Embed Size (px)
Citation preview
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA
JOVITA JUODSNUKYTĖ
BALTYMŲ, IŠSKIRTŲ IŠ ISLANDINĖS KERPENOS
(CETRARIA ISLANDICA (L.) ACH.) GNIUŽULŲ, KOKYBINIS IR
KIEKYBINIS NUSTATYMAS, KIETŲJŲ KAPSULIŲ GAMYBA IR
BALTYMŲ ATSIPALAIDAVIMO IŠ KAPSULIŲ TYRIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovė:
prof. dr. Nijolė Savickienė
Konsultantas:
prof. habil. dr. Arūnas Savickas
KAUNAS, 2015
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
FARMACIJOS FAKULTETAS
FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas Vitalis Briedis
Data
BALTYMŲ, IŠSKIRTŲ IŠ ISLANDINĖS KERPENOS
(CETRARIA ISLANDICA (L.) ACH.) GNIUŽULŲ, KOKYBINIS IR
KIEKYBINIS NUSTATYMAS, KIETŲJŲ KAPSULIŲ GAMYBA IR
BALTYMŲ ATSIPALAIDAVIMO IŠ KAPSULIŲ TYRIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Konsultantas:
prof. habil. dr. Arūnas Savickas
Data
Recenzentas
Darbo vadovas
prof. dr. Nijolė Savickienė
Data
Darbą atliko
Magistrantė
Jovita Juodsnukytė
Data
Data
KAUNAS, 2015
2
TURINYS
SANTRAUKA ............................................................................................................................................... 4
SUMMARY ................................................................................................................................................... 6
SANTRUMPOS ............................................................................................................................................. 9
ĮVADAS ...................................................................................................................................................... 10
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ........................................................................................................ 11
1. LITERATŪROS APŽVALGA ................................................................................................................ 12
1.1. Islandinės kerpenos (Cetraria islandica (L.) Ach.) gniužulų cheminė sudėtis .................................... 12
1.2. Islandinės kerpenos vaistinės žaliavos - gniužulų, farmakologinis poveikis ir pritaikymo galimybės
medicinoje .................................................................................................................................................... 12
1.2.1. Priešvėžinis poveikis .......................................................................................................................... 12
1.3.1. Gelchromatografija ............................................................................................................................ 14
1.4. Baltymų kokybinis nustatymas ............................................................................................................. 15
1.4.2. Masių spektrometrija ......................................................................................................................... 16
1.5. Baltymų kiekybinis nustatymas ............................................................................................................ 17
1.5.1. Lowry kiekybinio baltymų nustatymo metodas ................................................................................. 18
1.5.3. Baltymų kiekybinis nustatymas Bradford metodu ............................................................................. 18
1.6. Baltymų technologinis funkcionalizavimas .......................................................................................... 19
1.6.1 Kietųjų kapsulių gamyba .................................................................................................................... 20
2. TYRIMO METODIKA ........................................................................................................................... 22
2.1. Tyrimo medžiagos ................................................................................................................................ 22
2.2. Reagentai............................................................................................................................................... 22
2.2.1. Reagentų paruošimas ......................................................................................................................... 23
2.2.1.1. Baltymų elektroforezei naudotų tirpalų ruošimas: .......................................................................... 23
2.2.1.2. NaDS – PAGE gelio paruošimas ir užpildymas ............................................................................. 23
3
2.2.1.3. Fosfatinio buferinio tirpalo gamyba ................................................................................................ 24
2.3. Įranga .................................................................................................................................................... 24
2.4.1. Baltymų frakcionavimas gelchromatografijos metodu ...................................................................... 25
2.4.2. Kiekybinis baltymų nustatymas Bradford metodu ............................................................................ 25
2.4.3. NaDS poliakrilamidinio gelio elektroforezė ...................................................................................... 26
2.4.4. Kietųjų kapsulių su baltymais gamyba .............................................................................................. 27
2.4.5. Birumo greitis ir subėrimo kampas .................................................................................................... 28
2.4.6. Kapsulių masės vienodumo testas ..................................................................................................... 29
2.4.7. Kietųjų kapsulių tirpimo testas .......................................................................................................... 29
2.4.8. Tyrimų duomenų statistinis įvertinimas............................................................................................. 30
3. TYRIMŲ REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ..................................................................................... 31
3.1. Baltymų frakcionavimas ....................................................................................................................... 31
3.2. Baltymų kiekybinis nustatymas ............................................................................................................ 32
3.3. Baltymų molekulinės masės nustatymas, taikant NaDS – PAGE elektroforezę .................................. 33
3.4. Kietųjų kapsulių gamyba ...................................................................................................................... 34
3.5. Kapsulių masės vienodumo testas ........................................................................................................ 34
3.6. Birumo nustatymas ............................................................................................................................... 35
3.7. Baltymų atsipalaidavimo iš kapsulių tyrimas ....................................................................................... 35
4. IŠVADOS ................................................................................................................................................ 37
5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ...................................................................................................... 38
6. LITERATŪROS SĄRAŠAS ................................................................................................................... 39
7. PRIEDAI .................................................................................................................................................. 43
4
SANTRAUKA
BALTYMŲ, IŠSKIRTŲ IŠ ISLANDINĖS KERPENOS (CETRARIA
ISLANDICA (L.) ACH.) GNIUŽULŲ, KOKYBINIS IR KIEKYBINIS
NUSTATYMAS, KIETŲJŲ KAPSULIŲ GAMYBA IR BALTYMŲ
ATSIPALAIDAVIMO IŠ KAPSULIŲ TYRIMAS
Jovitos Juodsnukytės magistro baigiamasis darbas/ mokslinė vadovė prof. Nijolė Savickienė1
Konsultantas: prof. habil. dr. Arūnas Savickas2
1Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Farmakognozijos katedra. – Kaunas.
2Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Vaistų technologijos ir sociainės
farmacijos katedra. – Kaunas.
Darbo tikslas: Nustatyti baltymų, išskirtų iš islandinės kerpenos (Cetraria islandica (L.) Ach.) gniužulų,
kokybinę ir kiekybinę sudėtį, pagaminti kietąsias kapsules ir atlikti baltymų atsipalaidavimo iš kapsulių
tyrimą.
Darbo uždaviniai:
1. Išskirstyti Cetraria islandica (L.) Ach. baltymus į frakcijas.
2. Nustatyti baltymų kiekį ir molekulinę masę.
3. Pagaminti kietąsias kapsules su Cetraria islandica (L.) Ach. gniužulų baltymais.
4. Ištirti Cetraria islandica (L.) Ach. baltymų atsipalaidavimą iš kietųjų kapsulių.
Metodika:
1. Gelchromatografijos metodo pagalba Cetraria islandica (L.) Ach. baltymai išskirti į frakcijas pagal jų
molekulių dydį.
2. Natrio dodecilsulfato poliakrilamido gelio (NaDS – PAGE) elektroforezės metodu nustatyta frakcijose
esančių baltymų molekulinė masė.
3. Cetraria islandica (L.) Ach. baltymai kiekybiškai nustatyti, taikant Bradford metodą.
4. Baltymų atsipalaidavimas iš kietųjų kapsulių tirtas krepšelio metodu.
5
Rezultatai:
1. Gelchromatografijos metu Cetraria islandica (L.) Ach. baltymai išskirstyti į 69 frakcijas.
2. NaDS – PAGE elektroforezės metu nustatyta baltymų molekulinė masė - 40, 55 ir 130 kDa.
3. Atlikus Bradford kiekybinį baltymų frakcijų tyrimą, nustatyta, kad Cetraria islandica (L.) Ach.
baltymų koncentracija frakcijose yra nuo 2.263± 0.07 µg/ml iki 6.722± 0.09 µg/ml.
4. Didžiausias baltymų kiekis atsipalaidavo iš kietųjų kapsulių po 60 min.
Išvados:
1. Gelchromatografijos metodas nebuvo pakankamai selektyvus baltymų atskyrimui - baltymai atsiskyrė
tik dalinai.
2. Frakcijose nustatyta didžiausia baltymų koncentracija - 6.722± 0.09 µg/ml. Šiose frakcijose nustatyta
40, 50 ir 130 kDa baltymų molekulinė masė.
3. Naudojant Prosolv® ir aerosilo pagalbines medžiagas, pagamintos kietosios kapsulės, turinčios po
3.68 µg baltymų. Miltelių birumo ir kapsulių vienodumo testo rezultatai atitiko Europos farmakopėjoje
keliamus reikalavimus.
4. Nustatyta, kad baltymai iš Cetraria islandica (L.) Ach. kapsulių atsipalaiduoja dalinai – iki 63±0.58
proc.
Reikšminiai žodžiai: Cetraria islandica (L.) Ach., augalų baltymai, gelfiltracija, NaDS – PAGE.
6
SUMMARY
PROTEINS, SEPARATED FROM CETRARIA ISLANDICA (L.)
ACH. THALLUS, QUALITATIVE AND QUANTITATIVE
ANALYSIS, CAPSULATION AND DETERMINATION OF
PROTEIN RELEASE FROM HARD CAPSULES
Jovita Juodsnukytė master thesis/ Supervisor of the research paper: prof. dr. Nijolė Savickienė1
Consultant: prof. habil. dr. Arūnas Savickas2
1Department of Pharmacognosy, Faculty of Pharmacy, Lithuanian University of Health Sciences, Kaunas,
Lithuania;
2 Department of Drug Technology and Social Pharmacy, Faculty of pharmacy, Lithuanian University of
Health Sciences, Kaunas, Lithuania;
Objective of work: to perform qualitative and quantitative analysis of proteins from Cetraria islandica
(L.) Ach thallus, to accomplish capsulation and to value the release of proteins from hard capsules.
Main tasks:
1. To separate proteins into fractions.
2. To estimate the quantity and molecular mass of proteins.
3. To prepare hard capsules enriched with Cetraria islandica (L.) Ach. protein fractions.
4. To evaluate release of proteins from hard capsules.
Methods:
1. Size Exclusion Chromatography was used for the protein separation into fractions.
2. The molecular mass of proteins was estimated by using SDS – PAGE electrophoresis.
3. The quantity of protein was measured by Bradford method.
4. Proteins release from hard capsules was measured with bascet apparatus.
Results:
7
1. Proteins of Cetraria islandica (L.) Ach. thallus were separated into 69 fractions during Size Exclusion
Chromatography.
2. SDS-PAG electrophoresis shows results, that molecular mass of proteins is respectively 44, 55 and 130
kDa.
3. The amount of proteins fractions was determined using Bradford assay. It was estimated, concentration:
2.263± 0.07 µg/mL - 6.722± 0.09 µg/mL.
4. The maximum amount of proteins was released after 60 min.
Conclusions:
1. Method of gelfiltration was not selective enough - proteins were separated partly.
2. The highest protein concentration - 6.722 ± 0.09 µg/ml. In these fractions molecular mass of protein
was 40, 50 and 130 kDa.
3. Capsules enriched of proteins were prepared using Prosolv® and aerosil excipients, with 3.68 µg of
proteins. Powder flow and uniformity of capsules matched requirements of European Pharmacopea.
4. Determined, that proteins from Cetraria islandica (L.) Ach capsules realesed 63±0.58 proc.
Key words: Cetraria islandica (L.) Ach, Size Exclution Chromatography, proteins of plants, SDS-PAGE.
8
PADĖKA
Nuoširdžiai dėkoju magistrinio baigiamojo darbo vadovei prof. dr. Nijolei Savickienei bei
magistrinio baigiamojo darbo konsultantui prof. habil. dr. Arūnui Savickui už visapusišką pagalbą,
bendradarbiavimą ir konsultacijas magistrinio darbo metu.
Taip pat norėčiau padėkoti Vilniaus universiteto Biotechnologijos instituto darbuotojams, ypač
Gitanai Mickienei ir Editai Mištinienei už naudingas konsultacijas bei pagalbą magistrinio baigiamojo
darbo metu.
9
SANTRUMPOS
Akrilamido-BIS - N,N′-Metilen – bis – akrilamidas;
APS – amonio persulfatas;
BCR – Bicinchoninė rūgštis;
Eur. Ph. - Europos Farmakopėja;
IL-10 – interleukinas-10;
IL-12 – interleukinas-12;
MS - Masių spektroskopija;
NaDS – natrio dodecilsulfatas;
NaDS-PAGE - natrio dodecilsulfato poliakrilamido gelio elektroforezė;
PBS – fosfatinio buferio tirpalas;
TEMED – N,N,N',N'-Tetrametiletan-1,2-diaminas (angl. N,N,N',N'-tetramethylethane-1,2-
diamine);
TRIS - Tris(hidroksimetil)aminometanas (angl. Tris (hydroxymethyl)aminomethane);
TRIS-HCl - Tris(hidroksimetil)aminometano ir druskos rūgšties buferis.
