Kemiska metodprinciper inom allmänkemi samt vanliga felkällor

Sten-Erik Bäck

Klinisk kemi

Labmedicin Skåne

Analyser inom allmänkemi

•Beställs ofta

•Har kort analystid

•Analyseras utan föregående upparbetning (utfällning, extraktion etc.)

•Baseras på spektrofotometri eller jonselektiv mätning

•Analyseras på samma plattform

•Använder färdigköpta reagens

•Utförs i plasma/serum

Metodprinciper inom allmänkemi P-ALAT Enzym P-Koldioxid Enzymreagens P-ALP Enzym P-Kolesterol ER + Komplexbindning P-Ammonium Enzymreagens P-Kreatinin (enz) Enzymreagens P-Apolipoprotein A1 Immunturbidimetri P-Kreatinkinas (CK) Enzym P-Apolipoprotein B Immunturbidimetri P-LDL-kolesterol Enzymreagens P-ASAT Enzym S-LD Enzym P-Bilirubin, konj Komplexbindning P-Lipoprotein (a) Immunturbidimetri P-Bilirubin Komplexbindning S-Litium Komplexbindning P-Calcium Komplexbindning P-Magnesium Komplexbindning P-Digoxin Immunoassay Dv-Natrium Jonselektiv mätning P-Fosfat Komplexbindning P-Natrium Jonselektiv mätning S-Gallsyror Enzymreagens P-Pankreasamylas Enzym P-Glukos Enzymreagens P-Paracetamol Immunoassay (EMIT) P-GT Enzym P-Salicylat Enzymreagens P-HDL-kolesterol Enzymreagens P-TIBC Immunturbidimetri P-Järn Komplexbindning P-Triglycerider Enzymreagens Dv-Kalium Jonselektiv mätning P-Urat Enzymreagens P-Kalium Jonselektiv mätning U-Urat Enzymreagens Dv-Klorid Jonselektiv mätning P-Urea Enzymreagens P-Klorid Jonselektiv mätning P-Homocystein Enzymreagens

Metodprinciper inom allmänkemi P-ALAT Enzym P-Kolesterol Enzymregens

P-ALP Enzym P-Digoxin Immunoassay P-ASAT Enzym P-Paracetamol Immunoassay (EMIT) P-GT Enzym P-Apolipoprotein A1 Immunturbidimetri

P-Kreatinkinas (CK) Enzym P-Apolipoprotein B Immunturbidimetri S-LD Enzym P-TIBC Immunturbidimetri

P-Pankreasamylas Enzym Lp(a) Immunturbidimetri P-Ammonium Enzymreagens Dv-Kalium Jonselektiv mätning

S-Gallsyror Enzymreagens P-Kalium Jonselektiv mätning P-Glukos Enzymreagens Dv-Klorid Jonselektiv mätning P-HDL-kolesterol Enzymreagens P-Klorid Jonselektiv mätning

P-Koldioxid Enzymreagens Dv-Natrium Jonselektiv mätning P-Kreatinin (enz) Enzymreagens P-Natrium Jonselektiv mätning

P-LDL-kolesterol Enzymreagens P-Bilirubin, konj Komplexbindning P-Salicylat Enzymreagens P-Bilirubin Komplexbindning

P-Triglycerider Enzymreagens P-Calcium Komplexbindning P-Urat Enzymreagens P-Fosfat Komplexbindning U-Urat Enzymreagens P-Järn Komplexbindning

P-Urea Enzymreagens S-Litium Komplexbindning P-Homocystein Enzymreagens P-Magnesium Komplexbindning

Enzymbestämningsmetoder

• Enzymer används som markörsubstanser

• Goda analysegenskaper

– Känsliga

– Lätta att mäta

– Billiga

Princip: do your thing!

• Substrat ↔ Produkt

• Substrat i överskott

• Lämpliga reaktionsbetingelser i övrigt (pH, temperatur, coenzymer etc.)

• Ett signalsystem

=> Reaktionshastigheten = k x Ea (µkat/L)

Ofta utnyttjat signalsystem

NADP+ + H+ + 2e- NADPH

Enzymbestämningsmetoder

• Mäter omvandlingen substrat – produkt

• Betingelserna (pH, temperatur, cofaktorer etc.) avgör hastigheten

• Optimerade betingelser för mätning har definierats av IFCC

• Spårbarhet?

Enzymbestämningsmetoder - mer eller mindre komplexa

Nitrofenylfosfat+ H2O Nitrofenol (gul) + fosfat (ALP)

L-Laktat + NAD+ Pyruvat + NADH + H+ (LD)

L-Alanin + 2-oxoglutarat pyruvat + L-glutamat (ALAT) Pyruvat + NADH + H+ L-Laktat + NAD+ (LD)

L-Aspartat + 2-oxoglutarat oxalacetat + L-glutamat (ASAT) Oxalacetat + NADH + H+ L-Malat + NAD+ (MDH)

Kreatinfosfat + ADP kreatin + ATP (CK) ATP + D-glukos ADP + G6P (HK) G6P + NADP+

D-6-fosfoglukonat + NADPH + H+ (G6PDH)

Enzymer som reagens

• Metoderna mäter substratkoncentration

• Hög specificitet för ett visst substrat eller en substratfamilj – ex ureas, urikas,

glukosoxidas

– eliminerar behovet av upparbetning

– minskar interferensrisken

Kreatinin

Urat

Ammoniak

Urea

Glukos

Laktat

Triglycerider

etc.

