhvata dobijanje kulture bez očiglednih
zaraza, tako da zadovoljavajući procenat eksplantata preživljava u kulturi, i daje
rastenje eksplantata brzo. Druga faza obuhvata adventivnu organogenezu izdanaka ili
embriona kao i stimulaciju indukcije aksilarnih izdanaka. A treća faza ožiljavanje
izdanaka i presađivanje u zemljište.
Debergh i Maene (1981) su proces podelili u nekoliko faza: nulta obuhvata higijenski
uzgoj biljaka sa kojih se uzimaju eksplantati, prva uključuje uspostavljanje aseptičnih
kultura, a druga indukciju meristemskih centara, njihov razvoj u izdanke i
multiplikaciju. U trećoj a fazi vrši se uniformno izduživanje izdanaka, a u trećoj b fazi
isecanje izduženih izdanaka a zatim ožiljavanje i adaptacija takvih reznica. Može se
primetiti da se ožiljavanje izdanaka ne vrši u uslovima in vitro, već se u međufazi IIIa
izdanci izdužuju, a potom isecaju i ožiljavaju u zemljišni supstrat kao i zelene reznice.
Ovaj sistem pogodan je za masovno klonsko razmnožavanje. Oba ova sistema mogu
se sumirati u sledeće operacije: priprema, skupljanje i transport materijala; površinska
sterilizacija; postavljanje primarnih eksplantata in vitro; provera na zarazu;
multiplikacija izdanaka; izduživanje izdanaka; ožiljavanje izdanaka i adaptacija
sadnica (Vinterhalter i Vinterhalter 1996).
Kultura in vitro je postupak koji podrazumeva rast vrlo sitnih organa, delova tkiva ili
izolovanih ćelija u aseptičnim (sterilnim) uslovima. Sam naziv kultura in vitro
označava gaenje kultura u staklu ili prozirnim posudama, tj. in vitro propagacija (lat.
in vitro – u staklu; biljke se uzgajaju u prozirnim posudama). Ovaj način
razmnožavanja biljaka često se naziva mikrorazmnožavanje (mikropropagacija), jer
su biljni organi ili cele biljke, u odnosu na generativnu proizvodnju, u minijaturnim
dimenzijama. Sam postupak osigurava vrlo brz proces dobijanja velikog broja serija
biljaka, koje su istovetne po razvoju, rastu i genetičkom potencijalu vrste. Bez
sumnje, to je proces kloniranja, jer sve proizvedene biljke predstavljaju matične
kopije razmnoženog majčinskog uzorka (Međedović 2003).
Postupci kulture in vitro mogu biti primenjeni u smislu očuvanja i zaštite genofonda
neke ugrožene vrste, razmnožavanja genetički superiornijih stabala, oblika otpornih
na hemijski stres, zagađenost atmosfere, otpornost prema određenim pesticidima i
herbicidima, itd. Kultura in vitro predstavlja najmoćnije sredstvo moderne genetike i
molekularne biologije u cilju israživanja rasta i razvoja biljaka. (Međedović 2003).
Postoje različiti pristupi u klasifikaciji tehnika kulture biljaka u uslovima in vitro.
Tehnike se mogu deliti ili po tipu eksplantata koji se uvodi u kulturu (ćelije, organi,
tkiva) ili po nameni (haploidi, somatska embriogeneza, samoklonalno variranje itd.).
Prema tipu eksplantata – za pokretanje kulture in vitro se mogu koristiti gotovo svi
delovi biljke tj. različiti eksplantati, počev od embriona, preko delova klijanaca -
korena, kotiledona, epikotila i hipokotila (kod dikotila), odnosno mezokotila i
koleoptila (kod monokotila) i svih delova odrasle biljke, uključujući listove, lisne
peteljke i delove cveta.
Prema nameni, kulture se klasifikuju kao kulture haploida, kulture korenova, kulture
za mikropropagaciju, in vitro propagacija, somatska embriogeneza, somaklonalno
variranje.
Tri hronološki najstarije in vitro tehnike kod biljaka su: kultura tkiva (ćelija), kultura
embriona i kultura korenova. Iako su odigrale važnu ulogu u opštem razvoju tehnike
kulture in vitro, na njima se danas vrši razmerno malo istraživanja.
Prema vrsti eksplantata razlikuju se sledeći tipovi kultura :
-kultura embriona gde se dobijanje biljke vrši iz oplođenih ili neoplođenih zigotskih
embriona.
-kultura organa, skup tehnika za dobijanje biljaka iz različitih organa.
-kultura meristema, gde je početni eksplantat apikalni meristem sa ili bez jedne ili više
lisnih primordija i koji obično daje pojedinačne izdanke.
-vrh izdanka ili kultura izdanka se karakteriše upotrebom vrha izdanka ili pupoljka sa
nekoliko lisnih primordija.
-kultura nodija koristi bočne pupoljke na stabljikama ili deo stabljike koji nosi bilo
pojedinačne ili višestruke članke ( nodije ). Svaki pupoljak daje pojedinačni izdanak.
Organizovani rast se odnosi na stvaranje ili održavanje diferenciranih struktura. On
nastaje kada se organizovani delovi biljke ili organa (aplikalni meristemi, listovi,
mladi cvetni pupoljci ili plodovi ) uvedu u kulturu i nastave svoj rast i razvitak pri
čemu sačuvaju svoju početnu strukturu.
