Upload
others
View
1
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
Kamil Jurowski
Kamila Kochan
Anna Jurowska
Grzegorz Zając
Kornel Roztocki
https://scientiaeetdidactics.wordpress.com/
mgr Kamil Jurowski [email protected]
Absolwent Wydziału Chemii Uniwersytet Jagiellońskiego w Krakowie (2012) – praca pod tytułem „Zastosowanie metody LA ICP MS do obrazowania cynk w strukturach mózgu szczura jak narzędzie do badania patofizjologii depresji”. Obecnie doktorant na macierzystej jednostce. Jego zainteresowania naukowe dotyczą zastosowania technik spektrometrii mas w badaniach bioanalitycznych (metalomika, proteomika, lipidomika). W swoim dorobku posiada cztery publikacje związane z zastosowaniem spektrometrii mas w badaniach biomedycznych. Jest autorem wielu wystąpień konferencyjnych zarówno krajowych jak również międzynarodowych. Oprócz zainteresowań naukowych aktywnie zajmuje się dydaktyką akademicką. Od początku studiów doktoranckich jest stypendystą Konsorcjum „KNOW” (Krajowy Narodowy Ośrodek Wiodący) im. Mariana Smoluchowskiego w Krakowie. Członek Polskiego Towarzystwa Chemicznego oraz Polskiego Towarzystwa Spektrometrii Mas.
mgr Kamila Kochan [email protected]
Absolwentka Wydziału Chemii Uniwersytetu Jagiellońskiego w Krakowie (2012). Pracę magisterską pod tytułem „Obrazowanie pojedynczych komórek za pomocą spektroskopii FT-IR” zrealizowała w Zespole Obrazowania Ramanowskiego. Obecnie doktorantka na Wydziale Chemii UJ. W ramach pracy doktorskiej zajmuję się aplikacją komplementarnych technik obrazowania metodami spektroskopii oscylacyjnej (FT-IR, Raman) do badania modeli uszkodzenia wątroby. Skupia się stosowaniu technik spektroskopii oscylacyjnej zarówno ex vivo jak również do badań żywych komórek. W swoim dorobku posiada 11 publikacji w czasopismach z listy filadelfijskiej dotyczących aplikacji technik obrazowania metodami spektroskopii oscylacyjnej do badań biomedycznych. Jest autorką licznych wystąpień konferencyjnych, a także stypendystką Konsorcjum „KNOW” (Krajowy Narodowy Ośrodek Wiodący) im. Mariana Smoluchowskiego w Krakowie oraz kierownikiem i wykonawcą kilku grantów badawczych.
mgr Anna Jurowska [email protected]
Absolwentka Wydziału Chemii Uniwersytetu Jagiellońskiego w Krakowie – praca magisterska pt. „Synteza i charakterystyka fizykochemiczna nowych kompleksów Mo(IV) z ligandami N, i N,N-donorowymi”. Obecnie doktorantka II roku Chemii na macierzystej jednostce. Badania związane z tematem rozprawy doktorskiej realizuje w Zespole Chemii Koordynacyjnej. W swojej pracy naukowej zajmuje się syntezą i charakterystyką fizyko-chemiczną kompleksów metali d- elektronowych z dendrymerycznymi ligandami opartymi na strukturze triazyny. Od początku studiów doktoranckich jest stypendystką Konsorcjum „KNOW” (Krajowy Narodowy Ośrodek Wiodący) im. Mariana Smoluchowskiego w Krakowie. Jest autorką czterech publikacji z listy filadelfijskiej i kilkunastu wystąpień na konferencjach krajowych oraz międzynarodowych.
mgr Grzegorz Zając [email protected]
Tytuł magistra uzyskał w 2014 roku na Wydziale Chemii Uniwersytetu Jagiellońskiego; temat pracy: "Struktura, spektroskopia i stereochemia astaksantyny". W swoich badaniach, realizowanych na studiach doktoranckich, wykorzystuje nowoczesne techniki chiralooptyczne do badania struktury i równowagi konformacyjnej cząsteczek chiralnych o znaczeniu biologicznym. Jego zainteresowania naukowe dotyczą przede wszystkim badań układów chiralnych z wykorzystaniem ramanowskiej aktywności optycznej ROA (ang. Raman Optical Activity), oraz jej zaawansowanych rozwinięć: RROA (ang. Resonance Raman Optical Activity) i SEROA (ang. Surface-enhanced Raman Optical Activity), jak również innych metod chiralooptycznych (ECD, VCD). Jest autorem dwóch publikacji w czasopismach z listy filadelfijskiej i licznych wystąpień na krajowych i międzynarodowych konferencjach naukowych.
mgr Kornel Roztocki [email protected]
Absolwent Wydziału Chemii Uniwersytetu Jagiellońskiego w Krakowie, studia magisterskiej ukończył z wyróżnieniem w 2014; tytuł pracy: „Synteza układów M-MOF z udziałem metaloligandów hydrazonowych”. Doktorat realizuje na macierzystej uczelni zajmując się głównie zagadnieniami związanymi z chemią koordynacyjną, a w szczególności chemią supramolekularną oraz związkami typu MOF (sieci metalo-organiczne).
K. Jurowski, K. Kochan, A. Jurowska, G. Zając, K. Roztocki, Intepretacja
widm spektroskopowych i spektrometrycznych okiem młodych naukowców,
Scientiae et Didactics, 2015, ISBN 978-83-941637-2-3
11
K. Jurowski, K. Kochan, A. Jurowska, G. Zając, K. Roztocki, Intepretacja
widm spektroskopowych i spektrometrycznych okiem młodych naukowców,
Scientiae et Didactics, 2015, ISBN 978-83-941637-2-3
12
K. Jurowski, K. Kochan, A. Jurowska, G. Zając, K. Roztocki, Intepretacja
widm spektroskopowych i spektrometrycznych okiem młodych naukowców,
Scientiae et Didactics, 2015, ISBN 978-83-941637-2-3
13
‡
W polskiej literaturze fachowej brak jest monografii,
która przedstawiałaby w jednej pozycji różnorodne
podejścia do interpretacji widm spektroskopowych
i spektrometrycznych. Informacje na temat interpretacji
widm opisane w niniejszej monografii są bardzo ważne
z dydaktycznego punktu widzenia, bowiem stanowią
zestawienie najważniejszych informacji w przypadku
interpretacji widm w jednej monografii. Dla Autorów
niniejszej monografii jest dużym zaskoczeniem, iż do tej
pory nie było w polskiej literaturze żadnej pozycji
poświęconej tym podstawowym, niezwykle ważnym
zagadnieniom.
We współczesnym Świecie dominuje komputeryzacja,
cyfryzacja i coraz większa ilość monografii występuje
w postaci elektronicznej (e-booki). W tego typu
rozwiązaniach można dopatrywać się zarówno wad jak
K. Jurowski, K. Kochan, A. Jurowska, G. Zając, K. Roztocki, Intepretacja
widm spektroskopowych i spektrometrycznych okiem młodych naukowców,
Scientiae et Didactics, 2015, ISBN 978-83-941637-2-3
14
i zalet, niemniej jest to obecnie jedyny możliwy środek
przekazu do najszerszego grona odbiorców. Taki właśnie
cel przyświecał Autorom niniejszej monografii, którzy
zdecydowali się wydać tę pozycję tylko w postaci
elektronicznej.
Autorzy dokonali możliwie największych starań, aby
uniknąć ewentualnych błędów i zastosować poprawną
nomenklaturę fachową. Niemniej Autorzy zdają sobie
sprawę z ewentualnych niedoskonałości pracy i proszą
o zgłaszanie swoich wątpliwości bezpośrednio na adresy
mailowe przedstawione w notach biograficznych niniejszej
monografii. Wszystkie zaprezentowane widma stanowią
wyniki badań Autorów lub zostały zapożyczone
z bezpłatnych i ogólnodostępnych baz danych, które mogą
być wykorzystywane w monografiach na potrzeby
dydaktyczne.
Mamy nadzieję, iż praca ta będzie stanowić cenne
źródło wiedzy w nowoczesnym wydaniu, które umożliwi
zapoznanie wielu czytelników z obliczeniami spektrosko-
powymi i spektrometrycznymi, patrząc przez pryzmat
młodych naukowców, którzy też byli studentami
i zdają sobie sprawę jak trudno jest znaleźć źródło wiedzy
związane z tego typu tematyką.
Kraków, 2015
Autorzy
K. Jurowski, K. Kochan, A. Jurowska, G. Zając, K. Roztocki, Interpretacja
widm spektroskopowych i spektrometrycznych okiem młodych naukowców,
Scientiae et Didactics, 2015, ISBN 978-83-941637-2-3
15
1
Spektrometria mas
1.1. Wstęp
Widmo mas (z ang. mass spectrum) to graficzne
przedstawienie zależności intensywności sygnału od
stosunku m/z dla jonów. Innymi słowy, widmo mas
w określonych warunkach eksperymentalnych stanowi
zapis (wykres lub tabelę) natężenia sygnałów
analitycznych (natężenie prądu wytwarzanego przez jony
w miarę ich docierania do detektora) dla danych wartości
m/z. Intensywność sygnału (piku) na widmie wskazuje
zatem na względną liczbę jonów – im wyższy jest pik, tym
większa jest populacja jonu, od którego ten pik pochodzi.
Z uwagi na to, że na widmie mas można zaobserwować
zazwyczaj sygnały charakteryzujące się smukłym i ostrym
kształtem, sygnały te nazywa się pikami, a nie pasmami
tak jak ma to miejsce w różnych metodach spektrosko-
powych. Poniżej przedstawiono przykładowe widmo mas
dla o-ksylenu – rysunek 1.1 oraz tabela 1.1.
K. Jurowski, K. Kochan, A. Jurowska, G. Zając, K. Roztocki, Interpretacja widm spektroskopowych i spektrometrycznych
okiem młodych naukowców, Scientiae et Didactics, 2015, ISBN 978-83-941637-2-3
16
Rys. 1.1. Widmo mas o-ksylenu w postaci wykresu.
