KLEINE BEITRAGE ZUR BESTIMMUNG DES IEP VON PROTOPLASTEN

V. MIRR0-RATAPIIORETISCHE VERSUCHE MIT PFLA2~ZLICtIEN ZELLEN l)

Vori HANS PFEIFFER (Bremen)

Mit 3 Figuren

Eingegangen am 12. Dezember 1931

1. Die S t e l l u n g des k a t a p h o r e t i s c h e n V e r f a h r e n s u n t e r den M e t h o d e n z u r - B e s t i m m u n g des IEP . - - Elektriseh geladene Kolloidteilehen (Elektrosomen) verhalten sich bekanntlich wie sehr groge Ionen. Wie solche wandern sie beim Anlegen einer EMK innerhalb des LOsungsraumes zu einem der beiden Pole. Eine derartige Verwendung des kataphoretischen Experiments zur Ermittlung des iso-elektrisehen Punktes ( I E P ) b e r u h t auf dessert urspriinglicher D e f i n i e r u n g bei W. B. HARDX, der darunter jenes Stadium verstand, in welehem die Elektrosomen ihre Ladung und damit ihre bevorzugte Bewegungsrichtung gegen~iber einwirkenden elektrisehen Str0men eingeb(il3t haben (7, S. 1575). Indem n~tmlich die Ampholyte in ihrem IEP an Zahl die gleiehe Menge positiver und negativer Ionen zeigen werden, kann nieht mehr eine ein- seitige (in saurer LOsung kathodische, in alkalischer dagegen anodische) Wanderung der Teilchen im Stromgeffille resultiereu, sondern ist min- destens eine gleieh starke doppelsinnige Verschiebung oder ein Stillstand der Teilchen zu erwarten.

Bei der g r u n d s ~t t z 1 i e h e n B e d e u t u n g des mikro-kataphoretischen Experiments (9, 8.824) for die Bewertung von gewissen Azidit~ttsstadien des Mediums als des IEP der darin suspendierten Objekte oder mindestens ihrer kolloiden Teilehen ist eigentlich verwunderlieh, dab die Messungs- ergebnisse nieht noeh in viel grtigerer Zahl vorliegen. Den Grund daffir dtirfen wit wohl auger in gewissen Unbequemlichkeiten bei der Dutch-

1) F o r t s e t z u n g aus Protoplasma, 11, 85---96; 12, 268--278; 14, 83--90, 90--96.

K M n e Beitr~ige zur Bes t immung des I E P von Protoplasten. V 591

ffihrung der Methode vornehmlich in unserer geringen Kenntnis des s p e z i e l l e n A b l a u f e s des yon mehreren Variabeln beeinflugten Vor- ganges sehen.

Die mathematisehe Theorie aller e l e k t r o k i n e t i s c h e n Erschei- nungen (8, S. 36), also auger der elektrischen Uberftihrung yon festen Teilchen ( K a t a p h o r e s e ) u n d Fliissigkeiten ( E l e k t r o o s m o s e ) aueh tier Entstehung elektriseher Str0me dureh Bewegung von festen und fl(issigen Teilehen ( k a t a p h o r e t i s e h e und S t r 0 m u n g s s t r 0 m e ) , ver- danken wit haupts~tchlieh H. v. HELm~OLTZ und J. PERRI~, sowie naeh Ausffihrung neuer experimenteller Untersuchungen, vornehmlich yon R. ELLIS, ganz besonders M. v. SMOLUCI-IOWSZL Danach ist beispielsweise bei der Kataphorese die Geschwindigkeit der bewegten Teilehen u zu

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(worin g den Potentialsprung zwisehen den Bewegungen der Doppelschieht der Phasengrenzfl~tehe, E das angelegte Potentialgef~tlle, 1) die Dielektri- zit~ttskonstante der Fltissigkeit, ~ die Viskosit~tt derselben und 1 die L~tnge tier bei ihren Versuehen berfieksichtigten Kapillare bedeuten) zu setzen (1, S. 328; 8, S. 64). Naeh dieser Oleiehung kann eigentlieh nut dann die Bewegungsgeschwindigkeit als Mal3 tier elektrisehen Ladung der Teilehen gelten, wenn die a n d e r n V a r i a b e l n als konstant angenommen werden dtlrfen. Mindestens ftir die ViskositSt ~ darf aber nach Erfahrungen Fm WEB~RS als wahrseheinlich gelten, dab ihr Weft w~thrend der elek- trisehen Durehstr0mung weehselt.

Dieser Befund 1Ltgt also fiir den Anfang die Anwendung tier Methode auf Inhaltsbestandteile yon Protoplasten weniger geeignet erseheinen als die Erprobung an S u s p e n s i o n e n g a n z e r Ze l len oder isolierter Bestandteile derselben in experimentell einigermaBen konstant zu hal/ tenden k~ ins t l i ehen Medien. In der Tat liegen darfiber auger den hier aueh genannten Arbeiten (5; 10; 11; 12) sehon einige weitere Ergeb- nisse vor (s. die Literatur: 8, S. 98f.), und auch die zu beaehtenden Fehler- quellen sind durehaus nieht unbekannt. Wenn hier trotzdem noehmals tlber solehe Versuche beriehtet wird, so gibt schon das Auffinden mOglieher V e r e i n f a e h u n g e n an den Apparaturen und die ausgezeichnete Be- w'~.hrung in der Literatur angegebener Verbesserungen an den Elek- t r o d e n einen ausreiehenden Anlal3. Ferner wurden mindestens teilweise n eue O bj e k t e benutzt und so Kontrollwerte ftlr die noeh mitzuteilende Nethode des Aufsuchens des IEP nach PlSCHINGEU (Ermittlung des Anf~trbungsriickganges) gefunden.