Neorganizovani rast često se javlja u kulturi tkiva. Ćelijski agregati koji se tada
javljaju obično nemaju ni jednu prepoznatljivu strukturu biljnog organizma i sadrže
samo određeni broj različitih specijalizovanih i diferenciranih ćelija . Tu se ubrajaju :
-kultura biljnog tkiva, tkivna kultura ili kalus-neorganizovana proliferaciona masa
ćelija,
-kultura ćelija u suspenziji sastoji se od populacije ćelija i malih ćelijskih skupina koje
rastu u tečnoj podlozi.
-kultura pojedinačnih ćelija se postiže izolovanjem pojedinačnih ćelija iz kalusa ili
kulture ćelija u suspenziji.
-kultura protoplasta je kultura ćelija kojima je predhodno odstranjen ćelijski zid, a čiji
su protoplasti očuvani i živi.
Organogeneza je proces formiranja pojedinih organa ili čitave biljke u uslovima
kulture in vitro. Kao primarni eksplantati mogu se koristiti embrioni, delovi klijanaca,
apikalni meristemi, fragmenti zrelih organa i intaktni organi.
Pravac organogeneze zavisi od balansa egzogeno dodatih regulatora rastenja, u prvom
redu citokinina i auksina. Organogeneza može biti direktna, kada se na primarnom
eksplantatu direktno regenerišu biljni organi, koji daju kompletnu biljku, ili indirektna
preko formiranja kalusa, na kome se zatim začinju biljni organi.
Somatska embriogeneza je proces koji se odigrava in vitro i dolazi do razvoja
embriona iz somatskih ćelija,gde se one diferenciraju u somatski embrion i na taj
način stvaraju kompletne biljke.
Somatska embriogeneza može biti direktna ili indirektna. Direktna embriogeneza
karakteristična je za ćelije koje poseduju embriogeni potencijal i pre postavljanja
eksplantata u kulturu. One taj potencijal ispoljavaju u pogodnim uslovima kulture bez
prisustva egzogeno dodatih regulatora rastenja (Sharp i sar. 1980). Sastav hranljive
podloge deluje kao stimulator ili represor embriogene sposobnosti. Ovaj vid
embriogeneze opisan je kod zeljastih biljaka (Maheswaran i Williams 1984, 1986).
Indirektna embriogeneza se dešava kod delimično diferenciranih ćelija, kod kojih je
prethodno neophodno izvršiti redeterminaciju, ove ćelije prolaze kroz veći broj deoba
koje rezultiraju formiranjem kalusa. Ćelije kalusa zatim učestvuju u formiranju
embriona. Ovaj proces je nemoguć bez prisustva egzogeno dodatih regulatora
rastenja. Redeterminacija je moguća zahvaljujući totipotentnosti ćelija, a može biti
indukovana fizičkom ili fiziološkom izolacijom ćelija i tkiva, kada se uklanja
represivno dejstvo okolnih ćelija i tkiva i kada se ukida komunikacija između ćelija
(Maheswaran i Williams 1984, 1986).
Fundamentalan značaj somatske embriogeneze ogleda se u mogućnosti da se složeni
sistem kakav je diferencijacija i razviće embriona in vivo, može pojednostavljeno
pratiti u uslovima in vitro. Sa druge strane, razumevanje fizioloških i biohemijskih
procesa koji se dešavaju tokom embriogeneze in vivo je značajno radi usavršavanja
novih protokola koji bi procese somatske embriogeneze poboljšali.
2. CILJ RADA
Cilj ovog rada je bio da se da se ispita mogućnost uvođenja vrste Micromeria
pulegium u kulturu in vitro, kao i da se utvrdi uticaj različitih koncentracija regulatora
rastenja na indukciju aksilarnih pupoljaka, njihovu multiplikaciju i elongaciju.
Takođe, ispitivani su uslovi pod kojima je moguće ožiljavanje izdanaka i dobijanja
kompletne regenerisane biljke in vitro.
3. MATERIJAL I METODE
3.1. Biljni materijal
Biljke Micromeria pulegium prikupljene su u klisuri Svrljiškog Timoka. Tokom
eksperimentalnog rada osnovni biljni materijal bili su nodalni segmenti Micromeria
pulegium. Eksplantati koji su korišćeni su bili približno iste veličine. Vršni pupoljci
nisu korišćeni kao eksplantat. Na svaku podlogu postavljano je po 30 nodalnih
eksplantata.
3.2. Metode sterilizacije
3.2.1. Sterilizacija biljnog materijala
Biljke Micromeria pulegium su sterilisane korišćenjem 25%-tnog rastvora varikine
(komercijalni naziv natrijum hipohlorita - NaOCl sa 60 g aktivnog hlora/l) u trajanju
od 25 minuta, i potom ispirane tri puta sterilnom destilovanom vodom. Radi
eliminacije gljivične infekcije eksplantati su izlagani delovanju sterilnog rastvora
nistatina (5%) u trajanju od 24 časa, nakon čega su isprani tri puta sterilnom
destilovanom vodom a zatim aseptično preneti na hranljivu podlogu.
3.2.2. Sterilizacija hranljivih podloga, rastvora i pribora
Hranljive podloge i destilovana voda su sterilisani u autoklavu na temperaturi od 120
°C u trajanju od 30 minuta. Instrumenti, kao i petri kutije i ostalo posuđe i pribor su
sterilisani suvom sterilizacijom u trajanju od 1-2 sata na temperaturi od 160-180 °C.
Radni prostor je tretiran UV lampom u trajanju od najmanje 2 sata, dok je radna
površina tretirana 95%-im alkoholom. Pincete i skalpeli su sterilisani iskuvavanjem u
destilovanoj vodi 25 minuta, a zatim uranjani u 96%-tni etil-alkohol i opaljivani na
plamenu. Pribor je u toku rada često menjan, odnosno vraćan u alkohol i sterilisan na
plamenu.