K. Jurowski, K. Kochan, A. Jurowska, G. Zając, K. Roztocki, Interpretacja
widm spektroskopowych i spektrometrycznych okiem młodych naukowców,
Scientiae et Didactics, 2015, ISBN 978-83-941637-2-3
17
Tabela 1.1. Widmo mas o-ksylenu w postaci tabeli.
m/z Intensywność względna [%]
26 1,29
27 9,61
38 2,77
39 18,12
40 2,19
41 3,09
50 7,09
51 16,7
52 7,41
53 5,03
61 1,42
62 3,16
63 7,67
64 1,81
65 9,80
66 1,29
74 2,26
75 1,74
76 1,55
77 18,43
78 8,83
79 7,22
89 2,83
91 99,99
92 8,32
102 1,35
103 5,8
104 2,77
105 21,92
106 55,77
107 5,09
K. Jurowski, K. Kochan, A. Jurowska, G. Zając, K. Roztocki, Interpretacja
widm spektroskopowych i spektrometrycznych okiem młodych naukowców,
Scientiae et Didactics, 2015, ISBN 978-83-941637-2-3
18
Należy zauważyć, że najczęstszym sposobem
przedstawiania widma mas jest prezentacja graficzna,
a nie tabelaryczna. Niemniej w zależności od celu badań,
obie formy prezentacji wyników są ważne. Powszechnie
więc widmo mas kojarzy się z wykresem słupkowym,
gdzie na osi x odłożona jest wartość (m/z), a na osi y
odłożona jest intensywność względna (%).
Na widmie mas najbardziej intensywny pik nazywany
jest pikiem podstawowym. Wysokość piku
podstawowego przyjmuje się za 100%, a wysokość
pozostałych pików odnosi się do tej wartości. Z kolei jony
powstałe w wyniku fragmentacji związku są rozdzielane
w zależności od ich stosunku masy do ładunku (m/z).
Warto zwrócić uwagę na to, że większa liczba jonów jest
naładowana pojedynczo, stąd skalę widma traktuje się
często jako skalę wyrażoną w jednostkach masy. Nie tak
rzadko możliwe są jony naładowane podwójnie, które
pojawiają się na skali m/z przy wartościach
odpowiadających połowie ich masy. Na widmie mas mogą
również występować takie jony, które powstały na skutek
usunięcia z cząsteczki jednego elektronu – takie jony
nazywają się jonami cząsteczkowymi (molekularnymi,
M) i zazwyczaj występują na widmie mas przy największej
wartości m/z. Wyjątkiem są grupy sygnałów
charakteryzujących się wartościami m/z równymi: M+1,
M+2, M+3, … itd. Sygnały tego typu noszą nazwę pików
izotopowych. Źródłem takich pików jest to, że liczne
pierwiastki obecne w związkach występują w przyrodzie
K. Jurowski, K. Kochan, A. Jurowska, G. Zając, K. Roztocki, Interpretacja
widm spektroskopowych i spektrometrycznych okiem młodych naukowców,
Scientiae et Didactics, 2015, ISBN 978-83-941637-2-3
19
w postaci wielu izotopów (wiele pierwiastków nie jest
monoizotopowych).
Liczba pików o znacznej intensywności w widmie mas
oraz ich rozmieszczenie jest charakterystyczną cechą
danej cząsteczki analitu. Masa i względne stężenie jonu
molekularnego wskazują na wielkość i ogólną trwałość
cząsteczki. Widmo mas zawierające kilka pików
o znacznej intensywności wskazuje, że cząsteczka ulega
tylko niewielkiej liczbie rozpadów, co świadczy o trwałości
produktów lub o obecności małej liczby nietrwałych
wiązań.
1.2. Interpretacja widm mas
1.2.1. Identyfikacja piku jonu molekularnego
Z uwagi na to, że wzór cząsteczkowy jest zazwyczaj
jedną z najważniejszych informacji otrzymywaną z widma
mas, stąd należy mieć pewność, że w grupie pików
o masach: M, M+1, M+2 itd. pik jonu molekularnego został
prawidłowo zidentyfikowany.
Wiadomo, że jon cząsteczkowy musi być jonem
posiadającym nieparzystą liczbę elektronów, z uwagi na
fakt, iż powstaje z cząsteczki na skutek utraty jednego
elektronu.
K. Jurowski, K. Kochan, A. Jurowska, G. Zając, K. Roztocki, Interpretacja
widm spektroskopowych i spektrometrycznych okiem młodych naukowców,
Scientiae et Didactics, 2015, ISBN 978-83-941637-2-3
20
1.2.1.1. Stopień nienasycenia (wskaźnik deficytu atomów wodoru)
Jedną z metod umożliwiających określenie, czy dany
jon ma nieparzystą liczbę elektronów jest tzw. stopień
nienasycenia (S), który określa sumę wiązań
wielokrotnych oraz układów pierścieniowych. W niektórych
źródła literaturowych stopień nienasycenia określa się
czasami jako tzw. wskaźnik deficytu atomów wodoru. Dla
prostych cząsteczek organicznych, w których obecne są
tylko atomy węgla, wodoru, tlenu, siarki, azotu oraz
chlorowców można zapisać uproszczony wzór na stopień
nienasycenia (S):
𝑆 =2𝑛𝐶−𝑛𝐻+𝑛𝑁−𝑛𝑋+2
2 (1.1)
gdzie:
𝑛𝐶 – atomy węgla
𝑛𝐻 – atomy wodoru
𝑛𝑁 – atomy azotu
𝑛𝑋 – atomy chlorowców
Podsumowując:
Jeśli w cząsteczce są obecne atomy wodoru, to ich
liczbę odejmuje się od podwójnej liczby atomów
węgla;
K. Jurowski, K. Kochan, A. Jurowska, G. Zając, K. Roztocki, Interpretacja
widm spektroskopowych i spektrometrycznych okiem młodych naukowców,
Scientiae et Didactics, 2015, ISBN 978-83-941637-2-3
21
Jeśli w cząsteczce są obecne atomy azotu, to ich
liczbę dodaje się do podwójnej liczby atomów
węgla;
Jeśli w cząsteczce są obecne atomy chlorowców,
to ich liczbę odejmuje się od podwójnej liczby
atomów węgla;
Niech jako przykład posłuży cząsteczka kwasu
cynamonowego:
W cząsteczce tej obecnych jest:
𝑛𝐶 = 9
𝑛𝐻 = 8
𝑛𝑁 – 0
𝑛𝑋 – 0
Wówczas stopień nienasycenia wynosi 6, ponieważ:
𝑆 =2𝑛𝐶 − 𝑛𝐻 + 𝑛𝑁 − 𝑛𝑋 + 2
2=
2 ∙ 9 − 8 + 0 − 0 + 2
2= 6
Analizując wzór półstrukturalny można stwierdzić,
K. Jurowski, K. Kochan, A. Jurowska, G. Zając, K. Roztocki, Interpretacja
widm spektroskopowych i spektrometrycznych okiem młodych naukowców,
Scientiae et Didactics, 2015, ISBN 978-83-941637-2-3
22
że w cząsteczce kwasu cynamonowego znajduje się
5 wiązań typu π (czerwone strzałki) oraz jeden pierścień
aromatyczny (różowe tło) w sumie 6, co jest w zgodzie
z wcześniejszymi obliczeniami:
Z punktu widzenia spektrometrii mas, ważne jest, by
pamiętać, że stopień nienasycenia dla jonów
o nieparzystej liczbie elektronów musi być liczbą
całkowitą. Z kolei dla jonów o parzystej liczbie elektronów,
stopień nienasycenia będzie liczbą niecałkowitą.
1.2.1.2. Reguła azotowca
Jeśli cząsteczka związku organicznego lub jon posiada
nieparzystą liczbę atomów azotu, to liczba określająca jej
masę cząsteczkową jest nieparzysta. Jeśli z kolei
cząsteczka lub jon zawiera parzystą liczbę atomów azotu
lub nie zawiera ich wcale, to masa cząsteczkowa jest
wyrażona liczbą parzystą. Reguła ta znajduje
K. Jurowski, K. Kochan, A. Jurowska, G. Zając, K. Roztocki, Interpretacja
widm spektroskopowych i spektrometrycznych okiem młodych naukowców,
Scientiae et Didactics, 2015, ISBN 978-83-941637-2-3
23
zastosowanie do wszystkich związków zawierających
atomy: C, H, O, N, S, P, B, Si oraz atomy fluorowców. Na
podstawie przedstawionych wcześniej informacji można
dojść do następujących wniosków:
Jony o nieparzystej liczbie elektronów (tzw. jony
nieparzystoelektronowe), odpowiadające cząsteczce
niezawierającej atomów azotu lub zawierających ich
parzystą liczbę będą miały masę wyrażoną liczbą
parzystą;
Jony o parzystej liczbie elektronów (tzw. jony
parzystoelektronowe), odpowiadające cząsteczce
zawierającej nieparzystą liczbę atomów azotu będą
miały masę wyrażoną liczbą nieparzystą.
Warto zwrócić uwagę na to, że jony nieparzysto-
elektronowe powstają głównie w EI, z kolei jony
parzystoelektronowe powstają głównie w ESI, APCI oraz
MALDI.
1.2.1.3. Analiza pików jonów fragmentacyjnych w pobliżu piku badanego
jonu
Rozpoznawanie piku jonu molekularnego można
również dokonać poprzez analizę pików jonów
fragmentacyjnych w pobliżu badanego jonu. Utrata
fragmentów o masach z zakresu: 3 – 15 oraz z zakresu:
K. Jurowski, K. Kochan, A. Jurowska, G. Zając, K. Roztocki, Interpretacja
widm spektroskopowych i spektrometrycznych okiem młodych naukowców,
Scientiae et Didactics, 2015, ISBN 978-83-941637-2-3
24
20 – 26 jest bardzo mało prawdopodobna, stąd jeśli
obserwuje się piki odpowiadające fragmentom o tak
zmienionej masie, to można przypuszczać, że
rozpatrywany jon jest raczej jonem fragmentacyjnym, a nie
cząsteczkowym.
1.2.1.4. Zmiana warunków pomiaru
Zmiana warunków pomiarowych daje również
możliwości na dostarczenie dowodów potwierdzających
właściwe rozpoznanie jonu cząsteczkowego. W takim
przypadku pomocne może okazać się maksymalne
wzmocnienie, co ułatwi obserwację bardzo słabego piku
jonu molekularnego.
Drugim sposobem może być zmniejszenie energii
strumienia elektronów, co powoduje zmniejszenie
intensywności jonów fragmentacyjnych w porównaniu
z intensywnością jonu cząsteczkowego. Należy zauważyć,
że dotyczy to również jonów fragmentacyjnych
pochodzących od kontaminacji.
Innym podejściem może być również zastosowanie
innego typu jonizacji niż EI, np. jonizacja chemiczna,
jonizacja polem w większym stopniu sprzyjają tworzeniu
grupy pików jonu molekularnego, stąd jeśli są dostępne to
również powinny być zastosowane.