592 P f e i f f e r

Methodischer Tell

2. Die U n t e r s u c h u n g s a p p a r a t u r . --- Die kataphoretische Teehnik ist schon oft dargestellt worden (Lit. s. 7, S. 1575), so dal~ hier sogleich die gewfihlte Anordnung beschrieben werden kann. Wie bei L/2ERS und GEYS (5, S. 374) und ganz ~thnlieh bei vorlfiufigen Versuehen PlSCm~'GERS (10, S. 179) ist aueh hier yon dem yon L. MICHAELIS (6, S. 118f.) angegebenen Verfahren der M i k r o k a t a p h o r e s e i n i t t e l s un- p o l a r i s i e r b a r e r E l e k t r o d e n ausgegangen worden.

In die seitlieh die Cxrenze der Kataphoresekammer (entspreehend gestiitztes Deckglas auf dem Objekttr'ager) tiberragende Untersuchungs- II{issigkeit tauehen die 8 i l b e r d r a h t - A g a r e l e k t r o d e n , bei deren tter- stellung vor allem Erfahrangen yon G. ETTISCH und T. Ps S. ~ELFAN, JOS. GICKLIIORN, K. UMRATH, A. DEJDAR, A. NISTLER und J. PEKAREK ZU Rate gezogen worden sind (vg'l. auch KELLER 4, S. 282 bis 295). Ganz besonders ist auf die yon GICKLHORN und UMRATH (2, S. 237) ausftihrlieh besehriebenen Phasen der Herstellung symmetriseher Kapillarenpaare (Fig. 1), deren Ftillung mit erw'/irmtem 2 % Agar + n/10 KC1 und endlieh die Manipulationen zum Vortreiben der Kapillarftillung (Erfi~hrungen I)EJDARS) ZU verweisen. Die zu tiberwindenden, von G~CKL- ~0~N (2, S. 240f.) besehriebenen Sehwierigkeiten sind bei den hier zur Anwendung kommenden Elektroden geringer, insofern die Kapillaren durehaus das Mehrfache des sonst erwiinschten Lumens aufweisen d0rfen, aueh flache Elektroden nieht hinderlich zu sein brauchen.

Die Elektroden sind in der yon MICHAELIS (6, S. 119) und yon vielen andern Autorsn geiibten Art mit passend gebogener C-lasrOhrs zu v er- b i n d e n , und diese ist selbst mit der sehon erwahnten KOl-Agar-Mischung zu fiillen und in ein OefN3 mit gleieher Mischung zu ssnksn. Dann sind welter die m e t a l l i s c h e n Pole der stromzuftihrsndsn Leitung entweder direkt in das gleiehe Oef~tl3 zu tauehen oder nach einem Verbesserungs- vorschlage yon MICHaELIS (6, S. 119) erst in ein dureh I I-Rohr (mit KOl-Agar-Fiillung) damit verbundenes Oef~tl3 mit CuS04.

kls S t r o m q u e l l s disnt sin Oleishstrom yon 6--8 Volt, den man dursh Anwendung. einss Vorschaltwiderstandes und eines Stromwechslers aus dsm zur Verfiigung stehenden Lichtstrom o. a. darstellt. Zum Re- gulieren der Stromintsnsit~tt und des Potentials kann man einen verstell- baren Widerstand vorsehsn, etwa in der bekanntsn Potentiometer- schaltung. Dutch Einsehaltung sines Stromsshlfissels kann der Strom nach Belisben unterbroshsn werden. Auch ist dafiir zu sorgen, dab dutch

Kleine Beitr~ge zur Bestimmung des I E P von Protoplusten. V 593

ver~nderbare Verteilung der zuffihrenden Leitungsdr~thte die Stromrich- tung nach Belieben umgewendet werden kann (vgl. auch die s chema- t i s c h e A n o r d n u n g nach Fig. 2).

Die M i k r o k a m m e r kann in einer der bereits gebr~uchlichen Ausbildungsweisen (g. H6BER, L. ~V[ICHAELIS, R. ELLIS, H.A. Mc TAG- a~RT, T~E SVEDBERa, ST. V. @Y6ROu J. H. NO~TImOP, H. R. KRUYT, A. E. VAN ARKEL, R. F/2RTtI, O. BL/Jlt, H. FREUNDLICH, H. A. ABRA1RSON U. V. a.) zur Anwendung kommen, und auch die ersten eigenen Versuche

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Fig. 1. H e r s t e l l u n g u n d A u f b e w a h r u n g der S i l b e r - A g a r - M i k r o e l e k t r o d e n naeh GTC~r,HO~ und UMRATH (2, S. 237); man beachte besonders: das sukzessive Aus- ziehen des Glasrohres (a--c), die Agareilffiillung mit Pipette P (d), die Bereithaltungs- form (e), das Vortreiben der Ffillung ([) und die Einfiihrung des Silberdrabtes D (g),

endlich die Aufbewahmmg auf Glasbloek mit aufgeklebten Glasst.aben (p, p'). Protoplasma. X V 3 8