3.3. Hranljiva podloga
Osnovna hranljiva podloga koja je korišćena u ovom radu bila je Murashige, T. and
Skoog, F. (1962) – MS podloga. Ova hranljiva podloga ima određeni sastav makro,
mikro mineralnih soli i organskih dodataka. Sastav je prikazan u tabelama:
Makro mineralne soli MS (mg/l)
NH4NO3 1650 KNO3 1900 CaCl2 × 2H2O 440 MgSO4 × 7H2O 370 KH2PO4 170
Mikro mineralne soli
MS (mg/l)
Mn SO4 × 4H2O 22.3 Zn SO4 × 7H2O 8.6 H3BO3 6.2 KJ 0.83 NaMoO4 × 2H2O 0.25 CuSO4 × 5 H2O 0.025 CoCl2 × 6 H2O 0.025 FeSO4 × 7H2O 27.8 Na2EDTA 37.3
Osim makro i mikro mineralhih soli hranljivim podlogama se dodaju organski dodaci:
Organski dodaci
MS (mg/l)
vitamin B1 0.4 vitamin B6 0.5 nikotinska kiselina 0.5 glicin 2.0
(g/l) mioinozitol 0.1 saharoza 30.0 agar 7.0
pH vrednost podloge je podešavana na 5.8.
3.3.1. Hranljive podloge za indukciju aksilarnih pupoljaka Micromeria pulegium
Za ispitivanje uticaja regulatora rastenja na indukciju aksilarnih pupoljaka u osnovnu
hranljivu podlogu MS dodati su 6-benzil aminopurin (BA) u rasponu koncentracija od
0,1 μM - 30,0 μM i indol-3-sirćetna kiselina (IAA) u koncentraciji 0,57 μM. Kontrola
nije sadržala regulatore rastenja. Korišćene koncentracije regulatora rastenja su
prikazane u Tabeli 1.
Tabela 2. Sadržaj hormona u hranljivim podlogama za multiplikaciju izdanaka
Hranljiva podloga
1 2 3 4 5 6 7
BAP (μM) 0 0,1 0,3 1,0 3,0 10,0 30,0 IAA (μM) 0,57 0,57 0,57 0,57 0,57 0,57 0,57
Eksplantati su postavljani u staklene teglice (5×5×12 cm). Svaka od pripremljenih
hranljivih podloga bila je razlivena u po 3 teglice. Teglice su sadržale po 30-35 ml
hranljive podloge, bile su zatvorene metalnim zatvaračima koji su na sredini imali
otvor kroz koji je provučena vata, zbog boljeg provetravanja, a zadržavanja
aseptičnosti kulture. U svaku teglicu postavljeno je po 10 eksplantata, na taj način je
na svaki tretman postavljeno po 30 eksplantata.
Kulture su gajene u komori za rastenje na temperaturi 21±2 °C, sa fotoperiodom od
16 sati svetlosti i 8 sati mraka, pri svetlosti fluorescentih belih cevi „Tesla” - Pančevo
i gustinom fotonskog fluksa od 50 μmol s-1m-2.
Četiri nedelje nakon postavljanja eksplantata na različite hranljive podloge utvrđen je
broj aksilarnih pupoljaka po eksplantatu, kao i dužina aksilarnih pupoljaka.
3.3.2. Hranljive podloge za razviće aksilarnih pupoljaka Micromeria pulegium
Izduživanje aksilarnih pupoljaka odvijalo se spontano na podlozi MS bez regulatora
rastenja. Gajenje dobijenih izdanaka trajalo je najmanje 4 nedelje, a zatim su oni
prenošeni na podloge za ožiljavanje.
3.3.3.Hranljive podloge za indukciju korenova na aksilarnim izdancima
Micromeria pulegium
U cilju da se inicira ožiljavanje, korišćeni su izdanci stari mesec dana koji nisu bili
manji od 10 mm.
Hranljiva podloga korišćena tokom ožiljavanja izdanaka sadržala je MS mineralni
rastvor (Murashige, Skoog, 1962), koja je dopunjena sa indol-3-buternom kiselinom
(NAA) u koncentracijama od 0,1 do 0,3 μM. Pri tom je pH vrednost hranljive podloge
podešena na 5,8 pre autoklaviranja na temperaturi od 120 ºC i pritisku od 1,5 atm
tokom 30 minuta.
Ožiljavanje izdanaka obavljeno je u staklenim teglama (5×5×12 cm), koje su sadržale
po 70 ml hranljive podloge. Na svaki tretman je postavljeno po 30 eksplantata, u tri
tegle po 10 eksplantata. Tretman je trajao tri nedelje nakon čega je utvrđen procenat
ožiljenih izdanaka.
4. REZULTATI
4.1. Uvođenje M. pulegium u kulturu in vitro
Prema literaturnim podacima M. pulegium do sada nije uvedena u kulturu in vitro.
Nakon sterilizacije nodalni eksplantati su postavljeni na podlogu MS bez regulatora
rastenja. Na ovoj podlozi eksplantati su proveli 4 nedelje. Tokom tog vremena
eliminisani su eksplantati koji su bili zaraženi nekom infekcijom ili eksplantati koji su
nekrozirali. Preostali zdrav biljni materijal iskorišćen je za indukciju aksilarnih
pupoljaka na nodalnim segmentima M. pulegium i na taj način je kultura in vitro
uspešno uspostavljena.
