(중온)일반세균 – 평판집락법

(ES 05702.1a) 김 재 건 교수

목차

1. 개요

1.1 목적

1.2 적용범위

2. 용어정의

3. 분석기기 및 기구

4. 시약

4.1.1 저온일반세균 배지 (R2A agar)

4.1.2 희석액

5. 시료채취 및 관리

6. 분석절차

7. 결과보고

• (중온)일반세균

: (35.0±0.5)℃에서

표준한천배지 or 트립톤 포도당 추출물 한천배지에

집락을 형성하는 모든 세균

2. 용어정의

2. 용어정의

1. 피펫 or 자동피펫 : 멸균된 부피 1mL~5mL의 용량피펫 or 자동피펫

(플라스틱팁 포함)

2. 페트리접시 : 멸균된 지름 약 9㎝, 높이 1.5㎝의 유리제품(65 ㎠)

or 1회용 플라스틱(57 ㎠)

3. 항온수조 : 수온 44~46℃ 유지 가능한 것 사용

3. 분석기기 및 기구

3. 분석기기 및 기구

4. 배양기 : 배양온도 (35.0±0.5)℃로 유지 가능한 것 사용

5. 집락계수기 : - 확대경과 조명장치 부착

- 페트리접시를 놓는 판에 1 ㎠로 구획이 그려진 것 사용

3. 분석기기 및 기구

3. 분석기기 및 기구

4.1 시약

중온일반세균 배지(Plate Count Agar)

증류수 1L + 표1or2의 조성대로 넣어 녹임

※ 한천 제외 ↓

pH를 (7.2±0.2)로 조정 ↓

한천을 넣음 ↓

가열 용해 ↓

121℃에서 15분간 고압증기멸균 (고압증기멸균기)

※ 가급적 상용화된 완성제품을 사용

4. 시약 및 표준용액

4.1 시약

4. 시약 및 표준용액

•먹는물, 샘물 및 염지하수에 존재하는 (중온)일반세균을

분석함에 있어 검사결과의 정확과 통일을 기하기 위해

필요한 제반사항에 대하여 규정함

1. 개요

1.1 목적

1.2 적용범위 •먹는물 수질기준 및 검사 등에 관한 규칙 제2조의

규정에 의한 먹는물의 수질기준에 규정된 먹는물, 샘물 및

염지하수의 수질검사에 적용

2. 인산완충희석액(KH2PO4)

KH2PO4 34g + 500mL 증류수에 녹임 ↓

0.5M NaCl 용액으로 실온에서 pH를 (7.2±0.2)로 조정 함

↓ 증류수 넣음

→ 전량 : 1L (보존용 원액)

↓ MaCl2∙6H2O 81.1g + 1L 증류수에 녹임

(염화마그네슘 용액) ↓

보존용 원액 1.25mL + 염화마그네슘용액 5.0mL + 증류수 넣음

→ 전량 : 1L

※ 인산완충희석액 : (99±2)mL or (9.0±0.2)mL 가 되도록 나선식 마개가 있는 희석병 or 시험관에 나누어 121℃에서 15분간 고압증기멸균

1. 펩톤희석액

증류수 + 펩톤용액 넣어 희석

→ 최종농도 : 0.1%

↓ 실온에서 pH가 (6.8±0.2)가 되도록 조정

※ 펩톤희석액 : (99±2)mL or (9.0±0.2)mL 가 되도록 나선식 마개가 있는 희석병 or 시험관에 나누어 121℃에서 15분간 고압증기멸균