K. Jurowski, K. Kochan, A. Jurowska, G. Zając, K. Roztocki, Interpretacja
widm spektroskopowych i spektrometrycznych okiem młodych naukowców,
Scientiae et Didactics, 2015, ISBN 978-83-941637-2-3
25
1.2.2. Intensywność piku jonu molekularnego
Intensywność piku molekularnego w widmie mas jest
tym większa, im mniejsza jest energia potrzebna do
jonizacji cząsteczki i im trwalszy jest jon cząsteczkowy.
Strukturze cząsteczki odpowiadają charakterystyczne
wartości energii jonizacji, a to określa wielkość energii
potrzebnej do wytworzenia jonu cząsteczkowego.
Należy zwrócić uwagę, że jeśli cząsteczka zawiera
wiązanie łatwo ulegające rozszczepieniu, to pik jonu
molekularnego będzie charakteryzował się bardzo małą
intensywnością. Zazwyczaj intensywność jonu
molekularnego wzrasta ze wzrostem nienasycenia i ze
wzrostem liczby pierścieni, przy czym jest mniejsza dla
łańcuchów rozgałęzionych. Wzrost intensywności piku
jonu cząsteczkowego może być z kolei powodem
obecności heteroatomów, mających na zewnętrznych
powłokach łatwo ulegające dysocjacji elektrony.
W tabeli 1.2. przedstawiono ogólne wskazówki
pomocne podczas przewidywania intensywności piku jonu
molekularnego dla widm różnego rodzaju klasy związków
organicznych.
……………………………………………………………………………………………….……
……………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………..
K. Jurowski, K. Kochan, A. Jurowska, G. Zając, K. Roztocki, Interpretacja
widm spektroskopowych i spektrometrycznych okiem młodych naukowców,
Scientiae et Didactics, 2015, ISBN 978-83-941637-2-3
26
Tabela 1.2. Ogólne wskazówki pomocne podczas przewidywania
intensywności piku jonu molekularnego. in
tensyw
ność p
iku
jonu
mo
lekula
rnego
mała lub pik nie występuje
średnia duża
kla
sa z
wią
zków
alkohole
alifatyczne
aminy
alifatyczne
nitryle
związki o rozga-
łęzionych
łańcuchach
związki nitrowe
aromatyczne bromo-
i jodopochodne
sprzężone alkeny
pochodne benzylowe
oraz benzoilowe
ketony i aldehydy
o prostych łańcu-
chach, estry, kwasy
karboksylowe, amidy
etery
halogenki alkilowe
węglowodory
aromatyczne
aromatyczne
nitryle i aminy oraz
fluoro- i chloro-
pochodne
nasycone związki
cykliczne
1.2.3. Wzory cząsteczkowe
Jedną z najbardziej użytecznych informacji,
pozyskiwanych z widma mas, jest wzór cząsteczkowy
danego związku. Jeśli istnieje możliwość identyfikacji jonu
molekularnego, to istnieją dwa sposoby ustalania wzoru
cząsteczkowego w zależności od rozdzielczości
stosowanego spektrometru mas. Najlepszą metodą jest
zastosowanie aparatu odznaczającego się dużą
K. Jurowski, K. Kochan, A. Jurowska, G. Zając, K. Roztocki, Interpretacja
widm spektroskopowych i spektrometrycznych okiem młodych naukowców,
Scientiae et Didactics, 2015, ISBN 978-83-941637-2-3
27
zdolnością rozdzielczą, co umożliwia dokładny pomiar
masy jonu molekularnego. Z uwagi na to, że masy
atomowe nie wyrażają się liczbami całkowitymi, masa
każdego zestawu atomów będzie wyrażona
charakterystyczną liczbą niecałkowitą. Dokładny pomiar
masy pozwala zatem odróżnić dwa sygnały. Warto
zwrócić uwagę, iż istnieją różnorodne tabele, które
ułatwiają powiązanie dokładnych mas ze wzorami
cząsteczkowymi. Dokładne wyznaczanie masy
cząsteczkowej jest szczególnie ważne podczas, gdy
zachodzi potrzeba potwierdzenia poprawności identyfikacji
konkretnego jonu cząsteczkowego, natomiast jest mało
przydatne w przypadku prób ustalania wzoru nieznanego
analitu.
Inną metodą może być pomiar intensywności pików
izotopowych, szczególnie jeśli wykorzystuje się widma
mas wykonane przez spektrometry mas o małej
rozdzielczości. W tym przypadku należy stosować
abundancje trwałych izotopów. Dane dla poszczególnych
izotopów są przedstawiane w dwojaki sposób – jako
odsetek wszystkich występujących izotopów, albo jako
odsetek izotopu występującego w największej ilości.
Każda więc kombinacja atomów będzie dawała grupę
pików izotopowych o możliwych do przewidzenia
intensywnościach. Niech jako przykład posłuży metan,
w którym stosunek intensywności pików 12CH4:13CH4
wynosi 100:1,08. Intensywność piku M+1 będzie równa
1,08% intensywności piku molekularnego. Warto
K. Jurowski, K. Kochan, A. Jurowska, G. Zając, K. Roztocki, Interpretacja
widm spektroskopowych i spektrometrycznych okiem młodych naukowców,
Scientiae et Didactics, 2015, ISBN 978-83-941637-2-3
28
nadmienić, że bardzo mały wkład w intensywności tego
piku będzie też wnosiła cząsteczka 12C1H32H.
Należy zauważyć, że jednym z warunków, jaki musi być
spełniony, aby możliwe było zastosowanie intensywności
pików izotopowych do określenia wzoru cząsteczkowego,
jest względnie duża intensywność piku molekularnego.
W innym przypadku piki izotopowe mogą być zbyt słabe,
aby można było zmierzyć ich intensywność z wymaganą
dokładnością. Innym problemem może być nakładanie się
piku sprotonowanego jonu molekularnego, słabych jonów
tła lub pików kontaminacji próbki. Warto zwrócić uwagę,
iż metoda ta daje poprawne wyniki tylko dla cząsteczek
o masie nie większej niż 250 – 300.
1.2.4. Fragmentacja
Pik jonu molekularnego dostarcza podstawowych
informacji na temat tożsamości cząsteczki. Dalsze
informacje można uzyskać z układu pików
fragmentacyjnych, które pochodzą od jonów powstałych
na drodze rozpadu jonu molekularnego. Ponieważ nie
wszystkie jony mają takie samo znaczenie, poniżej
zestawiono najważniejsze zasady i metody postepowania
podczas interpretacji widm:
Najważniejszy na widmie mas jest pik jonu
molekularnego;
K. Jurowski, K. Kochan, A. Jurowska, G. Zając, K. Roztocki, Interpretacja
widm spektroskopowych i spektrometrycznych okiem młodych naukowców,
Scientiae et Didactics, 2015, ISBN 978-83-941637-2-3
29
Spośród jonów o podobnej masie lub powstających
w porównywalnych ilościach, jony o nieparzystej
liczbie elektronów mają na ogół większe znaczenie
niż jony o parzystej liczbie elektronów – jony
o nieparzystej liczbie elektronów tworzą się zwykle
w reakcjach przegrupowania, które mogą być
charakterystyczne dla poszczególnych klas
związków;
można się spodziewać, że jony o dużych masach
będą dostarczały ważniejszych informacji niż te,
o małych masach powstających w wyniku prostych,
łatwych do wyjaśnienia fragmentacji;
Źródłem cennych informacji o rodzajach procesów
rozpadu mogą być jony metastabilne;
Istnieją dwa ważne czynniki decydujące
o intensywności pików jonów fragmentacyjnych
w widmie mas: 1) różnice między energiami wiązań
rozrywających się i tworzących w trakcie
powstawania jonu; 2) trwałość danego jonu.
Widmo mas stanowi swojego rodzaju „molekularny
odcisk palca”, ponieważ każda cząsteczka posiada
własny, charakterystyczny szablon fragmentacji, a z kolei
prawdopodobieństwo, że dwie cząsteczki będą posiadały
identyczny szablon fragmentacyjny, jest bardzo małe.
Obecnie bardzo rzadko dochodzi do samodzielnej
K. Jurowski, K. Kochan, A. Jurowska, G. Zając, K. Roztocki, Interpretacja
widm spektroskopowych i spektrometrycznych okiem młodych naukowców,
Scientiae et Didactics, 2015, ISBN 978-83-941637-2-3
30
interpretacji złożonych widm mas, ponieważ możliwa jest
komputerowa identyfikacja nieznanego związku poprzez
analizę porównawczą badanego szablonu fragmenta-
cyjnego z widmem mas z darmowych bibliotek widm mas,
oferowanych przez różnorodne firmy specjalizujące się
w budowie instrumentów analitycznych.
Jeśli jednak zachodzi potrzeba samodzielnej analizy
widma mas, to możliwe jest wyciąganie wniosków,
dotyczących struktury badanej cząsteczki na podstawie
sposobu jej fragmentacji.
Wiadomo jest, że fragmentacja zachodzi wówczas, gdy
wzbudzony, mający znaczną energię kationorodnik,
rozpada się samorzutnie na mniejsze fragmenty
- wiązania chemiczne pękają i powstają w najprostszym
przypadku dwa fragmenty. Jeden z tych dwóch
fragmentów ma ładunek dodatni, jest karbokationem,
natomiast drugi jest obojętnym elektrycznie rodnikiem.
Co więcej, ładunek dodatni pozostaje na tym fragmencie,
na którym jest trwalszy, czyli lepiej stabilizowany
- w czasie fragmentacji powstają karbokationy bardziej
trwałe.
Poniżej przedstawiono zarys informacji na temat
charakterystycznych właściwości fragmentacyjnych
niektórych wybranych grup funkcyjnych:
alkohole – ta klasa związków organicznych posiada
dwie charakterystyczne ścieżki fragmentacji: rozpad
alfa oraz dehydratację; w przypadku pierwszej z nich
K. Jurowski, K. Kochan, A. Jurowska, G. Zając, K. Roztocki, Interpretacja
widm spektroskopowych i spektrometrycznych okiem młodych naukowców,
Scientiae et Didactics, 2015, ISBN 978-83-941637-2-3
31
rozerwaniu ulega wiązanie C—C najbliższe grupy
hydroksylowej, dając obojętny rodnik oraz fragment
naładowany elektrycznie i zawierający atom tlenu,
co można schematycznie przedstawić jako:
W drugim przypadku (dehydratacja), eliminowana jest
cząsteczka wody, dając alkenowy kationorodnik o 18 u
lżejszy od masy jonu molekularnego, co można
schematycznie przedstawić jako:
aminy – ulegają charakterystycznemu rozpadowi α,
podobnie jak alkohole; wiązanie C—C najbliższe do
atomu azotu ulega rozerwaniu, dając obojętny rodnik
alkilowy oraz kation z atomem azotu, co można
schematycznie przedstawić jako: ……………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………
K. Jurowski, K. Kochan, A. Jurowska, G. Zając, K. Roztocki, Interpretacja
widm spektroskopowych i spektrometrycznych okiem młodych naukowców,
Scientiae et Didactics, 2015, ISBN 978-83-941637-2-3
32
aldehydy i ketony – jeśli na trzecim atomie węgla od
grupy karbonylowej znajduje się atom wodoru (γ atom
węgla), to ulegają charakterystycznemu rozczepieniu
cząsteczki – tzw. rozszczepieniu McLaffertyego.