10
ĮVADAS
Islandinės kerpenos (Cetraria islandica (L.) Ach.) preparatai, pasižymintys antibakteriniu,
apetitą gerinančiu poveikiu dažniausiai vartojami arbatų ar pastilių forma. Mokslinėje literatūroje
aprašomi Cetraria islandica (L.) Ach, antriniai metabolitai – polisacharidai-gliukanai, tokie kaip
lichenanas ar izolichenanas, tiriamas jų poveikis bei pritaikymo galimybės. Nedaug dėmesio skiriama
pirminiams metabolitams, ypač baltymams, kurie gali būti naudojami profilaktikos ar gydymo tikslais.
Siekiant tiksliai nustatyti baltymų, išskirtų iš Cetraria islandica (L.) Ach. biologinį aktyvumą bei
atlikti in vivo tyrimus, būtina pagaminti farmacinę formą, praturtintą baltymais. Tyrimo metu pasirinkta
farmacinė forma – kietosios kapsulės, dėl paprasto gamybos būdo. Kietosios kapsulės yra puiki talpykla
įvairioms vaistinėms medžiagoms. Šią vaisto formą patogu vartoti.
Temos aktualumas ir tyrimo problema: Mokslinėje literatūroje nėra duomenų apie Cetraria
islandica (L.) Ach esančius baltymus. Dažniausiai Cetraria islandica (L.) Ach tyrimo objektu yra
gniužuluose esantys polisacharidai - lichenanas ir izolichenanas, bei antriniai Cetraria islandica (L.) Ach
metabolitai - protolichesterininė bei fumarprotocetrarinė rūgštys [1], mikrobiologinių tyrimų metu
nustatytas fenolinių junginių bei flavonoidų aktyvumas [2]. Todėl buvo aktualu nustatyti Cetraria
islandica (L.) Ach baltymų kokybinę – kiekybinę sudėtį, kapsuliuoti bei ištirti baltymų atsipalaidavimą iš
kietųjų kapsulių.
Tyrimo rezultatai žodiniu pranešimu pristatyti 2014 metais vykusioje Studentų Mokslininkų
Draugijos organizuojamoje Jaunųjų Mokslininkų ir Tyrėjų Konferencijoje, tema „Baltymų frakcijų,
praturtintų lektinais, išskirtų iš Echinacea purpurea L. Moench šaknų ir šakniastiebių, Chelidonium majus
L. žolės, Cetraria islandica L. gniužulų, antioksidacinio aktyvumo tyrimas“. Taip pat, 2014 metais
vykusioje tarptautinėje konferencijoje “The 5th International Conference on Pharmaceutical Sciences and
Pharmacy Practice“ buvo pristatytas stendinis pranešimas „Fractionation and determination of proteins
isolated from Cetraria islandica (L.) Ach. thallus”. Paruošta publikacija žurnalui Acta Pharmaceutica
tema „Fractionation and determination of proteins in Echinacea purpurea (L.) Moench roots“ (Gabriele
Balčiūnaitė, Jovita Juodsnukytė, Arūnas Savickas, Ona Ragažinskienė, Luka Šiatkutė, Gitana Žvirblytė,
Edita Mištinienė, Nijolė Savickienė).
Magistrinio darbo tyrimas yra dalis bendro Lietuvos – Baltarusijos projekto „Naujų augalinės
kilmės polipeptidų lektinų tyrimas ir panaudojimo būdų paieška, kuriant potencialius imunomoduliatorius
ir citostatikus“ (Nr. TAP-LB-12-006), atlikto bendradarbiaujant su Baltarusijos Valstybinės mokslų
akademijos, V.F. Kuprevičiaus eksperimentinės botanikos institutu.
11
Eksperimentas atliktas Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Farmakognozijos katedroje,
Vaistų technologijos ir socialinės farmacijos katedroje bei Vilniaus universiteto Biotechnologijos instituto
eukariotų genų inžinerijos laboratorijoje 2013 - 2014m.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Tyrimo objektas: baltymų frakcijos, išskirtos iš islandinės kerpenos (Cetraria islandica (L.)
Ach.) gniužulų, buvo paruoštos Baltarusijos Valstybinės mokslų akademijos, V.F. Kuprevičiaus
eksperimentinės botanikos institute.
Temos aktualumas ir tyrimo problema: Mokslinėje literatūroje nėra duomenų apie Cetraria
islandica (L.) Ach esančius baltymus. Dažniausiai Cetraria islandica (L.) Ach tyrimo objektu yra
gniužuluose esantys polisacharidai - lichenanas ir izolichenanas, bei antriniai Cetraria islandica (L.) Ach
metabolitai - protolichesterininė bei fumarprotocetrarinė rūgštys [1], mikrobiologinių tyrimų metu
nustatytas fenolinių junginių bei flavonoidų aktyvumas. [2] Todėl buvo aktualu nustatyti Cetraria
islandica (L.) Ach baltymų kokybinę – kiekybinę sudėtį, kapsuliuoti bei ištirti baltymų atsipalaidavimą iš
kietųjų kapsulių.
Tikslas: Nustatyti baltymų, išskirtų iš islandinės kerpenos (Cetraria islandica (L.) Ach.)
gniužulų, kokybinę ir kiekybinę sudėtį, pagaminti kietąsias kapsules ir atlikti baltymų atsipalaidavimo iš
kietųjų kapsulių tyrimą.
Uždaviniai: 1. Išskirstyti Cetraria islandica (L.) Ach. baltymus į frakcijas.
2. Nustatyti baltymų kiekį ir molekulinę masę.
3. Pagaminti kietąsias kapsules su Cetraria islandica (L.) Ach. gniužulų baltymais.
4. Ištirti Cetraria islandica (L.) Ach. baltymų atsipalaidavimą iš kietųjų kapsulių.
12
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Islandinės kerpenos (Cetraria islandica (L.) Ach.) gniužulų cheminė
sudėtis
Islandinė kerpena (Cetraria islandica (L.) Ach.) priskiriama gniužuliniams (žemesniesiems)
augalams, kerpių skyriui, Ascolichenes klasei ir kežinių šeimai [3]. Kerpės sudarytos iš dviejų junginių
grupių: pirminių metabolitų, esančių ląstelių viduje ir antrinių metabolitų, esančių tarpląstelinėje erdvėje.
Dažniausiai pasitaikantys pirminiai metabolitai yra baltymai, riebalai, angliavandeniai, amino rūgštys,
karotenoidai, polisacharidai ir vitaminai. Šie junginiai yra sintetinami kerpėje, dalyvauja metaboliniuose
procesuose ir yra kerpių gniužulo struktūros pagrindas. Antrinius metabolitus sintetina kerpės grybinė
dalis, ir šie metabolitai yra individualūs kiekvienai rūšiai. Šiuo metu yra žinoma apie 350 antrinių kerpių
metabolitų. Jie sudaro 0.1 – 10 proc. gniužulo sausos žaliavos [4, 5].
Cetraria islandica (L.) Ach gniužulo cheminėje sudėtyje daugiausia yra polisacharidų. Jie sudaro
20 – 25 proc. Pagrindiniai polisacharidai yra lichenanas, izolichenanas ir α-D-gliukanas. Taip pat
islandinėje kerpenoje aptinkama natūralių cukrų, tokių kaip galaktozė, manozė ir ramnozė, rūgščių:
fumaroprotocetrarinės rūgšties (2.6-11.5 proc.), protocetrarinės rūgšties (0.2-0.3 proc.), pėdsakai usninės
rūgšties (0.04 proc.). Taip pat randama nedideli kiekiai mineralų, fosfolipidų, sterolių [6].
1.2. Islandinės kerpenos vaistinės žaliavos - gniužulų, farmakologinis poveikis ir
pritaikymo galimybės medicinoje
Islandinės kerpenos vaistinė augalinė žaliava – gniužulai, dažniausiai vartojama simptominiam
gerklės skausmui ir dirginimui, taip pat sausam kosuliui mažinti bei esant apetito sutrikimams [7].
Analizuojant mokslinius literatūros šaltinius, randama in vivo ir in vitro tyrimų, kurių metu
nustatyta, kad islandinėje kerpenoje esančios medžiagos pasižymi antioksidaciniu, imunomoduliuojančiu,
priešuždegiminiu, antibakteriniu, priešvirusiniu, priešvėžiniu veikimu [6, 8].
1.2.1. Priešvėžinis poveikis
2014 metais atlikto tyrimo metu nustatytas islandinių kerpenų gniužulų priešvėžinis aktyvumas
[1]. Tyrimui pasirinktas metanolinis gniužulų ekstraktas, tirtos žmogaus melanomos (FemX) ir žmogaus
13
tiesiosios žarnos karcinomos (LS174) ląstelės. Islandinių kerpenų gniužulų metanolinis ekstraktas
pasižymėjo priešvėžiniu veikimu abiejose ląstelių grupėse. FemX ląstelių grupei IC50 buvo 22,68±2,03
µg/ml ir LS174 ląstelių grupei IC50 - 33,74±0,36 µg/ml. IC50 – ekstrakto kiekis, reikalingas 50 proc.
vėžinių ląstelių aktyvumo nuslopinimui. Kontrolei buvo naudojama cisplatina. Islandinių kerpenų
gniužulų metanolinis ekstraktas pasižymėjo silpnesniu poveikiu nei cisplatina [1,9].
1.2.2. Imunomoduliacinis aktyvumas
Nustatyta, kad vandeninis islandinių kerpenų antrinių metabolitų ekstraktas pasižymi
imunomoduliaciniu veikimu. 2008 metais atlikto tyrimo metu nustatytas islandinių kerpenų gniužulų
ekstrakto poveikis žmogaus dendritinėms ląstelėms, matuojant IL-10 ir IL-12p40 išsiskyrimą. Tyrimo
metu nustatyta, kad islandinių kerpenų gniužulų ekstraktas turi imunomoduliacinį poveikį, kadangi
padidėja IL-10 ir IL-12p40 koncentracija. Nustatyta, kad lichenanas yra pagrindinis islandinių kerpenų
junginys, nulemiantis augalo imunomoduliacinį poveikį [2].
1.2.3. Antioksidantininis aktyvumas
Mokslinėje literatūroje randama duomenų apie antioksidantinį islandinių kerpenų gniužulų poveikį
[10–12]. Nustatyta, kad šį poveikį lemia islandinės kerpenos cheminėje sudėtyje esantys fenoliniai
junginiai. 2005 metais atlikto tyrimo metu [12] palyginti 21 medicinoje vartojami augalai, tarp kurių
islandinė kerpena pasižymėjo silpnu antioksidantiniu aktyvumu.
1.2.4. Antibakterinis poveikis
Atliktuose tyrimuose nustatyta, kad Parmeliaceae šeimos augaluose esančios medžiagos pasižymi
antibakteriniu poveikiu [1,5,13,14]. 2014 metais publikuotame darbe teigiama, kad islandinių kerpenų
gniužulų metanolinis ekstraktas pasižymi silpnu antibakteriniu ir priešgrybeliniu aktyvumu. Tyrimo metu
islandinių kerpenų gniužulų metanolinis ekstraktas buvo palygintas su antibiotiku - streptomicinu ir
priešgrybeliniu vaistu - ketokonazoliu. Eksperimento metu, palyginus gautus rezultatus su kontrole,
nustatyta, kad Cetraria islandica (L.) Ach. gniužulų metanolinis ekstraktas pasižymi silpnu antibakteriniu
poveikiu [1].
14
1.3. Baltymų išskirstymas
Siekiant kuo tiksliau atlikti augaluose esančių baltymų analizę, tikslinga atlikti junginių
skirstymą. Augaluose esančių baltymų išskirstymui dažniausiai naudojami įvairūs chromatografijos
metodai, tokie kaip jonų mainų chromatografija ar gelchromatografija. Jonų mainų chromatografijoje
baltymų frakcionavimas pagrįstas jonine sąveika tarp baltymų ir nejudriosios fazės jonų.
