Két dimenziós emberi nyálmirigy modell az Két dimenziós emberi nyálmirigy modell az elektrolit transzportfolyamatok vizsgálatáraelektrolit transzportfolyamatok vizsgálatára

HEGYESI Orsolya1, FÖLDES Anna1,BORI Erzsébet1, LŐRINCZ Ádám2, RÁSONYI-KOVÁCS Orsolya2 ,

BARABÁS József2, Martin C. STEWARD3, VARGA Gábor1

1 Orálbiológiai Tanszék, 2 Arc- állcsont- Szájsebészeti és Fogászati Klinika; Semmelweis Egyetem, Budapest; 3Faculty of Life Sciences, The University of Manchester, UK

HáttérHáttér

Sjögren szindróma

sugárterápia(fej-nyaki tumorok kezelésére)

acinus sejtek pusztulása

csökkent nyáltermelés

hiposzaliváció

Primer sejtkultúrák létrehozásának kidolgozott lehetőségei huSMG – primary human salivary cell culture (primer humán nyálmirigy sejtkultúra) Tran et al. Tissue Eng 2005 11:172

PTHSG – primary total human salivary gland (primer teljes humán nyálmirigy sejtkultúra) Szlavik et al. Tissue Eng 2008 14:1915-26

humán szubmandibuláris nyálmirigyből primer sejtkultúra létrehozása, PTHSG és huSMG tulajdonágainak összehasonlításaoptimális kondíciók meghatározása polarizált epitheliális monolayer létrehozásáhoztranszepitheliális ionáramok vizsgálataaz elektrolit transzportban résztvevő transzporterek meghatározása

CélkitűzéCélkitűzéss

Hepato-STIM medium (BD Biosciences)

MEM medium (Sigma)

10%FBS, antibiotikum- antimycotikum oldat (Sigma)

Disszociáló puffer: 0,04% tripszin (Gibco) és 0,15mg/ml kollagenáz (Sigma-Aldrich) DMEM-F12 mediumban (Gibco)

Transwell Clear (Corning Costar)

Membrán ellenállás (TEER) mérés: EVOM (World Precision Instruments)

Warner két csatornás Ussing kamra (U-2500, Warner Instruments Co.)

Sejttenyésztés – primer kultúraSejttenyésztés – primer kultúra

Nyálmirigy minták RNS izolálás: TRI Reagent (Sigma)

Plasztik edényről and Transwell Clearmembránról RNS izolálás: Nucleospin RNA II. Kit (MACHEREY-NAGEL)

RT-PCR: High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystem)

HEPES-puffer oldat, 100% O2; HCO3—puffer oldat, 5% CO2/95% O2 és Cl—

mentes oldat

amilorid (10 µM) , bumetanid (100 µM), forskolin (10 µM), ATP (50 µM), karbakol (100 µM); (Sigma)

PTHSG Hepato-STIM

10x

huSMG

Hepato-STIM 10x

0

400

800

1200

0 2 4 6 8days

TEER

(Ω

cm

2)

MEM 0 nap

Hepato-STIM

MEM 2 nap

MEM 1. nap

gyorsan letapadó sejtek: PTHSG „mesenchimális progenitorok”egy nap utáni felülúszó: huSMG „epitheliális progenitorok”

PTHSG MEM 10

x

huSMG MEM 10xKulcstranszporterek (RT-CR)Kulcstranszporterek (RT-CR)

Funkcionális vizsgálatok rövidzárlati áramFunkcionális vizsgálatok rövidzárlati áram (I (Iscsc)) mérésével mérésével

Módszerek és Módszerek és eredményekeredmények

ENaCNBC1 NHE1NKCC1Pozitív kontroll: K: Vese

Minta jelölések:

Me: membránról izolált

Pl: plasztikról izolált

Ti: nyálmirigy szövetből izolált

Me, Pl, Pl, Me, Ti, Ti, Me, Pl, Pl, Me, Ti, Ti, KKMe, Pl, Pl, Me, Ti, Ti, Me, Pl, Pl, Me, Ti, Ti, KK Me, Pl, Pl, Me, Ti, Ti, Me, Pl, Pl, Me, Ti, Ti, KK Me, Pl, Pl, Me, Ti, Ti, Me, Pl, Pl, Me, Ti, Ti, KK

Transzpithelialis rezisztencia méréseTranszpithelialis rezisztencia mérése

*p<0,05

HCO3-

++

0

2

4

6

8PTHSG

4 4I sc (µ

A/c

m2)

ATP carbachol forskolin0

2

4

6

8

118 8 5 4

PTHSG

huSMG

∆I s

c (µ

A/c

m2) *

*p<0,05

vs baseline

*

* *

I sc (µ

A/c

m2) PTHSG

02

4

6

8

*

*p<0,05

*

0

2

4

6

8

∆ I

sc (

µA

/cm

2)

8 388*p<0,05

*

PTHSG huSMG

*

0

2

4

6

8PTHSG

8 85 6∆I s

c (µ

A/c

m2)

HCO3-

Cl-++

--

++

--

huSMG

*

*p<0,05

*

BAZOLATERALIS OLDAL

APIKALIS OLDAL

Na+

CA II

CO2

CO2+H2O H2CO3 H++HCO3-

HCO3-Cl-

CFTR

?

Cl-

CaC

C

NKA

K+ Na+

ATP ADP+PK+

HCO3-

K+Na+ Cl-

NKCC1

H+

Na+ HCO3-Na+Cl-

NBCNHE AE

Na+

ACINI

DUCT +Na

+Na

EN

aC

PKA IIcAM

P

Ca2+

forskolin

ATP

karbakol

bumetanid

10 µM amilorid

∆I s

c (µ

A/c

m2) PTHSG

*

0

2

4

6

8

5 5 99*p<0,05

Bumetanid hatása az ATP stimulált szekrécióra

Apikálisan adott amilorid hatása

Klorid és bikarbonát megvonásának hatása

EredményekEredmények

Vektoriális iontranszport aktiválása

HCO3-Cl-Cl-

++

--

Cl-++

--

HCO3-

Bum+-

-+

--

HCO3-& Cl-

Ami+-

++

-+

HCO3-& Cl-

Ami+-

++

+-

++

*

--

99 3

NKA

K+ Na+

ATPADP+P

++

nem stimulált ATP stimulált szekrécióra

nem stimulált ATP stimulált szekrécióra

Primer sejtkultúra: polarizált epithel monolayer létrejötte mind PTHSG és huSMG kultúrából Hepato-STIM médium alkalmazása kulcsfaktor

Transzepitheliális vektoriális elektrolit mozgás mindkét sejtkultúrában

1. Apikális irányú anionszekréció (Acináris jellemző)

Cl- és HCO3-

Ca2+- aktiválta szabályozási útvonal

2. Bazolateralis irányú Na+ abszorpció (Duktális jellemző)

Végeredmény: kétdimenziós nyálmirigyy kevert acinalis/duktális fenotípust mutatva:

működése genetikai vagy farmakológiai módosításra egyaránt alkalmas

MegbeszélésMegbeszélés

Támogatás: TÁMOP-4.2.1/B-09/1/KMR-2010-0001; OTKA: NI69008, CK80928 ;

Bazolaterális oldal

Apikális oldal

Cl-;HCO3ˉTranswell

Na+