] O n o~ 0 o ~ ~ ,

594 Pfe i f fe r

sind mit selbst hergestellten Kammern naeh den Vorschriften yon MIChAeL,S (6, S. 118) angestellt worden. Als Mikro-Kataphoresekammer sehr brauchbar sind aber auch die yon den Optischen Werken Emil Busch A. G., Rathenow, angefertigten D u r c h f l u l 3 - O b j ek t t r~ tgernach HAUSER (3, S. 37). Sie bestehen aus einer Metallplatte yon Form und GrSge der fibliehen Objekttr~tger mit einem flachen zylindrisehen BehSlter in der Mitte (Fig. 3), dessen Boden ein Glasfenster und dessen Rand zwei seitlieh einmtindende 0ffnungen mit Schlauehansatz tr~tgt. Mittels Gewinde wird Bin ebenfalls mit rundem Fenster versehener Deckel aufgesehraubt, dessen Fenster (Deckglas) leieht ausgewechselt werden kann, indem mittels Sehlttssels der Haltering herausgesehraubt und der zur Abdiehtung

Fig. 2. Schema der A n o r d n u n g (von unten nach oben) yon Kataphoresekammer, Strom- wender, Widerstand, Stromunterbrecher und

Stromquelle (hier Akkumulatorenbatterie).

Fig. 3. Der E. B~TscI~'sche Durch* fluI3- O bj ek~tr~ger in Seitenansicht

und yon oben.

dienende Gummiring herausgenommen wird. Je naeh dem Grade des Einschraubens ist die E n t f e r n u n g z w i s e h e n D e e k e l und B o d e n der Kammer zu variieren. !V[it Hilfe einer e i n f a e h e n Ska la , die in die Oberseite des am Deckel befindlichen Ringes eingraviert ist, und einer oberhalb des einen Sehlauchstutzens angebrachten Marke kann sogar auf die Herstellung bestimmter HShe der Mikrokammer eingestellt werden. (Die voile Umdrehung des Deekels im Gewinde des Beh~tlters entsprieht einer HShenver~tnderung yon 500 #1).)

1) Der Firma und besonders much den Herren Prof. F. HAVS~n und Dr. K. ALBRECHT sprieht Verf. fiir die wertvolle Unterstiitzung durch l')berlassung der App~r~tur seinen besten Dank aus.

Kleine Beitri~ge zur Bestimmung des IEP yon Protoplasten. V 595

3. Die w i e h t i g e r e n P e h l e r q u e l l e n und ihre V e r m e i d u n g . - - Bei Benutzung polarisierbarer Elektroden st6rt die an ihnen unver-

meidbare Gasentwieklung. Dureh die Bildung und das Zusammenfliegen yon @asbl~tschen entstehen St613e, die unter Umst~tnden die gerade beob- aehteten Teilehen betr~ehtlieh fortsehnellen k6nnen, inindestens die Beob- aehtung o% betr~ehtlich hindern. Ferner ist daran zu denken, dab bei ungentigendeIn Aussehlul3 yon P o 1 a r i s a t i o n e n die Kammerflttssigkeit dutch ungleiehe Gasentwieklung als ganzes eine Versehiebung erfahren kann. Aueh m6ehte gleiehzeitig die OberflXehe der Elektroden verkleinert werden und dutch ttineindiffundieren yon Zersetzungsprodukten der Elektroden in die Kammer die Teilehenladung eine unkontrollierbare Ver~tnderung erfahren. Diese und weitere Grtinde zwingen zur Herab- setzung, wenn nieht Aussehaltung yon Polarisationen und allen elektro- lytisehen Konzentrationsverfinderungen. Besonders f~ir Anordnungen mit Gleiehstrom ist zu empfehlen, den Strom nut m(;gliehst kurze Zeit zu schliegen und ihn naeh jeder Ablesung zu wenden. Dadureh werden aueh StOrungen dutch Temperaturerh0hung vermieden, die sich aus d e r m i t dem Stromdurehgang leieht eintretenden Erw~trmung ergeben.

Aul3er dutch Polarisierung der Elektroden, die durch deren Bau und dureh Verktirzung tier Versuehsdauer tunliehst ausgesehlossen wird, ergeben sieh irrt~tmliehe Beobaehtungen dutch ungentigende Beraek- siehtigung der Untersehiede der kataphoretisehen W a n d e r u n g in den v e r s e h i e d e n e n H 6 h e n der K a m m e r . Beim Stromschlug ergibt sieh nSmlieh, wie allgemein bekannt (6, S. 117), in den die Glasw~tnde be- r~ihrenden Flfissigkeitssehiehten als Polge auftretender Potentialdiffe- renzen zwisehen Glas und L6sung eine (oft entgegengesetztel)) Fliissigkeits- bewegung (Elektroosmose), die besehleunigend oder (gew6hnlieh) hemmend auf die Teilehenversehiebung einwirkt. Die jeweils beobaehtete Raum- verfinderung ist eben die Resultante aus der elektroosmotisehen Str0mung nnd der kataphoretisehen Eigenbewegung der Teilehen. So ergibt sieh die Notwendigkeit, die Teilehengesehwindigkeit in jener Tiefe zu untersuehen, in der die Gesehwindigkeit des LOsungsmittels sieh dem Grenzwert 0 nithert, d.h. bei der aus M.v. SMOI~UC~-mWSK~S Interpolationsformel abzuleitenden Tiefe x

1) E n t g e g e n g e s e t z t ist die Aufl~dung dann , wenn (wie in den gewdhnlich zur Untersuchung kommenden F/~llen) die W~ndladung gegen das Dispersionsmittel den gleichen Ladungssinn wie die Teilchenludung hat.