Gelchromatografija yra paprastesnis metodas, jis paremtas junginių skirstymu remiantis jų dalelių dydžiu.
Gelchromatografija yra dažnai pasirenkams metodas, norint išskirti baltymus iš biologinių junginių [15].
1.3.1. Gelchromatografija
Gelchromatografija - medžiagų atskyrimo metodas, pagrįstas tiriamojo objekto molekulių
dydžiu. Gelchromatografijos metu molekulės, tekėdamos per kolonėlėje esantį gelį, atskiriamos pagal
dydžio skirtumus. Kitaip nei kitose chromatografijos rūšyse, molekulės nesijungia su nejudančia faze,
kuria užpildyta kolonėlė.
Gelchromatografija yra plačiai pritaikoma molekulių, kurios yra jautrios pH, temperatūros
pokyčiams, atskyrimui. Gelchromatografija gali būti atliekama įvairiomis sąlygomis, įvairiu
temperatūriniu režimu [16].
Gelchromatografijos metu naudojama kolonėlė yra užpildoma porėtu geliu. Šis gelis turi būti
stabilus ir nereaguoti su medžiagomis, kurias norima atskirti. Prieš pradedant gelchromatografiją, į geliu
užpildytą kolonėlę įleidžiama buferio, kuris naudojamas kaip mobilioji fazė baltymams ar kitoms
tiriamoms medžiagoms pernešti. Buferio įleidžiama tam, kad jis užpildytų gelio poras bei pašalintų
galimai esančius oro tarpus.
Gelchromatografija paremta principu, jog medžiagos iš kolonėles išteka dalelių dydžių
mažėjimo tvarka, t.y. iš kolonėlės pirmieji išteka stambiausi junginiai, kadangi jie neprasiskverbia į gelio
poras. Po didesnių junginių iš kolonėlės išteka smulkesni junginiai. Visas procesas trunka tol, kol buferis
prateka pro kolonėlę [16]. Iš kolonėlės ištekėjusius junginius fiksuoja UV detektoriai, grafike stebimi iš
kolonėlės ištekėjusių medžiagų pikai pavaizduoti 1 paveikslėlyje.
15
1 Pav. Gelchromatorgafijos medžiagų atskyrimo tvarka
1.4. Baltymų kokybinis nustatymas
Siekiant identifikuoti baltymus, esančius junginyje, naudojama kokybinė analizė. Dažnai
baltymų nustatymui naudojami NaDS – PAGE ir masių spektrometrijos metodai. Šie metodai yra jautrūs,
greitai atliekami, pasižymi dideliu specifiškumu, jiems nereikia didelių tiriamųjų medžiagų kiekių. Taip
pat, šių metodų pagalba, tuo pačiu metu galima atlikti keleto baltymų kokybinį nustatymą. Na-DS –
PAGE metodas paremtas junginių atskyrimu pagal jų molekulinę masę [17]. Masių spektrometrijos
metodas paremtas medžiagų jonizacija bei jonizuotų medžiagų skirstymu [18].
1.4.1. Natrio dodecilsulfato poliakrilamidinio gelio elektroforezė (NaDS-PAGE)
NaDS PAGE elektroforezė - metodas, kuris taikomas, norint apytiksliai įvertinti baltymų
molekulinę masę, santykinį baltymų kiekį, esantį tiriamajame mėginyje [19]. Šis tyrimas taip pat
naudojamas augalinės kilmės baltymų nustatymui. NaDS – PAGE tyrimas paremtas junginių atskyrimu
pagal jų molekulinę masę [20]. Elektroforezės sistema susideda iš dviejų gelių, kuriais teka elektros
srovė. Pirmasis gelis yra koncentruojantis, kuriame baltymai yra sukoncentruojami prieš jiems patenkant į
antrąjį gelį. Antrasis gelis yra frakcionuojantis, jame baltymai pasiskirsto pagal jų molekulinę masę [17].
16
Dėl baltymuose esančių disulfidinių jungčių hidrofilinės ir hidrofobinės sąveikos, baltymai yra
sferiniai, antrinės ar tretinės struktūros. Norint tiksliai nustatyti baltymų molekulinę masę, šias
susiformavusias baltymo struktūras reikia išardyti. Tam naudojami detergentai. Elektroforezėje
naudojamas natrio dodecilsulfatas (NaDS). Jis veikia baltymo hidrofilinę ir hidrofobinę struktūrą. NaDS
taip pat padengia kiekvieną baltymo molekulę ir suteikia baltymui neigiamą krūvį, kurio pagalba baltymai
elektroforezės metu gali judėti link teigiamo elektros krūvio. NaDS – PAGE elektroforezės metodo
schema pateikta 2 paveikslėlyje [17,21].
2 Pav. NaDS – PAGE metodo schema.
(http://www.chem.fsu.edu/chemlab/bch4053l/character/mwdetermination/background.html)
1.4.2. Masių spektrometrija
Masių spektrometrija – plačiai naudojamas analitinis metodas junginių charakterizavimui bei
kiekybiniam nustatymui. Metodo pagalba galima tirti mažos molekulinės masės junginius, baltymus bei
vaistų metabolitus [22]. Masių spektrometrijos metodas yra paremtas medžiagų jonizacija bei jonizuotų
medžiagų skirstymu. Molekulių jonai identifikuojami pagal masės bei krūvio santykį. Šio metodo pagalba
galima sužinoti molekulinę junginio masę [23]. Masių spektrometrijos privalumai yra: reikalingas
nedidelis mėginio kiekis, greitas medžiagų diferencijavimas, gali būti suderintas su kitais metodais.
17
Nepaisant privalumų, šis metodas turi ir trūkumų: tiesiogiai nesuteikia junginio struktūrinės informacijos,
norint atlikti tyrimą, tiriamieji junginiai turi būti gryni [18].
Norint nustatyti ir charakterizuoti junginių molekulinę sudėtį, masių spektrometrija junginius
paverčia jonais – jonizuoja. Tuomet jonizuoti junginiai gali judėti elektriniame ir magnetiniame laukuose.
Yra trys svarbiausios masių spektrometrijos funkcijos ir komponentai: jonizacijos šaltinis, masių
analizatorius ir detektorius.
Jonizacijos šaltinyje, jonai patenka į vakuuminę zoną, kur tiriamojo junginio jonai yra sumaišomi
su judriosios fazės dujomis. Elektronų veikiamos judrios fazės molekulės protonizuojamos arba
deprotonizuojamos, įgavę krūvį judrios fazės molekulės deprotonizuoja arba protonizuoja tiriamojo
junginio – analitės molekules. Analitės, priešingo krūvio elektrodo, yra nukreipiamos į masių analizatorių
[18].
Masių analizatorių yra keletas rūšių: kvadrupolinis masių analizatorius, kvadrupolinė jonų
gaudyklė, lėkio trukmės masių analizatorius, jonų ciklotroninio rezonanso analizatorius. Masių
analizatoriuje jonai yra suklasifikuojami ir atskiriami pagal jų krūvį ir masę. Vienas plačiausiai
naudojamų analizatorių yra kvadrupolinis masių analizatorius. Jis sudarytas iš keturių, vienas prieš kitą
išsidėsčiusių strypų. Šie strypai yra prijungti prie kintamosios bei nuolatinės įtampos generatoriaus.
Sudaromas aukšto dažnio kintamas elektros laukas. Jonai iš jonizacijos šaltinio, patekę į kvadrupolinį
masių analizatoriaus elektros lauką, jame pradeda virpėti plokštumoje, statmenoje jo judėjimo krypčiai.
Elektrinio lauko stipriui sutapus su jono energija, kuri priklauso nuo jono masės ir krūvio santykio. Jonas
praskrenda tarp strypų, į juos neatsitrenkdamas ir yra užregistruojamas. Priešingu atveju, jonui
atsitrenkus, jis nėra registruojamas. Taigi keičiant elektrinio lauko stiprį, yra atliekamas jonų masės ir
krūvio skenavimas. Iš masių analizatoriaus jonai patenka į detektorių, kur atskirti jonai yra
identifikuojami ir atitinkamai pavaizduojami lentelėse. Masių spektrometrija yra plačiai taikoma
augalinių baltymų identifikavimui [18,24].
1.5. Baltymų kiekybinis nustatymas
Augale esančių baltymų koncentracijai nustatyti dažniausiai naudojami spektrofotometriniai
metodai, paremti UV ir regimosios šviesos absorbcija. Nustatymas pagrįstas tiriamųjų baltymų
koncentracijos lyginimu su žinomos koncentracijos baltymais. Dažniausiai naudojami tradiciniai baltymų
nustatymo metodai – Lowry, BCR, ir Bradfordo [25].
18
1.5.1. Lowry kiekybinio baltymų nustatymo metodas
Lowry baltymų kiekybinis nustatymas paremtas Cu2+ virtimo į Cu+ reakcija. Iš pradžių vyksta
baltyme esančių peptidinių jungčių reakcija su Cu2+ jonais, vėliau Cu 2+ virsta Cu+ jonais, kurie reaguoja
su Folin-Ciocalteau reagentu. Reakcijos metu susidaro mėlynas junginys. Junginio spalvos intensyvumas
tiesiogiai priklauso nuo amino rūgščių (tirozino, triptofano) kiekio tiriamajame junginyje. Šiuo metodu
baltymų koncentracija nustatoma 1-1000 µg/ml ribose [25–27]. Lowry metodo reakcija yra jautri
įvairioms medžiagoms, šis metodas išsiskiria tuo, kad tyrimas gali būti atliekamas esant stipriai šarminei
aplinkai - pH 10.0-10.5 [28].
1.5.2. Bicinchoninės rūgšties kiekybinio baltymų nustatymo metodas
Kiekybinis baltymų nustatymas bicinchoninės rūgšties (BCR) metodu paremtas Cu2+ virtimo į
Cu+ reakcija. Šis baltymų kiekio nustatymas remiasi tuo pačiu principu kaip ir LOWRY baltymų kiekio
nustatymas. Cu2+ reaguoja su peptidinėmis baltymų jungtimis, virsta Cu+. Cu+ reaguoja su BCR reagentu,
reakcijos produktas - ryškiai rožinės spalvos junginys. Spalvos intensyvumas priklauso nuo baltymų
kiekio esančio junginyje. Reakcijos produkto absorbcija matuojama spektrometru ir nustatoma
koncentracija, pasitelkiant jau žinomų, standartinių koncentracijų baltymų tirpalus, baltymų koncentracija
nustatoma 20-2000 µg/ml ribose [25,29].
BCR kiekybinio baltymų nustatymo metodas yra pranašesnis už Lowry metodą, kadangi šiame
metode naudojamų medžiagų neveikia platus spektras detergentų bei denatūruojančių medžiagų, (NaDS,
šlapalas, kai kurios amino rūgštys, riebalai) kurios veikia Lowry metodą [29]. Taip pat BCR metodo
reakcija yra stabili esant vidutiniškai šarminam pH. Lowry metodas yra stabilus esant pH 10.0-10.5.
Lyginant su Lowry metodu, BCR metodas yra jautresnis, bet atliekant tyrimus su redukuojančiomis
medžiagomis reikėtų rinktis Lowry metodą [28].
1.5.3. Baltymų kiekybinis nustatymas Bradford metodu
Bradfordo kiekybinis tyrimas yra tikslus ir greitai atliekamas metodas. Literatūros duomenimis,
Bradford metodą rekomenduojama naudoti bendram baltymų kiekio nustatymui, ypač įvertinant baltymų
kiekį, prieš taikant NaDS PAGE elektroforezę [30]. Augalų baltymų kiekybiniam nustatymui vienas iš
dažniausiai naudojamų metodų ir yra Bradford kiekybinio baltymų nustatymo metodas [16,31,32].
19
Bradford kiekybinis nustatymas paremtas Coomassie G-250 dažo jungimosi su baltymais
reakcija. Coomassie dažas egzistuoja keturiose skirtingose joninėse formose. Anijoninė mėlyna dažo
forma jungiasi su baltymais. Reakcijos metu susidaro dažo - baltymo kompleksas. Baltymų koncentracija
gali būti nustatoma, matuojant tirpalo absorbciją spektrofotometru, esant 595 nm bangos ilgiui (3 pav.).