4.2. Indukcija aksilarnih pupoljaka na nodalnim eksplantatima M. pulegium
Dve nedelje nakon postavljanja eksplantata na MS hranljivu podlogu sa citokininom
BA i auksinom IAA, uočava se uspešno razviće nodalnih eksplantata u uslovima in
vitro. Procenat kontaminacije bio je nizak i od postavljenih 240 nodalnih eksplantata
bilo je kontaminirano svega 4,2%. Odnosno, udeo zdravih eksplantata je iznosio 95,8
%.
Bez obzira na koncentraciju korišćenog citokinina (BA), u roku od dve nedelje došlo
je od uočavanja aksilarnih pupoljaka na nodalnim eksplantatima M. pulegium. Ovo
potvrđuje od ranije poznatu činjenicu da niske koncentracije auksina u kombinaciji sa
citokininom pozitivno menjaju frekfenciju indukcije izdanaka i stimulišu njihov rast
(Mišić et al. 2006).
Na svim eksplantatima, bez obzira na tretman, došlo je do formiranja brojnih
aksilarnih pupoljaka (Tab. 3.). U tabeli 3. prikazan je procenat eksplantata sa
formiranim aksilarnim pupoljcima, prosečan broj i prosečna dužina aksilarnih
pupoljaka na nodalnim eksplantatima. Eksplantati su gajeni na hranljivoj MS podlozi
sa različitim koncentracijama BA u rasponu od 0 – 30,0 μM i IAA u koncentraciji od
0,57 μM. Nodalni eksplantati su bili postavljeni i na kontrolnu bezhormonsku
hranljivu MS podlogu.
Tabela 3. Indukcija aksilarnih pupoljaka na nodalnim eksplantatima
Tretman % eksplantata sa aksilarnim pupoljcima
Prosečan broj pupoljaka po eksplantatu
Prosečna dužina pupoljaka (mm)
Bez hormona 100 13,20 ± 0,99 6,77 ± 0,41 0,57 μM IAA 100 10,93 ± 0,71 6,14 ± 0,39 0,1 μM BA + 0,57 μM IAA 100 9,43 ± 0,82 5,90 ± 0,44 0,3 μM BA + 0,57 μM IAA 100 12,40 ± 1,35 6,32 ± 0,51 1,0 μM BA + 0,57 μM IAA 100 12,83 ± 0,95 7,13 ± 0,41 3,0 μM BA + 0,57 μM IAA 100 15,93 ± 1,24 8,36 ± 0,43 10,0 μM BA + 0,57 μM IAA 100 14,38 ± 0,86 9,45 ± 0,40 30,0 μM BA + 0,57 μM IAA 100 12,77 ± 0,83 5,77 ± 0,26
Na podlozi bez hormona došlo je do indukcije aksilarnih pupoljaka na svim
eksplantatima (Tab. 3.). Na ovoj podlozi u proseku je formirano 13,20 pupoljaka po
eksplantatu, čija je prosečna dužina bila 6,77 mm. Eksplantati su bili zdravi, normalno
razvijeni, bez vidljive vitrifikacije (Slika 2.)
Slika 2. M. pulegium na podlozi MS bez regulatora rastenja
Na podlozi MS sa 0,57 μM indol–3–sirćetne kiseline (IAA) prosečan broj aksilarnih
pupoljaka po eksplantatu bio je 10,93, a njihova prosečna dužina bila je 6,14 mm. To
je izvesno smanjenje i broja i dužine pupoljaka u poređenju sa kontrolnim
eksplantatima (Tab. 3.). Morfoloških razlika između ove dve grupe eksplantata nije
bilo (Slika 3).
Slika 3. M. pulegium na podlozi MS sa 0,57 μM IAA
Slika 4. M. pulegium na podlozi MS sa 0,1 μM BA i 0,57 μM IAA
Najmanji prosečan broj pupoljaka po eksplantatu zabeležen je na MS podlozi sa 0,1
μM BA i 0,57 μM IAA (Tab.3.). Prosečan broj formiranih aksilarnih pupoljaka po
eksplantatu bio je 9,43, a njihova prosečna dužina bila je 5,90 mm. Niske
koncentracije citokinina i auksina dovele su do značajnog smanjenja broja formiranih
pupoljaka a takođe uticale su da pupoljci imaju i manju dužinu (Slika 4).
Na hranljivoj podlozi MS sa 0,3 μM BA i 0,57 μM IAA prosečan broj formiranih
aksilarnih pupoljaka po eksplantatu bio je 12,40, a njihova prosečna dužina bila je
6,32 mm. Pri ovoj kombinaciji i koncentraciji hormona broj i dužina pupoljaka su još
uvek manji nego na podlozi bez hormona.
Na eksplantatima gajenim na MS podlozi sa 1 μM BA i 0,57 μM IAA formirano je
prosečno 12,83 aksilarnih pupoljaka, a njihova prosečna dužina bila je 7,13 mm (Tab.
3.). Morfološki se ovi eksplantati nisu razlikovali od eksplantata gajenih na
kontrolnoj podlozi (Slika 5).
Slika 5. M. pulegium na podlozi MS sa 1 μM BA i 0,57 μM IAA
Najveći prosečan broj pupoljaka po eksplantatu dobijen je kada su eksplantati M.
pulegium gajeni na podlozi sa 3 μM BA i 0,57 IAA. Broj pupoljaka bio je 15,93 a
njihova prosečna dužina 8,36 mm (Tab. 3.). Eksplantati su bili vitalni, zelene boje
(Slika 6).
Slika 6. M. pulegium na podlozi MS sa 3 μM BA i 0,57 μM IAA
Slika 7. M. pulegium na podlozi MS sa 10 μM BA i 0,57 μM IAA
Najveća prosečna dužina pupoljaka je postignuta na eksplantatima gajenim na MS
podlozi sa 10 μM BA i 0,57 μM IAA (Tab. 3.) Na ovoj podlozi prosečno je formirano
14,38 pupoljaka po eksplantatu, a njihova dužina bila je 9,45 mm u proseku (Slika 7).