W takim przypadku atom wodoru zostaje przeniesiony
do atomu tlenu z grupy karbonylowej, następnie pęka
wiązanie C—C, co z kolei prowadzi do powstania
obojętnej cząsteczki alkenu, a ładunek dodatni
pozostaje na fragmencie, zawierającym atom tlenu,
co można schematycznie przedstawić jako:
Oprócz tej przemiany aldehydy i ketony mogą ulegać
również fragmentacji poprzez rozpad α, polegający na
rozerwaniu wiązania między grupą karbonylową
a najbliższym atomem węgla, w wyniku czego powstaje
obojętny rodnik oraz kation zawierający atom tlenu,
co można schematycznie przedstawić jako:
K. Jurowski, K. Kochan, A. Jurowska, G. Zając, K. Roztocki, Interpretacja
widm spektroskopowych i spektrometrycznych okiem młodych naukowców,
Scientiae et Didactics, 2015, ISBN 978-83-941637-2-3
33
1.2.5. Reguły przydatne podczas interpretacji widm mas
Podczas interpretacji widma mas, warto posługiwać się
pewną strategią, której etapy przedstawiono poniżej.
Należy jednakże zauważyć, że każde widmo mas stanowi
indywidualny problem i nie można sztywno trzymać się
jakiegokolwiek schematu postępowania. Dlatego też
poniżej przedstawiono jedynie ogólne zasady, które mogą
być przydatne podczas interpretacji widm mas:
Etap I. Należy najpierw zidentyfikować jon
molekularny (M+);
Etap II. Poddać związek analizie elementarnej oraz
obliczyć na jej podstawie stopień nienasycenia
związku (S);
Etap III. Na podstawie ogólnej analizy widma mas
należy wyciągnąć wszystkie możliwe wnioski
na temat struktury związku - zidentyfikować
serie pików i jony charakterystyczne;
Etap IV. Na podstawie obecności jonów o dużych
masach należy ustalić prawdopodobną
strukturę fragmentów obojętnych;
K. Jurowski, K. Kochan, A. Jurowska, G. Zając, K. Roztocki, Interpretacja
widm spektroskopowych i spektrometrycznych okiem młodych naukowców,
Scientiae et Didactics, 2015, ISBN 978-83-941637-2-3
34
Etap V. Należy zidentyfikować piki jonów
o nieparzystej liczbie elektronów i rozważyć
możliwe przegrupowania;
Etap VI. Na podstawie danych uzyskanych z widma
mas oraz innych przesłanek należy
zaproponować prawdopodobną strukturę
związku, posiłkując się w razie potrzeby
bazami danych lub tablicami spektrometry-
cznymi.
1.2.6. Przegląd widm mas wybranych klas związków
organicznych
Z uwagi na fakt, iż monografia ta nie jest dedykowana
wyłącznie spektrometrii mas, stąd poniżej zestawiono
jedynie zarys podstawowych informacji na temat widm
mas wybranych klas związków organicznych.
1.2.6.1. Węglowodory
1.2.6.1.1. Alkany
Ponieważ do zjonizowania węglowodorów nasyconych
jest wymagana relatywnie duża wartość energii, stąd
powstałe jony ulegają najczęściej przypadkowym
przegrupowaniom. Zazwyczaj jon molekularny daje się
zaobserwować, ale jego intensywność może być
niewielka. Zwykle widma mas alkanów zawierają serię
K. Jurowski, K. Kochan, A. Jurowska, G. Zając, K. Roztocki, Interpretacja
widm spektroskopowych i spektrometrycznych okiem młodych naukowców,
Scientiae et Didactics, 2015, ISBN 978-83-941637-2-3
35
pików, których położenie różni się o czternaście jednostek
masy, co odpowiada jonom różniącym się liczbą grup
metylenowych (-CH2- lub =CH2). Warto zwrócić również
uwagę na to, że jon M-CH3 zazwyczaj nie jest obecny na
widmie mas.
Dla węglowodorów o prostych łańcuchach
intensywność pików innych jonów stopniowo się zwiększa,
osiągając maksimum przy m/z 43 (C3H7+) lub m/z 57
(C4H9+) – piki te powstają od jonów znacznie
rozgałęzionych, powstających w wyniku przegrupowań
cząsteczkowych. Przykład widma mas dla alkanów
nierozgałęzionych na przykładzie undekanu przedsta-
wiono na rysunku 1.2.
W przypadku alkanów rozgałęzionych można
zaobserwować piki odpowiadające preferowanym
rozszczepieniom przy III° lub IV° atomach węgla.
Przykładem tego może być pik m/z 113 na widmie mas dla
2,6-dimetylooktanu, które zostało przedstawione na
rysunku 1.3. Pik m/z 113 odpowiada drugorzędowemu
karbokationowi, który powstaje poprzez oderwanie grupy
etylenowej.
……………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………….
……………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………..
K. Jurowski, K. Kochan, A. Jurowska, G. Zając, K. Roztocki, Interpretacja widm spektroskopowych i spektrometrycznych
okiem młodych naukowców, Scientiae et Didactics, 2015, ISBN 978-83-941637-2-3
36
Rys. 1.2. Widmo mas nierozgałęzionego węglowodoru nasyconego na przykładzie undekanu.
K. Jurowski, K. Kochan, A. Jurowska, G. Zając, K. Roztocki, Interpretacja widm spektroskopowych i spektrometrycznych
okiem młodych naukowców, Scientiae et Didactics, 2015, ISBN 978-83-941637-2-3
37
Rys. 1.3. Widmo mas rozgałęzionego węglowodoru nasyconego na przykładzie 2,6-dimetylooktanu.
K. Jurowski, K. Kochan, A. Jurowska, G. Zając, K. Roztocki, Interpretacja
widm spektroskopowych i spektrometrycznych okiem młodych naukowców,
Scientiae et Didactics, 2015, ISBN 978-83-941637-2-3
38
1.2.6.1.2. Alkeny
Zazwyczaj na widmach mas alkenów, pik jonu
molekularnego jest wyraźny. Ponadto, bardziej intensywna
w porównaniu do alkanów jest seria pików odpowiadająca
masie CnH+
n-1. Seria ta jest widoczna np. w widmie mas
heks-1-enu, które zostało przedstawione na rysunku 1.4.
Zazwyczaj określenie położenia wiązania podwójnego nie
jest możliwe z uwagi na łatwo zachodzące
przegrupowania.
1.2.6.1.3. Areny
Z uwagi na stabilizujący wpływ pierścienia
aromatycznego, w widmach mas arenów występuje
zazwyczaj bardzo intensywny pik jonu molekularnego.
Zazwyczaj można również zanotować piki jonów
podwójnie zjonizowanych, które występują w widmie mas
przy wartościach odpowiadających połowie ich masy
rzeczywistej. W widmach pochodnych benzenu obecny
jest pik m/z 91, który pochodzi od jonu tropyliowego
(C7H7+), który po utracie obojętnej cząsteczki etynu
przekształca się w jon o wartości m/z 65 (C5H5+). Przykład
widma mas pochodnej benzenu na przykładzie toluenu
przedstawiono na rysunku 1.5.
Warto zwrócić uwagę, że w przypadku związków
aromatycznych podstawionych grupami alkilowymi
posiadającymi co najmniej trzy atomy węgla, atom wodoru
z pozycji γ może ulegać przeniesieniu – w analogii do
K. Jurowski, K. Kochan, A. Jurowska, G. Zając, K. Roztocki, Interpretacja
widm spektroskopowych i spektrometrycznych okiem młodych naukowców,
Scientiae et Didactics, 2015, ISBN 978-83-941637-2-3
39
przegrupowania McLafferty’ego. Efektem tego jest pik m/z
92. Przykład widma mas dla tego typu związków
aromatycznych na przykładzie butylobenzenu przedsta-
wiono na rysunku 1.6.
Rys. 1.4. Widmo mas alkenu na przykładzie heks-1-enu.
……………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………..
K. Jurowski, K. Kochan, A. Jurowska, G. Zając, K. Roztocki, Interpretacja widm spektroskopowych i
spektrometrycznych okiem młodych naukowców, Scientiae et Didactics, 2015, ISBN 978-83-941637-2-3
40
Rys. 1.5. Widmo mas pochodnej benzenu na przykładzie toluenu.
K. Jurowski, K. Kochan, A. Jurowska, G. Zając, K. Roztocki, Interpretacja widm spektroskopowych i
spektrometrycznych okiem młodych naukowców, Scientiae et Didactics, 2015, ISBN 978-83-941637-2-3
41
Rys. 1.6. Widmo mas związku aromatycznego podstawionego grupami alkilowymi, posiadającymi co
najmniej trzy atomy węgla na przykładzie butylobenzenu.
K. Jurowski, K. Kochan, A. Jurowska, G. Zając, K. Roztocki, Interpretacja
widm spektroskopowych i spektrometrycznych okiem młodych naukowców,
Scientiae et Didactics, 2015, ISBN 978-83-941637-2-3
42
1.2.6.2. Alkohole, fenole i etery
Zazwyczaj pik jonu molekularnego na widmach mas
alkoholi jest bardzo słaby lub wręcz niezauważalny.
W przypadku tej klasy związków charakterystycznymi
jonami są stabilizowane przez rezonans karbokationu,
powstałe na drodze rozpadu α. Preferowanym kierunkiem
tego rozpadu jest ten, w którym oderwaniu ulegają jak
największe grupy alkilowe.
W przypadku alkoholi I° charakterystycznym pikiem jest
M – 18, co wynika z utraty cząsteczki wody przez jon
molekularny. Warto zwrócić uwagę na to, że pik ten może
również pochodzić od jonu powstałego na drodze
termicznego rozkładu alkoholu w komorze jonizacyjnej.
