Z. Krebsforseh. 73, 141--148 (1969)

Krebse bei Ratten und M/iusen nach Ffitterung mit kommerziellem Fischfutter

WILEELM C. HUEr~R

Fort ~yers, Florid~

Eingegangen am 21. Februar 1969

Cancers in Rats and Mice Fed with Commercial Fish Feeds

Summary. Rats and mice were given two different feeds which had produced in a high percentage of rainbow trout primary liver cancers. The feeds induced in some of the rodents benign tumors of the liver (adsnomas, cholangiomas), adenocarcinomas of the stomach and colon, and in mice also leukemias.

Degenerations and necroses of liver cells occurred almost exclusively in animals with liver tumors and were rare in animals without such neoplasms.

The subcutaneous injection of alcohol extracts of one of these feeds failed to elicit cancerous responses at the site of administration as well as in organs and tissues remote from ist.

These observations do not support the supposition that a contamination of the fish feeds with aflatoxin is the principal cause of the liver cancers affecting rainbow trout.

Because of the continued uncertainty of the actual cause of these tumors it is advisable to prohibit by law the sale for human consumption of rainbow trout with liver cancers.

Zusammen]assung. Die Ffitterung yon Ratten und Mausen mit zwei Fischfuttern, die bei Regenbogen-Forellen in einem hohen Prozentsatz Leberkrebse erzeugt batten, verursachte bei einigen dieser Nagetiere gutartige Tumoren der Leber (Adenome, Cholangiome), Adeno- karzinome des Magens und Diekdarms, und bei M~usen auch Leuk/~mien. Leberzelldegenera- tionen und Nekrosen wurden beinahe aussch]iel31ich in Tieren mit Lebertumoren gesehen und waren self~n in Tieren ohne diese Geschwfilsf~. Die subkutane Injektion von A]koholextrak~en eines Fisc~utters verursachte in keinem ~a]l die Entwicklung yon Tumoren. Diese Befunde lassen sich nicht in Einklang bringen mit der Annahme, dab eine Verunreinigung der Fisch- nahrung mit Aflatoxin die Hauptursache der in Forellen gesehenen Leberkrebse ist. Wegen der welter bestehenden Unsicherheit fiber die Ursache der Hepatombildung bei Forellen ist es ratsam, den Handel, den Verkauf und die Konsumierung yon Forellen mit Leberkrebsen gesetzlich zu unterbinden.

Epidemien yon prim/~ren Leberkrebsen bei Regenbogenforellen wurden w/~hrend der ]etzten 15 Jahre in Fischz/ichtereien der USA, I tal ien, Frankre ieh u n d J a p a n beobachtet (WOOD u. LARSO~, 1961 ; HUErE~ u. t)AYNE, 1961 ; RUCKER,

YASU~AXE u. WOLF, 1961; As~rL~.u u. HALVER, 1963; LEVADITI, VIBElCT U. NAZlMOFF, 1960; GHIT~O U. CERETTO, ]962). Sie folgten der Einf i ihrung yon kommerziell hergestell tem Fischfut ter in dieser Industr ie . Dieses Spezialfutter wurde entwickelt, u m das Wachs tum und die Gewichtszunahme der Fische zu besehleunigen a n d sie dami t sehneller verkaufsfertig zu machen.

Da viele Bestandtei le dieses Fu t te r s auch im F u t t e r fiir andere Tier~rten, z. B. I-Iiihner, u n d in menschlichen Nahrungsmi t t e ln verwendet werden, erschien es wiehtig festzustellen, ob die Ff i t terung yon krebserzeugendem Fisehfut ter / ihnl iche Geschwiilste bei Saugetieren, d. h. R a t t e n und Miiusen, zur Folge hat wie bei der Forelle. 10 Z. ]~rebsforsch. Bd. 73