Najmanju prosečnu dužinu aksilarni pupoljci imali su kada su eksplantati gajeni na
MS podlozi sa 30 μM BA i 0,57 μM IAA (Tab. 3.). Prosečan broj pupoljaka bio je
12,77, a njihova prosečna dužina bila je 5,77. Eksplantati na ovoj podlozi imaju
skraćene internodije, i žbunastu formu (Slika 8). Na listovima koji dodiruju hranljivu
podlogu ili su blizu hranljive podloge uočavaju se tamne mrlje, začetak nekroze tkiva.
Eksplantati dobijaju zeleno-žutu boju.
Slika 8. M. pulegium na podlozi MS sa 30 μM BA i 0,57 μM IAA
Na slici 9. su eksplantati sa namanjim prosečnim brojem pupoljaka po eksplantatu
(0,1 μM BA + 0,57 μM IAA, prva tegla sa leve strane), zatim eksplantati sa najvećom
prosečnom dužinom pupoljaka (10 μM BA + 0,57 μM IAA, tegla u sredini) i
eksplantati sa najmanjom prosečnom dužinom pupoljaka (30 μM BA + 0,57 μM IAA,
tegla desno). Eksplantati sa ove tri podloge se značajno razlikuju i morfološki.
Slika 9. M. pulegium na podlozi MS sa a) 0,1 μM BA + 0,57 μM IAA, b) 10 μM BA
+ 0,57 μM IAA, c) 30 μM BA + 0,57 μM IAA
Slika 10. M. pulegium na podlozi MS sa a) 0,1 μM BA + 0,57 μM IAA, b) 3 μM BA
+ 0,57 μM IAA, c) 30 μM BA + 0,57 μM IAA
Najveći broj pupoljaka kao i prosečan broj pupoljaka po eksplantatu postignut je sa
eksplantatima koji su se nalazili na MS podlozi sa 3 μM BA i 0,57 μM IAA (slika 10
b).
a b c
a b c
Uporedni prikaz broja indukovanih aksilarnih pupoljaka i njihovih dužina u odnosu na
podlogu na kojoj su gajeni prikazan je na histogramu 1.
Histogram 1. Prosečan broj aksilarnih pupoljaka i njihove prosečne dužine formiranih
na eksplantatima gajenim na MS hranljivoj podlozi sa različitim regulatorima rastenja
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
kontrola 0,57 IAA 0,1 BA + 0,57 IAA
0,3 BA + 0,57 IAA
1 BA + 0,57 IAA
3 BA + 0,57 IAA
10 BA + 0,57 IAA
30 BA + 0,57 IAA
broj pupoljaka
duzina pupoljaka (mm)
4.3.Indukciju korenova na aksilarnim izdancima Micromeria pulegium
Eksplantati za indukciju rizogeneze bili su aksilarni izdanci M. pulegium dužine oko
10 mm, dobijeni procesom indukcije aksilarnih pupoljaka. Hranljiva podloga za
indukciju korenova bila je MS sa tri različite koncentracije auksina NAA (0,1 μM; 0,2
μM i 0,3 μM). Eksplantati gajeni na MS hranljivoj podlozi bez regulatora rastenja
predstavljala je kontrolu.
Prvi znaci formiranja korena na izdancima M. pulegium uočavali su se tokom druge
nedelje gajenja eksplantata na induktivnim podlogama (Slika 11). Koren se uglavnom
formira na bazalnom kraju izdanka ili u nodusu stabla.
Slika 11. Ožiljavanje M. pulegium na podlozi MS sa 0,1 μM NAA
Na izdancima gajenim na podlozi bez regulatora rastenja formiranje korena bilo je
sporadično, samo 2,5% izdanaka je okorenjeno (Tab. 4.). Na hranljivoj podlozi MS sa
0,1μM IAA ožiljeno je 30 %, na podlozi sa 0,2μM 20% a na podlozi sa 0,3μM 5%
izdanaka. Sa povećanjem korišćene koncentracije auksina procenat ožiljenih izdanaka
bio je sve manji.
Tabela 4. Indukcija korenova na aksilarnim izdancima M. pulegium
Tretman Ožiljene biljke (%) Kontrola 2,5 NAA 0,1μM 30 NAA 0,2μM 20 NAA 0,3μM 5
5. DISKUSIJA
Mikropopagacija M. pulegium nodalnim eksplantatima je bila uspešna. Ovim radom
su definisani uslovi pod kojima dolazi do razvića i izduživanja aksilarnih pupoljaka,
kao i ožiljavanja izdanaka M. pulegium.
Na eksplantatima M. pulegium gajenim na hranljivoj podlozi MS bez regulatora
rastenja došlo je do formiranja aksilarnih pupoljaka. Prosečan broj pupoljaka bio je
13,20. Ovo nije jedinstveni slučaj, i kod vrste Salvia brachyodon (Mišić et al. 2006)
došlo je do formiranja aksilarnih pupoljaka na nodalnim eksplantatima kada su oni
gajeni na podlozi bez regulatora rastenja.
Kada je hranljivoj podlozi dodat samo auksin prosečan broj pupoljaka po eksplantatu,
kao i njihova prosečna dužina bila je manja nego na kontrolnoj podlozi. Drugačiji
rezultati dobijeni su na vrsti Mentha piperita (Sujana and Naidu, 2011.), auksini
primenjeni bez citokinina imali su stimulativan efekat.