Jako przykład może posłużyć widmo mas propan-1-olu
przedstawione na rysunku 1.7. Na widmie tym można
zauważyć pik m/z 42 z uwagi na utratę cząsteczki wody,
pik m/z 59 z uwagi na utratę atomu wodoru oraz jon
m/z 31, który pochodzi od jonu CH2=O+H.
W przypadku fenoli na widmie mas występuje
intensywny pik jonu molekularnego. Do charakter-
rystycznych pików fenoli można zaliczyć takie, które
pochodzą od jonów M-28 (co wynika z utraty CO
i powstania jonu nieparzystoelektronowego) oraz M-29 (co
wynika z utraty CHO). Na rysunku 1.8 przedstawiono
widmo mas dla fenolu (hydroksybenzenu). Charakte-
rystycznymi pikami na tym widmie są: m/z 65 (pochodzący
z utraty CHO) oraz m/z 66 (pochodzący z utraty CO),
a ponadto pik jonu molekularnego m/z 94.
K. Jurowski, K. Kochan, A. Jurowska, G. Zając, K. Roztocki, Interpretacja
widm spektroskopowych i spektrometrycznych okiem młodych naukowców,
Scientiae et Didactics, 2015, ISBN 978-83-941637-2-3
43
W przypadku eterów pik jonu molekularnego jest
bardzo mało intensywny lub niezauważalny. W przypadku
tej klasy związków obserwuje się bardzo często piki
pochodzące z dwóch charakterystycznych procesów
fragmentacyjnych. Pierwszy z nich to rozpad wiązania
węgiel-tlen, co skutkuje pojawieniem się piku
o największej intensywności. Drugi proces polega na
rozerwaniu wiązania między atomami węgla α oraz β
(czyli rozszczepienie α). Przykładem może być widmo
mas eteru dietylowego, na którym obserwuje się
intensywne piki: m/z 59, m/z 45 oraz m/z 31- rysunek 1.9.
Rys. 1.7. Widmo mas alkoholu I° na przykładzie propan-1-olu.
K. Jurowski, K. Kochan, A. Jurowska, G. Zając, K. Roztocki, Interpretacja widm spektroskopowych i
spektrometrycznych okiem młodych naukowców, Scientiae et Didactics, 2015, ISBN 978-83-941637-2-3
44
Rys. 1.8. Widmo mas fenolu (hydroksybenzenu).
K. Jurowski, K. Kochan, A. Jurowska, G. Zając, K. Roztocki, Interpretacja widm spektroskopowych i
spektrometrycznych okiem młodych naukowców, Scientiae et Didactics, 2015, ISBN 978-83-941637-2-3
45
Rys. 1.9. Widmo mas eteru dietylowego.
K. Jurowski, K. Kochan, A. Jurowska, G. Zając, K. Roztocki, Interpretacja
widm spektroskopowych i spektrometrycznych okiem młodych naukowców,
Scientiae et Didactics, 2015, ISBN 978-83-941637-2-3
46
1.2.6.3. Aldehydy i ketony
W przypadku aldehydów i ketonów pik dla jonu
molekularnego jest zazwyczaj zauważalny. Na widmie
mas dla tych klas związków istnieją charakterystyczne piki
pochodzące od karbokationów, jakie powstają w wyniku
rozpadu α względem grupy karbonylowej, co prowadzi do
powstania dwóch możliwych jonów acyliowych, które
w konsekwencji tracą cząsteczkę tlenku węgla(II).
W przypadku aldehydów oraz ketonów aromatycznych
pikiem podstawowym jest zazwyczaj pik jonu C6H5-C≡O+,
co daje pik m/z 105. Warto zauważyć, że rozpad α ma
mniejsze znaczenie niż w przypadku ketonów, chociaż
intensywny pik przy m/z 29, odpowiadający CHO, jest
czasami obecny na widmie mas.
Dla aldehydów i ketonów charakterystyczne jest
również przegrupowanie McLafferty’ego, pod warunkiem
jednak, że grupa alkilowa związana z grupą karboksylową
ma łańcuch zbudowany z co najmniej trzech atomów
węgla. Na drodze tej przemiany powstają jony
o nieparzystej liczbie elektronów, co jest pomocne
podczas analizy widma. Pik tego typu odpowiadający
jonowi nieparzystoelektronowemu o m/z 43 może być
zaobserwowany np. na widmie 4-metylopentan-2-onu –
rysunek 1.10.
K. Jurowski, K. Kochan, A. Jurowska, G. Zając, K. Roztocki, Interpretacja widm spektroskopowych i
spektrometrycznych okiem młodych naukowców, Scientiae et Didactics, 2015, ISBN 978-83-941637-2-3
47
Rys. 1.10. Widmo mas 4-metylopentan-2-onu.
K. Jurowski, K. Kochan, A. Jurowska, G. Zając, K. Roztocki, Interpretacja
widm spektroskopowych i spektrometrycznych okiem młodych naukowców,
Scientiae et Didactics, 2015, ISBN 978-83-941637-2-3
48
1.2.6.4. Kwasy karboksylowe
W przypadku widm mas kwasów monokarboksylowych
pik jonu molekularnego zazwyczaj jest obecny. Rozpad
α daje dwa piki jonów o masach: M-17 (OH) oraz M-45
(COOH), np. widmo mas dla C3H5COOH – rysunek 1.11.
1.2.6.5. Estry kwasów karboksylowych
W przypadku estrów kwasów karboksylowych
o ogólnym wzorze R1COOR2 pik pochodzący od jonu
molekularnego jest zazwyczaj widoczny, jeśli grupa
alkilowa R1 zawiera mniej niż cztery atomy węgla. Piki
charakterystyczne pochodzą od jonów powstałych na
skutek przegrupowania McLafferty’ego. Przegrupowanie
to może zachodzić z udziałem grup alkilowych takich jak
– acylowa oraz alkoksylowa, ale pod warunkiem, że grupy
te są zbudowane przynajmniej z trzech (w przypadku
pierwszej grupy) lub dwóch (w przypadku drugiej grupy)
atomów węgla.
Warto zauważyć, że charakterystyczny jon dla estrów
alkoholi, charakteryzujących się długimi łańcuchami,
powstaje na skutek przegrupowania dwóch atomów
wodoru – jest to tzw. przegrupowanie typu
„McLafferty’ego + 1”. Przykładowo w widmie mas
butanianu etylu przedstawionym na rysunku 1.12., obecne
są dwa charakterystyczne piki pochodzące od
nieparzystoelektronowych jonów o m/z 88 oraz m/z 60,
które powstały na skutek dwóch następujących po sobie
K. Jurowski, K. Kochan, A. Jurowska, G. Zając, K. Roztocki, Interpretacja
widm spektroskopowych i spektrometrycznych okiem młodych naukowców,
Scientiae et Didactics, 2015, ISBN 978-83-941637-2-3
49
przegrupowań McLafferty’ego. Co więcej, odczepienie
grupy alkoksylowej powoduje intensywny pik o m/z 71
(M-OCH2CH3). Często w spektrometrii mas mówi się
o tzw. „diagnostycznym wskaźniku”, jakim jest pik
o m/z 71.
Rys. 1.11. Widmo mas dla kwasu masłowego.
………………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………...
K. Jurowski, K. Kochan, A. Jurowska, G. Zając, K. Roztocki, Interpretacja widm spektroskopowych i
spektrometrycznych okiem młodych naukowców, Scientiae et Didactics, 2015, ISBN 978-83-941637-2-3
50
Rys. 1.12. Widmo mas dla butanianu etylu.
K. Jurowski, K. Kochan, A. Jurowska, G. Zając, K. Roztocki, Interpretacja
widm spektroskopowych i spektrometrycznych okiem młodych naukowców,
Scientiae et Didactics, 2015, ISBN 978-83-941637-2-3
51
1.2.6.6. Aminy
W przypadku amin alifatycznych pik jonu
molekularnego posiada małą intensywność, z kolei
w przypadku amin aromatycznych intensywność ta jest
wysoka. Charakterystyczne reakcje rozpadu są
analogiczne jak w przypadku alkoholi i eterów.
W przypadku amin I° podstawionych w pozycji α jest
preferowane odczepienie największej grupy alkilowej
– analogiczna sytuacja jest w przypadku amin II° oraz III°.
Niech jako przykład posłuży widmo mas dla dietyloaminy
przedstawione na rysunku 1.13.
1.2.6.7. Amidy
Jeśli chodzi o zachowanie amidów, to rozpad ich
przebiega podobnie jak ma to miejsce w przypadku
odpowiednich kwasów karboksylowych i estrów
metylowych. Dla wszystkich amidów charakterystyczne
jest tworzenie jonów o masie M+1 w reakcji między jonami
i cząsteczkami. Co więcej, w widmach amidów
I° występuje zwykle intensywny pik przy m/z 44. Co
więcej, podobnie jak w innych klasach związków
organicznych, obserwuje się przegrupowania
McLafferty’ego. Na rysunku 1.14 przedstawiono
przykładowe widmo mas dla acetamidu.
K. Jurowski, K. Kochan, A. Jurowska, G. Zając, K. Roztocki, Interpretacja widm spektroskopowych i
spektrometrycznych okiem młodych naukowców, Scientiae et Didactics, 2015, ISBN 978-83-941637-2-3
52
Rys. 1.13. Widmo mas dla dietyloaminy.
K. Jurowski, K. Kochan, A. Jurowska, G. Zając, K. Roztocki, Interpretacja widm spektroskopowych i
spektrometrycznych okiem młodych naukowców, Scientiae et Didactics, 2015, ISBN 978-83-941637-2-3
53
Rys. 1.14. Widmo mas dla acetamidu.
K. Jurowski, K. Kochan, A. Jurowska, G. Zając, K. Roztocki, Interpretacja
widm spektroskopowych i spektrometrycznych okiem młodych naukowców,
Scientiae et Didactics, 2015, ISBN 978-83-941637-2-3
54
2
Spektroskopia
ramanowska
2.1. Wstęp
Widma ramanowskie dostarczają informacji
o kompozycji badanej próbki na poziome molekularnym.
Oznacza to, że pozwalają one na identyfikację wszystkich
składników próbki. Spektroskopia ramanowska może być
stosowana zarówno do oznaczeń jakościowych, jak
i ilościowych. W przypadku analizy ilościowej konieczne
jest jednak wykonanie odpowiedniej kalibracji. Co więcej,
możliwe jest określenie np. konformacji molekuł, długości
łańcucha, czy stopnia nienasycenia kwasów tłuszczowych.