Coomassie G-250 dažas dažniausiai jungiasi prie arginino, triptofano, tirosino, histidino ir fenilalanino
grupių [33]. Šis metodas yra lengvai atliekamas. Bradford metodu baltymų nustatymo ribos yra 2-2000
µg/ml [27]. Didžiausias Bradfordo metodo privalumas, lyginant jį su kitais metodais yra jautrumas ir
reakcijos greitis. Šią reakciją galima atlikti per labai trumpą laiką, tai puikiai tinka greitam baltymų kiekio
nustatymui. Bradfordo metodas, lyginant jį su Lowry metodu taip pat pasižymi maži jautrumu įvairiems
detergentams [28].
3 Pav. Bradford kiekybinio nustatymo metodo schema [33].
1.6. Baltymų technologinis funkcionalizavimas
Baltymams gali būti suteiktos perenteralinės (injekcijos) ir neperenteralinės (geriamosios,
inhaliacinės, transdermalinės) farmacinės formos. Atliekant ikiklinikinius tyrimus, tiriant baltymų
atsipalaidavimą, dažnai pasirenkama farmacinė forma – kapsulės. Kapsulės yra kieta vaisto forma,
dažniausiai skiriama vartoti per os. Kapsulės gali turėti kietą arba minkštą apvalkalą, gali būti įvairaus
dydžio ar formos. Kietosios kapsulės, lyginant jas su kitomis farmacinėmis formomis, turi daug
privalumų. Jos yra unikalios formos, lengvo vartojimo. Taip pat kapsulės turi geresnį biopraeinamumą
nei tabletės. Dėl greitai suyrančio kietųjų kapsulių želatininio apvalkalo, veikliosios medžiagos
atsipalaiduoja per trumpą laiką. Kietųjų kapsulių nesudėtinga gamyba, atliekama mažiau kokybę
užtikrinančių testų, gamybai naudojama nedaug įrangos [34].
Nepaisant privalumų, kapsulės turi ir trūkumų. Lyginant kapsulių ir tablečių gamybą pramoniniu
būdu, per tokį patį laiko tarpą, kapsuliavimo mašinos pagamina mažiau kapsulių, nei tabletavimo
mašinos – tablečių. Kapsulės negali būti užpildytos koncentruotais preparatais, druskomis (bromidais,
jodidais), kadangi jiems atsipalaidavus iš kapsulių, dėl lokalaus poveikio, gali kilti virškinimo trakto
20
dirginimas. Kietosios kapsulės negali būti užpildytos higroskopinėmis medžiagomis, kadangi jos sugeria
vandenį esantį kapsulėje. Netekę vandens kapsulės tampa trapiomis [34].
1.6.1 Kietųjų kapsulių gamyba
Kapsulių apvalkalas gaminamas iš želatinos arba kitų medžiagų. Apvalkalo konsistencija gali
būti keičiama pridedant įvairių medžiagų, tokių kaip glicerolis ar sorbitolis. Kietųjų kapsulių želatininio
apvalkalo gamybai gali būti naudojami dažikliai, pigmentai, paviršiui aktyvios medžiagos. Gaminant
kietųjų kapsulių apvalkalus, nerūdijančio plieno rezervuaruose, 60-70 °C temperatūros demineralizuotame
vandenyje, ištirpinama želatina. Gaunamas klampus, turintis oro burbuliukų, 30-40 proc. želatinos
tirpalas. Norint pašalinti oro burbuliukus, jie gali būti nusiurbti vakuumo pagalba. Karštame tirpale
želatina hidrolizuojasi, taigi norint išsaugoti visas jos savybes, būtina optimizuoti gamybos metodą. Į
želatinos tirpalą pridedama dažiklių, konservantų, pamatuojamas tirpalo klampumas viskozimetru. Jei
reikia, klampa reguliuojama pridedant 60-70 °C vandens. Kapsulių apvalkalas gaminamas, panardinant į
želatinos tirpalą, specialias nerūdijančio plieno formas. Tam, kad želatina tolygiai pasiskirstytų, formos
sukamos aplink horizontalią ašį. Besisukančios formos yra džiovinamos šaltu oru, siekiant tolygios
apvalkalo formos bei greitesnio džiovimo proceso. Sekančio etapo metu formos džiovinamos karšto oro
srove krosnyse. Apvalkalams galutiniai išdžiuvus, jie nuimami nuo formų [35].
Be apvalkalui reikalingų medžiagų, į kapsules taip pat dedamos įvairios pagalbinės medžiagos.
Daugeliu atveju kapsulės yra užpildytos vienkartine vaisto doze [36]. Kapsulių užpildą dažniausiai sudaro
kietos konsistencijos medžiagos milteliai arba granulės [34].
Pildant kapsules milteliais arba granulėmis svarbu įvertinti fizikinės dalelių savybes. Siekiant
užtikrinti turinio homogeniškumą, visos medžiagos dedamos į kapsulę, turi būti panašaus dalelių dydžio ir
formos. Siekiant kokybiškai užpildyti kapsules svarbus kriterijus yra miltelių dalelių dydis. Optimalu, jei
miltelių dalelių dydis yra tarp 50-150 µm. Taip pat labai svarbus kriterijus yra dalelių forma.
Kapsuliuojant miltelius, kurių dalelių forma yra šiurkšti, kampuota, gali būti pridedama panašaus dydžio,
apvalių pagalbinių medžiagų. Labai svarbu prieš kapsuliavimą sumažinti miltelių lipnumą. Lipnūs
milteliai kimba prie metalinių konstrukcijų, lėtina kapsuliavimo procesą bei gali pažeisti kapsuliavimo
mašiną. Lipnumo galima išvengti kartu nemaišant drėgmę sugeriančių medžiagų, su medžiagomis
turinčiomis daug vandens [35].
Taip pat kapsulės gali būti užpildytos skystomis, kietomis ar pastos konsistencijos medžiagomis.
Kapsulių užpildo sudėtyje gali būti viena ar kelios veikliosios bei pagalbinės medžiagos [36].
21
Kietosios kapsulės gaminamos įvairių dydžių. Dydžių skirtumas priklauso nuo kapsulės talpos,
diametro, ilgio. Žmonėms gaminamų kapsulių dydžiai skirstomi nuo 000 (didžiausias) iki 5 (mažiausias)
[37,38]. Kietąsias kapsules galima užpildyti nuo 0,13 ml iki 1,37 ml. [34]. Jei pasirinktas veikliosios
medžiagos kiekis yra per mažas užpildyti visai kapsulei, tuomet būtina pridėti pagalbinių medžiagų,
dažniausiai kaip užpildą gamintojai renkasi laktozę ir monokristalinę celiuliozę [35,39].
Kapsulių gamyba gali būti labai įvairi. Pramoniniu metu kapsulių gamybos ir kapsuliavimo
procesas yra pilnai automatizuotas, pagaminamas didelis kiekis kapsulių. Kapsuliuojant kietąsias kapsules
mašinėle, procesas nėra automatinis, vienu metu pagaminama iki 50 kapsulių. Klasikinė kapsuliavimo
mašinėlė susideda iš plokštelių, turinčių vienodo diametro angas. Angos atitinka tam tikro dydžio
kapsulių dugno ir dangtelio diametrus. Kiekviena kapsuliavimo mašinėlė tinka tik vieno dydžio
kapsulėms kapsuliuoti. Norint kapsuliuoti kito dydžio kapsules, pakeičiamos mašinėlėje esančios
plokštelės. Prieš kapsuliuojant kapsulės yra atidengiamos, kapsulės atskirai išdėliojamos į angas. Ant
plokštelės, į kurią įstatyti kapsulių dugnai, užberiamas kapsuliuojamas turinys ir tolygiai, mentelės
pagalba, užpildomos kapsulių ertmės. Užpildžius vienodai kapsules, tolygiai sudedamos plokštelės su
kapsulių kepurėlėmis ir kapsulių kūnais. Plokštelės tarpusavyje stipriai suspaudžiamos, spaudimo metu
kapsulės uždaromos. Atidarius plokšteles kapsulės išimamos. [35,40].
22
2. TYRIMO METODIKA
2.1. Tyrimo medžiagos
Baltymų frakcijos, išskirtos iš islandinės kerpenos (Cetraria islandica (L.) Ach.) gniužulų,
paruoštos Baltarusijos Valstybinės mokslų akademijos, V.F. Kuprevičiaus eksperimentinės botanikos
institute.
2.2. Reagentai
„0“ dydžio želatininės kapsulės (Capsuline, JAV);
Mikrokristalinė celiuliozė, Prosolv® SMCC HD90 (JRS Pharma, Vokietija);
Bevandenis koloidinis silicio dioksidas (aerosilas), (Degussa AG, Vokietija);
PBS vandeninis tirpalas (1.37 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na2HPO4, 18 mM KH2PO4, pH = 7.4)
(Sigma-Aldrich, JAV);
Jaučio serumo albuminas (BSA) (Sigma-Aldrich®, JAV);
Bradfordo reagentas (sudėtis: 100mg mėlynos spalvos briliantinio mėlynojo dažiklio G-250; 50 ml
95proc. etanolio, 100 ml 85 proc. fosforo rūgšties, skiedžiama vandeniu iki 1 litro tūrio) (Sigma–Aldrich
(JAV);
Baltymų standartai (dalelių dydis 10-200 kDa, rinkinys PageRuler™, naudojamas elektroforezei)
(Fermentas, Lietuva);
Dinatrio hidrofosfatas (Merck, Darmstadt, Vokietija);
Natrio chloridas (Merck, Darmstadt, Vokietija);
Nekoncentruota vandenilio chlorido rūgštis (Sigma-Aldrich, JAV);
TRIS (Tris(hidroksimetil)aminometanas), (Sigma-Aldrich, JAV);
Natrio dodecilsulfatas (Sigma-Aldrich, JAV);
Amonio persulfato milteliai (APS), (Sigma-Aldrich, JAV);
Akrilamidas/bisakrilamidas - sudarytas iš 30 g akrilamido ir 0.8 g N,N'-metilen-bis-akrilamido (Sigma-
Aldrich, JAV);
Tetrametiletilendiaminas (TEMED), 99% (Sigma-Aldrich, JAV);
Tris-Glicino NaDS buferis (25 mM Tris, 192 mM glicinas ir 0.1% NaDS, pH - 8.3). (Sigma-Aldrich,
JAV);
23
LB buferis (Lane Marker Non-reducing Sample Buffer), sudarytas iš 0.3M TRIS-HCl, 5 proc. NaDS, 50
proc. glicerolio ir rožinio dažiklio. (Thermo Scientific, JAV);
Ultra švarus (I vandens kokybės lygio) vanduo (Biotechnologijos institutas, Lietuva);.
Thermo Scientific Pierce Silver dažymo rinkinys (Fisher Scientific, JAV);
Etanolis (reaktifikuotas spiritas 96.3%)(„Stumbras“, Lietuva).
Acto rūgštis 99.8% (Standart, Lenkija)
Natrio hidroksidas (NaOH) (Sigma-Aldrich, JAV)
2.2.1. Reagentų paruošimas
2.2.1.1. Baltymų elektroforezei naudotų tirpalų ruošimas:
1. 1.5 M TRIS-HCl buferinis tirpalas, pH 8.8. 18,15 g TRIS tirpinama 70 ml ultra švaraus
vandens. Į tirpalą įpilama 4 M HCl tiek, kad pH būtų 8,8 . Skiedžiama su ultra švariu vandeniu iki 100 ml.
Saugoma +4ºC temperatūroje;
2. 0.5 M TRIS-HCl buferinis tirpalas, pH 6.8. 6.0 g TRIS tirpinama 70 ml ultra švaraus
vandens. Į tirpalą įpilama 4 M HCl tiek, kad pH būtų 6.8.. Skiedžiama su ultra švariu vandeniu iki 100 ml.
Saugoma +4ºC temperatūroje;
3. 10 proc. NaDS tirpalas. 5.0 g NaDS tirpinama nedideliame kiekyje ultra švaraus vandens.
Tirpalas praskiedžiamas iki 50 ml, laikomas kambario temperatūroje;
4. 10 proc. APS tirpalas. 100 mg APS ištirpinama 1 ml ultra švaraus vandens ir praskiedžiama
iki 100ml.
