Upload
josie
View
278
Download
18
Tags:
Embed Size (px)
DESCRIPTION
Klasifikasi , Mekanisme dan Aplikasi Enzim DNA Ligase. Abdul Arifin 20508013. Klasifikasi DNA Ligase. Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (NC-IUBMB). Enzim Nomenklatur. DNA Ligase (ATP). EC.6.5.1.1. Struktur molekul. Definisi ; - PowerPoint PPT Presentation
Citation preview
1
Klasifikasi, Mekanisme dan Aplikasi Enzim DNA Ligase
Abdul Arifin20508013
Klasifikasi DNA LigaseNomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology
(NC-IUBMB)Enzim NomenklaturDNA Ligase (ATP) EC.6.5.1.1
Definisi; DNA Ligase: salah satu enzim ligase yang membentuk ikatan kovalen fosfodiester diantara ujung 3’Hidroksi dari satu nukleotida dengan ujung 5’fosfat dari nukleotida yang lain dan melibatkan ATP dalam reaksinya.
Struktur molekul
Mekanisme ReaksiSecara Umum;
(DNA)n + (DNA)m (DNA)n+m
ATPDNA Ligase
AMP + Ppi
Sisi Aktif (Lysine)
3
NH-AMP
DNA ligase
DNA ligase
NH2
ATP
PP1
T4E.coli
NAD+
NMN
AMP
Ligated DNA
Mekanisme DNA Ligase
Suatu rantai DNA yang terpisah
Pembentukan intermediate enzim energi tinggi dengan transfer gugus adenosil dari NAD+ atau ATP pada gugus amino dari residu lysine
Transfer gugus adenosil ke ujung 5’ fosfat pada DNA yang terpisah
Gugus hidoksil menyerang ujung 5’ fosfat – adenosil - enzim
Tipe-tipe DNA Ligase
Pada Hewan Mamalia terdapat 4 tipe spesifik dari enzim DNA Ligase, diantaranya ;• DNA Ligase I : yang mengkatalis reaksi ligasi fragmen-fragmen
Okazaki pada pemanjangan rantai sewaktu proses replikasi DNA berlangsung dan beberapa fragmen-fragmen rekombinasi
• DNA Ligase II : Bentuk alternative dari DNA Ligase III yang ditemukan pada sel yang tidak dapat membelah diri
• DNA Ligase III : Bentuk kompleks dengan XRCC1 suatu protein yang memperbaiki DNA dengan mencegah terjadinya mutasi penghilangan basa DNA dan fragmen-fragmen rekombinan
• DNA Ligase IV : Bentuk kompleks dengan XRCC4. Kompleks enzim ini mengkatalisis tahap akhir proses perbaikan penggabungan ujung non-homolog DNA rantai ganda.
Umumnya enzim-enzim DNA ligase pada mulanya ditemukan dalam T4 bakteriofag, E. coli dan bakteri lainnya.
Regulator DNA LigaseRegulation of DNA Ligase activity by poly(ADP-ribose) yang disusun oleh Debbie Creissen dan Sydney Shall dalam Nature 296, 271-272 (18 March 1982)
Cell cycle regulation of a DNA ligase-encoding gene ( CaLIG4) from Candida albicansDisusun oleh Andaluz, E., et. al., yang dipublikasikan dalam Yeast volume 15 issue 12, 1999, p1199-1210
Regulation of inter- and intramolecular ligation with T4 DNA ligase in the presence of polyethylene glycol yang disusun oleh Hayashi, K., et. al., yang dipublikasikan dalamNucleic Acids Research, 1986, vol. 14, No.19 7617-7631
Polyethylene glycol (PEG) mempengaruhi reaksi ligasi pada T4 DNA ligase. Dalam 10% (w/v) larutan PEG 6000, hanya ligasi intermolekular yang dipertinggi oleh kation-kation monovalent, sementara reaksi ligasi inter- dan intramolekular dapat terjadi tanpa PEG.
Nuclear ADP-ribosyl transferase (ADPRT) menkatalisis transfer ADP-ribos dari NAD+ ke protein Kromatin untuk membentuk mono-,oligo-, and poly (ADP-ribose)-termodifikasi. Enzim ini sangat tergantung DNA untuk aktivitasnya dan diaktivasi dengan adanya celah dalam DNA. Hal ini mengindikasikan biosintesis poly(ADP-ribose)n dibutuhkan untuk perbaikan yang efektif untuk beberapa jenis kerusakan DNA.
menjelaskan tingkat transkripsi enzim CaLIG4 dalam C. albicans bervariasi selama siklus sel ragi. Sel-sel yang baru terbentuk mengandung tingkat transkripsi basa yang meningkat sampai tingkat maksimum ketika sel dalam keadaan G1 akhir. Sesudah itu, tingkat ranskripsi menurun ketika replikasi DNA dimulai.
pisahkan gen DNA ligase menjadi DNA rantai tunggal dengan pemanasan 94oC selama 1 menit
gabungkan primer ke rantai tunggal DNA, dengan suhu 50oC/140 detikAnnealing
Denaturasi
pembentukan rantai ke dua dengan DNA polymerase dan dNTP pada suhu 72oC selama 1,5 menit
Extension
Dilakukan PCR sampai 40 siklus, Fragmen yang dihasilkan (total panjang 600nt), yang mirip dengan gen DNA ligase organisme x
Isolasi gen DNA ligase dari Thermococcus sp. 1591
Isolasi dan Karakterisasi DNA Ligase
Primer merupakan urutan daerah dari DNA ligase organisme x
Primer 1 and 2 Membentuk gen utuh.