W poniższym rozdziale przedstawione zostanie
K. Jurowski, K. Kochan, A. Jurowska, G. Zając, K. Roztocki, Interpretacja
widm spektroskopowych i spektrometrycznych okiem młodych naukowców,
Scientiae et Didactics, 2015, ISBN 978-83-941637-2-3
55
podejście do interpretacji widm ramanowskich na
przykładzie odpowiednio dobranych związków
chemicznych z grupy lipidów, białek i węglowodanów,
a także na przykładzie widm pochodzących z bardziej
skomplikowanych układów biologicznych. Przy analizie
widm ramanowskich wyodrębnić można zazwyczaj dwa
interesujące zakresy: tzw. fingerprint (0 – 1800 cm-1) oraz
wysoki zakres (2800 – 3200 cm-1). Ze względu na brak
pasm w obszarze pomiędzy tymi dwoma zakresami (1800
– 2800 cm-1) region ten zazwyczaj nie jest przedstawiany
na widmach materiałów biologicznych.
2.2. Interpretacja widm ramanowskich - lipidy
Lipidy stanowią grupę związków doskonale nadających
się do badania techniką spektroskopii ramanowskiej, ze
względu na duży przekrój czynny molekuł na
rozpraszanie. Sygnały lipidowe charakteryzują się
zazwyczaj dobrą intensywnością. W przypadku mieszanin
lipidów, oprócz identyfikacji ich obecności w próbce,
możliwe jest również oznaczenie np. stopnia nienasycenia
komponentów lipidowych, czy rozgałęzienia łańcucha
lipidowego. Na rysunku 2.1 przedstawiono widmo
ramanowskie kwasu palmitynowego wraz z przypisanymi
najważniejszymi pasmami. W obszarze odcisku palca
wyraźnie widoczne jest kilka pasm. W zakresie pomiędzy
1000 a ok. 1200 cm-1 obserwujemy pasma związane
z drganiami rozciągającymi szkieletu C – C. Następnie,
K. Jurowski, K. Kochan, A. Jurowska, G. Zając, K. Roztocki, Interpretacja
widm spektroskopowych i spektrometrycznych okiem młodych naukowców,
Scientiae et Didactics, 2015, ISBN 978-83-941637-2-3
56
widoczne są pasma związane z drganiami skręcającymi
grupy CH2 (δ(CH2), z ang. twisting) oraz drganiami
deformacyjnymi grup CH3 i CH2 (δ(CH3) i δ(CH2)).
W wysokim zakresie z kolei widoczne są pasma
związane z drganiami rozciągającymi wiązań C – H,
odpowiednio dla grup CH2 oraz CH3, przy czym pasma,
odpowiadające drganiom rozciągającym asymetrycznym,
pojawiają się przy niższej wartości liczby falowej niż
pasma odpowiadające drganiom rozciągającym
symetrycznym. W tabeli 2.1 zestawiono obserwowane
pasma dla widma ramanowskiego kwasu palmitynowego
wraz z ich odpowiednim przypisaniem.
Tabela 2.1. Zestawienie położenia pasm wraz z ich przypisaniem dla
widma kwasu palmitynowego (rys.2.1).
Położenie pasma [cm-1] Przypisanie
1068 ν (C – C)
1134 ν (C – C)
1300 τ (CH2)
1427 β (CH2)
1442 α (CH2 /CH3)
1467 β (CH2 /CH3)
2848 νs (=CH2)
2882 νas (=CH2)
2925 νs (=CH3)
2967 νas (=CH3)
K. Jurowski, K. Kochan, A. Jurowska, G. Zając, K. Roztocki, Interpretacja widm spektroskopowych i
spektrometrycznych okiem młodych naukowców, Scientiae et Didactics, 2015, ISBN 978-83-941637-2-3
57
Rys. 2.1. Widmo ramanowskie kwasu palmitynowego wraz z przypisaniem najważniejszych pasm.
K. Jurowski, K. Kochan, A. Jurowska, G. Zając, K. Roztocki, Interpretacja
widm spektroskopowych i spektrometrycznych okiem młodych naukowców,
Scientiae et Didactics, 2015, ISBN 978-83-941637-2-3
58
Kwas palmitynowy stanowi przykład lipidu nasyconego.
W przypadku obecności wiązań wielokrotnych na widmie
ramanowskim pojawiają się dodatkowe pasma, związane
z ich drganiami. Przykład takiego widma przedstawiono na
rysunku 2.2. Przykładem wymienionych pasm,
pochodzących od drgań wiązań wielokrotnych, mogą być
m.in. pasma położone przy 1266, 1657 i 3012 cm-1. Ich
obecność pozwala na jednoznaczną identyfikację
nienasyconych lipidów. W tabeli 2.2 zestawiono
obserwowane pasma dla widma ramanowskiego kwasu
oleinowego wraz z ich odpowiednim przypisaniem.
Tabela 2.2. Zestawienie położenia pasm wraz z ich przypisaniem dla
widma kwasu oleinowego (rys.2.2). Pasma pochodzące od wiązań
wielokrotnych zaznaczono kolorem czerwonym.
Położenie pasma [cm-1] Przypisanie
1084 ν (C – C)
1266 δ(CH2)
1305 τ (CH2)
1444 α (CH2 /CH3)
1657 ν(C=C)
2852 νs (=CH2)
2892 νas (=CH2)
3012 ν(=CH)
K. Jurowski, K. Kochan, A. Jurowska, G. Zając, K. Roztocki, Interpretacja widm spektroskopowych i
spektrometrycznych okiem młodych naukowców, Scientiae et Didactics, 2015, ISBN 978-83-941637-2-3
59
Rys. 2.2. Widmo ramanowskie kwasu oleinowego wraz z przypisaniem najważniejszych pasm.
K. Jurowski, K. Kochan, A. Jurowska, G. Zając, K. Roztocki, Interpretacja
widm spektroskopowych i spektrometrycznych okiem młodych naukowców,
Scientiae et Didactics, 2015, ISBN 978-83-941637-2-3
60
Fakt występowania pasm pochodzących wyłącznie od
drgań wiązań wielokrotnych pozwala nie tylko
zidentyfikować obecność takich związków w badanej
próbce, ale również zbadać ich stopień nienasycenia.
Stopień nienasycenia rozumiany może być jako stosunek
ilości wiązań wielokrotnych do ilości wiązań pojedynczych.
Intensywność każdego pasma, odpowiadającego danemu
drganiu danego wiązania, rozpatrywanego jako oscylator,
uzależniona jest od ilości tych wiązań. A zatem
intensywność pasm związanych z wiązaniami
wielokrotnymi będzie proporcjonalna do ich ilości.
Analogiczna sytuacja ma miejsce dla wiązań
pojedynczych. Zatem stosunek intensywności pasm
odpowiadający wiązaniom wielokrotnym do intensywności
pasm odpowiadających wiązaniom pojedynczym będzie
ściśle powiązany ze stopniem nienasycenia.
W spektroskopii ramanowskiej najczęściej wykorzystuje
się tzw. intensywność integralną pasma, tj. wartość całki
odpowiadającej polu powierzchni pod pasmem.
W spektroskopii ramanowskiej możemy wyodrębnić trzy
kryteria wyznaczania stopnia nienasycenia, przy czym pod
pojęciem kryterium rozumiany jest zestaw pasm
wykorzystywanych do oceny stopnia nienasycenia.
Pierwszym z nich są pasma położone przy ok. 1266
i 1305 cm-1, pochodzące odpowiednio od wiązań
nienasyconych i nasyconych. Kryterium to jest stosowane
powszechnie. Znaczącą trudnością z nim związaną jest
jednak słabe rozdzielenie wymienionych pasm. Powoduje
to konieczność arbitralnego i często niejednoznacznego
K. Jurowski, K. Kochan, A. Jurowska, G. Zając, K. Roztocki, Interpretacja
widm spektroskopowych i spektrometrycznych okiem młodych naukowców,
Scientiae et Didactics, 2015, ISBN 978-83-941637-2-3
61
określenia granic całkowania.
Drugim, najpowszechniej wykorzystywanym kryterium,
jest stosunek intensywności pasm położonych przy 1657
i 1444 cm-1. W tym przypadku pasma są zdecydowanie
rozdzielone, a ich granice wyraźnie określone.
W przypadku skomplikowanych mieszanin, zawierających
również składniki białkowe, należy jednak mieć na uwadze
fakt, iż pasmo położone przy 1657 cm-1 może częściowo
pokrywać się z pasmem amidowym I.
Trzecim możliwym do wykorzystania kryterium jest
stosunek pasm położonych przy 3012 i 2852 cm-1.
Kryterium to jest jednak wykorzystywane stosunkowo
rzadko ze względu na jego słabą czułość. Pasmo
położone przy 3012 cm-1 (pochodzące od lipidów
nienasyconych) jest znacząco mniejsze od pasma
położonego przy 2852 cm-1. Tym samym, aby stosunek
intensywności wymienionych pasm uległ niewielkiej
zmianie konieczna jest istotna zmiana zawartości lipidów
nienasyconych.
Na rysunku 2.3 przedstawiono zestaw widm kwasów
tłuszczowych o wzrastającym stopniu nienasycenia. …………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
K. Jurowski, K. Kochan, A. Jurowska, G. Zając, K. Roztocki, Interpretacja
widm spektroskopowych i spektrometrycznych okiem młodych naukowców,
Scientiae et Didactics, 2015, ISBN 978-83-941637-2-3
62
Rys. 2.3. Zestaw widm ramanowskich kwasów tłuszczowych
o różnym stopniu nienasycenia.
***
Innym interesującym przykładem zastosowania
spektroskopii ramanowskiej do analizy lipidów jest ocena
obecności izomerów geometrycznych trans w badanej
próbce. Wykorzystywane jest do tego pasmo pochodzące
od drgań rozciągających wiązanie C=C. W przypadku
obecności izomeru cis pasmo to położone jest przy około
1656 cm-1, natomiast w przypadku konformeru trans ulega
K. Jurowski, K. Kochan, A. Jurowska, G. Zając, K. Roztocki, Interpretacja
widm spektroskopowych i spektrometrycznych okiem młodych naukowców,
Scientiae et Didactics, 2015, ISBN 978-83-941637-2-3
63
przesunięciu do około 1675 cm-1. Na rysunku 2.4
przedstawiono tą zależność na przykładzie kwasu
oleinowego oraz jego izomeru geometrycznego – kwasu
elaidynowego.
Rys. 2.4. Widma ramanowskie kwasu oleinowego (wiązanie
podwójne w konformacji cis) oraz jego izomeru geometrycznego –
kwasu elaidynowego (wiązanie podwójne w konformacji trans)
z zaznaczonym charakterystycznym położeniem pasma od drgania
rozciągającego C=C dla obu konformerów.
