Upload
meryl
View
44
Download
5
Embed Size (px)
DESCRIPTION
KÖRNYEZETVÉDELMI BIOTECHNOLÓGIA. BIODEGRADÁCIÓ, BIOREMEDIÁCIÓ. A környezet alkotó elemei egymással szoros összefüggésben léteznek, az egyes elemekre h ató ártalmak a környezet egészére kihatnak. Ha a fennálló egyensúlyt megbontjuk, - PowerPoint PPT Presentation
Citation preview
KÖRNYEZETVÉDELMI KÖRNYEZETVÉDELMI BIOTECHNOLÓGIABIOTECHNOLÓGIA
BIODEGRADÁCIÓ, BIOREMEDIÁCIÓ
A környezet alkotó elemei egymással szoros összefüggésben léteznek,az egyes elemekreható ártalmak a környezet egészére kihatnak. Ha a fennálló egyensúlyt megbontjuk,beláthatalan környezetvédelmi problémákkal találhatjuk szembe magunkat.
Fejlődő ipar felhalmozódó hulladék
veszélyes anyagok
A Föld mikroflórájának válasza az újonnan megjelenő anyagokra adaptáció
Alapfogalmak
biotechnológia
“biotechnologie - (EREKY Károly, 1917) all work by which products are produced from raw materials with the help of living organisms” [Ereky]
alkalmazott mikrobiológia
- biokonverzió, biotranszformációkülönböző (toxikus) vegyületek mikrobiális
átalakítása
- biodegradáció nem kívánatos, környezetre káros anyagok
lebontása mikrobiális úton
- bioremediáció (= tisztítás) a környezet megtisztítása a toxikus hulladékoktól
mikrobiális módszerekkel
környezetvédelem
- megelőzés- tervszerű környezetfejlesztés- környezetünk megóvása, védelme
A biotechnológiai eljárások szempontjából legfontosabb enzimek
• oxidázok, hidroxilázok, dehydrogenázok • reduktázok, hydrogenázok• hidrolázok• izomerázok• proteázok, lipázok
A biotechnológiában fontos mikroorganizmus csoportok
• Metanogének• Metilotrófok• Clostridiumok• Tejsav baktériumok• Bacillusok• Pseudomonasok• Fotoszintetizáló baktériumok, algák• Streptomycesek• Élesztők• Fonalas gombák
Metanogének:• archea• obligát vagy strict anaerobok• biogáz
Metilotrófok:• aerobok• C1-C3 szénforrások hasznosítása• pl. Metanotrófok metán oxidáció
Clostridiumok:• obligát anaerobok• Gram pozitívok• hőstabil endospóra• rendkívül sokféle reakcióra képesek
Tejsav baktériumok:• anaerobok• Gram pozitívok• élelemiszeripar
Bacillusok:• aerobok• endospóra• extracelluláris enzimek
Pseudomonasok:• aerob• heterotróf, Gram negatívok• exopoliszaharidok• biodegradáció
Fotoszint. baktériumok, algák:• aerob vagy anaerob• biopolimerek• Fotoszintézis, CO2 fixálás
Streptomycesek:• aerob, spórázó szervezetek• antibiotikum termelők• extracelluláris enzimek
Élesztők:• alkoholgyártás• pékélesztő
Fonalas gombák:• heterotróf eukaryota• szaprofita vagy parazita• jellegzetes sejtfal• spóraképzők• antibiotikumok• biokonverzió
XENOS = IDEGEN SZINTETIKUS = NEM TERMÉSZETES
EREDETŰ
Példák: peszticidek, herbicidek, oldószerek, egyes szerves vegyületek
Lebontásukra megoldás: - fizikai - kémiai módszerek
- biológiai
Az 1960-as évek elején felfedezték, hogy számos talajlakó mikroorganizmus képes a xenobiotikumok bontásáraEgyféle szennyezés ritkán fordul elő, ált. vegyes hulladék
sokféle enzim, mikroorg. szükséges
Legproblémásabb vegyületek az aromás, valamint halogén elem tartalmú vegyületek
Szerves oldószer hatása az organizmusra
egyik fő támadáspont a membrán
ahogy az oldószer akkumulálódik a membránban sérülnek annak funkciói:
1, aspecifikus permeabilizáció
E. coli : fenol jelenlétében ATP és K+ szabadul ki a sejtekből
toluol hatására RNS, foszfolipid és fehérje szivárgás
2, H+ és más ionok passzív áramlása membránon keresztül
sérül az ATP szintézis
3, membránban lévő fehérjék funkciója is sérül