38*

596 P fe i f f e r

(worin d die Gesamth0he der Kammer) resp. nach MICHAELIS (6, S. 119) in 1/5 und 4/5 der Gesamth6he tier Kammer. Es leuehtet ein, dal3 ftir die Einstellung auf bestimmte Tiefe der Kammer die Kenntnis ihrer senkrechten Ausdehnung niitzlich sein kann (Vorteil des E. Busc~Fschen DurchfluB-Obj ekttr~gers).

Von erheblieher Bedeutung for die praktische Durehffihrung der Versuche ist abet auch die r i c h t i g e W a h l der g e s a m t e n K a m m e r - hOhe. Je geringer diese ist, um so liehtst~trkere Bilder der Vorg~tnge sind zu erzielen und um so gr613ere Aussieht besteht naeh O. BLt~H zur Eliminierung elektroosmotiseher Fltissigkeitsstr6mungen. Andererseits wird indessen an Kammern sehr geringer H6he die geforderte Beschr~tnkung auf Beobachtungen in bestilnmten Schiehttiefen praktiseh unerftillbar. Allen diesen VerhSltnissen ist also stets die H6he der Mikrokammer anzupassen.

Eine wertvolle K o n t r o l l e ffir die Brauehbarkeit d er Beobaehtungs- ergebnisse hat man in der Anwendung d er Stromumkehr, die.bei Richtig- keit der Befunde aueh deren Verkehrung in den entgegengesetzten Ladungs- sinn und die umgekehrte Bewegungsrichtung ergeben mul3.

4. D i e U n t e r s u c h u n g s o b j e k t e u n d d i e V e r s u e h s m e d i e n . - - Auch die A u s w a h l der Untersuchungsobjekte hat sich einerseits naeh wunsehgem/tl3er Erleiehterung der Beobachtungen dutch Verwendung m0glichst gr6gerer Zellen, andererseits nach der damit verbundenen Erschwerung der kataphoretischen Bewegung einzustellen gehabt. Ferner sind in gr613erer Menge zu besehaffende und experimentell weniger empfind- lithe Objekte bevorzugt worden.

Die benutzte Saccharomyces cerevisiae ist eine yon einer Brauerei gelieferte, nieht nSher bekannte und besehriebene, u n t e r g S r i g e R a s s e (Gr613e der Einzelzellen 4--10#). Sis ist in ungehopfter Bierw(irze yon einem Gehalt yon etwa 10--12 ~o der Skala des BAH~I~'GSChon Saccha- rolneters bereit gehalten und in einigen F~tllen (S. 599) einige Tage hindureh in Bierwtirze kultiviert worden, wobei ihr Gehalt mit d er ein- setzenden G~trung a uf unter die Hi~lfte sinkt. Es ist auf die Maltnahmen bei der Kultivierung tier Objekte nieht mehr hinzuweisen, da die eigenen Erfahrungen schon wegen ihrer zu geringen Zahl die erfolgreichen Er- gebnisse yon E. CltR. HANSEN, P. LINDNEtt, H. PI~INaSHEIM, H. SCI~NEOG, A. GUILLIERMON~), H. ZI~:ES, H. WILL U. a. nicht ergfinzen k6nnen.

Weiter sind wie zu andern eigenen Versuchen aus den Bee ren - p e r i k a r p i e n von Solarium nigrum und Vitis vini[era in einer nur wenig

Kle ine Bei t r~ge zur B e s t i m m u n g des I E P von P ro top l a s t en . V 5 9 7

yon E. K i ~ s ~ abgewandelten Weise n a e k t e P r o t o p l a s t e n dargestellt und in Puffermischungen weehselnder CI~ (s. unten) suspendiert worden, indem mSgliehst die gleiehe Menge des die Protoplasten ffihrenden Beeren- saRes mit dem 25faehen Volumen des Puffers vermiseht und ganz kurz zentrifugiert worden ist.

Die seit Bo•. CoaTI ( 1 7 7 4 ) bekannten und yon C. N * G E L I ,

H. R. GOEPPERT, P. COtIN, W. HOF~EISTER, E. OVER~O~, A. VOT~VA U. a. h~tufig untersuehten S t a e h e l k u g e l n yon Nitella [lexilis und capitata werden in der iib]iehen Weise dutch Ansehneiden yon Internodialzellen und dureh Streiehen naeh der Zellwunde hin in dem entleerten Zelleninhalt neben gro!3en Kernen und Chloroplasten in Gestalt grauer, runder K6rper gefunden, die naeh dieser Manipulation in keinem Falle mehr yon tier sonst bisweilen bemerkten farblosen Hfille umgeben sin& Die kugeligen oder el]iptisehen K6rper messen ungefiihr 24 # und zeigen an der Peri- pherie zahlreiche, dieht gedr~ngte Forts~itze (,,WimperkSrperehen"). - -

