VILNIAUS GEDIMINO TECHNIKOS UNIVERSITETAS

Saulius Grigiškis

Kompleksinių biotechnologinių procesų kūrimo ir taikymo aplinkosaugoje

tyrimai

Mokslo darbų apžvalga Technologijos mokslai

Chemijos inžinerija (05T) Biotechnologija (T490)

Vilnius „Technika“ 2011

2

Saulius Grigiškis. Kompleksinių biotechnologinių procesų kūrimo ir taikymo aplinkosaugoje tyrimai: mokslo darbų apžvalga. Vilnius: Technika, 2011. 48 p.

Mokslo darbų apžvalgos įvade pateikiamos nagrinėtos problemos ir jų aktualumas, tyrimų tikslas ir uždaviniai, tyrimo metodai ir darbo rezultatų aprobavimas. Apžvalgos skyriuose aptarti kompleksinių biotechnologinių procesų kūrimo ir taikymo aplinkosaugoje tyrimo rezultatai. Pirmajame skyriuje nagrinėjamas naftos angliavandeniliais užteršto grunto ir vandens valymas naftos teršalus skaidančiais mikroorganizmais. Antrajame skyriuje aptarti būdai, leidžiantys pa-greitinti angliavandenilių skaidymą mikroorganizmais. Taip pat išnagrinėtos galimybės sukurti biologinės kilmės paviršiaus aktyviąsias medžiagas ir pagreitinti naftos teršalų skaidymą; sukurti kompleksinę naftos angliavandeniliais užteršto grunto ir vandens valymo tech-nologiją. Trečiajame skyriuje apžvelgti riebalinės taršos valymo mikroorganizmais aspektai, kurie buvo pritaikyti vamzdynų valymo nuo riebalinės taršos bei riebalų kompostavimo tyrimuose. Be to, sukurti įvairių formų imobilizuoti fermentiniai preparatai, ne tik pagreitinantys riebalinių teršalų skaidymą, bet ir tinkantys naujų produktų sintezei. Apžvalgos pabaigoje apibendrinti gauti rezultatai ir suformuluotos tolesnių tyrimų kryptys.

VGTU leidyklos TECHNIKA 1901-M mokslo literatūros knyga http://leidykla.vgtu.lt

ISBN 978-609-457-033-9

© Saulius Grigiškis, 2011 © VGTU leidykla TECHNIKA, 2011

3

TURINYS ĮVADAS ............................................................................................................. 4

Nagrinėjamos problemos ir jų aktualumas .............................................. 4

Tyrimų tikslas ir uždaviniai ....................................................................... 7

Mokslinis naujumas ..................................................................................... 7

Tyrimų metodai ........................................................................................... 9

Darbo rezultatų aprobavimas .................................................................... 9

1. NAFTOS ANGLIAVANDENILIŲ BIOLOGINIO SKAIDYMO TYRIMAI ....................................................................................................... 9

1.1. Mikroorganizmų atranka ir kultivavimo sąlygų optimizavimas ..................................................................................... 10

1.2. Aplinkos sąlygų įtaka užterštos aplinkos biologiniam valymui ................................................................................................ 16

2. NAUJOS KOMPLEKSINĖS NAFTOS ANGLIAVANDENILIAIS UŽTERŠTO GRUNTO BIOLOGINIO VALYMO TECHNOLOGIJOS SUKŪRIMAS .............................................................................................. 20

2.1. Biologinės kilmės paviršiaus aktyviųjų medžiagų taikymas gruntui nuo naftos teršalų plauti ...................................................... 21

2.2. Biotechnologinių procesų principinės schemos ir sukurtos inovatyviosios naftos teršalų skaidymo technologijos aplinkosauginės naudos analizė ....................................................... 25

2.3. Aplinkos, užterštos naftos teršalais, valymas in situ ...................... 29

3. RIEBALINIŲ TERŠALŲ BIOLOGINIS SKAIDYMAS ........................... 31

3.1. Riebalinius teršalus skaidančių mikroorganizmų atranka ir kultivavimo sąlygų optimizavimas .................................................. 31

3.2. Kanalizacijos vamzdžių valymo nuo riebalinės taršos tyrimai .... 34

3.3. Riebalinių teršalų kompostavimas ................................................... 36

GAUTI REZULTATAI, IŠVADOS IR JŲ PRAKTINĖ REIKŠMĖ .............. 39

TOLESNIŲ TYRIMŲ KRYPTYS ................................................................... 40

PROCEDŪRAI TEIKIAMŲ MOKSLO DARBŲ SĄRAŠAS ...................... 41

CREATION, INVESTIGATION AND APPLICATION OF COMPLEX BIOTECHNOLOGICAL PROCESSES FOR ENVIRONMENTAL PROTECTION .............................................. 46

Summary ..................................................................................................... 46

4

ĮVADAS Nagrinėjamos problemos ir jų aktualumas Besivystant pramonei, buvo sukurta daug naujų produktų, kurie tiek pagerina, tiek ir pablogina žmonių gyvenimą. Šiuo metu jau egzituoja taršos, kurios veikia žmogaus gyvenimo kokybę, sveikatos būklę, o kartu ir gyvenimo trukmę. Sunku įvertinti tokios taršos poveikį, dažnai jis pastebimas tik vėlesnėse kartose. Metodikų nustatyti kenksmingą poveikį daugeliu atvejų nėra sukurta, paprastai nėra galimybės atsisakyti kenksmingų produktų, nes nėra alternatyvų juos pakeisti.

Viena iš taršos rūšių, su kuria dažniausiai susiduriama, yra tarša nafta ir jos produktais. Išgavus naftą, ji vežama dideliais atstumais, dėl to padidėja avarijų tikimybė, o jos panaudojimas sukelia šiltnamio efektą didinančių dujų išsiskyrimą, kas veikia įvairių regionų ekologinę būklę. Nustatyta, kad per metus vien tanklaivių avarijose prarandama apie 1 mln. t naftos produktų, iš kurių 1/3 yra lengvosios frakcijos, kurios išgaruoja į aplinką, o kita dalis patenka į krantą ar nuskęsta jūrose. Naftos perdirbimo metu, valant ją nuo pašalinių medžiagų, susidaro naftos šlamas. Tai – daugiausia sunkiosios naftos angliavandenilių frakcijos, absorbuotos durpėse ar grunte. Taip pat susidaro dideli nafta užteršto vandens kiekiai, kuriuos sunku išvalyti. Vos patekę į aplinką, naftos produktai tampa grėsmingu teršalu, naikinančiu visa, kas gyva, taip pat ir žmogų. Yra daugybė naftos produktų rūšių, pasižyminčių skirtingomis savybėmis. Nevienodas ir jų kenksmingumas aplinkai. Pavojingiausi yra lakieji, aplinkoje greitai išsisklaidyti gebantys naftos produktai. Tai – benzinas, žibalas, dyzelinas ir kiti skystos konsistencijos produktai. Kietojo fizinio būvio naftos produktai, tokie kaip bitumas, aplinkai mažai arba visiškai nepavojingi, todėl kalbant apie naftos produktus toliau bus aptartos tik skystojo būvio atmainos. Naftos angliavandeniliais užterštas gruntas ir vanduo yra valomi fizikiniais (grunto terminis apdorojimas), cheminiais (naudojant teršalus oksiduojančias medžiagas) ar biologiniais (skaidant naftą ją oksiduojančiais mikroorganizmais) metodais. Tačiau, gruntą

5

valant biologiniu būdu, ne visada pasiekiamas norimas rezul-tatas, nes naftos teršalus oksiduojančių mikroorganizmų efekty-vumui įtakos turi sezoniniai temperatūros pokyčiai ir per didelės naftos teršalų koncentracijos jame. Vis plačiau taikomas fitoatkūrimo metodas, naudojant augalus naftos teršalams šalinti iš grunto, kadangi šis valymo būdas reikalauja mažiau sąnaudų nei kiti biologinio valymo metodai. Taikant fitoatkūrimą, užterštas gruntas prieš tai turi būti papildomai valomas, kad naftos teršalų koncentracijos sumažėtų iki optimalių augalams vegetuoti. Naftą skaidančių mikroorganizmų paiešką ir atranką tyrė įvairių šalių mokslininkai: Zo Bell (nuo 1946 m.), R. M. Atlas, R. Bartha, V. N. Diadechko, L. E. Hallas, B. Kimura, M. Mu-rakami, M. D. Lee ir kt. (Čipinytė, Grigiškis 2000). Lietuvoje aplinkos valymo nuo naftos teršalų darbai pradėti tik atkūrus nepriklausomybę. Pradėti Taikomosios enzimologijos mokslinių tyrimų institute ir vėliau tęsiami mokslinėje gamybinėje UAB „Biocentras“. Didėjant aplinkos valymo darbų apimtims, iškyla poreikis juos optimizuoti. Tik naujų kompleksinių ir ekologiškų grunto bei vandens valymo nuo naftos teršalų procesų kūrimas ir tyrimai leidžia išspręsti iškilusias problemas.

Kita šiuo metu pramonėje ir buityje aktuali problema yra riebalinė tarša. Europos Sąjungos valstybėse perdirbant mėsą, žuvį ir spaudžiant aliejų, į nuotekas patenka dideli vandenyje ištirpusių ir jo paviršiuje plaukiančių riebalų, aliejaus ir kraujo kiekiai. Per didelės šių teršalų koncentracijos stabdo nuotekų valymo biologinius procesus. Tai ypač aktualu Lietuvoje ir kitose Šiaurės rytų Europos regiono valstybėse, kuriose dėl sezoninių oro temperatūrų kaitos biologiniai procesai vyksta sudėtingomis sąlygomis ir lėčiau. Nuotekų valymą biologinio valymo įrengi-niuose ir riebalų koncentraciją juose griežtai reglamentuoja teisės aktai. Perdirbant mėsą ir žuvį bei spaudžiant aliejų, iškyla ne tik nuotekų valymo, bet ir dėl vamzdynų sienelių uždumblėjimo kylančių problemų, o susidaręs riebalinis dumblas apskritai neutilizuojamas. Įvairios kilmės riebalų biologinis skaidymas priklauso nuo riebalų sudėties, riebalų rūgščių struktūros ir nuo mikroorganizmų sintetinamų riebalus skaidančių fermentų

6

savitumo. Mikroorganizmų panaudojimo riebalinių teršalų utilizavimo problemoms spręsti galimybes jau seniai nagrinėja įvairių šalių mokslininkai: Y. Matsumiya, H. K. Shong, D. Hora-kova, A. M. Brooksbank, O. Bhumibhamon, J. L. Tisinger, G. R. Lemus, T. Suzuki (Čipinytė, Grigiškis, Baškys 2009). Tačiau šios problemos sunkiai sprendžiamos, jei naudojami tik vienos krypties biotechnologiniai procesai. Perspektyviau yra tirti biotechnologinius riebalinių teršalų utilizavimo procesus, juos kompleksiškai sujungiant ir kuriant naujos kartos technologijas, leidžiančias valyti riebalais užterštą gruntą ir vandenį, riebalines atliekas utilizuoti kompostuojant bei valyti riebalais užterštus vamzdynus. Riebalinių teršalų skaidymo procesams katalizuoti fermentai lipazės dar nėra plačiai taikomos dėl jų ypatumų ir įvairių priedų būtinumo. Nors lipazės sudaro nedidelę dalį visų pramoniniu būdu gaminamų fermentinių preparatų, tačiau savo pritaikymo galimybėmis pranoksta daugelį kitų biokatalizatorių. Įvairių adsorbentų panaudojimas, imobilizavimo ir katalitinio veikimo sąlygų optimizavimas išplėstų lipazių praktinio taikymo galimybes.