Niske koncentracije citokinina BA u kombinaciji sa konstantnom koncentracijom
auksina dovele su do formiranja manjeg broja aksilarnih pupoljaka po eksplantatu u
odnosu na eksplantate na kontrolnoj podlozi. I dužina pupoljaka bila je manja od
dužine pupoljaka na kontrolnim eksplantatima.
Prosečno najveći broj pupoljaka (15,93) formiran je na eksplantatima gajenim na
podlozi sa 3 μM BA i 0.57 μM IAA. Stimulativni efekat niske koncentracije auksina i
različitih koncentracija citokinina na indukciju aksilarnih pupoljaka je poznat kod
različitih vrsta biljaka (Cuenca et al. 2000, S., Çöçü et al. 2004, Singh and Sehgal
1999, Yuan et al. 1994, Vandemoortele et al. 1996). Kombinacija BA i auksina bila je
efikasna u indukciji aksilarnih pupoljaka Salvia brachyodon (Mišić et al. 2006).
Kinetin je pozitivno delovao na indukciju pupoljaka kod Salvia sclarea (Sharafzadeh
et al. 2011), a kombinacija kinetina i auksina kod vrste Mentha piperita
(Venkatramalingam and Ebbie, 2011).
Osim stimulativnog uticaja zabeležen je i inhibitoran uticaj citokinina na indukciju i
razviće aksilarnih pupoljaka, kod Mentha arvensis (Akram et al. 2013) i Coleus
barbatus (Gupta et al. 2010).
Dužina pupoljaka formiranih na eksplantatima M. pulegium bila je najveća kada su
eksplantati gajeni na hranljivoj podlozi sa 10 μM BA + 0,57 μM IAA (9,45 mm).
Nasuprot pojavi kod drugih vrsta iz familije Lamiaceae, kod kojih je prisustvo
citokinina BA u hranljivoj podlozi inhibiralo izduživanje pupoljaka (Singh and Sehgal
1999, Meszaros et al. 1999, Mišić et al. 2005), pa su uglavnom pupoljci eksplantata
gajenih na podlozi bez regulatora rastenja bili najduži.
Prve promene na izdancima koji su postavljeni na hranljive podloge za ožiljavanje
primećene su tokom treće nedelje. Začeci korena formiraju se u bazi izdanka i na
prvom nodusu stabla. Pojava korena na izdancima gajenim na podlogama sa
auksinom oko dvadesetog dana u kulturi zabeležena je i kod Salvia brachyodon
(Mišić et al. 2006).
Spontano ožiljavanje izdanaka M. pulegium (na podlozi bez regulatora rastenja)
zabeleženo je kod 2,5% izdanaka. Ova pojava nije retka, ona je zabeležena i kod
Salvia bancoana, S. valentine (Cuenca and Amo-Marco, 2000), kao i kod S.
milthiorrhiza (Morimoto et al. 1994).
Za stimulisanje ožiljavanja izdanaka M. pulegium korišćena je α-naftil sirćetna
kiselina (NAA). Na podlozi sa najnižom korišćenom koncentracijom NAA (0,1 μM)
ožiljeno je 30% izdanaka, sa povećanjem koncentracije NAA u podlozi procenat
ukorenjenih biljaka bio je manji, pa je na podlozi sa NAA 0,2 μM ožiljeno 20%
izdanaka a na podlozi sa NAA 0,3 μM ožiljeno 5% izdanaka. Sličan stimulativni
uticaj različitih koncentracija IBA, IAA i NAA na ožiljavanje zabeležen je kod
izdanaka Salvia brachyodon (Mišić et al. 2006), kao i kod S. fruticosa (Arikat et al.
2004). Međutim kod ožiljavanja Lavandula latifolia NAA je imala inhibitorni efekat
na rizogenezu Sánches-Gras and Calvo (1996).
6. ZAKLJUČAK
Kultura in vitro Micromeria pulegium je uspešno uspostavljena. Indukcija najvećeg
broja aksilarnih pupoljaka 15,93 dobijena je gajenjem nodalnih eksplantata na MS
hranljivoj podlozi sa 3 μM BA i 0,57 μM IAA. Najveća dužina aksilarnih pupoljaka
9,45 je dobijena gajenjem eksplantata na hranljivoj podlozi sa 10 μM BA i 0,57 μM
IAA.
Izdanci koji su gajeni na hranljivoj podlozi bez regulatora rastenja ožiljavali su se u
malom broju. Ožiljavanje na podlogama sa NAA je bilo uspešno. Uočljiv je uticaj
koncentracije NAA na ožiljavanje izdanaka. Najniža korišćena koncentracija NAA
(0,1 μM) dovela je do ožiljavanja 30% eksplanata, a sa povećanjem koncentracije
NAA procenat ukorenjenih izdanaka bio je manji.
Metoda kulture in vitro uspešno se može koristiti za razmnožavanje M. pulegium
indukcijom aksilarnih pupoljaka i može biti značajna pomoć u rešavanju problema
zaštite i očuvanja ove endemične vrste.
7. LITERATURA
1. Ammirato P.V. (1989): Control and expression of morfogenesis in culture.
Chapter from book: Plant Tissue Culture and its Agricultural Applications (23-
45), editors: Withers L.A., Alderson P.G
2. Akram et al. (2013): Monoterpene contents in in vitro cultures and field-
grown plants of Japanese mint Mentha arvensis L. Pak. j. biochem. mol.
biol., 74-79
3. Arabaci T., Dirmenci T., Celep F.(2010): Morphological character analysis
in Turkish Micromeria Benth. (Lamiaceae) species with a numerical
taxonomic study. Turk J Bot 34, 379-389.