Um bei den Versuehen die W a n d e r u n g de r 0 b j e k t e im S t rom- gef~l le bei w e e h s e l n d e r C~ (7, S. 1577) untersuehen zu kOnnen, bedarf es in dieser Hinsicht abgestufter (gepufferter oder ungepufferter) Medien, deren Auswahl sieh naeh den gerade benutzten Objekten zu riehten hat. So sind naeh einigen V o r v e r s u c h e n , die sieh fiber die ganze Breite zwisehen pH 2,6 und 7,8 erstreekt haben, die Zellen yon Saccharomyces in ungehopfter Bierwiirze, die Staehelkugeln yon Nitella in 150fach verdfinntem Zellsaft suspendiert und die Flfissigkeiten dutch t r o p f e n - w e i s e n Z u s a t z y o n n/10 ttC1 u n d NaOH auf die gewtinschten pH- Stufen (2,8; 3,6; 4,4; 4,6; 4,8; 5,0; 5,2; 5,4; 5,6; 5,8; 6,0; 6,6) gebraeht worden. Bei den Staehelkugeln yon Nitella und vet al]em bei den naekten Protoplasten yon Solanum und Vitis sind ferner mOgliehst gleiehe Mengen des die Objekte enthaltenden Saftes mi t d e m g l e i c h e n V o l u m e n y o n P u f f e r g e m i s c h e n vermengt worden, und zwar sind aueh dieses Mal wegen ihres weiten Umfassungsbereiches die Gemisehe naeh T. C. Mc ILVAINE allen andern bekanntgegebenen Rezepten vorgezogen worden. Die Stufen ergeben sieh dabei dureh Misehung bestimmter Volumina Yon 0,1 reel Zitronens/iure und 0,2 reel Dinatriumphosphat:

15,89 cm a S~ure -~- 4,11 cm s P h o s p h a t . . . . . . . . . p H 3,0

12,90 . . . . ~ 7,10 . . . . . . . . . . . . . . . 3,8 11,72 . . . . - r 8,28 . . . . . . . . . . . . . ,, 4,2 10,65 . . . . q- 9,35 . . . . . . . . . . . . . . . 4 , 6

10,14 . . . . -F 9,86 . . . . . . . . . . . . . . . 4,8

598 P f e i f f e r

9 ,70 o m a S ~ u r e + 10,30 c in a P h o s p h a ~ . . . . . . . . . p H 5,0

9 ,28 . . . . + 10,72 . . . .

8 ,85 . . . . + 11,15 . . . .

8 ,40 . . . . + 11,60 . . . .

7,91 . . . . . + 12,09 . . . .

6 ,78 . . . . + 13,22 . . . .

4 ,55 . . . . + 15,45 . . . .

1,27 . . . . + 18,73 . . . .

. . . . . . . . . ,, 5,2

. . . . . . . . . ,, 5 ,4

. . . . . . . . . . . 5 ,6

. . . . . . . . . ,, 5 ,8

. . . . . . . . . . . 6,2

. . . . . . . . . ,, 6,8

. . . . . . . . . . . 7,6

Ergebnisse und Diskussion

5. Die k a t a p h o r e t i s c h e W a n d e r u n g der u n t e r s u e h t e n 0 bj e k t e. - - Nit grOl3erer oder gegen den IEP abnehmender Geschwindig- keit bewegen sich die naekten Protoplasten yon Solanum nigrum in Puffermisehungen zwisehen 7,6 und 5,0 zur Anode, unterhalb pi t 4,6 deutlich zur Kathode, so dab der gesuehte IEP bei oder wenig fiber pH 4,8 (bei oder wenig unter einer C~ yon 1,6" 10 -5) liegen dtirfte. Die Wanderung der Protoplasten yon Vitis vini/era ist in dem weiten Bereieh yon pK 7,6 bis 4,6 positiv, bei pH 3,8 und 3,0 aber negativ geriehtet, so dab wir also innerhalb des Gebietes um pH 42 bis 4,6 (Ct~ 6 ,3 .10 -5 his 2 ,5-10 -5) den IEP zu suehen haben werden. Ferner ist aus der positiv geriehtete~ Bewegung der Staehelkugeln yon Nitella in Misehungen zwisehen pK 6,2 und 7,6, der negativ verlaufenden zwisehen pi t 5,4 und 3,8 auf die Lage des IEP in der Zone zwisehen pH 5,8 und 5,6 (vielleieht bis pH 5,5 ?) zu sehliegen.

Eine reeht gute BestStigung des letzten Wertes und im vorliegenden Falle - - wegen gr013erer Zahl der vergliehenen CH- Stufen - - sogar noeh eine anseheinend genauere Bestimmung ergibt die Wiederholung des Versuehes mit verdtinntem Zellsaft, der im u n g e p u f f e r t e n Zustande naeh empiriseh ermitteltem Sfiure- und Basenzusatz als Medium der weehselnden Ca benutzt wird. Positiv geriehtete Bewegung finder sieh jetzt bei pH 6,0 und geringerer CH, negativ verlaufende bei pH 5,4 und darunter, so dab der Wendepunkt wohl in dem Bereiehe zwisehen pH 5,8 und 5,5 (Ct~ 1,6 �9 10 -6 bis 3,2 �9 10 -6) zu suehen ist. (Oder sollte an der geringen Verbrei- terung der isoelektrisehen Zone die Benutzung ungepufferter Medien die Ursaehe sein ?)