4. 시약 및 표준용액

4.2 희석액

1. 멸균된 시료용기 사용, 무균적으로 시료를 채취, 즉시실험

※ 즉시 실험 불가의 경우 : 빛이 차단된 4℃ 냉장 보관 상태에서

24시간 이내에 시험

2. 잔류염소를 함유한 시료를 채취한 경우

: 시료채취 전 멸균된 시료채취 용기에

멸균한 싸이오황산나트륨용액을 최종농도 0.03% 되도록 투여

5. 시료채취 및 관리

5. 시료채취 및 관리

3. 수도꼭지에서 시료를 채취할 경우

: 수도꼭지를 틀어 2~3분 흘려 보낸 후 채취

☞수도꼭지에 부착물이 있을 경우 : - 부착물 제거

- 깨끗한 헝겊 or 휴지로 이물질을

제거 후 채취

※ 필요에따라 수도꼭지 입구를 화염멸균할 수 있음

4. 먹는샘물, 먹는해양심층수 및 먹는염지하수 제품수의 경우

: - 병의 마개를 열지 않은 상태의 제품을 뜻함

- 병에 넣은 후 12시간내 4℃를 유지한 상태에서 검사

※ 병의 마개가 열린 것은 사용 불가

5. 시료채취 및 관리

5. 시료채취 및 관리

① 시료를 희석액으로 펩톤액을 사용하여 평판의 집락수가 30~300개 사이가

되도록 희석하고 각 단계 희석액 1mL씩을 멸균된 페드리접시 2매에 넣음

② 삼각플라스크에 필요한 양만큼 증류수와 배지(PCA)를 혼합하고

마그네틱 바를 넣은 뒤 가열 교반기에 교반하며 가열

③ 시험관에 배지 12㎖씩 분주하고 시험관 캡을 꽉 닫지 않고

살짝 열린 상태로 Rack에 꽂아 호일로 멸균 중 시험관 캡이

분리되지 않도록 시험관의 윗부분을 감싼 뒤

autoclave(고압증기멸균기)에 넣어 멸균

(121℃ / 1.5atm / 15~20min)

6. 분석절차

6. 분석절차

④ 멸균이 되는 동안 항온수조에 온도(46℃)를 맞춰놓아

멸균 완료 후 배지가 굳지 않게 바로 사용할 수 있도록

준비하고 크린벤치에 실험 초자기구들을 세팅해 두고

Fan과 UV등을 작동시켜 무균상태로 준비

⑤ 멸균이 끝나면 실험 시작 전에 배지가 굳지 않도록

시험관을 항온 수조에 넣어 보관

6. 분석절차

6. 분석절차

⑥ 무균상태인 크린벤치(UV등을 반드시 끈 상태에서 실험 진행)에서

실험을 시작하는데 cold chamber에 보관되어 있는 Sample을

꺼내어 멸균수에 10-1부터 10-4까지 희석

⑦ micro pipette으로 Sample 1㎖(1,000㎕)를 취해 각각9㎖씩

멸균 희석수가 담겨 있는 시험관에 단계별로 희석

※ 다음 단계로 넘어갈 때마다 voltex 사용

6. 분석절차

6. 분석절차

⑧ 단계희석한 sample을 1㎖(1,000㎕)를 취해 petri dish에

분주하고멸균한 배지를 부어 혼합(∞모양으로 혼합할 것)하여

굳힌 뒤 배양조건에 맞는 incubator에 도치배양

[ PCA : 35.0±0.5℃ / 48±2hr ]

단, 샘물, 먹는샘물, 염지하수는 24±2hr

⑨ colony counter를 이용해 집락수를 세고 기록

6. 분석절차

6. 분석절차

6. 분석절차 - 판정방법 • 음성대조군

: ① 음성대조군 시험으로 멸균된 희석액을 상기 방법과 동일하게 실험하여 음성대조군으로 함

② 시험결과 : 음성으로 나왔을 경우에만 유효한 결과 값으로 판정

• 계수할 경우

☞ 원칙 - 확산집락 X , 평판당 30개∼300개의 집락을 형성한 평판을 택함

: ① 평판마다 300개 이상의 집락이 형성되었을 경우 : 가장 대표적인 평판을 택하여 밀집평판측정법에

따라 집락수를 계산

② 평판마다 30개 이하의 집락이 형성되었을 경우 : 원액을 접종한 평판의 집락을 계수하여 평균하여 기재

③ 30개～300개의 집락을 가지는 평판이 없고 300개 이상의 집락을 가지는 평판이 1개 이상 존재하는 경우

: 300개에 가장 가까운 평판의 집락을 계수한다.

• 계산방법 : ① 안지름 9 cm의 유리 페트리접시를 사용한 경우

: 1 cm2내의 집락수를 13군데에서 계수하여 평균한 집락수에 65를 곱함

② 1회용 플라스틱 페트리접시를 사용한 경우 : 57을 곱함

※ 시료의 희석조작부터 평판용 배지를 페트리접시에 나누어 넣을 때까지의 조작시간은 20분을 초과하지 않아야 함

6. 분석절차

•결과의 표기 - (중온)일반세균수(CFU) : 해당 희석배수에 사용된 각 평판 내의 집락수를 측정,

합한 후 사용한 평판수로 나누어 평판당 평균집락수를 구하여

여기에 해당 희석배수를 곱한 수치

- 표기 : (중온)일반세균수(CFU)/mL

- (중온)일반세균수가 100이상일 경우 : 높은 단위 숫자로부터 3단계 이하는

사사오입하여 유효숫자를 2단계로 끊어

그 이하를 0으로 한 수치를 mL 중의

저온일반세균수로 기재

- 저온일반세균수가 100미만일 경우 : 소숫점 이하는 버린 수치를 mL 중의

저온일반세균수로 기재

7. 결과보고

7. 결과보고