4. Arikat, N.A., Jawad, F.M., Karam, N.S., Shibli, R.A.: Micropropagation and
accumulation of essential oils in wild sage (Salvia fruticosa Mill.). -
Scientia Hort. 100: 193-202, 2004.
5. Bogosavljević S., Zlatković B., Ranđelović V. (2007): Flora klisure
Svrljiškog Timoka. 9th Symposium on Flora of Southeastern Serbia and
Neighbouring Regions, Niš, proceeding, 41-54
6. Boissier E (1879): Flora Orientalis. vol. 4. Basel & Geneve, 568 – 575.
7. Bonga J.M. (1982): Tissue culture techniques. Chapter from book: Tissue
culture in Forestry (4-36), edited by Bonga J.M. and Durzan D.J.
8. Bräuchler, C., Ryding, O. and Heubl, G. (2008): The genus Micromeria
(Lamiaceae), a synoptical update. Willdenowia 38: 363-410.
9. Briquet J. (1896): Satureja. In: Engler A and Prantl K (ed.), Die Natürlichen
Pflanzenfamilien. pp. 296-303. Leipzig.
10. Çöçü, S., Uranbey, S., İpek, A., Khawar, K.M., Sarihan, E.O., Kaya, M.D.,
Parmaksiz, İ., Özcan, S.: Adventitious shoot regeneration and
micropropagation in Calendulla officinalis L. - Biol. Plant. 48: 449-451,
2004.
11. Cuenca, S., Amo-Marco, J.B.: In vitro propagation of two Spanish endemic
species of Salvia through bud proliferation. - In Vitro cell. dev. Biol. Plant
36: 225-229, 2000.
12. Gupta et al., (2010): Variations in growth of tubers of field grown Coleus
barbatus as affected by different hormonal treatments. African Journal of
Plant Science Vol. 4(12), pp. 467-473.
13. Maheswaran, G., Williams, E. G. (1984): Direct somatic embryoid
formation on immature embryos of Trifolium repens, T. pratense and
Medicago sativa, and rapid clonal propagation of T. repens. Ann. Bot. 54:
201-211.
14. Maheswaran, G., Williams, E. G. (1986): Primary and secondary direct
somatic embryogenesis from immature zygotic embryos of Brassica
campestris. J. Plant Physiol. 124: 455-463.
15. Marković M., Tanasić M., Stojić N., Bulatović R., Jović M., Vidojković S.,
Stanković D. (2012): Improvement of Micropropagation Protocol of
Phalaenopsis sp. for the Method of Direct Shoot Regeneration from Nodes
of Floral Spikes. Bulletin of the Faculty of Forestry 106: 141-150.
16. Međedović, S., Ferhatović Dž., (2003). Klonska proizvodnja sadnica drveća
i grmlja. Bemust, Sarajevo
17. Meszaros, A., Bellon, A., Pinter, E., Horvath G.: Micropropagation of lemon
balm. - Plant Cell Tissue Organ Cult. 57: 149-152, 1999.
18. Misic, D.; Grubisic, D.; Konjevic, R. (2006): Micropropagation of Salvia
brachyodon through nodal explants. Volume 50, Number 3, pp. 473-476(4)
19. Mišić, D., Ghalawenji, N.A., Grubišić, D., Konjević, R.: Micropropagation
and reintroduction of Nepeta rtanjensis Diklić & Milojević, an endemic
and critically endangered perennial of Serbia. - Phyton 45: 9-20, 2005.
20. Morimoto, S., Goto, Y., Shorama, Y.: Production of lithospermic acid B
and rosmarinic acid in callus tissue and regenerated plantlets of Salvia
miltiorrhiza. - J. natur. Prod. 57: 817-823, 1994.
21. Murashige T. and Skoog F. (1962): A revised medium for rapid growth and
bioassays with tobaco tissue cultures. Phisiol. Plant. 15: 473-497.
22. Parić, A., Pustahija, F., Karalija E. (2011): Propagacija biljaka kulturom in
vitro. Prirodno – Matematički fakultet, Sarajevo. 65 – 95.
23. Sánches-Gras, M.C., Calvo, M.C.: Micropropagation of Lavandula latifolia
through nodal bud culture of mature plants.-Plant Cell Tissue Organ Cult.
45: 259-261, 1996.
24. Sharafzadeh et al. (2011): Influence of growth regulators on growth and
secondary metabolites of some medicinal plants from Lamiaceae family.
25. Silic C. (1979): Monographie der Gattungen Satureja L., Calamintha
Miller, Micromeria Benth., Acinos Miller und Clinopodium L. in der Flora
Jugoslawiens, Zemaljski Muzej BiH, Sarajevo, pp. 172 – 262.
26. Singh, N.K., Sehgal, C.B.: Micropropagation of ‘Holy Basil’ (Ocimum
sanctum Linn.) from young inflorescences of mature plants. - Plant Growth
Regul. 29: 161-166, 1999.
27. Slavkovska V. , Couladis M., Bojovic S., Tzakou O., Pavlovic M., Lakusic
B., and Jancic R. (2005): Essential oil and its systematic significance in
species of Micromeria Bentham from Serbia and Montenegro. Pl. Syst.
Evol. 255: 1–15
28. Stevanović V. et al. (1999): Crvena knjiga flore Srbije. 1, Isčezli i krajnje
ugroženi taksoni Ministarstvo za životnu sredinu republike Srbije,
Beograd; Biološki fakultet Univerziteta u Beogradu, Beograd; Zavod za
zaštitu prirode Republike Srbije, Beograd, 380-382.