***
Kolejnym interesującym zagadnieniem, możliwym do
obserwacji i oceny za pomocą spektroskopii ramanowskiej
K. Jurowski, K. Kochan, A. Jurowska, G. Zając, K. Roztocki, Interpretacja
widm spektroskopowych i spektrometrycznych okiem młodych naukowców,
Scientiae et Didactics, 2015, ISBN 978-83-941637-2-3
64
jest długość (oraz rozgałęzienie) łańcuchów lipidowych.
Jak można było zaobserwować na zaprezentowanych
dotychczasowo widmach oraz w tabelach, ugrupowania
CH2 i CH3 są źródłem różnych pasm (choć często
położonych blisko siebie). Zarówno długość, jak
i rozgałęzienie łańcucha kwasów tłuszczowych (i innych
lipidów) przekładają się bezpośrednio na ilość ugrupowań
CH2 i CH3 w molekule. Poprzez ocenę stosunku
intensywności odpowiadających im pasm możliwe jest –
podobnie jak w przypadku stopnia nienasycenia –
określenie długości/rozgałęzienia łańcucha lipidowego.
Na rysunku 2.5 przedstawiono przykład dwóch
nasyconych kwasów tłuszczowych o różnej długości
łańcucha.
Rys. 2.5. Widma ramanowskie kwasu palmitynowego i stearynowego.
K. Jurowski, K. Kochan, A. Jurowska, G. Zając, K. Roztocki, Interpretacja
widm spektroskopowych i spektrometrycznych okiem młodych naukowców,
Scientiae et Didactics, 2015, ISBN 978-83-941637-2-3
65
Na rysunku 2.5 zaznaczono dwa obszary, w których
występują wyraźne różnice. Pierwszym z nich jest zakres
pomiędzy 1400 a 1500 cm-1. W przypadku obu kwasów
występują trzy pasma . W przypadku kwasu stearynowego
(wyższy stosunek ilości grup CH2 do grup CH3) pasmo od
drgań β grupy CH2 ulega jednak przesunięciu w kierunku
niższej wartości liczby falowej. Zmianie ulegają również
stosunki intensywności poszczególnych pasm (rysunek
2.6). .
Rys. 2.6. Widma ramanowskie kwasu palmitynowego i stearynowego
w zakresach głównych różnic: 1400 – 1500 cm-1
(po lewej) oraz 2800
– 3050 cm-1
(po prawej).
K. Jurowski, K. Kochan, A. Jurowska, G. Zając, K. Roztocki, Interpretacja
widm spektroskopowych i spektrometrycznych okiem młodych naukowców,
Scientiae et Didactics, 2015, ISBN 978-83-941637-2-3
66
Różnicę długości łańcucha (rozumianą jako różnicę
stosunku ilości grup CH2 do ilości grup CH3) można
wyraźniej zaobserwować w wysokim zakresie (2800 –
3050 cm-1), gdzie pasma od drgań ugrupowań CH2 i CH3
są lepiej rozdzielone. W przypadku obu kwasów
najintensywniejszym jest pasmo odpowiadające drganiu
rozciągającemu asymetrycznemu grupy CH2 (νas (=CH2),
ok. 2882 cm-1). Wyraźnie widoczne (choć mniej
intensywne) jest również pasmo pochodzące od drgań
rozciągających symetrycznych tej grupy (νs (=CH2), ok.
2848 cm-1). Różnicę w długości łańcucha możemy jednak
zaobserwować na podstawie pasm odpowiadających
drganiom ugrupowań CH3. Chociaż liczba tych grup w obu
cząsteczkach jest taka sama, to jednak stosunek ilości
grup CH3 do grup CH2 jest wyższy w kwasie
palmitynowym. W widmie kwasu palmitynowego wyraźnie
widoczne są zarówno drgania asymetryczne jak
i symetryczne grup CH3, podczas gdy w widmie kwasu
stearynowego intensywność pasma pochodzącego od
drgania symetrycznego CH3 jest już zbyt mała.
***
Do grupy lipidów, oprócz kwasu tłuszczowych,
zaliczamy szereg innych związków chemicznych, m.in.
trójglicerydy, cholesterol i jego estry oraz fosfolipidy.
Różnice w budowie chemicznej z oczywistych względów
znajdują swoje odzwierciedlenie w widmach
ramanowskich.
K. Jurowski, K. Kochan, A. Jurowska, G. Zając, K. Roztocki, Interpretacja
widm spektroskopowych i spektrometrycznych okiem młodych naukowców,
Scientiae et Didactics, 2015, ISBN 978-83-941637-2-3
67
Trójglicerydy są to estry glicerolu oraz trzech kwasów
tłuszczowych. Z tego względu w ich widmie pojawiać się
będą nie tylko pasma od kwasów tłuszczowych
(nasyconych i/lub nienasyconych – w zależności od
trójglicerydu), ale również pasma m.in. od wiązania
estrowego. Na rysunku 2.7 przedstawiono widma
trójglicerydu nasyconego (tripalmitynian glicerolu) oraz
kwasu tłuszczowego, budującego dany trójgliceryd (kwas
palmitynowy) wraz z przypisaniem charakterystycznych
pasm.
Jak widać, widmo trójglicerydu różni się nieco od widma
budującego go kwasu tłuszczowego. Podstawową różnicą
jest obecność pasma pochodzącego od drgania
rozciągającego wiązanie estrowe (ν(C=O)), polożonego
przy ok. 1745 cm-1 (zaznaczonego na rysunku 2.7 kolorem
czerwonym). Pasmo to będzie obecne w widmach
ramanowskich wszystkich trójglicerydów, a także estrów.
Poza obecnością wymienionego pasma, na widmie
trójglicerydu zauważyć można szereg innych różnic.
Wysoki zakres charakteryzuje się wiekszą intesywnością
w stosunku do zakresu odcisku palca (600 – 1800 cm-1) w
porówananiu do widma kwasu tłuszczowego. Wynika to z
faktu, iż w wysokim zakresie obecne są pasma związane
z drganiami ugrupowań CH2 i CH3. Cząsteczka
trójglicerydu posiada w swojej strukturze aż trzy
cząsteczki kwasu tłuszczowego (stąd około trzykrotnie
większą liczbę ugrupowań CH2). Pasma powiązane
z ugrupowaniami CH2 (≈2850 cm-1 oraz 2885 cm-1) będą
K. Jurowski, K. Kochan, A. Jurowska, G. Zając, K. Roztocki, Interpretacja
widm spektroskopowych i spektrometrycznych okiem młodych naukowców,
Scientiae et Didactics, 2015, ISBN 978-83-941637-2-3
68
zatem znacznie bardziej intensywne w widmie
trójglicerydu.
Rys. 2.7. Widma ramanowskie kwasu palmitynowego (niebieskie)
oraz tripalmitynianu glicerolu (czarne) wraz z położeniem pasm.
K. Jurowski, K. Kochan, A. Jurowska, G. Zając, K. Roztocki, Interpretacja
widm spektroskopowych i spektrometrycznych okiem młodych naukowców,
Scientiae et Didactics, 2015, ISBN 978-83-941637-2-3
69
Z drugiej strony jednak czasteczka trójglicerydu
posiada nieznacznie większą ilość ugrupowań CH3 niż
cząsteczka kwasu tłuszczowego. Wyraźna zmiana
stosunku ilości ugrupowań CH2 do ilości ugrupowań CH3
w przypadku trójglicerydu w porównaniu do kwasu
tłuszczowego powoduje, że dla trójglicerydu pasma
pochodzace od drgań ugrupowań CH3 są niewidoczne.
Pomimo opisanych różnic pomiędzy widmami kwasu
tłuszczowego oraz odpowiadającego mu trójglicerydu daje
się pomiędzy nimi zauważyć również pewne
podobieństwo. Obecność tych samymch pasm lipidowych
(z wyjątkiem pasma pochodzącego od drgania
rozciągającego C=O), ich zbliżone położenie oraz profil
spektralny widma pozwalają wnioskować, że w obrębie
obu tych związków występują podobne ugrupowania.
Opisane różnice miedzy widmem kwasu tłuszczowego
i pochodzącego od niego trójglicerydu są zdecydowanie
mniejsze niż różnice pomiędzy widmami ramanowskimi
dwóch trójglicerydów o różnym stopniu nienasycenia.
Widma takie przedstawiono na rysunku 2.8.
Podobnie jak w przypadku kwasów tłuszczowych,
również dla trójglicerydów możliwe jest określenie stopnia
nienasycenia. Jak widać na rysunku 2.8, obecność wiązań
wielokrotnych w łańcuchu kwasu tłuszczowego
trójglicerydu jest źródłem pasm pochodzących od drgań
rozciągających oraz deformacyjnych tego wiązania. Są to
pasma położone (analogicznie jak w widmie ramanowskim
kwasu tłuszczowego) przy ok. 1270, 1659 oraz 3008 cm-1
K. Jurowski, K. Kochan, A. Jurowska, G. Zając, K. Roztocki, Interpretacja
widm spektroskopowych i spektrometrycznych okiem młodych naukowców,
Scientiae et Didactics, 2015, ISBN 978-83-941637-2-3
70
(zaznaczone na rysunku 2.8 kolorem niebieskim). W tabeli
2.3 zestawionio pasma obserowane na widmach
ramanowskich tripalmitynianu oraz trioleinianu glicerolu
wraz z ich przypisaniem.
Tabela 2.3. Zestawienie położenia pasm wraz z ich przypisaniem dla
widma trójglicerydów przedstawionych na rysunku 2.8.
Położenie pasma [cm-1] Przypisanie
875 ν (C – C)
1066 ν (C – C)
1084 ν (C – C)
1270 δ(CH2)
1302(6) τ (CH2)
1445 (7) α (CH2 /CH3)
1470 β (CH2 /CH3)
1659 ν(C=C)
1745(9) ν(C=O)
2850(3) νs (=CH2)
2884 νas (=CH2)
2905 νas (=CH2)
2932 νs (=CH3)
3008 ν(=CH)
K. Jurowski, K. Kochan, A. Jurowska, G. Zając, K. Roztocki, Interpretacja
widm spektroskopowych i spektrometrycznych okiem młodych naukowców,
Scientiae et Didactics, 2015, ISBN 978-83-941637-2-3
71
Rys. 2.8. Widma dwóch trójglicerydów o różnym stopniu
nienasycenia: tripalmitynianu oraz trioleinianu glicerolu wraz
z położeniem pasm.