Kompleksiniai biotechnologiniai procesai aplinkosaugoje kuriami naudojant biosintezės, biologinio skaidymo ar biokatalizės metodus. Biosintezė – tai biologinis procesas, kai mikroorganizmai, naudodami augimui mitybinės terpės medžiagas, konvertuoja jas į kitus junginius. Šio proceso produktais gali būti ląstelės, fermentai ar kitos biologiškai aktyvios medžiagos, kurie gali būti panaudoti taršos biologinio skaidymo arba biokatalizės procesuose. Biolo-ginio skaidymo procesams galima naudoti tiek pačius mikroor-ganizmus, tiek ir iš jų išskirtas biologiškai aktyvias medžiagas. Biokatalitinių procesų metu dažniausiai naudojami iš mikroor-ganizmų išskirti fermentai. Aplinkai valyti nuo skirtingos kilmės teršalų kuriamos kompleksinės biotechnologinės sistemos, kurios kartu sujungia tiek biosintezės ir biologinio skaidymo ar biosintezės ir biokatalizės procesus, tiek ir visas sistemas.

7

Tyrimų tikslas ir uždaviniai Apžvalgoje pristatomų mokslo darbų tikslas – sukurtų biotechnologinių procesų sujungimas, kuriant kompleksines technologijas, skirtas gruntą ir vandenį valyti nuo naftos teršalų ir aplinką – nuo riebalinių teršalų, bei atlikti jų optimizavimo ir praktinio taikymo tyrimus.

Šiam tikslui pasiekti buvo sprendžiami tokie uždaviniai: − grunto ir vandens valymo nuo naftos angliavandenilių

biologinio skaidymo būdu tyrimai; − biologinės kilmės paviršiaus aktyviųjų medžiagų sukū-

rimas, jų savybių ir taikymo grunto plovimui nuo naftos teršalų tyrimai;

− grunto ir vandens valymo nuo naftos teršalų kompleksinės technologijos sukūrimas;

− riebalinės taršos biologinio skaidymo tyrimai; − kompleksinės vamzdynų valymo nuo riebalinių teršalų

biotechnologijos sukūrimas ir jos praktinio taikymo tyri-mai;

− riebalinių teršalų kompostavimo technologijos sukūrimas ir jos praktinio taikymo tyrimai.

Mokslinis naujumas Iš atrinktų naftą oksiduojančiųjų mikroorganizmų sudarytos naujos kompozicijos, gebančios efektyviai skaidyti naftos angliavandenilius, ir sukurta šių mikroorganizmų dauginimo technologija. Įvertinta žemų temperatūrų įtaka ir konstatuota, kad po užšaldymo mikroorganizmai išlieka gyvybingi, o patekę į palankias sąlygas dauginasi ir pasiekia tokį patį lygį kaip ir nešaldyti, bet nepraranda gebėjimo oksiduoti naftą. Tai leidžia efektyviau panaudoti mikroorganizmus, valant didelius kiekius grunto nuo naftos teršalų, kai procesai trunka ilgiau nei metus.

Atrinkti biologinės kilmės aktyviąsias paviršiaus medžiagas sintetinantys mikroorganizmai. Sukurta nauja naftos teršalų išplovimo iš grunto technologija. Ištirtas naftos plovimo iš grunto

8

mechanizmas ir sukurta ekonomiška, optimali ir ekologiška naftos angliavandenilių išplovimo iš grunto technologija.

Pagal toleranciją naftos teršalams buvo įvertinti grunto fitoatkūrimui geriausiai tinkantys augalai.

Sukurta kompleksinė naftos teršalų valymo iš grunto technologija ex situ, apimanti mikroorganizmų biosintezę, biologinės kilmės paviršiaus aktyviųjų medžiagų panaudojimą naftos angliavandeniliams išplauti ir pradinei teršalų koncentracijai sumažinti. Ir tokiu būdu pagreitinti likusių teršalų skaidymą ir grunto fitoatkūrimą.

Sukurtas sorbento – naftą skaidančių mikroorganizmų darinys. Tam tikslui atrinktas mikroorganizmas, gebantis ne tik skaidyti naftos teršalus, bet ir sintetinti biologinės kilmės paviršiaus aktyviąsias medžiagas. Tai pritaikyta senos taršos ir technologinių procesų metu susidarančioms atliekoms, kuriose likę daugiausia sunkūs angliavandeniliai, valyti in situ. Įvertintos kompozicijos galimybės padidinti teršalų bioprieinamumą mikroorganizmams ir gebėjimą surišti migruojančiąją naftos angliavandenilių frakciją.

Atrinkti mikroorganizmai, gebantys skaidyti įvairios sudėties riebalus ir sintetinti fermentą lipazę. Sukurta nauja mišrioji kultūra ir jai padauginti – periodinis kultyvavimo būdas su pamaitinimu.

Nustatyti optimalūs vamzdynų valymo nuo riebalinės taršos parametrai ir konstatuota, kad po valymo vamzdžiuose likę riebalus skaidantieji mokroorganizmai suformuoja bioplėvelę, neleidžiančią susidaryti naujiems riebalų kamščiams vamzdžiuose.

Sukurta nauja kompleksinė ir pažangi taršos prevencijos požiūriu riebalinių teršalų biologinio skaidymo technologija, apimanti vandens valymo, kompostavimo ir fitoatkūrimo procesus.

Apie darbo mokslinį naujumą byloja trys patentai.

9

Tyrimų metodai Biotechnologinių procesų analizei bei jų taikymo galimybių tyrimams buvo naudojami biologiniai, cheminiai, biocheminiai ir analitiniai metodai. Procesams optimizuoti buvo taikoma reak-cijos paviršiaus metodologija ir matematiniai optimizavimo metodai, duomenims apdoroti ir grafiškai pateikti naudota Origin programa, pateikiant eksperimentų rezultatus, nurodytas aritmetinis vidurkis plius/minus standartinis nuokrypis. Darbo rezultatų aprobavimas Pagrindiniai darbo rezultatai pristatyti respublikinėse ir tarptautinėse konferencijose: International conference „Microclimate and physics of soil: problems, ecology education“. 1997. Kaunas; The First International Congress of Petroleum, Contaminated Soils, Sediments and Water. 2002. London; International conferences Ecobalt. 2002, 2003, 2004, 2005, 2007. Riga; International conference „Biotechnical functionalization of renewable polymeric materials“. 2009. Elba, Italy; The 7th and 8th International Scientific and Practical conferences „Environment, Technology. Resources“. 2009, 2011. Rezekne, Latvia.

Iš viso autorius paskelbė 70 mokslo publikacijas. 1. NAFTOS ANGLIAVANDENILIŲ BIOLOGINIO SKAIDYMO TYRIMAI Nafta sudaryta iš kelių tūkstančių skirtingų organinių junginių, kurie yra skirstomi į: sočiuosius (n ir izoalkanai, cikloparafinai), aromatinius (mono-, di- ir daugiacikliai aromatiniai junginiai), angliavandenilius, dervas, asfaltenus. Pagal virimo temperatūrą naftos frakcijos yra skirstomos į: benziną (iki 180 °C) , žibalą (150–300 °C), dyzeliną (200–350 °C), tepalus (325–510 °C).

Dėl cheminių junginių įvairovės ir skirtingo jų toksiškumo naftos angliavandeniliai yra vieni pavojingiausių organinių teršalų, veikiančių ekosistemą. Naftos angliavandeniliais užterš-tai aplinkai valyti taikant biotechnologinius metodus, susiduria-

10

ma su skirtingomis aplinkos sąlygomis, tokiomis kaip tempera-tūra, deguonies koncentracija, pH, drėgmė. Taip pat didelę įtaką valymui turi skirtingų mitybinių komponentų, tokių kaip azoto, fosforo junginių, mikroelementų, vitaminų ir kitų medžiagų, esančių skirtinguose dirvožemio tipuose (smėlyje, molyje ar juodžemyje), koncentracijos.

Siekiant efektyviai išvalyti naftos teršalus iš grunto ir vandens, reikia taikyti kompleksines technologijas. Jos paremtos tiek mechaniniu angliavandenilių atskyrimu, tiek panaudojimu mikroorganizmų savybės skaidyti naftos teršalus. Šis procesas aprašomas apibendrinta lygtimi: CnHm + nO2 + Mikroorganizmai + Mitybiniai priedai → CO2 + H2O + Mikroorganizmai + tarpiniai produktai + Q ↑. (1)

Angliavandenilių biologinis skaidymas iš esmės yra egzo-terminė oksidacijos-redukcijos reakcija. Jos metu angliavandenilis oksiduojasi atiduodamas elektronus, o deguonis, juos prisijung-damas, redukuojasi. Aerobiniai mikroorganizmai kaip elektronų akceptorių naudoja tik molekulinį deguonį (O2). 1.1. Mikroorganizmų atranka ir kultivavimo sąlygų optimizavimas Naftą oksiduojantys mikroorganizmai plačiai paplitę gamtoje, tačiau tik nedaugelis iš jų pasižymi geromis naftos skaidymo savybėmis ir savitumu naftos teršalams. Tai riboja šių mikro-organizmų pritaikymą efektyviam pramoniniam aplinkos valymui nuo pramoninių naftos teršalų. Todėl naftos angliavandenilių biologiniam skaidymui paspartinti gamtiniai mikroorganizmai papildomi grynomis aktyviomis naftą oksiduojančių mikroor-ganizmų kultūromis ar jų asociacijomis.

Pirmieji darbai buvo atlikti su mišriąja naftos angliavan-denilius skaidančių mikroorganizmų kultūra, gauta iš Sibiro geologijos instituto. Iš šios kultūros išskirtam mikroorganizmų kamienui Pseudomonas putida 36 sukurta bakterinio preparato

11

gamybos technologija aplinkai nuo naftos teršalų valyti. Šį bakterinį preparatą naudojant aplinkai valyti buvo susidurta su problemomis: nepakankamu jo efektyvumu, valant nepalankiomis aplinkos sąlygomis skirtingus naftos teršalų tipus ir koncentracijas. Siekiant išplėsti naftą skaidančių mikroorganizmų veikimo spektrą, iš naftos produktais užterštų vietų buvo skiriami mikroorganizmai, naudojantys dyzeliną, kaip vienintelį anglies šaltinį, o išskirti aktyviausi kamienai buvo saugomi kultūrų kolekcijoje.

Pirmuoju etapu iš išskirtų mikroorganizmų buvo atrinkti 5 aktyviausieji ir sukurtas bakterinis preparatas, skirtas aplinkai nuo naftos teršalų valyti (Grigiškis, Čipinytė 1998). Remiantis šiais mikroorganizmais, buvo sukurtas naftos angliavandeniliais užterštos aplinkos valymo metodas, kuris buvo patentuotas JAV (Baškys, Grigiškis, Vilutis USA patentas Nr. 5494580, 1996) ir Lietuvoje (Grigiškis et al. LT patentai Nr. 3111 ir 3112, 1994).

Siekiant efektyviau valyti aplinką nuo naftos teršalų, antruoju etapu buvo papildomai atlikta naftą oksiduojančiųjų mikroorganizmų atranka. Iš nafta ir jos produktais užterštų dirvožemio bei vandens mėginių buvo išskirta ir išgryninta 190 angliavandenilius skaidančių mikroorganizmų kamienų. Ištyrus mazuto ir dyzelinių degalų mišinio (1:1) suskaidymo inten-syvumo priklausomybę nuo mikroorganizmų kamieno nustatyta, kad per 24 h dinaminėmis sąlygomis mineralinėje terpėje daugiau kaip 50 % testinio substrato suskaidė tik vienuolika išskirtųjų mikroorganizmų (Čipinytė, Grigiškis 2000a).