29. Sujana, P., Naidu, C.V., (2011): Impact of Different Carbohydrates on
High Frequency Plant Regeneration from Axillary Buds of Mentha
piperita (L.) – An Important Multipurpose Medicinal Plant. Journal of
Phytology 2011, 3(5): 14-18.
30. Tatić B., Blečić V. (1984): Sistematika i filogenija viših
biljaka.Univerzitetski udžbenik, Zavod za udžbenike i nastavna sredstva,
Beograd, 314 - 316.
31. Vandemoortele, J.L., Billard, J.P., Boucaud, J., Gaspar, T.:
Micropropagation of parsley through axillary shoot proliferation. - Plant
Cell Tissue Organ Cult. 44: 25-30, 1996.
32. Venkatramalingam, K., Ebbie M.G. (2011): An efficient in vitro culture
method of shoot regeneration for a medicinary important plant Mentha
piperita.
33. Vinterhalter, D., Vinterhalter B., (1996): Kultura in vitro i
mikropropagacija biljaka. Axial, P.O., Beograd (15-54).
34. Yuan, Y.J., Hu, T.T., Yang, Y.M.: Effects of auxins and cytokinins on
formation of Cataranthus roseus G. Don multiple shoots. - Plant Cell
Tissue Organ Cult. 37: 193- 196, 1994.
BIOGRAFIJA KANDIDATA
Jovana Spasić rođena je 08.07.1988. godine u Leskovcu. Završila je osnovnu školu
,,8. oktobar” u Vlasotincu, nakon čega upisuje gimnaziju ,,Stevan Jakovljević”,
prirodno – matematički smer, u Vlasotincu. Godine 2007. započinje osnovne
akademske studije na Prirodno–matematičkom fakultetu, Univerziteta u Nišu, na
Departmanu za biologiju i ekologiju, koje završava 2010. godine sa zvanjem „biolog“.
Iste godine upisuje master akademske studije na Departmanu za biologiju i ekologiju,
odsek Biologija, koje završava 2012. godine, sa prosečnom ocenom 8,44.
Прилог 5/1
ПРИРОДНO - MАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ НИШ
КЉУЧНА ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈА
Редни број, РБР:
Идентификациони број, ИБР:
Тип документације, ТД: монографска Тип записа, ТЗ: текстуални / графички Врста рада, ВР: мастер рад Аутор, АУ: Јована Спасић Ментор, МН: Драгана Стојичић Наслов рада, НР:
“Микропропагација Micromeria pulegium (Benth.)”
Језик публикације, ЈП: српски Језик извода, ЈИ: енглески Земља публиковања, ЗП: Р. Србија Уже географско подручје, УГП: Р. Србија Година, ГО: 2013. Издавач, ИЗ: ауторски репринт Место и адреса, МА: Ниш, Вишеградска 33. Физички опис рада, ФО: (поглавља/страна/ цитата/табела/слика/графика/прилога) 38 стр. ; 11 слика, 5 табела Научна област, НО: биологија Научна дисциплина, НД: биологија Предметна одредница/Кључне речи, ПО: Micromeria pulegium, микропропагација
УДК 581.165.7:633.822
Чува се, ЧУ: библиотека
Важна напомена, ВН:
Извод, ИЗ: Micromeria pulegium (Benth.) је ендемична врста јужних Карпата, такође је и угрожена врста на Црвеној листи васкуларне флоре Србије и Црне Горе. У овом раду испитана је могућност регенерације биљака путем индукције аксиларних пупољака на нодалним експлантатима М. pulegium коришћењем различитих регулатора растења. Најефикасније комбинације хормона биле су: 3 μМ BA и 0,57 μМ IAA; и 10 μМ BA и 0,57 μМ IAA. Добијени аксиларни пупољци су издуживани а затим и ожиљени деловањем ауксина 0,1 μМ NAA.
Датум прихватања теме, ДП:
Датум одбране, ДО:
Чланови комисије, КО: Председник: Члан: Члан, ментор:
Образац Q4.09.13 - Издање 1
Q4.16.01 - Izdawe 1
Прилог 5/2
ПРИРОДНО - МАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ НИШ
KEY WORDS DOCUMENTATION
Accession number, ANO: Identification number, INO: Document type, DT: monograph Type of record, TR: textual / graphic Contents code, CC: master thesis Author, AU: Jovana Spasić Mentor, MN: Dragana Stojičić Title, TI: “Micropropagation of Micromeria pulegium (Benth.)”
Language of text, LT: Serbian Language of abstract, LA: English Country of publication, CP: Republic of Serbia Locality of publication, LP: Serbia Publication year, PY: 2013 Publisher, PB: author’s reprint Publication place, PP: Niš, Višegradska 33. Physical description, PD: (chapters/pages/ref./tables/pictures/graphs/appendixes) 38 p. ; 11 figures, 5 tables
Scientific field, SF: biology Scientific discipline, SD: biology Subject/Key words, S/KW: Micromeria pulegium, micropropagation.
UC 581.165.7:633.822
Holding data, HD: library
Note, N:
Abstract, AB: Micromeria pulegium (Benth.) is an endemic species of southern Karpats, it
is, as well, endangered species on the Red list of vascular flora in Serbia and
Montenegro. In this article we examine the possibility of plant regeneration
through induction of axillar buds on nodal explants M. Pulegium by using
different growth regulators. The most efficient hormone combinations were 3
μM BA and 0,57 μM IAA; and 10 μM BA and 0,57 μM IAA. Produced axilar
buds are extended and later tendrilled by auxin 0,1 μM NAA.
Accepted by the Scientific Board on, ASB: Defended on, DE: Defended Board, DB: President: Member: Member, Mentor:
Образац Q4.09.13 - Издање 1