142 W.C. HvEP]~:

Exper imente l ler Teil

Zwei Typen solchcn Fischfutters, welehe an Regenbogenforellen Leberkrebse in einem hohen Prozentsatz in mehreren Fisehziichtereien erzeugt hatten (Hv~PE~ und P~u 1961), wurden zur Fiitterung yon l~atten und Mi~usen verwendet. Fischfutter A wurde von Herrn PAVL 1%. T~o~Pso~, Leiter des Bureau of Sport Fishers and Wildlife, U. S. Department of the Interior, zu diesen Zwccken zur Verfiigung gestellt, w~hrend Fischfutter B yon Drs. WoL~ und JACKson, Department of Fish and Game, State of California, geliefert wurde. ])as ur- spriinglich kSrnige Futter wurde den Tieren in gepulverter Form gegeben. Die Tiere konnten cs ad libitum konsumieren. D~ jedoch Futter B nicht gut yon M~usen vertragen wurde, er- hielten sie abweehselnd fiir je zwei Wochen lang Fischfutter und normales M~usefutter.

Futter B wurde 50 schwarzen Bethesda Ratten (30 weibliche, 20 m~nnliche) verfiittert. Die Tiere waren bci Beginn des Experiments 3 Monate alt. Futter A und B wurde au~erdem an je 160 M~use des C57 black Stammes gegeben. Die Tiere waren ungef~hr 6 Wochen alt; in jeder Gruppe befanden sich 80 weibliche nnd 80 m~nnliche Mause.

In einem zweiten Experiment, in dem 120 C57 black M~use Verwendung fanden, erhie]ten diese Tiere in zweiwSchentliehen Zwisehenri~umen subcutane Injektionen yon 0,02 cc a eines Athylalkoholkonzentrats yon Futter A in die Nackengegend. Diese LSsung wurde durch Extrahierung yon 20 Pfund gepulvertem Futter A mit ungefi~hr 1001 Alkohol erhalten. ~ach- dem der Alkohol ~u~ das gepulverte Futter 4 Std lang unter dauerndem Riihren bei Raum- temperatur gewirkt hatte, wurde der Extrakt dutch Filterung erhalten und dann im Vakuum auf 2 1 konzcntriert. Destillierapparat ~nd Filter wurden mit Hexan ausgewaschen, um fettige Best~ndteile des Futters zu erhalten. Die Waschfliissigkeit wur4e dem Konzentrat zugesetzt, und die Mischung wurd schliei~lich unter 2 mm Druck in vacuo destilliert, wobei das Sammel- gefal~ mit Kohlendioxydeis gekiihlt wurde. Die so erhaltene Endmenge yon Fliissigkeit re- pr~sentierte 16,2~ des extrahierten Futters.

Die Maximaldauer der Experimente war 2 Jahre. Die dann iiberlebenden Tiere wurden getStet und wie alle vorher verstorbenen Tiere autoptisch untersucht. Alle Organe und Gcwebe, welche pathologische Ver~nderungen zeigten, wurden histologisch untersuch~.

Exper imente l le Beobachtungen

Die wicht igs ten Ergebnisse s ind aus den D a t e n ersichtl ich, die in den Tab. 1 u. 2 zusammenge fa$ t sind.

Ke ine der 120 MiSuse, welche bei no rma lem F u t t e r subcu tan mi t Alkohol- e x t r a k t in j iz ier t wurden und keine der no rma l geff i t ter ten Kontrol lmKuse ent- wickel ten Tumoren i rgendwelcher Ar t . Dagegen wurden bei den 240 M~usen, welche F i s c l~u t t e r A bzw. B erhiel ten, zusammen 13 LeukKmien, 4 Re t iku lum- sa rkome der Leber , 1 L e b c r a d e n o m und 1 Adenocarc inom des D ickda rms gesehen, d. h. im Ganzen 19 Geschwfilste. W~hrend bedeu t same Untersch iede in der Ge- s a m t t u m o r a u s b e u t e zwisehen mi t F i sch fu t t e r geff i t ter ten und mi t normale r Di~t gef t i t te r ten l~a t ten n ich t bes tanden , zeigten die Tiere der Exper imen ta l sc r i e auger den verschiedenen Tumoren , welche bei d iesem S t a m m spon tan vo rkommen , 7 Geschwiilste ungew6hnl icher Ar t , d. h. 2 Adcnocarc inome des Magens, 1 Adeno- carc inom der Lunge u n d 1 A d e n o m der Leber und 3 Cholangiome.