Atliekant tolesnius tyrimus, remiantis morfologiniais, fiziolo-giniais-biocheminiais ir kultūriniais požymiais, buvo nustatyta aktyviausių mikroorganizmų taksonominė priklausomybė ir gebėjimas skaidyti naftą, jos produktus bei kai kuriuos naftos angliavandenilius.

Žinoma, kad mišriosios kultūros turi didesnį potencialą skaidyti naftos angliavandenilius. Todėl, norint padidinti sun-kesnių angliavandenilinių substratų (naftos ir mazuto) suskai-dymo efektyvumą, iš penkių kamienų, kurių grynosios kultūros aktyviausiai skaidė naftą ir jos produktus bei kai kurių klasių

12

angliavandenilius (antraceną, oktadekaną, dekaliną, pristaną ir asfaltenus), buvo kuriamos asociacijos (Čipinytė, Grigiškis 2000b).

Apibendrinus naftos ir mazuto skaidymo rezultatus mišriomis Arthrobacter genties kamienų kultūromis, konstatuota, kad aktyviausia buvo kamienų Arthrobacter sp. N3, NJ9 ir M1 asociacija.

Naftos ir mazuto skaidymo Arthrobacter sp. N3, NJ9 ir M1 kamienų asociacija bei atskirais jos kamienais smėlyje, molyje, juodžemyje, durpėse ir sūriame bei gėlame vandenyje tyrimo rezultatai parodė (1 lentelė), kad abu substratus asociacija 1,1–2,3 karto skaidė efektyviau nei pavieniai jos kamienai, o inten-syviausiai – gėlame vandenyje ir juodžemyje.

Naftą skaidančioms bakterijoms pagausinti ir šioms savy-bėms suintensyvinti reikėjo parinkti auginimo terpes, sąlygas bei tinkamą kultivavimo būdą. 1 lentelė. Naftos ir mazuto suskaidymo Arthrobacter sp. kamienais ir jų asociacija priklausomybė nuo dirvožemio bei vandens tipo

Substra-tas*

Substrato koncentracija pasibaigus biologiniam skaidymui Arthrobacter

sp. Dirvožemyje, mg/g Vandenyje, mg/l

kamienai smėlyje molyje juod-žemyje durpėse gėlame sūriame

N3

Nafta

6,6±0,51 6,2±0,35 4,9±0,17 6,8±0,53 7,2±0,61 11,3±0,93 NJ9 7,2±0,50 5,7±0,42 4,6±0,22 6,2±0,35 10,1±0,99 15,5±0,80 M1 7,0±0,35 6,4±0,35 4,7±0,41 6,2±0,39 12,3±0,1 15,3±0,95 N3+NJ9+M1 5,4±0,44 4,3±0,31 3,7±0,16 5,1±0,25 5,3±0,45 9,8±0,51 N3

Mazutas

8,9±0,72 8,6±0,66 8,0±0,72 8,9±0,47 9,9±0,70 13,7±0,82 NJ9 9,2±0,64 8,3±0,57 7,3±0,65 8,6±0,58 14,1±1,0 18,7±1,00 M1 9,6±0,73 7,7±0,43 7,4±0,53 8,7±0,53 15,8±1,12 19,8±1,23 N3+NJ9+M1 8,2±0,60 7,2±0,52 5,8±0,46 8,1±0,49 8,3±0,78 11,2±0,67 *pradinė substratų koncentracija dirvožemyje – 12,5 mg/g (sausojo svorio), vandenyje – 25,0 mg/L, pH buvo atitinkamai 7,0; 6,5; 6,9; 5,0 ir 7,2. Temperatūra, 30 °C, proceso trukmė – 7 paros.

13

Auginimo terpių parinkimas atliktas dviem etapais. Pir-miausia buvo tiriama Arthrobacter sp. N3, NJ9 ir M1 kamienų augimo ir jų gebėjimo skaidyti angliavandenilius priklausomybė nuo anglies, azoto, fosforo šaltinių ir kai kurių mineralinių druskų. Remiantis gautais tyrimo rezultatais, buvo sukurtos terpės šiems kamienams auginti. Apibendrinus tyrimo rezultatus paaiškėjo, kad anglies ir organinio azoto šaltiniai turėjo didžiausią įtaką tirtųjų kultūrų augimui ir gebėjimui skaidyti naftą. Todėl antruoju etapu buvo optimizuota šių komponentų koncentracija terpėse, nau-dojant matematinį daugiafaktorį eksperimentų planavimą, leidžiantį pagausinti bakterijų kiekį (Levišauskas et al. 2004b). Šis statistikinis regresijos lygties modelis buvo pritaikytas optimizuoti Arthrobacter sp. N3 kamieno augimo terpę: 2 2 2

2 1 2 3 2 3= 71,5 + 4,38 +7,38 – 7,63, – 6,63 – 6,33y x x x x x x , (2) čia x1 – oleino rūgštis [g/L]; x2 – mielių ekstraktas [g/L]; x3 – ka-zeino hidrolizatas [g/L]; y – bakterijų kiekis [KSV/L].

Identiška eksperimento planavimo procedūra buvo pri-taikyta ir Arthrobacter sp. NJ9 bei Arthrobacter sp. M1 kamienų augimo terpėms optimizuoti.

Šis terpės optimizavimas leido tirtiesiems Arthrobacter sp. N3, NJ9, M1 kamienams nuo 1,16 iki 1,35 karto padidinti ląstelių išeigas.

Tinkamo kultivavimo būdo parinkimas yra taip pat svarbus veiksnys norint padidinti mikroorganizmo ląstelių išeigas.

Remiantis periodinio kultivavimo rezultatais nustatyta, kad specifinis mazuto ir dyzelino mišinio suskaidymo visais Arthro-bacter genties kamienais greitis priklausė nuo augimo fazės ir buvo didžiausias eksponentinėje fazėje, o kultūroms senstant, – jis mažėjo (Grigiškis et al. 2005). Todėl antrajame Arthrobacter sp. N3, NJ9 ir M1 auginimo etape, remiantis periodinio kultivavimo rezultatais, buvo apskaičiuotas optimalus pamaitinimo anglies šaltiniu ir kitais terpės komponentais pradžios laikas bei greitis, siekiant palaikyti santykinį bakterijų biomasės augimo greitį, atitinkantį didžiausią specifinį mazuto ir dyzelino mišinio suskaidymo greitį. Tinkamas maitinimo profilis apskaičiuotas

14

naudojant paprastą biomasės augimo pusiau periodinėje kultū-roje modelį: ( )= µ −dx xs x u

dt V ; (3)

0( ) −= − +s

s sds q s x udt V ; (4)

=dV udt

, (5) čia x – mikroorganizmų koncentracija [KSV/L]; s – substrato (oleino rūgšties ar saulėgrąžų aliejus) koncentracija [g/L]; s0 – sub-strato koncentracija pamaitinimo tirpale [g/L]; V – kultūrinio skys-čio tūris fermentatoriuje [L]; µ – santykinis biomasės augimo greitis [h–1]; qs – santykinis substrato sunaudojimo greitis [g/(L⋅h)]; u – maitinimo tirpalo pylimo į fermentatorių greitis [L/h].

Pamaitinimo metu palaikant substrato koncentraciją S = S* (dS/dt = 0), gaunamas pageidaujamas santykinis biomasės au-gimo greitis µ = µ*, kuriuo remiantis apskaičiuojamas pagei-daujamą augimo greitį atitinkantis pamaitinimo greitis:

( )( ) ( )

0

0

exp( )

∗ ∗

=

∗=

−

st

q s xV tu t s s

μ. (6)

Pamaitinimo pradžios laiko momentas (t = 0) atitinka perio-dinės kultūros amžių, kai pasiekiamas didžiausias biomasės aktyvumas skaidyti naftos angliavandenilius, nustatytas perio-dinės kultūros eksperimentuose. Parametrų ∗s , ( )∗sq s , ∗µ ir ( )

0=txV reikšmės lygtyje (4) atitinka periodinės kultūros būseną

pamaitinimo pradžios momentu. Arthrobacter sp. N3, NJ9 ir M1 kamienų pusiau periodinio

kultyvavimo rezultatai parodė, kad pamaitinimas anglies šaltiniu ir koncentruota mitybine terpe skirtingai veikė kamienų augimą ir jų gebėjimą skaidyti angliavandenilius (1 pav).

15

1 pav. Mazuto ir dyzelinių degalų mišinio skaidymo Arthrobacter sp. kamienų periodinėmis (•) ir pusiau periodinėmis (■) kultūromis

aktyvumas: a – Arthrobacter sp. N3; b – Arthrobacter sp. NJ9; c – Arthrobacter sp. M1

Arthrobacter sp. N3, NJ9 ir M1 kamienų potencialas skaidyti angliavandenilius buvo įvertintas pagal mazuto ir dyzelino mišinio kiekį, kurį per 6 h gali suskaidyti ląstelės, esančios 1 ml kultūrinio skysčio. Parodyta, kad pusiau periodinės Arthrobacter sp. N3, NJ9 ir M1 kultūros turi 3,7; 3,8 ir 2,7 karto didesnį potencialą skaidyti testinį substratą nei periodinės.

16

1.2. Aplinkos sąlygų įtaka užterštos aplinkos biologiniam valymui Naftos angliavandeniliais užterštos aplinkos valymas yra sudėtingas procesas, priklausantis nuo T, pH, mikroorganizmų įvedimo į jų veikimo zoną dažnio ir intensyvumo. Savo ruožtu intensyvumas priklauso nuo to, kokioje aplinkoje (dirvožemyje ar vandenyje) vyksta skaidymas. Dirvožemyje angliavandenilių skaidymas vyksta lėčiau ir priklauso nuo jo struktūros, rūgš-tingumo, talpumo vandeniui, cheminės ir mikrobiologinės sudėties bei sezoninės temperatūrų kaitos (nuo teigiamų vasarą iki neigiamų žiemą) skirtingose klimato zonose (Čipinytė, Grigiškis et al. 1995). Temperatūrų kaitos įtaka angliavandenilių skaidymo intensyvumui buvo tirta su atrinktais Arthrobacter sp. NJ5, NJ9, Pseudomonas species 31 ir Azotobacter vinelandii 21 kamienais.

Žemos temperatūros įtaka naftos biologinio skaidymo pro-cesui žemėje ir vandenyje buvo įvertinta pagal mikroorganizmų kiekio ir naftos koncentracijos pokyčius. Temperatūrų įtakos naftos biodegradacijos procesui žemėje tyrimo rezultatai pateikti 2 lentelėje.

Nustatyta, kad bandymo pabaigoje tirtuose pavyzdžiuose bendras ir ypač naftą oksiduojančiųjų mikroorganizmų kiekis padidėjo (naftą oksiduojančiųjų – apie 100 kartų), palyginti su jų kiekiais, nustatytais pavyzdžiuose prieš užšaldymą. Rezultatai rodo, kad po užšaldymo mikroorganizmai išliko gyvybingi, o patekę į palankias sąlygas dauginosi ir pasiekė tokį pat lygį kaip nešaldytuose pavyzdžiuose ir neprarado gebėjimo oksiduoti naftą.

Panaši priklausomybė buvo pastebėta tiriant temperatūrų kaitos įtaką naujai sukurtos kamienų Arthrobacter sp. N3, NJ9 ir M1 asociacijos gyvybingumui ir sugebėjimui skaidyti naftą (3 len-telė).

Tyrimai patvirtino, kad mikroorganizmų savybės išlikti gyvybingiems ir skaidyti naftą net ir po šaltos žiemos yra labai svarbios valant aplinką nuo naftos teršalų nepalankiomis

17

temperatūros sąlygomis, kada darbai užtrunka ne vienerius metus. 2 lentelė. Temperatūrų kaitos įtaka naftos mikrobiologinio skaidymo procesui žemėje

Eil. Nr.