5. Vienkartinis (1x) elektroforezės buferinis tirpalas. 100 ml TRIS-glicino-NaDS
elektroforezės buferinio tirpalo skiedžiama su ultra švariu vandeniu iki 1 litro;
2.2.1.2. NaDS – PAGE gelio paruošimas ir užpildymas
Skiriantysis 15 proc. poliakrilamido gelis
24
Skiriantysis 15 proc. poliakrilamido gelis sudarytas iš 5 ml 30 proc. akrilamido – BIS, 2.5 ml 1.5
M TRIS, pH 8.8 (žr. 2.2.16), 2.3 ml ultra švaraus vandens, 0.1 ml 10 proc. NaDS (žr.5.2.1.1), 0.1 ml APS
(žr.5.2.1.1), 0,01 ml TEMED.
Koncentruojantis 4 proc. poliakrilamido gelis
Koncentruojantis poliakrilamido gelis sudarytas iš 1.3 ml 30 proc. akrilamido-BIS, 2.5 ml 0.5 M
TRIS, pH 6.8 (žr. 5.2.1.1), 6.1 ml ultra švaraus vandens, 0.1 ml 10 proc. NaDS (žr. 5.2.1.1), 0.05 ml APS
(žr. 5.2.1.1), 0.01 ml TEMED.
Gerai išmaišomos atskirai kiekvieno (skiriančiojo ir koncentruojančiojo) gelių sudedamosios
dalys. Pradžioje gelio forma užpildoma skiriančiuoju geliu iki pažymėtos vietos. Tam, kad nepatektų oro,
ant supilto gelio į formą užpilama ultra švaraus vandens. Geliu užpildytoje formoje vyksta gelio
polimerizacija. Polimerizacija vyksta 20°C temperatūroje, apie 30 min. Sustingęs gelis praplaunamas
ultra švariu vandeniu. Ant skiriančiojo gelio, esančio gelio formoje, pilamas paruoštas koncentruojantis
gelis. Užpylus gelį, specialiomis gelio takelius formuojančiomis šukomis viršutiniame gelyje
suformuojami takeliai. Koncentruojančiam geliui sustingus, specialios šukos ištraukiamos. Paruoštas gelis
gali būti naudojamas elektroforezėje.
2.2.1.3. Fosfatinio buferinio tirpalo gamyba
Fosfatinis buferis naudojamas baltymų gryninimui gelchromatografijos metodu. Buferio
gamybai analitinėmis svarstyklėmis atsveriama 17.91 g HNa2O4P·12H2O ir 8.77 g NaCl. Šios medžiagos
tirpinamos 995 ml ultra švaraus vandens. Į tirpalą įpilama 4 M HCl tiek, kad pH būtų 7.0. Skiedžiama su
ultra švariu vandeniu iki 1000 ml. Saugoma +4ºC temperatūroje;
2.3. Įranga
Gelfiltracijos chromatografijos kolonėlė: GE Healthcare Superdex 200 10/300 (GE Healthcare life
sciences, UK)
Gelchromatografijos sistema: AKTA purifier 100 (GE Healthcare Life Sciences,
Švedija);
Baltymų elektroforezės aparatas CS-300V (Cleaver Scientific, UK);
Centrifuga 5415R (Eppendorf, JAV);
25
Termostatas Techne Dri-Block (R) Model DB-2D (Techne, UK);
Spektrofotometras Infinite M200 (Tecan, Šveicarija);
Krepšelinis aparatas (Erweka GmbH, Vokietija);
Analitinės svarstyklės CPA225D-0CE (Sartorius, Goettingen, Germany);
Vandens gryninimo sistema Synergy Millipore (Merck, Germany).
Automatiniai dozatoriai (Ependorf, JAV);
Laikmatis (Thermo Fisher Scientific, JAV);
2 mm sietas (Fisher Scientific, JAV);
Prietaisas miltelių birumui įvertinti Erweka AG (Erweka GmbH, Vokietija);
Kapsuliavimo mašinėlė „Capsuline-15“ (Capsuline, JAV);
2.4. Tyrimo metodai
2.4.1. Baltymų frakcionavimas gelchromatografijos metodu
Siekiant išskirstyti Cetraria islandica (L.) Ach. gniužulų baltymus į atskiras frakcijas pagal
molekulinę masę, naudota gelchromatografija.
Gelchromatografija atlikta AKTA purifier 100 gryninimo sistema, naudojant Superdex 200
10/300 GL kolonėlę. Kolonėlės sorbentas – agarozė ir dekstranas. Kaip eliuentas naudotas fosfatinis
buferis, sudarytas iš 50mM HNa2O4P * 12H2O ir 0,15M NaCl, kurio pH 7.0.
Siekiant, kad kietosios mėginio dalelės neužkimštų kolonėlės, 1.5ml baltymų mėginio, buvo
centrifiguota +4oC temperatūroje, 10000 apsisukimų per minutę greičiu, 15 minučių, naudojant
centrifugą.
Gelchromatografija atlikta, esant +4 - +16 oC temperatūrai. Siekiant užtikrinti kolonėlės
pusiausvyrą, į kolonėlę atsargiai įleidžiama 50ml ultra švaraus vandens, po to - 50ml eliuento –
fosfatinio buferio. Tėkmės greitis 0.5ml/min, didžiausia slėgio riba 1.4 MPa.
Prieš leidžiant mėginį, sistemos kilpa užpildoma fosfatiniu buferiu, kad neliktų oro. Švirkšto
pagalba suleidžiamas 1ml centrifuguoto mėginio skysčio, kuris yra virš nuosėdų - supernatanto. Mėginio
tėkmės greitis – 0.5ml/min. Frakcijos surenkamos į ependorfus po 0.5ml.
2.4.2. Kiekybinis baltymų nustatymas Bradford metodu
26
Baltymų, išskirtų iš Cetraria islandica (L.) Ach. gniužulų, kiekis nustatytas, naudojant
spektrofotometrinį Bradford metodą mikrolėkštelėse. Naudojant standartinių koncentracijų - 0.125, 0.25,
0.5, 1.0, 1.5 ir 2 mg/ml, jaučio serumo albuminą, sudaryta kalibracinė kreivė pavaizduota 4 paveikslėlyje.
Imama 120 µl skirtingos koncentracijos jaučio serumo albumino mėginio ir gerai sumaišoma su 120 µl
Bradfordo reagento.
Gauti skirtingų koncentracijų tirpalai, sumaišius jaučio serumo albuminą ir Bradfordo reagentą,
laikomi 20 ºC temperatūroje 5 minutes. Praėjus nustatytam laikui, spektrofotometru matuojama mišinių
absorbcija, esant 595 nm bangos ilgiui. Baltymų koncentracija skaičiuojama pagal 1 formulę.
𝑋 = 𝑌−0,0105
0,0205 (1 formulė)
Čia: X – koncentracija, µg/ml; Y – tiriamojo tirpalo absorbcija.
4 Pav. Kalibracinė Bradfordo metodo kiekybinio baltymų nustatymo kreivė
2.4.3. NaDS poliakrilamidinio gelio elektroforezė
y = 0,0205x + 0,0105R² = 0,9648
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0.4
0.45
0.5
0 5 10 15 20 25 30
Ab
sorb
cija
Standarto koncentracija (µg/ml)
27
Siekiant nustatyti baltymų frakcijose esančių baltymų molekulinę masę, atlikta vertikalioji
NaDS-PAGE elektroforezė.
Prieš vykdant NaDS-PAGE elektroforezę, pagal (2.2.1.2.) pateiktą aprašymą, specialioje formoje
paruošiamas gelis, sudarytas iš koncentruojančiojo ir skiriančiojo gelių. Elektroforezė atliekama
elektroforezės aparate. Forma su geliu įstatoma į aparatą, iš gelio ištraukiamos specialios šukos.
Elektroforezės indas užpildomas TRIS – glicino – NaDS buferiu. Elektroforezės eksperimento pradžioje
32 µl baltymų frakcijos sumaišoma su 8 µl LB buferiu. Gautas mišinys kaitinamas 5 minutes 95ºC
termostate. Į kiekvieną takelį įleidžiama 30 µl po kaitinimo gautų mėginių ir 0.5 µl PageRuler Prestained
Protein Ladder standarto. Elektroforezės metu palaikoma pastovi 200V ir 25mA elektros srovė.
Elektroforezės trukmė 90 min. Gelis dažomas Thermo Scientific Pierce Silver dažymo rinkiniu.
Gelis atsargiai dedamas į plastikinį indelį. Pradedant dažyti, 5 minutes gelis plaunamas ultra
švariu vandeniu. Ultra švarus vanduo pakeičiamas, gelis plaunamas dar 5 minutes. Plaunant gelį ultra
švariu vandeniu, lygiagrečiai pagaminamas tirpalas iš 30 proc. etanolio ir 10 proc. acto rūgšties, santykiu
3:1. Šiuo tirpalu užpilamas gelis ir paliekama 15 minučių. Pastarasis etapas kartojamas 2 kartus. Etanolio
ir acto rūgšties tirpalas nupilamas, ir gelis du kartus plaunamas 10 proc. etanolio tirpalu po 5 minutes.
Baigus šį etapą, gelis du kartus po 5 minutes plaunamas ultra švariu vandeniu.
Paruošiamas jautriklio darbinis tirpalas, sumaišant jautriklį (Silver Stain Sensitizer), esantį
sidabro dažų rinkinyje, su ultra švariu vandeniu, santykiu 1:500 ir užpilamas ant gelio. Gelis laikomas 1
minutę jautriklio darbiniame tirpale. Praėjus nustatytam laikui, gelis du kartus po 1 minutę plaunamas
ultra švariu vandeniu.
Paruošiamas darbinis sidabro dažų tirpalas. Ruošiant tirpalą, sumaišoma sidabro dažų stipriklis
(Silver Stain Enhancer) ir sidabro dažai (Silver Stain), santykiu 1:50, ir užpilamas ant gelio. Paruoštame
dažų tirpale gelis laikomas 30 minučių. Paruošiamas ryškinimo darbinis tirpalas: sumaišant sidabro dažų
stipriklį (Silver Stain Enhancer) ir sidabro dažų ryškiklį (Silver Stain Developer), santykiu 1:50. Tuo
pačiu metu paruošiamas ryškinimą stabdantis tirpalas, naudojant 5 proc. acto rūgštį. Prieš ryškinimą gelis
du kartus plaunamas ultra švariu vandeniu po 20 sekundžių. Gelis laikomas ryškinimo tirpale, kol pradeda
ryškėti esančių baltymų juostos. Išryškėjus juostoms, gelis laikomas ryškinimą sustabdančiame acto
rūgšties tirpale 10 minučių. Baigus dažymą, gelis nufotografuojamas ir laikomas ultra švariame
vandenyje.
2.4.4. Kietųjų kapsulių su baltymais gamyba
28
3 dalys baltymų sumaišomi porcelianinėje lėkštelėje su 10 dalių aerosilo ir 3 dalimis Prosolv.
Gautas mišinys paskleidžiamas ant pergamentinio popieriaus ir paliekamas džiūti 20±2 ºC temperatūroje,
24 valandas. Masei išdžiūvus, ji pertrinama per 2 mm sietą. Susidarę birūs milteliai mašinėlės pagalba
kapsuliuojami. Parinktos „0“ dydžio kapsulės.
2.4.5. Birumo greitis ir subėrimo kampas
Pagal Europos Farmakopėjos (Eur. Ph (01/2010:20936) birumo indeksas nustatytas Erweka
aparatu. Pasveriama 50±0,01 g medžiagos ir suberiama į prietaiso piltuvėlį, 20 sekundžių milteliai
veikiami vibracijos. Atidaromas piltuvėlis, ir išmatuojamas laikas t (sek), per kurį tiriamoji medžiaga m
(g) visiškai išbėga iš piltuvėlio. Birumas B (g/sek) apskaičiuojamas pagal 2 formulę. Optimalus miltelių
birumo greitis - 4 – 5 g/sek.
Pagal Europos Farmakopėjos (Eur. Ph (01/2010:20936) straipsnį, miltelių subėrimo kampas
matuojamas atlikus miltelių birumo tyrimą. Byrėdami milteliai suformuoja kūgį. Specialiu matlankiu
matuojamas kūgio kampas. Birumo įvertinimas pagal kūgi kampą pavaizduotas 1-oje lentelėje.