Die Gegend der Gas t ro in t e s t i na l tumoren der einen Maus u n d der be iden R a t t e n war s t a rk ve rd ick t a n d les t und zeigte ira Durchschn i t t ein homogenes, we l l e s Gewebe. Die Sch le imhaut war do r t u lzer ier t u n d in den Rand te f l en granular . Das Kolonca rc inom war ein einfuches Adenocarc inom, w~hrend die Magencarc inome Schleim b i ldende Adenocarc inome waren (Abb. 1 u. 2). Die Lebe r tumoren bei der Maus und den R a t t e n mai3en bis 2 m m im Durehmesser , waren deut l ich abgese tz t yore umgebenden normalen Lebergewebe durch ihre wei~e F a r b e und ihr medul]~- res Aussehen u n d waren typ i sch in ihrer his tologischen S t r u k t u r (Abb. 3 u. 4).

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144 W.C. HUEPE~:

Abb. 1. Sch]eimbfldendes Adenocarcinom des Magens einer t ~ t t e mit h~ufigen, epitheliMen Synzytien naeh t~iitterung mit Fisehfutter, das Leberkrebse in t~egenbogenforellen erzeugt haste

Abb. 2. Adenocareinom des auisteigenden Diekdarms einer Maus nach Fii~terung mit hepato- carcinogenem Fisehfutter

Krebse bei l~atten und ~gusen n~ch Fii~erung mit kommerziellem Fiseh{u~ter i45

Abb. 3. Hepatom in einer Maus nach Fiitterung mit Fischfutter

Abb. 4. Cholangiom in einer t~a~te gefiitt~rg mit Fischfutter

146 W.C. Hu~s~R:

Wi~hrend alle Lebern mit Tumoren eine gr6Bere Anzahl von hyalinen Nekrosen und I-Ierde yon degenerierenden Leberzellen enthielten, waren derartige Ver- i~nderungen die grebe Ansnahme in diesen Organen der fibrigen Tiere dieser Ver- suehsserien.

Bespreehung Die Versuehsergebnisse zeigen, dab der Alkoholextrakt des Fisehfutters keine

krebserzeugenden Stoffe enth~lt, da die mit ihm subeutan injizierten M~use weder lokal an der Injektionsstelle noeh in irgendeinem anderen Gewebe Krebse ent- wiekelten. Es besteht andererseits kein Zweifel, dab die beiden gepriiften Fiseh- futter naeh oraler Gabe einen deutliehen carcinogenen Effekt auf mehrere Organe yon Rat ten und Mi~usen hatten. Bei beiden Tierarten bestand diese Wirkung in der Entwieldung yon Lebertumoren (Adenome, Cholangiome) und yon Gastro- intestinalcareinomen in allerdings verh~ltnism~Big geringer Anzahl. M~use reagier- ten anBerdem mit der Entstehung einer grSBeren Zahl yon Leukiimien und Lym- phomen. Auf Grund dieser Befunde ist der SchluB bereehtigt, dab die untersuchten Fischfut~er naeh oraler Verabreiehung nieht nut carcinogen fiir lgegenbogenforellen sind, sondern auch fiir M~use und l~atten.