Naudotos kultūros

Mikroorganizmų titras, KSV/g Naftos koncentracija, mg/g žemės

prieš užšaldymą

bandymo pabaigoje pradi-

nė

prieš už-

šaldy-mą

ban-dymo pabai-goje iš viso

naftą oksi-

duojan-čiųjų

iš viso naftą oksi-

duojan-čiųjų

1 Pseudomonas sp. 31 4,0×105 1,2×104 ≥107 ≥106 9,80 2,25 1,40

2

NJ5+NJ9+ Pseudomonas sp. 31 2,9×106 7,6×104 ≥107 ≥106 9,80 1,35 1,20

3

Pseudomonas sp. 31 2,5×106 1,0×104 ≥107 ≥106 96,40 38,50 32,20

4 NJ5+NJ9+ Pseudomonas sp. 31 6,8×106 1,4×104 ≥107 ≥106 96,40 32,10 23,50

1*

Pseudomonas sp. 31 7,0×105 2,0×104 ≥107 ≥106 9,80 2,20 1,25

2*

NJ5+NJ9 + Pseudo-monas sp. 31 1,8×106 6,0×104 ≥107 ≥106 9,80 1,40 1,10

3*

Pseudomonas sp.31 4,1×106 1,5×104 ≥107 ≥106 96,40 35,40 26,90

4* NJ5+NJ9+ Pseudomonas sp. 31 5,0×106 1,2×104 ≥107 ≥106 96,40 30,60 20,70 *Nešaldyti kontroliniai mėginiai Kitas ne mažiau svarbus veiksnys biologiniam naftos teršalų

skaidymui yra aplinkos pH. Pastebėta, kad mišrioji Arthrobacter sp. N3, NJ9 ir M1 kamienų kultūra, valant užterštus įvairių tipų dirvožemius, kurių pH yra skirtingas (Grigiškis et al. 2002), skaido naftos angliavandenilius gana plačiose ribose (pH = 4–9), tačiau geriausiai – neutralioje.

18

3 lentelė. Temperatūros pokyčio įtaka Arthrobacter sp. N3, NJ9 ir M1 kamienų gyvybingumui ir sugebėjimui skaidyti naftos teršalus

Naudotos kultūros Angliavandenilius skaidančių mikroorganizmų titras, KSV/L

Naftos koncentracija, mg/g

pradinis, 105

prieš už-šaldymą,

105 po

užšaldymo, 105

bandymo pabaigoje,

105 pradinė bandymo

pabaigoje Šaldyti

Arthrobacter sp. N3 Arthrobacter sp. NJ9 Arthrobacter sp. M1

5,5 ± 0,9 10, ± 1,4 1,3 ± ,2 6,3 ± 0,7 10,0 ± 0,1 0,9 ± 0,01

Arthrobacter sp. N3 Arthrobacter sp. NJ9 Arthrobacter sp. M1

6,0 ± 1,0 9,4 ± 1,0 1,4 ± 0,3 8,7 ± 1,2 98,0 ± 2,0 18,1 ± 3,5

Nešaldyti Arthrobacter sp. N3 Arthrobacter sp. NJ9 Arthrobacter sp. M1

5,5 ± 1,0 11,0 ± 0,9 5,5 ± 0,2 8,1 ± 1,3 10,0 ± 0,1 0,7 ± 0,01

Arthrobacter sp. N3 Arthrobacter sp. NJ9 Arthrobacter sp. M1

6,0 ± 1,0 8,7 ± 0,9 6,1 ± 0,8 8,5 ± 0,9 98,0 ± 2,0 16,3 ± 2,7

Tolesni Arthrobacter sp. kamienų N3, NJ9 ir M1 asociacijos panaudojimo sunkiųjų naftos angliavandenilių (t. y. mazuto) skaidymui tyrimai parodė, kad inokuliavus mazutu užterštą gruntą naftą oksiduojančiųjų mikroorganizmų asociacija, jų kiekis po 7 parų sumažėjo, taip pat sulėtėjo ir mazuto suskaidymo intensyvumas. Kadangi naftos teršalų skaidymo metu dėl mikro-organizmų veiklos pakinta naftos angliavandenilinė sudėtis, susidarę tarpiniai produktai gali slopinti bakterijų dauginimąsi ir sulėtinti naftos angliavandenilių biologinį skaidymą. Taigi papildomai inokuliavus mikroorganizmais, keičiant asociacijos sudėtį, inokuliavimo dažnį ir sureguliavus C:N:P santykį 100:1:0,1, pavyko stabilizuoti jų kiekį valomajame grunte ir užtikrinti teršalų skaidymą skirtingo tipo grunte (smėlyje, molyje, durpėse ir juodžemyje). Pažymėtina, kad ši naftą skaidančių bakterijų asociacija naftos teršalus geriausiai skaidė juodžemyje.

Remiantis atliktų tyrimų rezultatais, Arthrobacter sp. kamienų N3, NJ9 ir M1 asociacija buvo pritaikyta in situ ir ex situ dirvožemiui ir vandens telkiniams nuo naftos teršalų valyti (2 pav.).

19

2 pav. Naftos teršalų skaidymo etapai: a – naftuotas šlamas; b – biologinis skaidymas; c – grunto atkūrimas augalais

a) b)

c)

20

2. NAUJOS KOMPLEKSINĖS NAFTOS ANGLIAVANDENILIAIS UŽTERŠTO GRUNTO BIOLOGINIO VALYMO TECHNOLOGIJOS SUKŪRIMAS Valant aplinką nuo naftos angliavandenilių, iškilo nemažai sun-kumų:

− didelės naftos ar mazuto koncentracijos; − sena tarša, kai lengvosios angliavandenilių frakcijos išga-

ravusios ir likusios tik sunkiosios; − durpingos ar molingos teritorijos, kada naftos angliavan-

deniliai absorbuoti durpių arba įsigėrę į molį. Šioms problemoms spręsti taikomos tiek sintetinės paviršiaus

aktyviosios medžiagos (toliau tekste – PAM), tiek biologinės kilmės paviršiaus aktyviosios medžiagos (toliau tekste – BKPAM) ir sorbentai. Nafta ir (ar) jos produktai iš grunto išplaunami naudojant PAM ir pervedant juos į vandeninę fazę arba sudaro-mos geresnės bioprieinamumo sąlygos, leidžiančios efektyviau ir pigiau suskaidyti naftos teršalus. PAM dažnai naudojamos skysčio paviršiaus įtempiui mažinti ir tarpfaziniam paviršiaus plotui didinti, taip palengvinant skirtingo poliškumo medžiagų perėjimą iš vienos fazės į kitą. Sintetinės PAM ir BKPAM yra palygintos 4 lentelėje. 4 lentelė. BKPAM ir sintetinių PAM palyginimas

BKPAM Sintetinės PAM BKPAM savybės yra palankesnės naftos produktams pernešti į mikroorganizmų ląsteles. Mikroorganizmai išskiria BKPAM kiekį, pakankamą naftos produktams įsisavinti. BKPAM nepažeidžia naftą skaidančių mikroorganizmų membranų, neturi toksinio poveikio. BKPAM lengvai biologiškai skaidomos, jų skilimo produktai nekenksmingi aplinkai.

Sintetinės PAM nėra specialiai pritaikytos naftos produktams pernešti į mikroorganizmų ląsteles. Kontroliuoti sintetinės PAM kiekius, reikalingus naftos produktams pernešti į mikroorganizmus. Sintetinės PAM labiau pažeidžia mikroorganizmų membranas, trikdo baltymų, fermentų veiklą. Sintetinės PAM lėčiau skaidomos, jų skilimo produktai gali būti kenksmingi aplinkai.

21

PAM gali būti gaminamos tiek cheminiu, tiek biologiniu būdais. Pagrindinės sintetinės PAM nors ir padidina biopriei-namumą dėl savo hidrofobiškumo/hidrofiliškumo, biodegrada-cijos procesui turi kitokį poveikį negu BKPAM. Pagrindinės BKPAM klasės jungia polisacharidus, baltymus, lipopolisacha-ridus, lipoproteinus arba jų kompleksus. Nustatyta, kad naftos angliavandenilius skaidantys mikroorganizmai gali sintetinti ir BKPAM. 2.1. Biologinės kilmės paviršiaus aktyviųjų medžiagų taikymas gruntui nuo naftos teršalų plauti PAM biologinis skaidomumas turi tiek teigiamą, tiek ir neigiamą poveikį valant aplinką. Neigiamas poveikis pasireiškia tuo, jog iš vienos pusės yra sunaudojamos bakterijų biologinio skaidymo funkcijai atlikti reikalingos maistinės medžiagos ir deguonis, o iš kitos pusės – susidarę tarpiniai junginiai yra toksiškesni ir tokiu būdu gali stabdyti patį biodegradavimo procesą. Teigiamas poveikis pasireiškia tuo, jog PAM palengvina suskaidytų junginių pasišalinimą iš valymo vietos. Taip pat paranku yra ir tai, kad skaidžios PAM gali būti panaudotos kaip pirminis substratas, t. y. kai teršalas yra skaidomas kometaboliškai. Ka-dangi BKPAM toksiškumas mažiau išreikštas, todėl in situ ir ex situ plaunant nafta užterštą gruntą, jos suranda vis platesnį pritaikymą. BKPAM yra aktyvesnės nei sintetinės PAM ir turi 10–40 kartų mažesnę kritinę micelės koncentraciją.

Emulsinimo metodu buvo atrinkti trys mikroorganizmų kamienai: Azotobacter vinelandii 21, Gr2 ir N3.

Pagrindinės tolesnių tyrimų kryptys buvo susijusios su naftos teršalų plovimo iš grunto technologijos kūrimu, naudojant BKPAM valymui nuo naftos teršalų, taip pat ir galimybe su mikroorganizmais sintetinti PAM, naudojant užterštos aplinkos angliavandenilius. Naftos teršalų išplovimo iš grunto techno-logijai sukurti buvo naudojamas Azotobacter vinelandii 21 mikroorganizmo kamienas. Tam atrinkta ir optimizuota kulti-vavimo terpė (Levisauskas, Grigiškis et al. 2004a). Maksimaliai

22

BKPAM išeigai pasiekti buvo panaudotas matematinio modeliavimo metodas, auginant kultūrą pusiau periodiniu būdu. Bendroji išeiga padidėja 11 %, realizavus praskiedimo greičio programos algoritmą. Gautos BKPAM buvo panaudotos nafta ar mazutu užterštiems gruntams plauti. Tirtas plovimo efektyvumas, naudojant BKPAM, įvertinant modelinio grunto tipą, teršalų koncentracijas ir pH įtaką (Kildišas, Grigiškis et al. 2003; Levišauskas, Grigiškis et al. 2004c). Nustatyta, kad plovimo kokybė ir sparta daugiausia priklauso nuo grunto tipo (Grigiškis, Žunda 2001). Geriausiai, patiriant mažiausius nuostolius, naftos angliavandeniliai išsiplovė iš smėlio, blogiausiai – iš molio. Sukurtos BKPAM išplauna 1,5 karto daugiau naftos teršalų nei sintetinės PAM.

Pramoniniu būdu valant gruntą nuo naftos teršalų in situ ir jo plovimui naudojant BKPAM, labai svarbi tampa proceso kaina (Levišauskas et al. 2004c). Ji priklauso nuo plovimo ciklo trukmės, ploviklio koncentracijos, temperatūros ir tirpalo pH. Technolo-ginio tyrimo modelinė schema pateikta 3 pav. Optimizavimo kriterijumi parinkta minimali plovimo proceso savikaina, kuri apima plovimo ciklui sunaudojamo bioploviklio kainą, energijos sąnaudas ir operatorių darbo užmokestį. Uždaviniui spęsti sudaryta tikslo funkcija, nustatanti plovimo ciklo savikainos priklausomybę nuo ciklo trukmės ir proceso technologinių para-metrų.