20
t
mB
(2 formulė)
1 lentelė. Miltelių birumo įvertinimas pagal kūgio kampą
Birumas Kūgio kampas (o)
Puikus 25 – 30
Geras 31 – 35
Vidutiškas 36 – 40
Priimtinas 41 – 45
Prastas 46 – 55
Labai prastas 56 – 65
Itin prastas > 66
29
2.4.6. Kapsulių masės vienodumo testas
Kapsulių masės vienodumo testas atliekamas pagal Europos farmakopėjos 01/2008:20905
straipsnį. Testui atlikti paimama 20 nepažeistų, atsitiktinai parinktų kapsulių. Pasveriamos visos
nepažeistos kapsulės. Pasvėrus kapsules, jos atidaromos ir atskirai pasveriamas kapsulės turinys bei
želatininis apvalkalas. Kapsulės turinio masė - tai yra visos nepažeistos kapsulės masės ir želatininio
apvalkalo masės skirtumas. Leistinas svėrinių nuokrypis yra reglamentuojamas. Kapsulėms, kurių
vidutinė masė yra mažiau nei 300mg, galimas 10 proc. nuokrypis. Kapsulėms, purių vidutinė masė yra
daugiau nei 300 mg, leidžiamas 7.5 proc. nuokrypis. Leidžiamas ne daugiau kaip dviejų svėrinių
nuokrypis nuo masės vidurkio. Taip pat nė vienas iš svėrinių negali viršyti masės vienodumo testo normų
daugiau kaip 2 kartus.
2.4.7. Kietųjų kapsulių tirpimo testas
Kapsulių tirpimo testas atliktas taikant krepšelio metodą. Testas naudojamas baltymų
išsiskyrimo iš kapsulių greičio nustatymui. Tyrimas atliktas su ERWEKA DZT aparatu. Aparatą sudaro
vandens vonia, į kurią įstatytas indas su tyrimui reikalinga terpe: 50 ml fosfato druskos buferinio tirpalo
(PBS) pH 8.00, terpės temperatūra 37±2o C, nustatytu greičiu besisukantis krepšelis, į kurį įdedama
atsitiktinai parinkta kietoji kapsulė. Krepšelio nuotolis nuo indo dugno 20 ± 2 mm. Kapsulei pradėjus
tirpti, pirmasis mėginys imamas, praėjus 15 minučių nuo tyrimo pradžios (kartojama keturis kartus: po 15,
30, 45 ir 60 min.). Kiekvieną kartą imama po 10 ml mėginio. Mėginiai imami iš vietos, esančios viduryje,
tarp tirpimo terpės paviršiaus ir krepšelio apatinės dalies, ne mažesniu kaip 10 mm atstumu nuo indo
sienelių. Po kiekvieno mėginio paėmimo atstatomas terpės tūris, t.y., įpilama po 10 ml PBS.
Siekiant nustatyti kapsulėse esančių baltymų koncentraciją, po baltymų atsipalaidavimo iš
kapsulių, išmatuota visuose keturiuose mėginiuose esančių baltymų koncentracija. Tam naudotas
Bradford kiekybinis nustatymas, aprašytas (2.4.2.) skyriuje. Naudojant standartinės koncentracijos jaučio
serumo albuminą, sudaryta kalibracinė kreivė, pavaizduota 5 paveikslėlyje.
𝑋 = 𝑌+0,0154
0,0604 (3 formulė)
Čia: X – koncentracija, µg/ml;
Y – tiriamojo tirpalo absorbcija.
30
5 Pav. Kalibracinė Bradfordo metodo kiekybinio baltymų nustatymo kreivė
2.4.8. Tyrimų duomenų statistinis įvertinimas
Tyrimų duomenys įvertinti statistiškai, naudojant Microsoft Office Excel (Microsoft, JAV). Visi
eksperimentai pakartoti po tris kartus ir išreikšti aritmetiniu vidurkiu ± standartinė paklaida SP.
y = 0,0604x - 0,0154R² = 0,9709
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0.4
0.45
0 5 10 15 20 25 30
Ab
sorb
cija
Standarto koncentracija (µg/ml)
31
3. TYRIMŲ REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1. Baltymų frakcionavimas
Baltymų išskirstymui pagal molekulių dydį naudota gelchromatografija. Iš Cetraria islandica
(L.) Ach. gniužulų išskirtų baltymų mėginys gelchromatografijos metu buvo išskirstytas į 69 frakcijų.
Gelchromatografija vykdyta pagal 2.2.2 skyriuje aprašytą metodiką. Frakcijos, ties kuriomis pastebėti
pikai, pasirinktos tolimesniems tyrimams. Kiekybiniams ir kokybiniams baltymų frakcijų tyrimams buvo
pasirinktos 13, 23, 24, 35, 44 ir 60 baltymų frakcijos. Gelchromatografijos rezultatai pateikiami 5 paveiksle.
6 Pav. Gelchromatografijos metodu išskirstytos Cetraria. islandica L. Ach. baltymų frakcijos . Gauti
rezultatai prie 215nm (raudona kreivė) ir 280 nm (mėlyna kreivė) UV bangos ilgio
Baltymų peptidinės jungtys sugeria 190-230 nm bangos ilgio šviesą. Taigi, tokiame šviesos
spektre jos tampa matomos [41]. Paveikslėlyje, rožine spalva pažymėtos smailės gautos prie 215 nm
bangos ilgio, literatūros duomenimis tai žymi peptidinių jungčių absorbciją [42].
32
Esant 280 nm bangos absorbcijai, vyksta aromatinių amino rūgščių (triptofano, tirozino)
absorbcija [43]. Gelchromatografijos metu, paveikslėlyje smailės, pažymėtos mėlyna spalva, vaizduoja
amino rūgščių buvimą tiriamajame junginyje, darome prielaidą, kad iš kolonėlės ištekėję junginiai yra
baltymai.
Vykdant baltymų išskyrimą pagal dalelių dydį. pirmieji iš kolonėlės išteka didesnio diametro
baltymai, kadangi jie nepatenka į gelio, kuriuo yra užpildyta chromatografijos kolonėlė, poras. Vykdyto
tyrimo rezultatai rodo, kad Cetraria islandica (L.) Ach. gniužuluose esantys baltymai atsiskyrė tik
dalinai. Didžiausi pikai grafike matyti 30-42 frakcijų vietoje. Todėl galima teigti, kad Cetraria islandica
(L.) Ach. gniužulų baltymų frakcijoje dominuoja vidutinio dydžio baltymai. Gelchromatografijos
paveiksle matyti, kad nuo 50 frakcijos yra labai maži pikai, taigi, galima teigti, kad turimame mėginyje,
mažos molekulinės masės baltymų yra maži kiekiai.
Grafike taip pat matyti, kad pikai, žymintys 34 ir 30 frakcijas, nėra atsiskyrę. Literatūros
duomenimis, gelchromatografijos selektyvumas ir atskyrimo kokybė priklauso nuo mėginio tūrio ir
kolonėlės parametrų. Taip pat baltymai gali neatsiskirti dėl tarpusavyje panašios struktūros ir molekulinės
masės [16]. Vykdytos gelchromatografijos metu, galima daryti prielaidą, kad parinkti netinkami kolonėlės
parametrai arba frakcijose esantys baltymai yra labai panašios struktūros. Kadangi 30, 34 frakcijos yra
greta, o gelchromatografija paremta junginių atskyrimu pagal dalelių dydį, smailių neatsiskyrimas galėjo
įvykti dėl junginių panašumo.
3.2. Baltymų kiekybinis nustatymas
Siekiant išsiaiškinti baltymų kiekį frakcijose, pasirinktas Bradfordo kiekybinis baltymų
nustatymas. Atlikus baltymų išskyrimą gelchromatografijos metu, pasirinktos 13, 23, 24, 35, 44 ir 60
frakcijos, kadangi jose pastebėti didžiausi pikai. Nustatytas baltymų kiekis pavaizduotas 2 lentelėje.
2 lentelė. Baltymų frakcijų, išskirtų iš Cetraria islandica L. (Ach.) gniužulų, kiekybinis nustatymas
Bradford metodu
Frakcijos Nr. Absorbcija, nm
Koncentracija, µg/ml
(X± S)
12 0.0851 3.639± 0.05
13 0.1289 5.776± 0.05
33
23 0.1400 6.317± 0.11
24 0.1483 6.722± 0.09
25 0.0793 3.356± 0.10
29 0.0621 2.517± 0.04
44 0.0699 2.898± 0.05
60 0.0569 2.263± 0.07
Iš lentelėje esančių duomenų matyti, kad didžiausia koncentracija nustatyta 23 ir 24 frakcijose,
atitinkamai – 6,722± 0.09 µg/ml ir 6,317± 0.11 µg/ml. Mažiausia koncentracija nustatyta 60 frakcijoje -
2.263± 0.07 µg/ml.
3.3. Baltymų molekulinės masės nustatymas, taikant NaDS – PAGE elektroforezę
Siekiant nustatyti Cetraria islandica (L.) Ach baltymų molekulinę masę, naudota NaDS –
PAGE elektroforezė. Tyrimas atliktas pagal 4.4.4. skyriuje aprašytą metodiką. Gauti rezultatai pateikiami
6 paveiksle.
7 Pav. Cetraria islandica L. (Ach.) baltymų frakcijų NaDS-PAGE elektroforezė. (St. – standartas)
34
NaDS PAGE elektroforezės tyrimui pasirinktos 23 ir 24 frakcijos, kadangi jose nustatyta
didžiausia baltymų koncentracija. Paveiksle pavaizduota 23 ir 24 frakcijų NaDS – PAGE elektroforezė.
Elektroforezės metu nustatyta, kad 23 ir 24 frakcijoje esantys baltymai yra 40, 55 ir 130 kDa molekulinės
masės.
Yra labai nedaug mokslinių duomenų apie kerpių gniužuluose esančius baltymus, jų sudėtį ar
koncentraciją. Literatūros šaltiniuose aprašomi 58 kDa glikoproteinai, esantys Xanthoria parietina (L.)
Th. Fr. kerpėje.
NaDS PAGE elektroforezės 7 paveiksle matyti, kad Cetraria islandica L. Ach baltymų
frakcijose taip pat yra panašios molekulinės masės 40-55 kDa baltymų [44].
Nustačius baltymų, esančių Cetraria islandica L. (Ach.) frakcijose, kokybinę ir kiekybinę sudėtį
NaDS-PAGE ir Bradfordo metodais, galima palyginti gautus rezultatus.
3 lentelė. 23 ir 24 baltymų frakcijų, išskirtų iš Cetraria islandica L. (Ach.) gniužulų, kokybinis (NaDS-
PAGE elektroforezė) ir kiekybinis (Bradford metodas) nustatymas
Frakcijos Nr. Koncentracija, µg/ml Molekulinė masė, kDa
23 6.317± 0.11 ~40, 55 ir 130
24 6.722± 0.09 ~40, 55 ir 130
Atlikus tyrimus ir palyginus rezultatus, galima teigti, kad Cetraria islandica L. Ach. baltymų
frakcijose didžiausia koncentracija yra baltymų, kurių molekulinė masė yra 40, 50 ir 130 kDa.
3.4. Kietųjų kapsulių gamyba
Iš Cetraria islandica (L.) Ach. gniužulų išskirtų baltymų tirpalo, turinčio 4.50±0,005 µg/ml
baltymų, pagal 2.4.4 skirsnyje pateiktą metodiką pagamintos kietosios kapsulės, kurių masė 0.34 ± 0.013
g.
3.5. Kapsulių masės vienodumo testas
Atlikus kapsulių vienodumo testą, gauti rezultatai pateikiami 4 lentelėje.
35
4 lentelė. Kietųjų kapsulių su baltymais masės nuokrypiai.
Tyrimo objektas
Masė, mg (X±SD; n=20)
1 2 3
Cetraria islandica (L.)
Ach. kietosios
kapsulės
0.34±0.013 0.34±0.004 0.34±0.005
3.6. Birumo nustatymas
5 lentelė. Baltymų ir pagalbinių medžiagų miltelių birumo parametrai (vidurkis±SN, n=5)
Tiriamasis mišinys Birumas (g/sek). Subėrimo kampas (SK), 0
Cetraria islandica (L.) Ach. baltymų
ir pagalbinių medžiagų mišinys
4.54±0.42 25.00±0.50
Atlikus birumo savybių tyrimus, nustatyta, kad baltymų ir pagalbinių medžiagų mišinys -
tinkamas kapsuliavimui.
3.7. Baltymų atsipalaidavimo iš kapsulių tyrimas
Ištyrus baltymų kiekį po atsipalaidavimo iš kapsulių, nustatyta, kad didžiausias kiekis baltymų
atsipalaiduoja po 60 minučių (63±0.58 proc.). Baltymų atsipalaidavimas, išreikštas procentais, pateiktas 7
paveikslėlyje.