In ~thnlieher Weise hat sieh bei Saccharomyces (Iriseh angesetztes oder his 2 Tage altes Material) naeh S~ture- und Basenzusatz is ungepuf- fetter Bierwiirze eine Bewegung der Zellen zur Anode in allen Medien zwischen pH 6,6 und 5,0, zur Kathoae in allen zwisehen pH 4,4 und 2,8

Kleine Beitr~ge zur Bestimmung des I E P yon Protoplasten. V 599

gezeigt, wahrend sieh in L6sungen mit einem pi t yon 4,8 bis 4,6 oder vielleieht 4,65 (also wohl C~ zwischen C~ 1,6.10 -5 und 2,2.10 -5) mit wechselnder Deutlichkeit Bin Stillstand, stets aber auffallende Verz6gerung der Zetlenversehiebung ergeben hat.

Von besonderem Interesse ist Bin gewisser Unterschied im Verhalten der Saccharomyces je naeh dem A l t e r der u n t e r s u c h t e n K u l t u r . Auch ohne Ans~tuern des Mediums ist n~tmlieh in dieser Hinsieht bereits eine untersehiedliehe CH gegeben. In weitgehender Best~ttigung yon Versuehen yon Li)ERS und G~Ys (5, S. 375) finder sieh n~mlieh beim Ansetzen der Kultur bisweilen aueh eine Wanderung tier Zellen zur Kathode und erst bis zu 1--2 Tage danaeh das eben besehriebene Ver- halten. W~hrenddessen ist die C~t des ~ediums entsprechend gewaehsen und nun tritt vom 3. oder 4. Tage an anseheinend eine U m l a d u n g der Ze l l en dureh das Nedium ein. W~thrend es nunmehr in einen pIt-Bereieh unterhalb des IEP sinkt, ergibt sieh eine entgegengesetzt geriehtete Zellverschiebung bei Anlegen der EMK. Alle Bemtthungen, an den andern Objekten eine entspreehende Erseheinung naehzuweisen, sind bisher fehlgesehlagen. An den Chloroplasten aus den Beerenperikarpien ist als Begleiterscheinung mit einsetzender Degeneration fast stets aus- gesproehen hydropiseher (vakuol~trer) Natur mit der O~-Zunahme (und Annfiherung an den IEP) hOehstens eine gewisse Verz6gerung der kata- phoretisehen Gesehwindigkeit der Objekte konstatiert worden, niemals aber eine Umladung und Umkehr der Wanderungsriehtung. Doeh mag tiber die halbquantitative Ausgestaltung der Versuehe in dieser l~iehtung nieht weiter beriehtet werden, da greifbare Ergebnisse noeh night ermittelt worden sind.

6. Von den M e c h a n i s m e n der e l e k t r i s e h e n B e l a d u n g . - - Schon Lt~ERS (5, S. 372--374)besprieht die Ursachen der elektrisehen Potentialdifferenz der kataphoretiseh untersuehten Zellen gegen das Suspensionsmittel, so dab wir uns bier mit einer kurzen Zusammenfassung begntigen k~nnen.

Insbesondere jene Versehiedenheiten im VerhMten der frisell in Bierwiirze an- gesetzten Saccharomyces-Suspensionen (Bewegung zur Kathode) und der gleichen Objekte nach Einsetzen der G~rt~tigkeit (umgekehrte Bewegung zur Anode) und wiederum naeh mel~rt~giger Kultur (nochmMige Umkehr zur Kathode), die wir soeben (s. oben) best~ttigt haben, weisen auf die beispielsweise yon I~. S. LILH~ und seiMem yon manehen Autoren vertretene Ansehauung, dM~ die p h y s i o l o g i s e h - e k e m i s c h e N a t u r des Z e l l e n - i n h a l t s (insbesondere der Plasmuampholyte) entseheidend das ka~phoretisehe Ver- hMten der Objekte beeinflu[tt. In dem vorliegenden Beispiele werden wir in der ers~en Umkehrung den Eintr i t t erh6hter Lebenst/itigkeit (Sprossung mit Zunahme der Nuklein-

600 P f e i f f e ~

substanz), in der sp/iteren deren Naehlassen oder Beendigung mit alhn~hliehem fJber- wiegen des Cytoplasmas erblieken dfirfen (5, S. 373). Es liegt kein Grund vor, fiir die Saccharomyces-Zelle eine Sonderstellung der gesehilderten Art anzunehmen. Danaeh ist also sehon physiologiseh-ehemiseh die spezifische Natur des gerade untersuehten Objekts wohl in jedem Falle bei der kataphoretisehen Bcwegungsriehtung wirksam beteiligt.

Naeh Tt~OR~TON (12) sollen in genfigend starken Stromgef~tllen lebende P f l a n z e n - zellen (Diatomeen, gewisse Bakterien, Saccharomyces, Vaucheria, Pleurococcus usw.) naet~ der Kathode, t i e r i s e h e (Erythroeyten u. a.) naeh der Auode wandern, und diese ~Iethode sell in zweifelhaften F/~llen sogar die systematisehe Zuordnung entseheiden k6nnen. Be- obaehtungen vieler anderer Autoren (8, S. 98f.) zeigen abet, daft mindestens eine generelle Gesetzm/tftigkeit keineswegs besteht. Das von Li~ERS (5, S. 375) untersueh~e, hier be- st~tigte Verhalten yon Saceharomyces (S. 599) ergibt vielmehr, dab selbst dieselben Ob- jekte je naeh gewissen physiologisehen Verh~ltnissen zu v611ig entgegengesetzten Er- gebnissen ft~hren k6nnen . In diesem Sinne m6ehten wir gewisse Gegens/~tzliehkeiten unter den in der Literatur niedergelegten Befunden vor allem mit ungenfigender Beriiek- siehtigung der physiologisehen Ursaehen der OberflS~ehenbeladung deuten. Wie das im einzelnen m6glieh ist, soil demn/iehst im Zusammenhange mitgeteilt werden.