Plovimo proceso kaina apskaičiuojama pagal tokią bendrąją formulę:

, , ,= + + +BKPAM T saugojimo E recirkuliacija W operatoriamsC C C C C , (7)

čia C – grunto plovimo vieno technologinio ciklo kaina [Lt]; CBKPAM – BKPAM sintetinančių mikroorganizmų kaina [Lt]; CT, saugojimo – nustatytos plovimo tirpalo temperatūros palaikymo kaina [Lt]; CE, recirkuliacija – energijos, reikalingos palaikyti ploviklio tirpalo recirkuliaciją, kaina [Lt/m3]; CW, operatoriams – operatorių darbo užmokestis [Lt].

23

3 pav. Naftos teršalų išplovimo iš grunto su BKPAM modelinė schema: 1 – talpa su BKPAM; 2 – reaktorius BKPAM tirpalui ruošti;

3 – reaktorius užterštam gruntui plauti; 4 – mechaninių dalelių nusodinimo talpa; 5 – BKPAM recirkuliacijos talpa; 6, 7 – siurbliai

Naftos teršalų išplovimo iš grunto proceso optimizacija pri-klauso nuo temperatūros, plovimo tirpalo pH, BKPAM koncen-tracijos plovimo tirpale ir plovimo proceso trukmės. Taigi minimali kaina apskaičiuojama pagal (7) formulę. Kiekviena (7) formulės dedamoji apskaičiuojama pagal funkcines priklau-somybes: = × + × ×

60W

BKPAM BKPAM BKPAM bCC P V P Q T , (8)

čia PBKPAM – koncentruotojų (60 %) BKPAM kaina [Lt/m3]; V – technologiniame plovimo procese naudojamo tirpalo tūris [m3]; CW – BKPAM koncentracija plovimo tirpale [%]; Qb – regeneruoja-mųjų BKPAM srauto greitis [m3/h]; T plovimo ciklo trukmė [h]. = × θ θ + × θ θ ×, . 0 .( – ) ( – ) ,T saugojimo temp temp P grC P V P Q T (9) čia Ptemp. – energijos, reikalingos 1 m3 plovimo tirpalo tempe-ratūrai pakelti 1 °C, kaina [Lt/m3/laipsniui]; θ – plovimo tirpalo temperatūra pagalbiniuose technologiniuose įrenginiuose [°C]; θ0 – plovimo tirpalo temperatūra pagrindiniame technologiniame

24

įrenginyje [°C]; θgr – grįžtančio plovimo tirpalo temperatūra [°C]; QP – plovimo tirpalo srauto greitis uždaroje plovimo sistemoje [m3/h].

,= ×E recirkuliacija cirkC P T , (10)

čia Pcirk – energijos, reikalingos palaikyti recirkuliacijos ciklą, kaina [Lt/h].

,= × ×W operatoriamsC n W T , (11)

čia n – operatorių skaičius; W – valandinis operatorių darbo įkainis [Lt/h].

Naftos angliavandenilių išplovimo iš grunto su BKPAM schema pateikta 4 pav.

4 pav. Naftos angliavandenilių išplovimo iš grunto ir skaidymo

principinė schema: KF – kietoji fazė; SF – skystoji fazė; NP – naftos produktai; DF – dujinė fazė; 1 – sąlygų standartizavimas; 2 – BKPAM

biosintezė; 3 – NP emulgavimas; 4 NP pernešimas į ląsteles; 5 – NP skaidymas

25

4 pav. pavaizduota: − micelės su naftos produktais susidarymas ir jų išplovimas

iš grunto ir vandens; − naftos teršalų skaidymas naftos angliavandenilius oksi-

duojančiais mikroorganizmais. Atlikus faktorinius eksperimentus ir taikant reakcijos

paviršiaus metodologiją, buvo nustatyta plovimo ciklo trukmės priklausomybė nuo optimizuojamų technologinių parametrų ir apskaičiuotos technologinių parametrų vertės, minimizuojančios plovimo proceso savikainą: temperatūra 26–29 °C, pH = 11, biologinės kilmės PAM koncentracija – 2,5–2,9 %. 2.2. Biotechnologinių procesų principinės schemos ir sukurtos inovatyviosios naftos teršalų skaidymo technologijos aplinkosauginės naudos analizė Pradžioje buvo atrinkti efektyviausiai naftos teršalus skaidantys mikroorganizmai, kurių pagrindu sukurtas naftą skaidantis bakterinis preparatas ir sukurta jo taikymo naftos teršalų skai-dymui technologija. Vėliau su mikroorganizmais buvo susin-tetintos BKPAM ir sukurta jų taikymo naftos teršalų išplovimui technologija. Sujungus išvardytus procesus, jie atitiko šiuos reikalavimus (5 pav.):

1) migruojančioji naftos teršalų frakcija atskiriama naudo-jant BKPAM;

2) užterštasis gruntas išvalomas, atskiriant nuo jo vande-ninę ir naftos fazes;

3) bioplovikliai naudojami pakartotinai; 4) atskirta nafta panaudojama kaip antrinė žaliava; 5) nemigruojančioji naftos teršalų frakcija biologiškai

skaidoma naudojantis atrinktaisiais mikroorganizmais; 6) galutinis grunto atkūrimas naudojant augalus.

26

5 pav. Naftos angliavandeniliais užteršto grunto valymo proceso

technologinių srautų schema: F1 – BKPAM gamybai skirtas fermentatorius; F2 – naftą degraduojančiųjų mikroorganizmų

kultivavimui skirtas fermentatorius; 1 – naftos angliavandeniliais užteršto grunto saugykla; 2 – plovimo talpa; 3 – mechaninio dalelių atskyrimo talpa; 4 – BKPAM tirpalo regeneravino talpa; 5 – BKPAM

tirpalo pašildymo talpa; 6 – naftos filtras; 7 – BKPAM tirpalo paruošimo talpa; 8 – regeneruotųjų naftos produktų talpa; 9 – mechaninio valymo talpa (naftos produktams, vandeniui ir šlamui atskirti); 10 – biologinio valymo talpa; 11 – užteršto vandens saugykla; 12, 13 – oro kompresoriai;

14 – oro filtras; 15, 16, 17, 18 – siurbliai; 19 – biodegradacijos vieta; 20 – fitoatkūrimo vieta

27

Remiantis užteršto grunto valymo proceso technologine sche-ma, sukurta aplinkos nuo naftos teršalų valymo kompleksinė strategija (Grigiškis, Žunda 2001; Kildišas, Grigiškis et al. 2003; Baškys, Grigiškis et al. 2004). Jos taikymas modifikuojant ir optimizuojant technologinį procesą, jo valdymą, technologinius režimus ir žaliavas lemia taršos sumažinimą užteršto grunto valymo procese. Kartu ši strategija leidžia panaudoti valymo metu susidariusias medžiagas kaip žaliavas tolesniems grunto valymo procesams (6 pav.).

6 pav. Naftos angliavandeniliais užterštam gruntui valyti

kompleksinės strategijos taikymo schema

Inovatyviosios naftos teršalų skaidymo technologijos aplin-kosauginė nauda pasireiškia tuo, kad regeneruojama:

− iki 60 % vienam valymo ciklui sunaudoto vandens; − iki 75 % vienam valymo ciklui sunaudotų BKPAM; − iki 20 % vienam valymo ciklui sunaudotos energijos. Kompleksinė naftos teršalų valymo technologija buvo

sukurta vykdant „Eureka“ projektą E!2522 „Opti-SoilClean“. Ši technologija pritaikyta naftos teršalais užterštam gruntui valyti 3 įmonėse (UAB „Grunto valymo technologijos“, AB „Orlen Lietuva“ ir UAB „Biocentras“). Šiose įmonėse iki šiol išvalyta apie 30 tūkst. t užteršto grunto. Vien bendrovėje „Orlen Lietuva“ grunto valymo aikštelės našumas siekia iki 12 tūkst. t per metus. Pasiekti rezultatai buvo įvertinti „Eureka“ nominacijomis už geriausius laimėjimus aplinkosaugos ir ekonomikos srityse.

28

„Opti-SoilClean“ projektas buvo paskelbtas Europos tarpvals-tybinės bendradarbiavimo programos „Eureka“ 2011 m. inovacijų prizo laimėtoju (7 pav.).

7 pav. „Eureka“ projekto E!2522 „Optisoil clean“ įvertinimas

29

2.3. Aplinkos, užterštos naftos teršalais, valymas in situ Vėlesni darbai buvo skirti angliavandeniliais užteršto grunto va-lymo tyrimams in situ. Senos taršos komponentai, technologinių procesų metu susidarančios atliekos, kuriose lieka mažai lengvų-jų angliavandenilių, yra sunkiai valomos dėl blogo prieinamumo mikroorganizmams. Tam reikia PAM ar kitų priedų, papildomai skatinančių naftos angliavandenilių skaidymą. Siekiant atpiginti aplinkos nuo naftos teršalų valymo procesus, reikia atrinkti mikroorganizmus, kurie ne tik skaidytų naftos angliavandenilius, bet ir sintetintų BKPAM, panaudodami juos kaip anglies šaltinį (Celiešiūtė, Grigiškis et al. 2009).

Remiantis emulgavimo metodu, buvo atrinkti 3 naftą oksi-duojančiųjų mikroorganizmų kamienai: Azotobacter vinelandii, Arthrobacter sp. N3, Gr2 (8 pav.).

8 pav. Arthrobacter sp. N3 kamieno, augančio ant mineralinio agaro su

dyzelinu (a) ir mazutu (b), BKPAM sintezė Pastebėta, kad Arthrobacter sp. N3 kamienas geriausiai sin-

tetina BKPAM augdamas ant naftos angliavandenilių (Čipinytė, Grigiškis et al. 2011). Toliau buvo tirtos BKPAM producento Arthrobacter sp N3 kultivavimo sąlygos ir nustatyta, kad intensyvi aeracija reikalinga bakterijų ląstelių augimui. Deja, ji inhibavo BKPAM sintezę. Siekiant to išvengti, Arthrobacter sp. N3 kamienas buvo auginamas dviem etapais: pradžioje kultūrinis skystis buvo aeruojamas (biomasei gauti), antrajame aeracija sustabdyta

30

(BKPAM gauti). Išskyrus ir iš dalies išgryninus BKPAM iš kultū-rinio skysčio, buvo nustatyta, kad ją sudaro kelios medžiagos, pasižyminčios aktyviomis paviršiaus savybėmis. Pastebėta, kad jos termostabilios 4–125°C temperatūroje, jų pH veikimo intervalas nuo 5 iki 10.

Likviduojant avarijas, kurių metu į aplinką patenka dideli naftos teršalų kiekiai in situ, svarbu efektyviai ir greitai sustabdyti taršos plitimą. Tam buvo sukurta sorbento – mikroorganizmo, skaidančio naftos angliavandenilius ir sintetinančio BKPAM, kompozicija (Grigiškis et al. 2011). Sorbento sistemos kompozicija buvo sukurta naudojant Arthrobacter sp. N3 kultūrą, jo sintetinamą BKPAM, popieriaus gamybos trumpojo plaušo atliekas kaip sorbentą, azoto ir fosforo trąšas. Ši kompozicija buvo pritaikyta skirtingo tipo gruntams valyti, kuriuose sunkiųjų angliavandenilių koncentracija siekė nuo 200 iki 300 g/kg grunto. Sorbento sistemos kompozicija, valant nuo naftos teršalų in situ, sustabdė jų migravimą į gilesnius grunto sluoksnius, suaktyvino patį bio-loginio skaidymo procesą ir savo ruožtu sumažino savikainą.