Kopplad reaktion för ökad specificitet

Glukos + ATP ADP + glukos-6-fosfat (HK, ospec)

Glukos-6-fosfat + NADP+ 6-fosfoglukonat +

NADPH + H+ (G6PDH, spec för glukos)

Jfr CK-metoden

Kreatinfosfat + ADP kreatin + ATP (CK)

ATP + glukos ADP + G6P (HK)

G6P + NADP+ 6-fosfoglukonat + NADPH + H+

(G6PDH) (Kreatinfosfat, ADP, glukos, NADP, HK, G6DPH i överskott)

Exempel: kreatinin

• Tidigare metod (Jaffe) komplexbindning med pikrat

– känslig för interferenser (glukos, protein, bilirubin, ketonkropper etc. etc.)

– många metodvarianter för att öka specificiteten

Trinderreaktionen

Färgreaktion

• H202 + 4-aminofenazon + fenol -> kinoniminfärgämne

Används i metoder för t ex

• Kreatinin

• Laktat

• Glukos

• Triglycerider

• Kolesterol

• HDL

• LDL

• Urat

Kreatinin + H2O Kreatin (kreatininas) Kreatin + H2O Sarkosin + Urea (kreatinas) Sarkosin + O2 + H2O Glycin + HCHO + H2O2 (sarkosinoxidas)

Urat + 2 H2O + O2 Allantoin + CO2 + H2O2 (urikas)

Kolesterolester + H2O Kolesterol + RCOOH (kolesterolesteras) Kolesterol + O2 Kolest-4-en-3-on + H2O2 (kolesteroloxidas)

Metoder som utnyttjar Trinderreaktionen

Komplexbindningsmetoder

• Användning av speciella bindarmolekyler som bildar färgade komplex med hög affinitet för analyten – Pikrinsyra (Kreatinin)

– Diazoreagens (Bilirubin)

– BAPTA (Ca)

– FerroZine (Fe)

– CPZ-III (Mg)

• Traditionell klinisk kemi

Jonselektiva elektroder (ISE)

• Används för mätning av elektrolytkoncentrationer (eller -aktiviteter!)

• Elektrokemisk mätteknik

• Vanliga Na, K, (Cl)

• Med eller utan spädning av provet

Interferens

• Analytisk

– Interfererar i reaktionen

– Hög bakgrund

– Kompetitiv interferens

• Biologisk interferens

– Hemolys (inte Hb)

Vanliga interferenser

Källa Hur

Hemolys biologisk interferens via eryrocytkomponenter, spektral interferens (Hb), direkt interferens (Hb)

Bilirubin hög bakgrund, direkt interferens, kompetitiv interferens

Lipider ljusspridning, volymseffekter

Interferenser

Hb-interferens i konjugerat bilirubin

Interferenstestning

• Interferogram enligt Glick*

• Rekommendationer finns i CLSI-dokumentet EP7-A2. Interference testing in clinical chemistry (CLSI 2005).

*Glick MR, Ryder KW, Jackson SA. Graphical comparisons of interferences in Clinical Chemistry Instrumentation. Clin Chem 32:470-5;1986

Lipidcentrifugering

• Centrifugering i >10 000 x g 10 minuter

ALAT Glukos

ALP GT

ASAT Järn

Bilirubin Kreatinin

Bilirubin, konjugerat LD

Ca Natrium, Kalium, Klorid

CK Pankreasamylas

CKMB Urat Fosfat Urea

Ultrafiltrering

• Eliminerar bilirubininterferens i kreatininprover

Elektrolyter i lipemiska prover – mäter vi rätt?

• Patient i Kristianstad med L-index 1093

– Obehandlat prov hade Na 114, K 4,0

– Efter lipidcentrifugering Na 125, K 4,4

• Från insert ISE:

Pseudohyponatremi

• Falskt lågt analysresultat beroende på hög halt av lipider eller protein

• Inträffar med metoder som mäter koncentrationen efter spädning av provet (t ex flamfotometri eller indirekt ISE (Cobas))

• Direkt ISE (ABL) mäter rätt

• Plasma innehåller normalt ca 93% vatten, i vilket elektrolyterna är lösta

• Resten utgörs av protein och lipider

• I extrema fall kan vattenandelen vara betydligt lägre

Vad händer när provet späds?

• Vid en spädning följer färre natriumjoner med i alikvoten till det nya röret ju högre lipidhalt i provet

Prov 1 före spädning

Prov 2 före spädning

Prov 1 efter spädning

Prov 2 efter spädning

Spädningssteg

Direkt/indirekt ISE

• Direkt ISE (t ex ABL) påverkas ej av höga lipid-/proteinnivåer – ABL mäter därför 7% högre elektrolyter i prover

med normal lipid- och proteinhalt, men… • mätresultatet kompenseras för denna skillnad

– Perfekt korrelation för elektrolyter kan emellertid aldrig erhållas mellan direkta och indirekta ISE-mätningar, eftersom… • kompensationen för 7% undanträngd volym bara är en

genomsnittssiffra!