K. Jurowski, K. Kochan, A. Jurowska, G. Zając, K. Roztocki, Interpretacja
widm spektroskopowych i spektrometrycznych okiem młodych naukowców,
Scientiae et Didactics, 2015, ISBN 978-83-941637-2-3
72
***
Kolejną interesującą grupą lipidów są cholesterole (tj.
cholesterol oraz jego estry). Związki te mają w swojej
strukturze pierścień, którego drgania są źródłem szeregu
specyficznych pasm. Na rysunku 2.9 przedstawiono
ramanowskie widmo cholesterolu oraz jego dwóch estrów
– palmitynianu oraz oleinianu.
Widmo ramanowskie cholesterolu jest bogate w pasma.
Niektóre z nich – jak np. pasmo położone przy 1442 cm-1
– nie są specyficzne wyłącznie dla cholesterolu, a raczej
dla całej grupy lipidów. Widoczne jest również pasmo
pochodzące od drgań wiązań podwójnych w pierścieniu
(około 1672 cm-1). Nie oznacza to jednak, że są to
wiązania w konformacji trans. Energia drgań wiązań
wielokrotnych w pierścieniu będzie jednak nieco inna niż
w przypadku wolnych kwasów tłuszczowych. Profil
spektralny widma – szczególnie w wysokim zakresie – jest
dla cholesterolu na tyle charakterystyczny, że pozwala go
jednoznacznie odróżnić od pozostałych lipidów.
Przykładem pasma pochodzącego od pierścienia
cholesterolu jest pasmo położone przy około 700 cm-1,
związane z drganiami deformacyjnymi pierścienia
cholesterolu.
Estry cholesterolu zbudowane są z pierścienia
cholesterolu oraz odpowiedniej reszty kwasu
tłuszczowego przyłączonej za pomocą wiązania
estrowego. Z tego względu w ich widmie ramanowskim –
K. Jurowski, K. Kochan, A. Jurowska, G. Zając, K. Roztocki, Interpretacja
widm spektroskopowych i spektrometrycznych okiem młodych naukowców,
Scientiae et Didactics, 2015, ISBN 978-83-941637-2-3
73
podobnie jak w przypadku każdego estru – obserwować
będziemy pasmo położone przy około 1740 cm-1 (drganie
rozciągające wiązanie C=O). Widoczne będą również
pasma markerowe dla reszty kwasu tłuszczowego.
A zatem, np. w przypadku gdy jest to kwas tłuszczowy
nienasycony, obserwować będziemy pasma pochodzące
od drgań wiązań wielokrotnych w łańcuchu (tj. m.in.
pasma przy około 1659 i 3009 cm-1). Ponieważ w obrębie
takiej molekuły występuje w dalszym ciągu pierścień
cholesterolowy na widmie występować będą również
pasma charakterystyczne dla niego – tj. przy ok. 700 cm-1
(drgania deformacyjne pierścienia) oraz 1668 cm-1
(drgania wiązań podwójnych w pierścieniu). Warto zwrócić
tutaj uwagę na przykład oleinianu cholesterolu, dla którego
w zakresie 1620 – 1700 cm-1 pojawiają się
w rzeczywistości dwa pasma (niezbyt wyraźnie
rozdzielone) – jedno, od drgania wiązania podwójnego
w łańcuchu kwasu tłuszczowego (ok. 1659 cm-1) oraz
drugie od drgań wiązań podwójnych pierścienia (ok.
1668 cm-1). …………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
K. Jurowski, K. Kochan, A. Jurowska, G. Zając, K. Roztocki, Interpretacja
widm spektroskopowych i spektrometrycznych okiem młodych naukowców,
Scientiae et Didactics, 2015, ISBN 978-83-941637-2-3
74
Rys. 2.9. Widma ramanowskie cholesterolu oraz jego dwóch estrów
– nasyconego (palmitynian) i nienasyconego (oleinian).
K. Jurowski, K. Kochan, A. Jurowska, G. Zając, K. Roztocki, Interpretacja
widm spektroskopowych i spektrometrycznych okiem młodych naukowców,
Scientiae et Didactics, 2015, ISBN 978-83-941637-2-3
75
Podsumowanie:
Obecność lipidów w próbce na podstawie widma
ramanowskiego można zidentyfikować z łatwością m.in.
na podstawie pasm położonych przy 1300 i 1444 cm-1.
Obecność wiązania wielokrotnego w lipidach
potwierdzają pasma pochodzące od ich drgań położone
przy ~1266, 1656 oraz 3010 cm-1.
Stopień nienasycenia można wyznaczyć z widma
ramanowskiego korzystając ze stosunków intensywności
(integralnej) pasm pochodzących od wiązań wielokrotnych
i pojedynczych, korzystając z następujących kryteriów:
I1266/I1305
I1656/I1444
I3010/I2885
Obecność estrów (kwasów tłuszczowych, cholesterolu,
itd.) można potwierdzić na podstawie występowania
pasma od drgania rozciągającego wiązanie estrowe,
położonego przy ok. 1740 cm-1.
Obecność cholesterolu można potwierdzić na
podstawie jego profilu spektralnego (wysoki zakres, tj.
2800 – 3050 cm-1) oraz obecności pasm pochodzących od
drgań pierścienia cholesterolu (np. ok. 701 cm-1).
O obecności estrów cholesterolu świadczy natomiast
współwystępowanie pasma pochodzące od estrów (~1740
cm-1) oraz pasm pochodzących od pierścienia
cholesterolu (np. ~701 cm-1).
K. Jurowski, K. Kochan, A. Jurowska, G. Zając, K. Roztocki, Interpretacja
widm spektroskopowych i spektrometrycznych okiem młodych naukowców,
Scientiae et Didactics, 2015, ISBN 978-83-941637-2-3
76
2.3. Interpretacja widm ramanowskich - białka
Kolejną grupą związków, których analizę można
przeprowadzić metodą spektroskopii ramanowskiej są
białka. W przypadku białek najbardziej charakterystyczne
pasma związane są z grupą CONH. W tabeli 2.4
zestawiono położenia pasm amidowych oraz ich
pochodzenie.
Dla identyfikacji konformacji białek szczególne
znaczenie ma położenie pasm amidowych I, II oraz III.
Położenia tych pasm zmieniają się znacznie, w zależności
od tego, czy dane białko występuje w formie α lub β.
Typowo, dla struktury α pasmo amidowe I położone jest
w zakresie pomiędzy 1655 a 1662 cm-1. Dla struktury β
natomiast pasmo amidowe I przesunięte jest w kierunku
wyższych wartości liczb falowych, tj. 1672 – 1674 cm-1.
Odwrotną zależność możemy zaobserwować dla pasma
amidowego III, występującego zazwyczaj w przedziale
1264 – 1274 cm-1 dla struktury α oraz w przedziale 1227 –
1242 cm-1 dla białek w konformacji β-kartki.
Z powyższych informacji wynika jasno, iż spektroskopia
ramanowska pozwala na identyfikację struktury
II-rzędowej białek. W niniejszym rozdziale przedstawione
zostaną przykłady widm białek o budowie wyłącznie
α-helisy, β-kartki oraz złożonych, zaliczanych do grup α/β
i α + β (posiadających fragmenty formujące zarówno
strukturę wyłącznie α-helisy jak i β-kartki, ulokowane
w sposób uporządkowany lub nieuporządkowany).
K. Jurowski, K. Kochan, A. Jurowska, G. Zając, K. Roztocki, Interpretacja
widm spektroskopowych i spektrometrycznych okiem młodych naukowców,
Scientiae et Didactics, 2015, ISBN 978-83-941637-2-3
77
Tabela 2.4. Zestawienie zakresów występowania charakterystycznych
pasm amidowych oraz ich pochodzenia.
Pasmo Położenie
pasma (zakres) [cm-1]
Pochodzenie
Amidowe A ~ 3500 Drganie rozciągające N-H
Amidowe B ~ 3100 Drganie rozciągające N-H
Amidowe I 1600 – 1690 Drganie rozciągające C=O
Amidowe II 1480 – 1580 Drganie rozciągające C-N oraz drganie zginające N-H*
Amidowe III 1230 – 1300
Amidowe IV 625 – 770 Drganie zginające O-C-N
Amidowe V 640 – 800 Drganie zginające** N-H
Amidowe VI 540 – 600 Drganie zginające** C=O
Amidowe VII ~ 200 Drgania szkieletowe
* drgania sprzężone
** poza płaszczyznę (z ang. out – of – plane)
Na rysunku 2.10 przedstawiono widmo albuminy –
białka należącego do grupy α. Jest to klasyczny przykład
białek o konformacji α (zerowa zawartość struktury β).
K. Jurowski, K. Kochan, A. Jurowska, G. Zając, K. Roztocki, Interpretacja widm spektroskopowych i
spektrometrycznych okiem młodych naukowców, Scientiae et Didactics, 2015, ISBN 978-83-941637-2-3
78
Rys. 2.10. Widma ramanowskie albuminy (reprezentującej białka grupy α) z zaznaczonymi położeniami
pasm oraz pochodzeniem (dla wybranych).
K. Jurowski, K. Kochan, A. Jurowska, G. Zając, K. Roztocki, Interpretacja
widm spektroskopowych i spektrometrycznych okiem młodych naukowców,
Scientiae et Didactics, 2015, ISBN 978-83-941637-2-3
79
Jak widać na widmie ramanowskim, zarówno położenie
pasma amidowego I (1657 cm-1), jak i pasma amidowego
III (1273 cm-1) potwierdzają strukturę albuminy jako
α- helisę. W przypadku analizy widm ramanowskich białek
należy również liczyć się z obecnością pasm
pochodzących od aminokwasów budujących owe białka.
Przykładem tego mogą być pasma położone przy
1009 cm-1 oraz przy 1321 i 1341 cm-1, pochodzące
odpowiednio od fenyloalaniny i tryptofanu. W tabeli 2.5
zestawiono przypisanie pasm widocznych na widmie
albuminy.
Tabela 2.5. Zestawienie położeń pasm wraz z ich przypisaniem dla
widma albuminy (α-helisa) przedstawionego na rysunku 2.10.
Położenie pasma [cm-1]
Przypisanie
1009 Fenyloalanina
1273 Amidowe III (ν(C-N) + δ(N-H))
1321 Tryptofan (δ(Ca – H)
1341 Tryptofan (δ(Ca – H)
1454 δ(C-H)
1657 Amidowe I (ν(C=O)
3060 ν(N-H)
Na rysunku 2.11 przedstawiono przykład białka –
elastyny – o strukturze β-kartki.
K. Jurowski, K. Kochan, A. Jurowska, G. Zając, K. Roztocki, Interpretacja widm spektroskopowych i
spektrometrycznych okiem młodych naukowców,