Siekiant galutinio grunto atkūrimo, po degradavimo proceso dažniausiai buvo naudojami augalai. Pastebėta, kad fito-atkūrimas sumažina galutinę valymo darbų kainą, turi estetinį privalumą ir leidžia išplėsti išvalyto grunto pritaikymo galimy-bes. Akivaizdu, kad fitoatkūrimo efektyvumas priklauso nuo grunto tipo, trąšų kokybės, drėgmės ir augalų tolerancijos liku-tinei taršai. Pagal toleranciją naftos teršalams buvo atrinkti šie vienmečiai augalai (Telyševa, Grigiškis et al. 2011):

Kukurūzai>>avižos>>lubinai>>pupos>>garstyčios. Daugiamečių augalų tolerancija naftos teršalams atrodė taip: Motiejukai>svidrė>raudonieji dobilai = mėlynžiedė liucerna. Tyrimų rezultatai parodė, kad atrinkti augalai gali vegetuoti

grunte, kuriame likutinė naftos teršalų koncentracija po biolo-ginio valymo siekė iki 4,5 %. Geriausiai adaptavęsi augalai per mėnesį šią taršą sumažino dar 1,5 karto. Visi tyrimai buvo atlikti vykdant „7FP Sorbent cont. 232533“ (Soil remediation technique for in situ cleaning of soils contaminated with heavy hydrocarbons mixtures) programą.

31

3. RIEBALINIŲ TERŠALŲ BIOLOGINIS SKAIDYMAS 3.1. Riebalinius teršalus skaidančių mikroorganizmų atranka ir kultivavimo sąlygų optimizavimas Kiekvienais metais plečiasi gamybos apimtys, auga urbanizacija, todėl didėja nuotekų, užterštų riebaliniais teršalais, kiekis. Rieba-linių nuotekų valymas aktualus mėsos, pieno, žuvies perdirbimo ir aliejaus spaudimo, taip pat viešojo maitinimo įmonėms, kurių kasdieninėje veikloje susidaro dideli riebalinių atliekų kiekiai. Vien Lietuvoje tokių nuotekų susidaro apie 1 mln. m3 per metus. Jas nukreipus į miestų ar gyvenviečių biologinio valymo įren-ginius, stabdomas nuotekų valymo procesas. Taip pat tam sunaudojami didesni energetiniai ištekliai. Pastaruoju metu riebalais užterštoms nuotekoms valyti ir kietosioms riebalinėms atliekoms utilizuoti vis plačiau taikomi biologiniai metodai.

Įvairios kilmės ir sudėties riebalų skaidymas mikroorganiz-mais priklauso nuo riebalų rūgščių liekanų struktūros. Dėl to šių medžiagų ardymo procesui didelės įtakos turi bakterijų sinte-tinamų riebalus skaidančių fermentų savitumas. Be to, kartu su riebaliniais teršalais į aplinką patenka ir bioprieinamumą prie riebalinių audinių ribojančios baltyminės medžiagos. Taigi, norint efektyviai spręsti šias problemas, reikia pasirinkti mikroor-ganizmus, gebančius skaidyti ne tik riebalus, bet ir baltyminės kilmės medžiagas.

Siekiant rasti mikroorganizmus, kuriuos būtų galima pri-taikyti kompleksinėje riebalinių atliekų utilizavimo techno-logijoje, buvo patikrintas 124 kamienų gebėjimas skaidyti riebalinius substratus (Čipinytė, Grigiškis et al. 2009). Nustatyta, kad UP2, F2, E13, Kl1 ir N3 kamienai greičiausiai skaidė saulėgrąžų ir alyvuogių aliejų, kiaulienos taukus bei jautienos lajų, o efektyviausi buvo Enterobacter aerogenes E13 ir Arthrobacter sp. N3 kamienai, pasižymėję aukščiausiu lipaziniu aktyvumu ir intensyviausiai skaidę sočiąsias (palmitino, stearino) bei nesočiąsias (oleino, linolino) riebalų rūgštis ir iš jų sudarytus trigliceridus (5 lentelė).

32

5 lentelė. Kai kurių riebiųjų rūgščių ir trigliceridų skaidymo intensyvumo priklausomybė nuo mikroorganizmų kamieno

Substratas Substrato suskaidymas, % E13 F2 UP2 N3 Kl1

Oleino rūgštis 95,0 ± 1,55 78,3 ± 2,33 90,0 ± 5,22 95,2 ± 2,72 65,5 ± 4,21 Linolo rūgštis 94,3 ± 1,27 95,7 ± 2,03 95,7 ± 1,37 92,3 ± 3,74 87,1 ± 5,19 Stearino rūgštis 28,5 ± 1,05 16,5 ± 1,56 17,5 ± 1,02 29,3 ± 1,47 11,3 ± 1,05 Palmitino rūgštis 31,2 ± 2,50 12,7 ± 2,20 19,0 ± 0,58 30,1 ± 2,26 17,0 ± 0,95 Trioleinas 87,8 ± 4,00 51,0 ± 2,50 59,3 ± 2,93 65,9 ± 3,14 35,2 ± 1,73 Trilinolinas 95,5 ± 3,92 93,0 ± 2,93 67,0 ± 3,47 98,3 ± 1,15 59,5 ± 6,44 Tristearinas 41,9 ± 2,55 6,0 ± 0,22 13,0 ± 1,15 40,3 ± 3,10 10,3 ± 0,86 Tripalmitinas 23,0 ± 1,47 0 8,4 ± 0,72 15,9 ± 0,99 2,0 ± 0, 4

Mišriąją E. aerogenes E13 ir Arthrobacter sp. N3 kamienų kultūrą auginant mineralinėje terpėje su 0,5 % aliejaus, nustatyti šie aliejaus hidrolizės produktai: riebalų rūgštys, monogliceridai ir digliceridai (9 pav.). Be to, pastebėta, kad bakterijos šiuos hidrolizės produktus naudojo augimui (10 pav.).

Be to, tyrimo rezultatai, gauti kiaulienos taukus juodžemyje skaidant su mišriąja Enterobacter aerogenes E13 ir Arthrobacter sp. N3. kamienų kultūra, parodė, kad ši mišrioji bakterijų kultūra riebalus skaidė apie 7 kartus intensyviau nei vietiniai dirvožemio mikroorganizmai (11 pav.).

Todėl efektyviam bakterijų asociacijos panaudojimui, utili-zuojant riebalinius teršalus, buvo ištirtas bakterijų kultivavimo būdas.

Didžiausiai bakterijų biomasės išeigai pasiekti ir teršalų skaidymo procesui atpiginti buvo panaudotas periodinis mikro-organizmų kultivavimo būdas su pamaitinimu (Levišauskas, Grigiškis et al. 2009). Optimizacijos tikslas buvo pasiekti didžiausią biomasės išeigą augimo ciklo gale. Dėl to buvo optimizuotas pamaitinimo greitis, palaikant jo dinamiką viso kultivavimo metu. Po šių procedūrų biomasės išeiga galiausiai siekė 1,24·1014 KSV ir

33

buvo 25 % didesnė, palyginti su išeiga, gauta kultivuojant periodiniu būdu.

9 pav. Junginių, gautų saulėgrąžų aliejų skaidant mišriąja

Enterobacter aerogenes E13 ir Arthrobacter sp. N3 kamienų kultūra, plonasluoksnė chromatograma. Takeliai: 1 – 0 h; 2 – 24 h; 3 – 48 h;

4 – 72 h; A – trigliceridai; B – riebalų rūgštys; C – digliceridai; D – monogliceridai

10 pav. Mišriosios Enterobacter aerogenes E13 ir Arthrobacter sp. N3

kamienų kultūros mikroskopinis vaizdas mineralinėje terpėje su saulėgrąžų aliejumi

34

11 pav. Kiaulienos taukų skaidymas juodžemyje mišriąja Enterobacter

aerogenes E13 ir Arthrobacter sp. N3 kamienų kultūra: 1 – vietiniai mikroorganizmai (kontrolė); 2 – mišrioji Enterobacter aerogenes

E13 ir Arthrobacter sp. N3 kamienų kultūra

Kadangi su riebaliniais teršalais į aplinką patenka ir balty-minės medžiagos, buvo tikslinga riebalus skaidančią bakterijų asociaciją papildyti baltymines medžiagas skaidančia kultūra Bacillus coagulans. Gauti tyrimų rezultatai buvo panaudoti vandens valymo nuo riebalinės taršos ir kanalizacijos vamzdynų valymo schemoms bei kietųjų riebalinių atliekų kompostavimo tech-nologijai parengti. 3.2. Kanalizacijos vamzdžių valymo nuo riebalinės taršos tyrimai Biologinio kanalizacijos vamzdžių valymo nuo riebalinės taršos procesai gali būti sugrupuoti į dvi pagrindines klases: anae-robinius ir aerobinius.

Anaerobinio valymo metu riebalai hidrolizuojami iki glicerolio ir riebalų rūgščių. Jie gali inhibuoti įvairių mikroor-ganizmų augimą ir tokiu būdu stabdyti valymo procesų darbus.

35

Aerobinio valymo metu riebalai paverčiami į nemalonaus kvapo neturinčias medžiagas CO2 ir H2O.

Į kanalizacinės sistemos vandenis patekusi riebalinė tarša dėl nespecifinės (fizikinės) adsorbcijos nusėda ant vamzdžių sienelių. Po kurio laiko sienelės apauga storu riebalų sluoksniu ir užkemša vamzdynus. Juos valant biodegraduojančiaisiais preparatais, šiems tenka veikti aerobinėmis ir anaerobinėmis sąlygomis. Dėl šių priežasčių, siekiant optimizuoti riebalais užkimštų vamzdynų valymo parametrus, neužtenka dirbti vien tik laboratorinėmis sąlygomis (Matikevičienė, Grigiškis et al. in press 2012). Tam reikėjo pasitelkti pilotinį įrenginį (12 pav.).

12 pav. Valymo nuo riebalinės taršos pilotinio įrenginio schema

Riebaliniais teršalais buvo užpildytas įrenginio vamzdynas ir, jiems nusėdus ant vamzdžių sienelių, buvo atliekami rieba-linės taršos valymo bandymai, keičiant bakterijų kompozicijos koncentraciją – nuo 2 % iki 7 %, o mišinio pH – nuo 6,5 iki 10. Atlikti tyrimai patvirtino, kad vamzdynų valymo nuo riebalinės taršos efektyvumas priklauso nuo mišinio pH ir bakterinės kompozicijos koncentracijos. Buvo nustatyti optimalūs riebalais užkimštų vamzdynų valymo parametrai: pH = 8, bakterinės kompozicijos koncentracija – 1,25 L/m2. Riebalus skaidant opti-maliomis sąlygomis, proceso efektyvumas per 21 dieną pasiekia iki 86,7 % (13 pav.).

Pastebėta, kad po valymo vamzdynuose likę riebalūs skai-dantys mikroorganizmai suformavo bioplėvelę, neleidžiančią susidaryti naujiems riebalų kamščiams vamzdžiuose.