4, megváltozik, nő a membrán fluiditása változik a membrán struktúrája, stabilitása és
membránon belüli kölcsönhatások
membránfelszín hidrációs tulajdonságai változnak
membrán vastagság változik
membrán felszín növekedés
védekezési mechanizmusok törzsről törzsre változnak
I. Citoplazma és külső membrán adaptáció: mind lipid mind fehérje szinten
cél: szolvens által megzavart membrán fluiditásának, stabilitásának újrateremtése
I/1. zsírsav összetétel
- megváltozik telített és telítetlen zsírsavak aránya
alkohol és aceton növelitelítetlen zsírsavak arányát a membránban
apoláris oldószerek pl. benzol csökkenti
szaturáció változás fluiditás változás szolvens hatását kompenzálja
"homoviszkózus adaptáció"
- membránban telítetlen zsírsavak cis trans izomerizációja
emeli a membrán rendezettségét és csökkenti a fluiditást
Adaptációs mechanizmusok
I/2. változik lipidek fejcsoportjainak összetétele
P. putida: difoszfatidil-glicerol (kardiolipin) aránya nő
P. putida Idaho: foszfatidiletanolamin nő
I/3. foszfolipid szintézis fokozódik
I/4. változik fehérje összetétel
I/5. lipopoliszacharid összetétel változás külső membránban
magának lipopoliszacharidoknak és lipoproteineknek is nő a mennyisége
LPS hidrofóbicitás csökkentő hatása van
I/6. külső membrán porinjai
P. putida OmpL mutáns: hiperszenzitív szolvensekre
P. aeruginosa OmpF hiány növeli a toleranciát
I/7. zsíroldékony vegyületek
Zymomonas mobilis: etanol jelenlétében hopanoidok mennyisége nő
Staphylococcus aureus: olajsav jelenlétében karotenoid szintézis nő
II. sejtfelszín hidrofóbicitás
csökkenése növeli a szolvens toleranciát
P. putida toluol adaptáció után sejtek felszíne kevésbé hidrofób (sok fehérje és LPS) III. ionok stabilizáló szerepe
Mg2+, Ca2+ stabilizálják Gr(-)-ok külső membránját pl.: Pseudomonas sp. - toluol
IV. Szerves oldószerek degradációja vagy kevésbé toxikus formává való transzformációja
V. Aktív exkréció a sejtből
bioremediáció
új, szerves oldószerekben stabil proteázok, lipázok egyéb enzimek
Biotechnológiai potenciál
A biodegradációs eljárásokban legismertebb,leggyakrabban előforduló mikroorganizmusok
PseudomonasokSphingomonasokRhodococcusok
BacillusokSugárgombák
A (szubsztituált) aromás szerves oldószerek lebontásáraaz oxigenáz, dehalogenáz enzimek alkalmasak
LEBONTÁSI ÚTVONAL LEHET AEROB, ANAEROB
aerob: mono- és dioxigenázok
anaerob: reduktív dehalogenáció, oxidált vegyületek: szulfát, nitrát
Aerob vs. anaerob metabolizmus
Aanerob metabolizmus benzoil-CoA-n keresztül
Benzoil-CoA konverziója acetil-CoA-vá
Monooxigenázok (hidroxilázok)
Monooxigenázok:
az O2 molekula egyik atomját építik be a célmolekulába
SH2 + O2 = SO + H2O (internal monooxigenáz, a szubsztrátról jön az elektron)
S + O2 + H2X = SO(H) + OH-_ + X (external monooxigenáz)
Példák:
- p-hydroxybenzoát hydroxiláz család
- phenol 2-hidroxiláz
- alkil csoport hidroxiláz (metán monooxigenáz)
- kámfor 5 monooxigenáz (Citokróm P-450 család)
Dioxigenázok, hidroxilázok
Y
X4-X-dihidroxihexadién
O2
NADH+H NAD+
H
OH
O
X
+
Sztereospecifikus hidroxilálás
enzimatikus szintézisek
hidroxiláz4-X-katekolát
H
OH
O
X
Aromás gyűrű hidroxilázok
Aromás gyűrűt hasító dioxigenázok
R
OH
OH
+ O2
COOHCOOH
R
intradiol cleaving/ 3,4-dioxygenases
CHO
R
OH
COOH proximal-extradiol cleaving/ 2,3-dioxygenases
COOHCHO
OH
R
distal-extradiol cleaving/ 4,5-dioxygenases
Mono- és dioxigenáz családok I.
Mono- és dioxigenáz családok II.
Mono- és dioxigenáz családok III.