36
8 Pav. Islandinės kerpenos (Cetraria islandica (L.) Ach.) baltymų atsipalaidavimas iš kietųjų kapsulių.
Baltymų išsiskyrimas iš kietųjų kapsulių - proporcingas laiko intervalui. Praėjus 15 minučių nuo
tyrimo pradžios, išsiskiria 50 proc. viso baltymų kiekio. Tyrimo pabaigoje, praėjus 60 minučių, iš viso
išsiskyrė 63±0,58 proc. baltymų.
50
58
6163
40
50
60
70
15 30 45 60
Ats
ipala
idavim
as
%
Laikas, min
37
4. IŠVADOS
1. Gelchromatografijos metodas nebuvo pakankamai selektyvus baltymų atskyrimui (baltymai atsiskyrė
tik dalinai).
2. Frakcijose nustatyta didžiausia baltymų koncentracija - 6.722± 0.09 µg/ml. Šiose frakcijose nustatyta
40, 50 ir 130 kDa baltymų molekulinė masė.
3. Naudojant Prosolv® ir aerosilo pagalbines medžiagas, pagamintos kietosios kapsulės, turinčios po
3.68 µg baltymų. Miltelių birumo ir kapsulių vienodumo testo rezultatai atitiko Europos farmakopėjoje
keliamus reikalavimus.
4. Nustatyta, kad baltymai iš Cetraria islandica (L.) Ach. kapsulių atsipalaiduoja dalinai – iki 63±0.58
proc.
38
5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS
Pagamintos Cetraria islandica (L.) Ach. baltymų kietosios kapsulės perduotos tolimesniems
biologinio aktyvumo tyrimams Baltarusijos mokslų akademijos V. Kuprevičiaus eksperimentinės
botanikos instituto mokslininkams.
Tolimesniuose tyrimuose rekomenduojama:
Nustatyti Cetraria islandica (L.) Ach. gniužuluose esančių baltymų struktūrą.
Nustatyti biologinį Cetraria islandica (L.) Ach. gniužuluose esančių baltymų aktyvumą.
Optimizuoti, tobulinti, vaistinės formos su Cetraria islandica (L.) Ach. baltymais gamybą.
39
6. LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Grujičić D, Stošić I, Kosanić M, Stanojković T, Ranković B, Milošević-Djordjević O. Evaluation
of in vitro antioxidant, antimicrobial, genotoxic and anticancer activities of lichen Cetraria
islandica. Cytotechnology. 2014;66(5):803–13.
2. Freysdottir J, Omarsdottir S, Ingólfsdóttir K, Vikingsson A, Olafsdottir ES. In vitro and in vivo
immunomodulating effects of traditionally prepared extract and purified compounds from Cetraria
islandica. Int Immunopharmacol. 2008;8(3):423–30.
3. Arup U, Ekman S, Grube M, Mattsson J-E, Wedin M. The sister group relation of Parmeliaceae
(Lecanorales, Ascomycota). Mycologia. 2007;99(1):42–9.
4. Nash T H. Lichen Biology. Cambridge: Cambridge University Press; 1996. p. 301.
5. Türk AÖ, Yilmaz M, Kivanç M, Türk H. The Antimicrobial Activity of Extracts of the Lichen
Cetraria aculeata and Its Protolichesterinic Acid Constituent. Zeitschrift fur Naturforsch - Sect C J
Biosci. 2003;58(11-12):850–4.
6. European Medicines Agency Cetraria islandica. Prieiga per internetą:
http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Herbal_-
_HMPC_assessment_report/2014/05/WC500167173.pdf.
7. European Medicines Agency, European Union herbal monograph on Cetraria islandica (L.).
Prieiga per internetą: http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Herbal_-
_Community_herbal_monograph/2015/02/WC500182211.pdf.
8. European Scientific Cooperative of Phytotheraphy. Monograpf lichen islandicus.Prieiga per
interneta: http://3p6hd548261g2ozsq64ddj4j.wpengine.netdna-cdn.com/wp-content/uploads/1-
ESCOP-Monograph-Lichen-Islandicus-2003-de.pdf.
9. Horhant D, Lamer A-C Le, Boustie J, Uriac P, Gouault N. Separation of a mixture of paraconic
acids from Cetraria islandica (L.) Ach. employing a fluorous tag—catch and release strategy.
Tetrahedron Lett. 2007;48(34):6031–3.
40
10. Gülçin İ, Oktay M, Küfrevioğlu Öİ, Aslan A. Determination of antioxidant activity of lichen
Cetraria islandica (L) Ach. J Ethnopharmacol. 2002;79(3):325–9.
11. Kotan E, Alpsoy L, Anar M, Aslan A, Agar G. Protective role of methanol extract of Cetraria
islandica (L.) against oxidative stress and genotoxic effects of AFB1 in human lymphocytes in
vitro. Toxicol Ind Health. 2011;27(7):599–605.
12. Ivanova D, Gerova D, Chervenkov T, Yankova T. Polyphenols and antioxidant capacity of
Bulgarian medicinal plants. J Ethnopharmacol. 2005;96(1-2):145–50.
13. Nariman F, Eftekhar F, Habibi Z, Falsafi T. Anti-Helicobacter pylori activities of six Iranian plants.
Helicobacter. 2004;9(2):146–51.
14. Ingólfsdóttir K. Usnic acid. Phytochemistry. 2002;61(7):729–36.
15. Janson J-C. Protein Purification: Principles, High Resolution Methods, and Applications. New
Jersey: Wiley; 2012. p. 7-10.
16. Ai E. Gel-filtration chromatography. Nat Methods. 2006;3(5):411–2.
17. Schwo H. SDS PAGE. Chapter 14. Prieiga per internetą: http://capricorn.bc.edu/bi204/wp-
content/uploads/2014/07/14-SDS-PAGE_2014.pdf.
18. Tamošiūnas V. Skysčių chromatografija-tandeminė masių spektrometrija antibiotikų nustatymui
maisto produktuose. Daktaro disertacija. 2009.
19. Introduction to SDS-PAGE.Prieiga per internetą: http://www.ruf.rice.edu/~bioslabs/studies/sds-
page/gellab2.html.
20. Luo S, Feng J, Pang H-M. High-throughput protein analysis by multiplexed sodium dodecyl sulfate
capillary gel electrophoresis with UV absorption detection. J Chromatogr A. 2004;1051(1-2):131–
4.
21. SDS Polyacrylamide Gel Analysis of Purified Fluorescent Protein. Prieiga per internetą:
http://www.babec.org/files/GFP_Labs_2012/PAGEAnalysis_SV.pdf.
41
22. Božović A, Kulasingam V. Quantitative mass spectrometry-based assay development and
validation: from small molecules to proteins. Clin Biochem. 2013;46(6):444–55.
23. Naujausių gamtos mokslo žinių sklaidos mokytojams tinklas. Prieiga per internetą:
http://gamta.vdu.lt/mokytojai/kursai/Augaliniai_genotoksiskumo_testai.pdf.
24. Chang WW, Huang L, Shen M, Webster C, Burlingame a L, Roberts JK. Patterns of protein
synthesis and tolerance of anoxia in root tips of maize seedlings acclimated to a low-oxygen
environment, and identification of proteins by mass spectrometry. Plant Physiol. 2000;122(2):295–
318.
25. Noble JE, Bailey MJA. Quantitation of protein. Methods Enzymol. 2009;463:73–95.
26. Waterborg JH, Matthews HR. The lowry method for protein quantitation. Methods Mol Biol.
2009.;7–10.
27. Okutucu B, Dinçer A, Habib O, Zihnioglu F. Comparison of five methods for determination of
total plasma protein concentration. J Biochem Biophys Methods. 2007;70(5):709–11.
28. Antharavally BS, Mallia KA, Rangaraj P, Haney P, Bell PA. Quantitation of proteins using a dye-
metal-based colorimetric protein assay. Anal Biochem. 2009;385(2):342–5.
29. Walker JM. The bicinchoninic acid (BCA) assay for protein quantitation. Methods Mol Biol.
2009.;32:11–5.
30. Protein determination by the Bradford method. Prieiga per internetą:
http://www.ruf.rice.edu/~bioslabs/methods/protein/bradford.html.
31. Woodard SL, Mayor JM, Bailey MR, Barker DK, Love RT, Lane JR, et al. Maize (Zea mays)-
derived bovine trypsin: characterization of the first large-scale, commercial protein product from
transgenic plants. Biotechnol Appl Biochem. 2003;38(2):123–30.
32. Oseas Da Silva MA, Zezzi Arruda MA. Mechanization of the Bradford reaction for the
spectrophotometric determination of total proteins. Anal Biochem. 2006;351(1):155–7.
42
33. Johnson M. Protein Quantitation. Mater Methods [Internet]. 2012 [cited 2015 Mar 8]. Available
from: http://www.labome.com/method/Protein-Quantitation.html. DOI:
http://dx.doi.org/10.13070/mm.en.2.115.
34. Banker G S, Siepmann J, Rhodes C. Modern Pharmaceutics, Fourth Edition. London:CRC Press;
2002. p. 864.
35. Podczeck F, Jones BE. Pharmaceutical Capsules. London: Pharmaceutical press; 2004. p. 119-122.
36. European Pharmacopoeia 7th Edition. Capsules. Capsulae 01/2008:0016.
37. Two-Piece Hard Capsules for Pharmaceutical Formulations. Priega per internetą:
http://www.ivtnetwork.com/sites/default/files/HardCapsules.pdf.
38. Podczeck F, Jones BE. Pharmaceutical Capsules. Pharmaceutical Press; 2004. p. 272.
39. Hard gelatine capsules. Prieiga per internetą: http://www.just.edu.jo/~sfg/Lab73.html.
40. Nair R, Vemuri M, Agrawala P, Kim S. Investigation of various factors affecting encapsulation on
the in-cap automatic capsule-filling machine. AAPS PharmSciTech. 2004;5(4):e57.
41. Goldfrad, Robert, Leo J. Saidel, Ervin M. The Ultraviolet Absorbtion of Spectra. 1951;397–404.
42. Kuipers BJH, Gruppen H. Prediction of molar extinction coefficients of proteins and peptides using
UV absorption of the constituent amino acids at 214 nm to enable quantitative reverse phase high-
performance liquid chromatography-mass spectrometry analysis. J Agric Food Chem.
2007;55(14):5445–51.
43. Held P, Davis K. UV Fluorescence Polarization as a Means to Investigate Protein Conformational
and Mass Change - Using Intrinsic Tryptophan Fluorescence in Conjunction with UV-capable
Polarizers. Proteins Structure and Mass Change Determinations. 2014; 1-5.
44. Molina M, Vicente C. Purification and characterization of two isolectins with arginase activity
from the lichen Xanthoria parietina. J Biochem Mol Biol. 2000;33(4):300–7.
43
7. PRIEDAI
7.1. Tezės pristatytos LSMU SMD „ Jaunųjų mokslininkų ir tyrėjų konferencijoje‘‘
2013 metais Farmacijos sekcijoje.
BALTYMŲ FRAKCIJŲ, PRATURTINTŲ LEKTINAIS, IŠ ECHINACEA PURPUREA L.
MOENCH ŠAKNŲ IR ŠAKNIASTIEBIŲ, CHELIDONIUM MAJUS L. ŽOLĖS, CETRARIA
ISLANDICA L. GNIUŽULŲ, ANTIOKSIDACINIO AKTYVUMO TYRIMAS
Luka Šiatkutė, Greta Kalvaitytė, Jovita Juodsnukytė
Farmakognozijos katedra, Neuromokslų institutas
Vadovas: Prof. N. Savickienė, prof. D. Majienė
Įvadas
Sparčiai augant lėtinėmis ligomis sergančių žmonių skaičiui, vis labiau domimasi natūraliomis
antioksidaciniu poveikiu pasižyminčiomis prevencinėmis priemonėmis. Sutrikus pusiausvyrai tarp
laisvųjų radikalų susidarymo ir antioksidantų apsaugos, patiriamas oksidacinis stresas, kuris gali inicijuoti
tokias lėtines ligas, kaip aterosklerozė, cukrinis diabetas, lėtinis inkstų nepakankamumas, reumatoidinis
artritas bei įvairios neurodegeneracinės ligos. Antioksidacinis aktyvumas – tai gebėjimas neutralizuoti
laisvųjų radikalų poveikį ir tokiu būdu sumažinti jų daromą žalą organizmui, sustiprinti ląstelės apsaugos
sistemas ir atkurti pažeistas struktūras. Antioksidaciniu aktyvumu pasižymi ir kai kuriuose augaluose
aptinkami biologiškai aktyvūs junginiai - lektinai. Tai neimuninės kilmės baltyminės medžiagos,
atpažįstančios bei gebančios jungtis prie įvairių angliavandenių. Lektinai geba sukelti eritrocitų bei kitų
ląstelių agliutinaciją, mitogeninę limfocitų stimuliaciją, inicijuoja supresinių ląstelių gamybą, histamino
išsiskyrimą iš bazofilų bei putliųjų ląstelių, sustiprina makrofagų fagocitozę, slopina auglio ląstelių bei
grybelių augimą, pasižymi imunomoduliuojančiu poveikiu in vivo, taip pat toksiškumu ląstelėms ir
daugeliu kitų savybių.