Gen DNA ligase utuh
DNA Thermococcus sp. 1591
Isolasi gen DNA ligase dari Thermococcus sp. 1591
Karakterisasi DNA Ligase
Salah satu sampel ditambahkan DNA ligase
Aktivitas ligase dapat ditentukan melalui dua metode
1.Molekul DNA kontrol2. DNA setelah penambahan enzim restriksi BstEII3. Sama seperti 2, tetapi sebelum elektroforesis sampelnya dipanaskan 70oC selama 10 menit4. Sampel fragmen DNA + BstEII dengan penambahan DNA ligase (45oC/1jam), buffer reaksi serta ATP5. Mirip dengan 4 tetapi tanpa ATP
C = produk ligasi (fragmen A + B)A dan B= fragmen hasil restriksi BstEII
Aplikasi DNA Ligase
Percobaan pertama DNA rekombinan
• 1971 ilmuwan memanipulasi DNA dan menempatkannya ke dalam bakteri
• 1972 ilmuwan menggabungkan dua molekul DNA dari sumber berbeda menggunakan endonuclease EcoRI (untuk memotong) dan DNA ligase (untuk menggabungkan kembali)
Aplikasi DNA LigaseKloning DNA pertama
Boyer, Helling Cohen, dan Chang menggabungkan fragmen-fragmen DNA dalam sebuah vector, dan mentransfer ke sel E. coli
Cohen and Chang menyimpulkan, mereka dapat menempatkan DNA bakteri ke dalam spesies bakteri yang berlainan
Tahun 1980 Boyer and Cohen menerima paten untuk metode dasar transformasi dan kloning DNA
Pemasukan gen ke dalam plasmid
menggunakan enzim restriksi
dan DNA ligase
1
Agrobacterium
Tiplasmid
T DNA
Titik restriksi
pengenalanke dalam sel tanaman yang dikembangkan
2
RekombinanTi plasmid
Plant cell
T DNApembawagen baru
dalam kromosom tanaman
Regenerasitanaman
3
Tanaman hasil rekayasa
DNA mengandung gen yang diinginkan
Aplikasi DNA LigaseDNA ligase dimanfaatkan untuk menggabungkan secara kovalen ikatan fragmen-fragmen suatu DNA, secara luas kemampuan ini diaplikasikan ke penggabungan suatu fragmen DNA pada suatu vektor plasmid, hal ini merupakan teknik dasar rekombinasi DNA
Organisma Modifikasi Genetik: Aplikasi DNA Ligase dalam Agriculture
Isolat DNAdari dua sumber
1E. coli
Potong kedua DNA dengan enzim restriksi
yang sama
2
Plasmid
Sel Manusia
DNA
Gen VSticky ends
campurkan DNA; merekabergabung berdasarkan pasangan basanya
3
DNA ligase menggabungkanikatan DNA secara kovalen
4
Rekombinan DNAplasmid
Gen V
plasmid dimasukkan ke bakteri
5
bakteri diklon6
Klon bakteri mengandung duplikat gen manusia
Perkembangan AplikasiDNA Ligase
Paul Berg, Stanley N. Cohen & Herbert Boyer, 1970 (p.1119)Klon DNA : (teknologi DNA rekombinan atau rekayasa genetik) 1. Potong DNA pada posisi tertentu dengan enzim restriksi endonuklease.2. Gabungkan kedua fragmen DNA dengan DNA ligase.3. Pilih molekul kecil yang mampu mereplikasi DNAnya sendiri. Potongan DNA dapat dimasukkan ke dalam kloning vektor (plasmid atau viral DNA) untuk membentuk DNA rekombinan.4. Pindahkan DNA rekombinan dari tabung tes ke sell induk untuk replikasi.5. Identifikasi cell induk yang mengandung DNA rekombinan.
Tanaman tembakakau,
diekspresikan dengan gen firefly luciferase
Beras ini dapat menolong mencegah terjadinya defisiensi terhadap vitamin A
“Beras Keemasan” telah dimodifikasi secara genetik agar meengandung beta-karotene
Tikus Rekayasa (Kanan), yang diekspresikan dengan gen HGH (Human Growth Hormone)
Kloning Sel-sel Hewan, Langkah menuju gen terapi
Sel-sel dan organisme rekombinan digunakan untuk menghasilkan protein-protein yang bermanfaat
Kesimpulan