METANOTRÓFOK: MMO=metán monooxigenáz
CH4
NADH+H+
O2
H2O
NAD+
O2
H2O
Xox
Xred
sMMOpMMO
CH3OH
Két fajta enzim: membrán kötött (pMMO, Cu+), citoplazmatikus szolubilis (sMMO, Cu-)
A metán oxidációja mellett NADH oxidáció (regenerálni kell)
sMMO: széles szubsztráspecificitás több száz szerves vegyület oxidációja
bioremediációtovábbi alkalmazás: metanolgyártás
Dioxigenázok, hidroxilázok
Y
X4-X-dihidroxihexadién
O2
NADH+H NAD+
H
OH
O
X
+
Sztereospecifikus hidroxilálás
enzimatikus szintézisek
hidroxiláz4-X-katekolát
H
OH
O
X
Aromás gyűrű hidroxilázok
Aromás gyűrűt hasító dioxigenázok
R
OH
OH
+ O2
COOHCOOH
R
intradiol cleaving/ 3,4-dioxygenases
CHO
R
OH
COOH proximal-extradiol cleaving/ 2,3-dioxygenases
COOHCHO
OH
R
distal-extradiol cleaving/ 4,5-dioxygenases
Aromás gyűrűt oxidáló hydroxilázok
Hydroxilázok szerepe a bioorganikus kémiában
Sphingomonas yanoikuyae
biphenil dioxigenáz
sztereoszelektív szintézisek
például még a morfin,
vagy a vanília szintézisében is
Hidroxilázok szerepe a biodegradációban
Hidroxilázok szerepe a klórozott vegyületek biodegradációjában
Az aromás diolok eddig ismert lebontási útvonalai
intradiol
extradiol
A gyűrűhasítás mechanizmusa
Szubsztituált (klórozott) szénhidrogénekre módosított ortho
útvonal
Szubsztrátspecificitás
Nem adaptált sejtek (periférikus útvonal)
Adaptált sejtek (periférikus útvonal)
Szubsztrátspecificitás II.
Centrális útvonal, specializálódott sejtek
ezt az adott útvonal minden enzimjére meg kellene vizsgálni
az útvonal mentén a specificitás változik
az enzimek specfificitását bővíteni kell
Szubsztrátspecificitás bővítése
a sejtek adaptációja, hosszú idő (6 – 8 hónap)
irányított evolúció
az útvonalak kombinálása egyesével, vagy...
Plasmid Size (kb) Conjugative Incompatibility group Substrate Host Reference
Peripheral pathways
TOL 117 + P-9 Xylenes, toluene, toluate Pseudomonas putida
9
9, 100 100, 101 101, 102 102, 172 172
NAH7 83 + P-9 Naphthalene via salicylate Pseudomonas putida
9
9, 37 37, 101 101, 139 139, 180 180, 181 181
pWW60-1 87 + P-9 Naphthalene via salicylate Pseudomonas sp.
17
17
pDTG1 83 + P-9 Naphthalene via salicylate Pseudomonas putida
145
145
SAL1 85 + P-9 Salicylate Pseudomonas putida
9
9, 22 22, 101 101, 180 180, 181 181
pKF1 82 ND Biphenyl via benzoate Acinetobacter sp. (reclassified
5
5, 53 53
as Rhodococcus globerulus)
pWW100 200 ND Biphenyl via benzoate Pseudomonas sp.
105
105
methylbiphenyls via toluates
pWW110 >200 ND ND Biphenyl via benzoate Pseudomonas sp.
18
18
methylbiphenyls via toluates
pCITI 100 ND ND Aniline Pseudomonas sp.
2
2
pEB 253 ND ND Ethylbenzene Pseudomonas fluorescens
12
12
pRE4 105 ND ND Isopropylbenzene Pseudomonas putida
38
38, 39 39
pWW174 200 + ND Benzene Acinetobacter calcoaceticus
175
175
pHMT112 112 ND ND Benzene Pseudomonas putida
157
157
pEST1005 44 ND ND Phenol Pseudomonas putida
94
94
pVI150 mega + P-2 Phenol, cresols, Pseudomonas sp.
8
8, 146 146
3,4-Dimethylphenol
Central pathways
pAC25 117 + P-9 3-Chlorobenzoate Pseudomonas putida
26
26
pJP4 77 + P-1 3-Chlorobenzoate, 2,4-D Ralstonia eutropha (formerly
33
33
Alcaligenes eutrophus)
pBR60 85 + ND 3-Chlorobenzoate Alcaligenes sp.
179
179
pRC10 45 ND ND 2,4-D Flavobacterium sp.
28
28
pP51 100 ND 1,2,4-Trichlorobenzene Pseudomonas sp.
165
165
pMAB1 90 ND ND 2,4-D Burkholderia (formerly
14
14
Pseudomonas cepacia
aND, not determined; 2,4-D, 2,4-dichlorophenoxyacetate.
A gének sokszor (mega)plazmidon vannak
Operon struktúrák
bifenil bontás
benzoesav bontás
módosított orto útvonal
Szabályozás
a transzkripciós faktor szubsztrátspecificitása
Metabolikus útvonalak kombinálása keresztezéssel
1. plazmid 2. plazmid 3. plazmid 4. plazmid
Plazmidrekombináció
konjug.
A törzs
Strain G
F törzsE törzs
D törzsC törzsB törzs
konjug.
konjugáció
Problémák azért még vannak