36

Po 1-os paros Po 3-jų parų

Po 7-ių parų Po 21-os paros 13 pav. Vamzdynų išvalymo nuo riebalinės taršos efektyvumas

3.3. Riebalinių teršalų kompostavimas Pramonėje ir namų ūkyje susidaranti riebalinė tarša gali būti skirstoma į dvi kategorijas: „geltonąją“ ir „rudąją“ (Aikaitė-Sta-naitienė, Grigiškis et al. 2010). Pirmajai priskiriami riebalai, kuriuos galima panaudoti gyvūnų maisto papildams ruošti, muilo, kosmetikos ir odos priežiūros priemonių gamybai. Tuo tarpu antrajai – priskiriami riebalai, kurių negalima pakartotinai naudoti, o jų utilizavimas reglamentuojamas teisės aktais. Remiantis teisės aktais, šios biologinės kilmės atliekos gali būti deginamos, pūdomos arba kompostuojamos. Kompostavimas – tai teršalų tvarkymo būdas, kada kompleksiškai veikiant biologiniais (mikroorganizmais), biocheminiais (fermentais) agentais ir žemės gyvūnais jie tampa bioskaliais (mineralizuotais) ir virsta biogeniniais elementais ar juodžemiu. Ši technologija yra paremta bioskalių riebalų homogenizacija, maišymu, gera aeracija ir irigacija.

37

Kompostuojant riebalų teršalus, susiduriama su daugybe kliūčių, tokių kaip žemas vandens sulaikymas ir prastas riebalų tirpumas jame, nepakankamas poringumas ir bioskaidumas. Taip pat, kompostuojant riebalus, nepageidautinas veiksnys yra nemalonus kvapas, atsirandantis dėl H2S (vandenilio sulfido), CH3SH (metilsulfido) ir kitų dujų išsiskyrimo. Šiems klausimams spręsti būtų galima panaudoti riebalus skaidančius fermentus – lipazes, tačiau juos galima panaudoti tik kartą, bet tai nerentabilu. Todėl bandyta stabilizuoti lipazes, taikant įvairius imobilizavimo būdus ant skirtingų adsorbentų (Grigiškis et al. 2010; Juciūnas, Grigiškis et al. 2011), kad būtų užtikrintas daugkartinis jų panaudojimas, išplečiant ne tik riebalinių teršalų biodegradavimo pritaikymo galimybes, bet ir esterinimo ir peresterinimo procesus (Asadauskas, Grigiškis et al. 2009). Riebalinių teršalų kompostavimo procesų technologiniams parametrams optimizuoti buvo taikyta faktiniais eksperimentais pagrįsta reakcijos paviršiaus analizės metodologija. Ją atlikus, nustatyta optimali eksperimentinio kompostavimo mišinio sudėtis: pradinis riebalų kiekis – 5 %, ląstelių koncentracija biopreparate – 109 KSV/g, struktūrinės medžiagos kiekis – 9 %. Apibendrinus gautus vandens valymo nuo riebalinės taršos kompostavimo proceso tyrimų rezultatus, sukurta riebalinių teršalų utilizavimo schema, susidedanti iš 6 pagrindinių stadijų (14 pav.):

− teršalų atskyrimo; − riebalais užteršto vandnens valymo; − kompostavimo mišinio paruošimo; − termofilinės kompostavimo stadijos; − mezofilinės kompostavimo stadijos (komposto brandi-

nimo); − fitoatkūrimo. Taip pat buvo suprojektuotas koncentruotųjų riebalinių atlie-

kų utilizavimo aikštelės modelis (15 pav.), kuris buvo išbandytas pusiau gamybinėmis sąlygomis ir gali būti taikomas gamybinei riebalų utilizacijos aikštelei įrengti.

38

14 pav. Riebalinių teršalų utilizavimo technologinė schema

15 pav. Koncentruotųjų riebalinių atliekų utilizavimo

aikštelės prototipas

39

Riebalinius teršalus kompostuojant, utilizavimo aikštelės pirmojo laipsnio valymo įrenginyje atliekamas termofilinis ir mezofilinis valymo etapai, siekiant sunaikinti patogeninius mikroorganizmus. Tuo tarpu antrojo laipsnio valymo įrenginyje vykdomas mezofilinis komposto brandinimas. Nustatyta, kad kompostavimo metu mišinys praranda apie 30–40 % organinių medžiagų CO2 ir H2O forma, skaičiuojant nuo pradinio kompos-tavimo mišinio kiekio. Pats kompostavimo procesas trunka 1–1,5 metų. Komposto kokybei įvertinti reikia nustatyti kompostavimo pabaigą, biodegradavimo efektyvumą ir likutinių riebalinių teršalų koncentracijas. Tam buvo panaudotas fitoatkūrimas – auginti raudonieji dobilai, tikrasis eraičinas ir hibridinė svidrė. Pastebėta, kad po fitoatkūrimo išvalymo laipsnis siekė 99 %, kai pradinė teršalų koncentracija buvo 55,6–138,9 g/kg, ir 90 %, kai teršalų koncentracija viršijo 222,2 g/kg (Kačkytė et al. 2011). Anksčiau aprašytų vandens valymo, kompostavimo ir fitoat-kūrimo procesų pagrindu sukurta pažangi taršos prevencijos po-žiūriu technologija. Taip pat dėl švaresnės gamybos ji atitinka griežtus aplinkos apsaugos ir higienos reikalavimus. Ją reali-zuojant, gaunamas 2 rūšių kompostas – su dideliu ir mažu maisti-nių medžiagų kiekiu. Pirmuoju atveju kompostas naudojamas žemės struktūrai pagerinti, o antruoju – kaip trąša, aprūpinanti augalus reikalingomis mineralinėmis ir organinėmis medžia-gomis. GAUTI REZULTATAI, IŠVADOS IR JŲ PRAKTINĖ REIKŠMĖ

− Atrinkti mikroorganizmai, skaidantys naftos teršalus, sukurtos ir ištirtos naftą skaidančių mikroorganizmų asociacijos.

− Įvertintas ir optimizuotas naftos teršalų biologinio skaidymo procesas, konstatuota, kad po užšaldymo mikroorganizmai išlieka gyvybingi, o patekę į palankias sąlygas dauginasi ir pasiekia tokį patį lygį kaip ir nešaldyti, bet ir nepraranda gebėjimo oksiduoti naftą;

40

− Optimizuoti naftos teršalų skaidymo technologiniai parametrai.

− Sukurta nauja kompleksinė naftos teršalų valymo iš grunto technologija, apimanti mikroorganizmų biosintezę, BKPAM panaudojimą naftos angliavandenilių išplovimui ir pradinės teršalų koncentracijos sumažinimui, biodegradavimo ir fitoatkūrimo procesus;

− Sukurta naftos teršalų utilizavimo technologija įdiegta į trijose įmonėse: UAB „Grunto valymo technologijos“, AB „Orlen Lietuva“ ir UAB „Biocentras“;

− Atrinkti mikroorganizmai, gebantys skaidyti įvairios sudėties riebalus;

− Optimizuotos mikroorganizmų, skaidančių riebalus, terpės ir kultivavimo sąlygos ir sukurtos įvairios, riebalinius teršalus skaidančių preparatų formos ant skirtingų adsorbentų;

− Nustatyti optimalūs vamzdynų valymo nuo riebalinės taršos parametrai bei konstatuotas bioplėvelės susidarymas, neleidžiantis vamzdžiuose susidaryti naujiems riebalų kamščiams;

− Sukurta kompleksinė riebalinių teršalų biologinio skaidymo technologija, apimanti vandens valymo, kompostavimo ir fitoatkūrimo procesus bei sukurtas riebalinių teršalų utilizavimo aikštelės prototipas.

TOLESNIŲ TYRIMŲ KRYPTYS Teikiamų darbų apžvalga ir atlikti tyrimai išryškino ateityje spręstinus klausimus. Numatomi šie tyrimai:

− bioskalių esterių fermentinės sintezės eksperimentiniai tyrimai;

− biotepalų sintezės eksperimentiniai tyrimai; − bioplastifikatorių kūrimas (naujos kartos plastmasių ir

gumų gamyba) (Asadauskas et al. 2009); − keratino turinčių atliekų utilizavimo tyrimai (Matike-

vičienė, Grigiškis et al. in press 2012; Grigiškis et al. 2011);

41

− nuotekų dumblo kvapų šalinimas (ekologiniai sprendi-mai);

− ekologiško biotechnologiniais procesais pagrįsto kuro kūrimas, stabilizavimo ir efektyvumo tyrimai (ekologiniai ir ekonominiai sprendimai) (Gailiūtė, Grigiškis et al. 2011).

Šių mokslinių tyrimų realizavimas pramonėje ir kitose srityse prisidėtų prie spartesnės šalies ūkio bei ekonomikos plėtros ir kartu padėtų spręsti daugelį socialinių problemų. PROCEDŪRAI TEIKIAMŲ MOKSLO DARBŲ SĄRAŠAS Straipsniai leidiniuose, įrašytuose į Mokslinės informacijos instituto duomenų bazės Thompson ISI Web of Science sąrašą Aikaitė-Stanaitienė, J.; Grigiškis, S.; Levišauskas, D.; Čipinytė, V.;

Baškys, E. V.; Kačkytė, V. 2010. Development of fatty waste composting technology using bacterial preparation with li-polytic activity, Journal of Environmental Engineering and Landscape Management 18(4): 296–305. ISSN 1648-6897.

Kačkytė, V.; Grigiškis, S.; Paliulis, D.; Aikaitė-Stanaitienė, J. 2011. Usage of plants for fat polluted soil treatment, Journal of En-vironmental Engineering and Landscape Management 19(4): 316–325. ISSN 1648-6897.

Levišauskas, D.; Galvanauskas, V.; Čipinytė, V.; Grigiškis, S. 2009. Optimization of fed-rate in fed-batch culture Enterobac-ter aerogenes 17 E13 for maximization of biomass productivi-ty, Information Technology and Control 38(2): 102–107. ISSN 1392-124X.

Levišauskas, D.; Galvanauskas, V.; Žunda, G.; Grigiškis, S. 2004a. Model-based optimization of biosurfactants production in fed-batch culture Azotobacter vinelandii, Biotechnology Letters 26(14): 1141–1146. ISSN 0141-5492.

Matikevičienė, V.; Grigiškis, S.; Levišauskas, D.; Kinderytė, O.; Baškys, E. 2012. Technology of biological treatment of lipid-rich wastewater and pipelines contaminated by lipids, Jour-

42

nal of Environmental Engineering and Landscape Management (in press) ISSN 1648-6897.

Straipsniai leidiniuose, įtrauktuose į Mokslinės informacijos instituto duomenų bazės Thomson ISI Proceedings sąrašą Asadauskas, S.; Griguceviciene, A.; Moroz, J.; Grigiskis, S.; Tvas-

ka, B. 2009. Volatility and oxidative degradation of biotech-nologically synthesized esters for utilization as plasticizers, in Polymer Chemistry and Technology: Proceedings of Scientific Con-ference Chemistry and Chemical Technology (22 April 2009, Kau-nas, Lithuania), Kaunas: Technologija, 6–10. ISSN 2029-2457.

Grigiškis, S.; Cipinyte, V. 1998. Implications of selected bacterial strains for contamination of oil pollutants in soil and water in Environmental Contamination and Remediation Practices at For-mer and Present Military Bases. Series 2: Environmental security (12–17 October 1997, Vilnius, Lithuania), Vol. 48. Dordrecht: Kluwer Academic Publishers, 277–281. ISBN 0-7923-5247-5.

Straipsniai recenzuojamuose leidiniuose, referuojamuose tarptautinėse duomenų bazėse, kurių sąrašą sudarė Lietuvos mokslo taryba Čipinytė, V.; Grigiškis, S. 2000a. Naftą skaidančių mikroorganiz-

mų atranka, Cheminė technologija 2(15): 65-69. ISSN 1392-1231. Čipinytė, V.; Grigiškis, S.; Baškys, E. 2009. Selection of fat-

degrading microorganisms for the treatment of lipids conta-minated environment, Biologija 55(3–4): 84–92. ISSN 1392-0146.

Čipinytė, V.; Grigiškis, S.; Špokienė, A.; Baškys, E. V.; Vilutis, K. 1995. Žemos temperatūros įtaka naftos mikrobiologinio deg-radavimo procesui, Cheminė technologija 1: 69–73. ISSN 1392-1231.