Allgemeiner anerkannt ist noeh die andere Deutungsm6g]iehkeit, n/imlieh die aus der kataphoretisellen Bewegung zu erschlieftende, weehselnde Beladung der Zellen- oberfl~ehe unter Anwendung der Theorie der Elektrokinese auf p h y si k a li s e h - e h e - m i s e h e P r o z e s s e zurfiekzuffihren (5, S. 373; 8, S. 63). }tier ist es ganz besonders die Annahme, daft die Teilehen sieh duret~ Ionenadsorp~ion aus dem Dispersionsmittel be- laden. In der Tat mfissen dann die im Sol verbleibenden, entgegengesetzt geladenen Elektrosomen die regelm~gig vorherrsehende ElektroneutrMit~t ergeben. Aueh zahl- reiehe in der Literatur verzeichnete Beobaehtungen der Umladbarkeit der wandernden Partikel (8, S. 100f.) stiitzen diese Deutung des Beladungsmeehanismus bestens. Ffir den Fall yon Umladungen mittels Anelektrolyte k6nnte dann aueh eine, der A. Co~H~- sehen Regel entspreehende dielektrisehe Polarisation herangezogen werden. Wie sehlieftlieh unter Voraussetzung des Vorkommens semipermeabler Zellgrenzen aueh die Theorie E. G. I ) o ~ A ~ s die M6gliehkeit der Erklfirung elektriseher Aufladung yon Zellen in bestimmten Disi~ersionsmitteb~ gibt, wird sehon yon L/~E~S und G~Ys (5, S. 373f.) ausreiehend angedeutet.

7. E r w e i t e r t e A n w e n d b a r k e i t Yon K a t a p h o r e s e b e s t i m - m u n g e n . - - Wie unter der letzteren Annahme der Abh~ngigkeit der Beladung von einem DoNNAN-Gleichgewicht das elektrophoretisehe Vet- halten je naeh der M6gliehkeit des Zusammenwirkens mehrerer Ampholyte, welche in chemisehe Verbindung treten m6gen oder nicht, eine Mehrzahl v0n Nullpunkten der Bewegung (Stillstandszonen) aufweisen kann, ist erst kfirzlieh yon STEARN (11, S. 582f.) in analytisehen Betraehtungen abgeleitet worden. In der Tat ist in soleher Weise bei manchen Bakterien v0n C. E. A. WINsLow und seinen Mitarbeitern I. S. FALl:, 3g. F. CAVL- ~IESI), E. H. FSEESON, H. J. S~AUONESSY und M. F. UPTON auger im elektrophoretisehen IEP aueh noah in je einer andern Zone der Azidit~ts-

Kleine Beitr~ge zur Bestimmung des IEP von Protoplasten. V 601

skala beiderseits davon ein elektrophoretischer Stillstand konstatiert worden. Dabei mSgen die beiden letzteren Bereiehe wohl den von STEAI~ (11, S 584) untersuchten F~tllen einer LSsung hinl~nglieh hoher CH be:[ relativ niedriger Kationenkonzentration des Ampholyten und einem Medium gen~igend niedriger On (holler Con) bei verh~ltnismttl~ig geringer Anionenkonzentration des Ampholyten entspreehen. Solch ein A z i d it ~t t s- e f f e k t auf die kataphoretisehe Teilehenbewegung ist mir ebenso wie andern Autoren bei den h ie r untersuehten Objekten nieht entgegen- getreten. Das ist vermutlieh sehon aus ihrer ganz anderen Gr0f3enordnung zu erkl~tren, lrgendwelehe Sel~l~isse auf den A u f b a u aus v e r s e h i e d e n e n A m p h o l y t e n und auf deren ehemisehes Verhalten seheinen mir aus den negativen Ergebnissen also nieht bereehtigt.

Dagegen m6ehte die Methode vielleieht noeh eine Anwendung in ganz anderer Richtung erlauben. Es ist bekannt, wie schwierig und zu- gleieh unzuverl~ssig Bestimmungen der i n t r a p l a s m a t i s e h e n A z i d i t S t an lebenden Zellen noeh heute sind; die zahlreiehen FehlermSgliehkeiten und unvermeidbaren Ungenauigkeiten brauehen dem Kundigen nicht wiederholt zu werden. Wenn sieh die oft verwirkliehte Beziehung der Lage des IEP zur intrazellul~tren OH als kausal abh~tngig erweist, wof~ir die weiteren Beitr~tge dieser Serie wohl noeh Belege beibringen werden (vgl. aueh 7, S. 1578f.), so ht~tte man es in der Hand, dureh Ausf~ihrung des relativ einfaehen Kataphoreseversuehes aueh den sehwieriger bestimm- baren Weft der On in bestimmter Ann:~therung zu finden. In diesem Sinne best~ttigt beispielsweise das angeftihrte Ergebnis mit Saccharomyces- Zellen (S. 598f.) die ~meh neueren V ersuehen yon F. F. No~D und seinem Schaler S. lVfAnDII~ASSAN getroffene Entseheidung zugunsten der yon A. TalT und L. FJ~TC~E~ vertretenen Werte der intrazellul~tren C~ (s. Protoplasma 12, z172--473 u. NoaD, Erg. Enzymforseh. 1, 77, 98, 1932).