Darbo tikslas:
Baltymų frakcijų, praturtintų lektinais, iš Echinacea purpurea L. Moench šaknų ir šakniastiebių,
Chelidonium majus L. žolės, Cetraria islandica L. gniužulų, antioksidacinio aktyvumo įvertinimas.
Baltymų, praturtintų lektinais, frakcijos paruoštos Baltarusijos Valstybinės mokslų akademijos, V.F.
Kuprevičiaus eksperimentinės botanikos institute, dalyvaujant bendrame Lietuvos – Baltarusijos projekte
44
„Naujų augalinės kilmės polipeptidų lektinų tyrimas ir panaudojimo būdų paieška, kuriant potencialius
immunomoduliatorius ir citostatikus“.
Uždaviniai:
1. Ištirti Echinacea purpurea L. Moench šaknų ir šakniastiebių, Chelidonium majus L. žolės, Cetraria
islandica L. gniužulų lektinų turinčių baltymų frakcijų antioksidacinį aktyvumą, panaudojant ABTS
(azinobisetilbenzotiazolinsulfo rūgšties) radikalus.
2. Palyginti tiriamų objektų antioksidacinį aktyvumą.
Darbo metodika:
Taikytas ABTS radikalų-katijonų surišimo metodas. Naudota spektrofotometrinė analizė, kai absorbcijos
maksimumas - 734 nm bangos ilgio. ABTS radikalas po aktyvavimo kalio persulfatu laikytas tamsioje,
vėsioje vietoje 16 valandų. Naudotas buferinis fosfato druskos tirpalas (PBS), užtikrinantis 7,4 pH
reikšmę.
Tyrimas vykdytas į PBS tirpalą pilant skirtingus kiekius lektinų (mikrolitrais) ir pridedant aktyvuoto kalio
persulfatu ABTS mėlynos spalvos tirpalo. Sumaišius šiuos reagentus, vykdyta spektrofotometrinė analizė.
Gauti rezultatai lyginti su kontroliniu tirpalu – ABTS radikalu-katijonu PBS tirpale.
Rezultatai:
1. Paveikus Echinacea purpurea L. Moench šaknų ir šakniastiebių baltymų frakciją, turinčią lektinų,
aktyvuotu ABTS tirpalu, absorbcija pradeda mažėti, esant 50µl baltymų 1ml tirpalo (absorbcija –
0,448±0,016 nm). Esant 75µl baltymų 1ml tirpalo, absorbcija sumažėjo beveik dvigubai ir toliau mažėjo
didinant baltymų, praturtintų lektinais, kiekį tirpale.
2. Paveikus Chelidonium majus L. žolės baltymų frakciją, turinčią lektinų, aktyvuotu ABTS tirpalu,
absorbcija mažėjo nuo 0,692±0,033 nm iki 0,216±0,034 nm. Mažiausia absorbcija (0,216) stebėta, esant
7 µl didžiųjų ugniažolių žolės baltymų1 ml tirpalo.
3. Paveikus Cetraria islandica L. gniužulų baltymų frakciją, turinčia lektinų, aktyvuotu ABTS tirpalu,
absorbcija mažėjo nuo 0,706±0,009 nm iki 0,457±0,011 nm. Mažiausia absorbcija (0,457) pasiekiama,
esant 300 µl baltymų 1 ml tirpalo.
45
Išvados:
1. Echinacea purpurea L. Moench šaknų ir šakniasitiebių, Chelidonium majus L. žolės, Cetraria
islandica L. Ach. gniužulų baltymų frakcijos, praturtintos lektinais, pasižymėjo antioksidaciniu
aktyvumu, surišant ABTS radikalą.
2. Lyginant baltymų frakcijas, praturtintas lektinais tarpusavyje stipriausiu antioksidaciniu aktyvumu
(71,29%) pasižymėjo Chelidonium majus L. žolės baltymų frakcija.
3. Lyginant baltymų frakcijas, praturtintas lektinais tarpusavyje silpniausiu antioksidaciniu aktyvumu
(39,31%) pasižymėjo Cetraria islandica L. gniužulų baltymų frakcija.
7.2. Tezės pristatytos tarptautinėje konferencijoje „The 5th International conference
of Pharmaceutical sciences and Pharmacy Practice 2014“. Stendinis pranešimas
FRACTIONATION AND DETERMINATION OF PROTEINS ISOLATED
FROM CETRARIA ISLANDICA (L.) ACH. THALLUS
Jovita Juodsnukytė1, Nijolė Savickienė1, Arūnas Savickas2, Gitana Žvirblytė3, Olga Kandelinskaya4,
Helena Grischenko4.
1Department of Pharmacognosy, Medical academy of Lithuanian University of Health Sciences,
Lithuania; 2Departmet of Drug Technology and Pharmaceutical Management, Lithuanian University of
Health Sciences, Lithuania; 3Institute of Biotechnology, Vilnius University, Lithuania; 4V.F.Kuprevich
Institute of Experimental Botany of Belarus Academy of Sciences, Belarus
Lichen is a symbiotic association composed of photosynthetic partner such as green alga or
cyanobacterium, and a fungal partner (Nash, 1996). Cetraria islandica (L.) Ach. (Iceland moss) is a
foliaceous lichen growing mostly in central Europe, North America and Siberia (Evans, 1994). Iceland
moss helps to relief dry cough, improves digestion and has antiemetic as well as immunostimulatory and
anti-inflammatory effects. Cetraria islandica (L.) Ach. is a plant rich of polysaccharides, lichen acids
(Ingolfsdottir et al., 1998). Cetraria islandica (L.) Ach. is also enriched with polypeptides, lichen acids
and water-soluble carbohydrates. The most important of them is lichenan, (1→3,1→4)β – D – glucan
(Puodžiūnienė el al., 2005; Abbott and Boraston, 2009). Proteins binding lichenan and izolichenan can be
determined using Bradford dyeing method (Freysdotirr et al. 2008), For the determination of other
proteins are often used Bradford and SDS-PAGE assays (Vergara-Barberán et al., 2014).
Aim of experiment:
46
To determine the quantity and molecular mass of proteins isolated from Cetraria islandica (L.) Ach.
thallus.
Experiment tasks:
1. To separate proteins into fraction, using Size Exclusion Chromatography;
2. To estimate the quantity and molecular mass of proteins.
Materials and methods:
1. Protein fractions isolated from Cetraria islandica (L.) Ach. thallus were achieved from V.F.Kuprevich
Institute of Experimental Botany of Belarus Academy of Sciences.
2. Size Exclusion Chromatography was used for the protein separation into fractions . Size Exclusion
Chromatography was performed with AKTA Purifier system, using Superdex 200 10/300 GL column.
3. The quantity of protein was measured by Bradford method using bovine serum albumin BSA (Sigma –
Aldrich, USA) protein standards.
4. The molecular mass of proteins was estimated by using of Sodium dodecyl sulfate polyakrylamide gel
electrophoresis SDS – PAGE.
5. Results were analyzed with MS excel.
Results: Proteins of Cetraria islandica (L.) Ach. thallus were separated into 80 fractions during Size
Exclusion Chromatography. Fractions number 13, 23, 35, 39, 44, 60 were chosen for the micro assay in
microplates (Bradford), because they presented the highest peaks.
The highest amount of proteins was determined in the 24th fraction (6,72 µg/mL) and in the 23th fraction
(6,32 µg/mL).
SDS-PAGE electrophoresis shows results in 23th and 24th fractions. According to PageRuler Prestained
Protein Ladder standard molecular mass of these proteins is respectively 44, 55 and 130 kDa.
47
Table 1. Concentration and molecular mass of proteins isolated from Cetraria islandica (L.) Ach.
Conclusions:
Proteins of Cetraria islandica (L.) Ach. were separated into fractions according to their molecular size.
Individual fractions were analyzed by Bradford and SDS-PAGE methods. Bradford assay revealed that
these fractions had the highest protein concentration (5,78; 6,32; 6,72 µg/mL). Moreover, gel
electrophoresis helped to determine the molecular mass of proteins in the 23th and 24th fractions, which
is 40, 55 and 130 kDa respectively. Proteins of Cetraria islandica (L.) Ach. require further investigation.
References
1. Abbott DW, Boraston AB. Interaction between Protein and (1,3) β-Glucans and Related
Polysaccharides. Chemistry, biochemistry and biology of (1,3) β-Glucans and Related
Polysaccharides. New York: Elsevier; 2009.
2. Evans WC. Pharmacognosy. Sixteenth Edition. Elsevier; 2009.
3. Freysdotirr J, Omarsdotirr S, Ingolfsdotirr K et al. In vitro and in vivo immunomodulating effects
of traditionally prepared extract and purified compounds from Cetraria islandica. International
Imunopharmacology. 2008; 8(3): 423-430.
4. Ingolfsdottir K, Jurcic K, Wagner J. Immunomodulating polysaccharides from aqueous extracts of
Cetraria islandica (Iceland moss). Phytomedicine. 1998; 5(5):333-339.
5. Nash III TH. Lichen biology. Cambridge: University Press; 1996.
6. Puodžiūnienė G, Janulis V, Milašius A, Budnikas V. Eksperimentiniai tyrimai. Kosulį slopinančių
vaistažolių mišinių sukūrimas. Medicina 2005; 41(6): 500-505.
48
7. Vergara-Barberán M, Lerma-García M J, Herrero-Martínez J M, Simó-Alfonso E F. Use of an
enzyme-assisted method to improve protein extraction from olive leaves. Food Chemistry. 2014;
169:28-33.
7.3. Paruošta publikacija žurnalui Acta Pharmaceutica.
„FRACTIONATION AND DETERMINATION OF PROTEINS IN
ECHINACEA PURPUREA (L.) MOENCH ROOTS“
Gabriele Balciunaite1, Jovita Juodsnukyte1, Arunas Savickas3, Ona Ragazinskiene4, Luka Siatkute1 Gitana
Zvirblyte2, Edita Mistiniene2, Nijole Savickiene1*
1Department of Pharmacognosy, Lithuanian University of Health Sciences, Kaunas, Lithuania
2 Institute of Biotechnology, Vilnius University, Vilnius, Lithuania
3Department of Social Pharmacy and Drug Technology, Lithuanian University of Health Sciences,
Kaunas, Lithuania
4Kaunas Botanical Garden of Vytautas Magnus University Kaunas, Lithuania
ABSTRACT
Echinacea purpurea (L.) Moench, a member of the Asteraceae family, is a plant rich in
flavonoids, essential oils, phenolic compounds, saponins, polysaccharides, and glycoproteins. The study
was aimed at evaluating the protein content in dried roots of Echinacea purpurea (L.) Moench after the
homogenization of the dried roots with liquid nitrogen, extraction in 0.01 mol L-1 phosphate-buffered
saline (PBS), and purification followed by fractionation of proteins using gel filtration chromatography.
The total protein concentration was measured using the Bradford method, and the evaluation of the
molecular mass of proteins was accomplished by applying the SDS-PAGE gel electrophoresis. The
Bradford assay revealed that these fractions had the highest concentration of proteins (4.66 - 6.07 mg mL-
1).
Glycoproteins, alkamides, and polysaccharides of Echinacea purpurea (L.) Moench roots are the
chemical compounds responsible for the immunomodulatory properties. However, there is a lack of
information about difference of protein content in E. purpurea fresh and dried roots material.