Grigishkis, S.; Chipinyte, V.; Telysheva, G.; Bashkys, E. 2002. Degradation of crude oil and fuel oil (mazut) in soil by Arth-robacter strains and their association, Latvian Journal of Che-mistry 3: 295–302. ISSN 0868-8249.

43

Grigiškis, S.; Čipinytė, V.; Levišauskas, D.; Baškys, E. V. 2005. Optimization of the Arthrobacter sp. cultures for degradation of the oil hydrocarbons, Latvian Journal of Chemistry 1: 263–271. ISSN 0868-8249.

Grigiškis, S., Samsonenko, J.; Baškys, E. V.; Čipinytė, V.; J., Tely-sheva, G.; Dizhbite, T.; Jashina, L. 2010. Immobilization of li-pase from Enterobacter aerogenes E13 on modified lignins to obtain a novel biocatalyst, Cheminė technologija 54(1): 47–55. ISSN 1392-1231.

Juciūnas, A.; Grigiškis, S.; Baškys, E. 2011. Immobilization of En-terobacter aerogenes E13 strain culture medium, distingui-shed by its lipase activity, in the ethylcellulose microcapsu-les, Biologija 57(1): 26–32. ISSN 1392-0146.

Levišauskas, D.; Tekorius, T.; Čipinytė, V.; Grigiškis, S. 2004b. Experimental optimization of nutrient media for cultivation of Arthrobacter bacteria, Latvian Journal of Chemistry 1: 75–80. ISSN 0868-8249.

Straipsniai kituose periodiniuose recenzuojamuose mokslo leidiniuose Baškys, E.; Grigiškis, S.; Levišauskas, D.; Kildišas,V. 2004b. A new

complex technology of clean-up of soil contaminated by oil pollutants, Aplinkos tyrimai, inžinerija ir vadyba 4(30): 78–81. ISSN 1392-1649.

Čipinytė, V.; Grigiškis, S. 2000b. Naftos ir jos produktų skaidymo naftą oksiduojančių mikroorganizmų asociacijomis tyrimas, Aplinkos inžinerija, 8(2): 74–79. ISSN 1392–1622.

Grigiškis, S.; Žunda, G. 2001. Paviršinio aktyvumo medžiagų (PAM) panaudojimas nafta ir jos produktais užterštam grun-tui valyti, Aplinkos inžinerija 9(1): 17–22. ISSN 1392–1622.

Kildišas, V.; Levišauskas, D.; Grigiškis, S.; Baškys, E. 2003. Deve-lopment of Clean-up Complex technology of soil contamina-ted by oil pollutants based on cleaner production concepts, Aplinkos tyrimai, inžinerija ir vadyba 3: 87–93. ISSN 1392-1649.

44

Levišauskas, D.; Brazauskas, K.; Chvostova, O.; Baškys, E.; Gri-giškis, S. 2004c. Optimization of technological parameters of the contaminated soil washing technology, Aplinkos tyrimai, inžinerija ir vadyba 4: 55–60. ISSN 1392-1649.

Tarptautinių recenzuojamų konferencijų pranešimų medžiagoje Celiešiūtė, R.; Grigiškis, S.; Čipinytė, V. 2009. Biological surface

active compounds application possibilities and selection of strain with emulsifying activity, in Environment. Technology. Resources: Proceedings of the 7th International Scientific and Pra-ctical Conference (25–27 June 2009, Rezekne, Latvia). Rezekne: RA Izdevniecība. Vol. 1: 267–272. ISSN 1691-5402.

Čipinytė, V.; Grigiškis, S.; Šapokaitė, D.; Baškys, E. V. 2011. Pro-duction of biosurfactants by Arthrobacter sp. N3, a hydrocar-bon degrading bacterium, in Environment. Technology. Resour-ces: Proceedings of the 8th International Scientific and Practical Conference (20–22 June 2011, Rezekne, Latvia). Rezekne: RA Izdevniecība. Vol. 1: 68–75. ISSN 1691-5402.

Gailiūtė, I.; Grigiškis, S.; Žėkaitė, G.; Čipinytė, V. 2011. Selection of microbes and conditions that induced bio-cracking of branched hydrocarbon squalane, in Environment. Technology. Resources: Proceedings of the 8th International Scientific and Pra-ctical Conference (20–22 June 2011, Rezekne, Latvia). Rezekne: RA Izdevniecība. Vol. 1: 46–52. ISSN 1691-5402.

Grigiškis, S.; Baškys, E. V.; Levišauskas, D.; Kavaliauskė, M.; Di-žavičienė, O.; Aikaitė-Stanaitienė, J. 2011. Optimization of sorbent system from paper mill waste short fibers for biore-mediation of heavy hydrocarbons, in Environment. Technolo-gy. Resources: Proceedings of the 8th International Scientific and Practical Conference (20–22 June 2011, Rezekne, Latvia). Re-zekne: RA Izdevniecība. Vol. 1: 104–111. ISSN 1691-5402.

Matikevičienė, V.; Grigiškis, S.; Levišauskas, D.; Sirvydytė, K.; Dižavičienė, O.; Masiliūnienė, D.; Ančenko, O. 2011. Optimi-zation of keratinase production by Actinomyces fradiae 119 and its application in degradation of keratin containing

45

wastes, in Environment. Technology. Resources: Proceedings of the 8th International Scientific and Practical Conference (20–22 June 2011, Rezekne, Latvia). Rezekne: RA Izdevniecība. Vol. 1: 294–300. ISSN 1691-5402.

Matikevičienė, V.; Masiliūnienė, D.; Grigiškis, S. 2009. Degrada-tion of keratin containing wastes by bacteria with keratinoly-tic activity, in Environment. Technology. Resources: Proceedings of the 7th International Scientific and Practical Conference (25–27 June 2009, Rezekne, Latvia). Rezekne: RA Izdevniecība. Vol. 1: 284–289. ISSN 1691-5402.

Telysheva, G.; Dizhbite, T.; Lebedeva, G.; Jashina, L.; Solodov-nik, V.; Mutere, O.; Grigiškis, S.; Baškys, E. V.; Aikaitė-Stanaitienė, J. 2011. Use of plants to remediate soil polluted with oil, in Environment. Technology. Resources: Proceedings of the 8th International Scientific and Practical Conference (20–22 June 2011, Rezekne, Latvia). Rezekne: RA Izdevniecība. Vol. 1: 38–45. ISSN 1691-5402.

Patentai Grigiškis, S.; Baškys, E. V.; Vilutis, K. 1994 12 25. Naftos teršalus

degraduojantis mikroorganizmas Azotobacter vinelandii 21. LR valstybinis patentų biuras Nr. 3111.

Baskys, E.V.; Grigiskis, S.; Vilutis, K. 1996 02 27. Method of decom-position of a hydrocarbonpolluted environment by the use of bac-terial compositions. USA patent No. 5 494 580.

Grigiškis, S.; Baškys, E.V.; Špokienė, A.O. 1994 12 25. Aplinkos, užterštos angliavandeniliais, valymo būdas. LR valstybinis pa-tentų biuras Nr. 3112.

46

Dalyvavimas Europos struktūrinių fondų lėšomis finansuojamuose tarptautiniuose ir Lietuvos Respublikos projektuose FP7-SME-2008-1 “SORBENT – Soil remediation technique for in situ cleaning of soils contaminated with heavy hydrocarbons mixtures” (2009-2011). Bendroji projekto vertė: 644 300 Lt; “BIOSKALESTER – design and evaluation of ageing – resistant with controllable flammability biodegradable esters” (2008–2010). Bendroji projekto vertė: 147 000 Lt; “BIODIESELLUBRICANT - development of the new biodiesel and biolubricant production technologies based on biocatalysis” (2007–2009). Bendroji projekto vertė: 282 500 Lt; E!3726 DEGREAS “Optimised complex technology for grease wastes utilization” (2006 – present). Bendroji projekto vertė: 326 000 Lt; FP6 CRAFT-COOP-CT-2004-508698 PURILEACH „Modular puri-fication system for heavily polluted leachate” (2005–2006 m.). Bendroji projekto vertė: 597 800 Lt; FP5 2002-72097-72097 CRAFT ABSORB „Novel Absorbent for Oil Tank Cleaning, Wastewater and Vapour Clean-Up“ (2003–2004 m.). Bendroji projekto vertė: 621 500 Lt; E!2522 OPTI-SOILCLEAN “ Optimised complex technology for clean up of soil, polluted by oil products“ (2001–2004 m.). Ben-droji projekto vertė: 864 000 Lt.

CREATION, INVESTIGATION AND APPLICATION OF COMPLEX BIOTECHNOLOGICAL PROCESSES FOR ENVIRONMENTAL PROTECTION Summary This review looks into research performed between 1989 and 2011. The reviewed research deals with the application of complex biotechnological processes for oil hydrocarbon and

47

grease polluted environment cleaning. The research includes biological degradation of oil hydrocarbons and grease degra-dation by microorganism-derived lipases.

Human population has reached 7 billion people already. Their survival requires energy and food resources. Energy is mainly derived from petroleum and its products. Food sources include meat, and cereals, and grains which are processed into oils.

Petroleum resources are usually far from the consumer, so before processing, it must be transported long distances and stored. During oil refining, logistics and its use, pollution is created. It is not only dangerous to humans, but also influences the climate.

Higher amounts of animals and plants used as food sources rapidly increase the expansion of food processing industry, meat industry, and oil extraction factories. All of this leads to the emergence of grease contamination. Some animal parts are suitable for processing, while others, which are not reused, contaminate water and pipelines, or are disposed off in landfills.

Lots of mechanical, physico-chemical and thermal technologies have been created to treat these types of pollution. However, neither of the conventional technologies is adequate for oil or grease decontamination, since they do not meet modern requirements, and are slow, expensive, or cause undesirable secondary pollution. Only complex biotechnological processes enable efficient and low-cost remediation without secondary pollution.

Since both pollution types are of a different nature, their treatment conceptions and processes also differ. Petroleum consists of a large variety of organic compounds. They are found in different forms in soil and water, at various concentrations, and in extreme environmental conditions. Degradation of these pollutants requires organisms that can survive extreme conditions and high concentrations of oil hydrocarbons, and can degrade them effectively. It is therefore necessary to increase the bioavailability – the ability to emulate petroleum hydrocarbons

48

with surface active materials or to reduce oil contaminants by using sorbents. Thus, combining the mentioned processes and phytoremediation, a petroleum hydrocarbon-contaminated soil and water treatment technology was created. This technology is installed in three plants: JSC “Grunto valymo technologijos”, JSC “Orlen Lietuva” and JSC “Biocentras”, and is in accordance with modern, clean technology requirements.

Although grease contamination is not as complicated as oil hydrocarbon contamination, it is more common in household activity, has a malodour and is readily available to pathogenic microorganisms; therefore its cleaning has special requirements regulated by laws.

These requirements imply that during the cleaning processes malodours must be prevented, pathogenic microorganisms - eliminated, and the technology must be cheap and long-lasting. Grease mainly pollutes water, pipelines or soil during its depositing. Thus, the development of a new treatment for fatty contaminants requires selection of microorganisms with lipolytic activity. In turn, they are used as grease degraders or their enzymes are stabilized by immobilization on different carriers making the degradation processes more efficient and cheaper. The results of those researches were used to create three fatty contaminant degrading techniques for water, soil and pipeline cleaning and non-recyclable contaminant composting.

Further research directions are related to environmental remediation from other common household and industrial contaminants (such as keratin-containing wastes), and the use of newly discovered enzymes and other biologically active substances for production of esters, fuels, lubricants, plasticizers, plastics and rubbers.