Das bier vorseh~vebende Ziel der Ermittlung nut des IEP sehliel3t eigentlieh die andere Aufgabe der B e s t i m m u n g des L a d u n g s w e r t e s aus. Es versteht sieh jedoeh, dal3 im Falle sistierter Kataphorese die C~ jener isotonisehen Puffergemisehe oder die Kationenkonzentration drei- wertiger Sehwermetallsalze (S. KozAwA u. a.) oder basiseher Farbstoffe (G. A. Baossa usw.) zugleich ein Mal3 far die urspr~ingliehe Ladung der Objekte ergeben (8, S. 99, 100; 9, S. 824, 826), Der Kolloidehemiker mag zwar bei seinem ganz andersartigen Material lieber unter Anwendung der HELM~OSTZ-PE~RINsehen Gleiehung (S. 591) zur direkten Ermittlung des g-Potentials sehreiten, abet far den Physiologen haben derartige Verfahren seit langem bereits ihre p r a k t i s e h e Brauchbarkeit erwiesen.

602 P f e i f f e r , Kleine Beitrgge zur Best immung des I E P yon Protoplasten. V

Zusammenfassung Neben einer Wfirdigung des mikro-kataphoret ischen Verfahrens ffir die gestellte

Aufgabe wird zuerst eine Ubersicht fiber die U n t e r s u e h u n g s a p p a r a t u r , fiber die zu beaehteuden F e h l e r q u e l l e n und fiber die benutzten U n t e r s u e h u n g s o b j e k t e und ihre Behandlungsweise gegebon. Das Verfahren von L. MICHAELIS wird kinsiehtlich der E l e k t r o d e n durch Vorsehlgge yon J. GICKL]tOR~ und K. U~RATIt, hinsichtlich der M i k r o k a m m e r durch Verwendung des E. BllSOlI'sehen Durchf]ulLObjekttrggers zu verbessern gesueht.

Die prakt ischen V e r s u c h e e r g e b e n ffir die naekten [~rotoplasten von Solanum nigrum den I E P bei einer CtI yon 1,6 . 10 - 5 oder wenig darunter , f fir jene yon Vitis vini/era in der Zone zwisehen 6,3 �9 l0 - 5 und 2,5 - 10 -5 . Der gesuehte Wert wird ffir die Stachelkngeln der beiden Nitella-~M'ten nach zwei versehiedenen Untersuchungsweisen i ibereinstimmend zu 1,6 �9 10 - 5 bis 3,2. 10 - 6 angenommen, wghrend er bei der unter- suel~ten unterg~irigel~ Rasse von Saccharomyces cerevisiae zwisehen 1,6- 10 - 5 und 2,2 �9 10 - 5 liegen dfirfte.

Die Diskussion ffihrt zu einer knappen [Tbersieht fiber die m6gliehen B e l a d u n g s - u r s a c h e n der Objekte und untersucht kurz die A n w e n d b a r k e i t des K a t a p h o r e s e - v e r s u c h e s ff ir w e i t e r e Z i e l e der Protoplasmaforsehung (analytiseh-chemiseher Aufbau der Objekte, ihre intrazellul~Lre Clt, Ladungswerg der Protoplasten).

L i t e r a t H r 1. F~E~nLICH, H., Capillarehemie, 2. Aufl., Leipzig, Akadem. Verlagsges., 1922. 2. GIeKLHOR~, J. und U~RAT~, K., Messung elektriseher Potentiale pflanzlicher Ge-

webe und einzelner Zellen. Protoplasma, 4, 228-~258, 1928. 3. H~USER, F., (Jber einen DurehfluB-Objekttr~tger. Bl~ttt. f. Unters.- u. Forsch.-

Instrum., 4, 37--38, 1930. 4. KELLE~, R., Die Elektrizit~t in der Zelle. 2. Aufl., M~hriseh-Ostrau, J. Ki t t l ' s

Nachf., 1925. 5. Li)m~s, H. und GEYS, K., Uber die Flockung tier Hefe. Koll.-Zeitschr., 30, 372

bis 376, 1922. 6. MICHA~LIS, L., Prakt ikum der physikalischen Chemie. 2. Aufl., Berlin, J . Springer,

1922. 7. PFEIFFER, H., Der isoelektrische Punk t (IEP) yon Protoplasten und seine Ermit t lung.

In: E. ABDERHALgE~, Handb. d. biol. Arbeitsmeth. (V), 2/~, 1563--1596, 1929. 8. - - Elektr izi t~t und Eiwei~e. (Wissensch. Forsch.-Ber., ~Naturw. Reibe, 21.) Dresden

1~. Leipzig, Th. Steinkopff, 1929. 9. -- The iso-eleotrie point of cells and tissues. Transact. Facaday Soe., 26, 822 bis

836, 1930. PISCm~OER, A., Die Lage des isoelektrischen Punktes histologischer Elemente als

Ursaehe ihrer verschiedenen F~rbbarkeit. Ztsehr. f. Zellf. u. mikr. Anat., 3, 169

bis 197, 1926. STEARN, ALLE~ ]~. und STEAI~SL ESTHER W., Metathetie equilibria of Bacterial

systems with special reference to Baeteriostasis and Bacterial floceulation. Proto- plasma, 12, 580--600, 1931.

THOR~TOSI, W. 1~[., The opposite electrification produced by animal and vegetable life. Prec. Roy. See. London (B), 82, 638--645, 1910.

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