Bei der Suche naeh der Iqatur der krebserzeugenden Agentien in diesen Fut tern wurden anfangs fettige Bestandteile unter Verdaeht gestellt, die im Lipidanteil yon t~aumwollsamenmehl, bzw. in ~)l yon Fischmehl vermutet wurden (WOLF u. JACKSOn, 1963; KRAYBrLL n. S H r ~ l ~ , 1964; HVv~Pv~R u. PAYNE, 1961). Insbeson- dere oxydierte und polymerisierte Fette, die bei der ErhitzRng der Rohprodukte und ihrer Umwandlung in Mehle gebildet werden, wurden verdi~ehtigt, da der- artige Produkte Gegenstand yon klinischen and experimentellen UntersuehRngen in bezng auf ihre Rolle als Krebsursachen bei Menschen und Tieren gewesen waren (O'GARA, STEWART, B~OWl~ u. HUEPER, 1969). Ffitterungsversuehe mit diesen Produkten an t~egenbogenforellen ifihrten jedoeh zur Entwicklung ent- weder yon nur wenigen Lebertumoren oder gaben negative l~esultate (WOLF u. JAOXSOS, 1963; IIALvER U. ASHLEY).

Naehdem ausgedehnte Untersuehungen mit einer grSBeren Zahl yon ehemi- sehen Hepatocareinogenen gezeigt batten, da~ viele yon ihnen eine gleiehe Wir- kung auf Regenbogenforellen ausiibten, wurde der Verdaeht auf Aflatoxin gelenkt, da diese Substanz eine auBerorden~lich hohe Leberkrebswirksamkeit zeigte und als Verunreinigung im BaumwollsamenS1 naehgewiesen werden konn~e (ScHoE)cTAL, 1957; LANCASTER, JE~KrNs U. P~LP, 1961; RICHII% MAI~TINEAUD, TOURY u. DvPrs, 1964; SALMO~ u. I q E W ] 3 ~ , 1963; I-IALvE~, 1963; AStXL~Y, GARDNER n. WOGA~, 1965). Da die Verfiitterung yon Aflatoxin an Regenbogenforellen zu einer hohen Ausbeute yon Lebertumoren ffihr~e, kamen HA~VER sowohI wie ASHLEY et al. zu dem Sehlu~, da9 die Epidemien yon Leberkrebsen bei amerikanischen Regenbogenforel]en auf die Verfiitterung yon mi~ Aflatoxin verunreinigtem Fiseh- futter zuriickzuffihren seien (SI~HUBE~ et al., 1965).

Die Ergebnisse der bier beriehteien Experimente lassen es jedoch zweifelhaft erscheinen, ob diese Annahme eine zufriedenstellende Erklgrung der Ursache dieser diatgren Epidemien yon Leberkrebs bei Forellen is~. Wghrend l%atten bei allen bisher berichteten Versuchen eine hohe Anfs ffir Leberkrebse und Leber- degenerationen bei Fiitterung mit Aflatoxin gezeigt haben, war diese Reaktion

Krebse bei Ratten und Mi~usen nach Fiitterung mit kommerziellem Fischfutter 147

nur schwaeh bei den Ratten und M~usen, welche in unseren Versuchen hepato- carcinogene Fischfutter erhielten. Beide Tierarten zeigten auBerdem Krebse des Magens und des Dickdarms, bzw., d .h . Krebse, die im al]gemeinen bei diesen Tierarten nach Aflatoxinbehandlung nicht beobachtet worden sind. Sehliel]lich ist aueh die Entstehung yon Leuki~mien bei Mi~usen naeh Ffitterung mit Fisch- futter nicht charakteristiseh ffir eine Aflatoxinreaktion. In diesem Zusammenhang mag noch erwahnt werden, dab die subcutane Applikation yon Aflatoxin bei Ratten zur Entwicklung yon lokalen Sarkomen ffihrte, die bei Mi~usen, die in ahnlicher Wcisc mit einem Alkoholextrakt eines der untersuchten Fischfutter behandelt warden ausblieb. Es ist somit zweilelhaft, ob mit Aflatoxin verunreinig- tes Futter die wirkliche und alleinige Ursache der Leberkrebsepidemie der Regenbogenforellen gewesen ist.

AuBer der wissenschaftlichen and wirtschaftlichen Bedeutung dieser Erkennt- nisse sind sie auch yon Wichtigkeit fiir den Schutz der BevSlkerung gegen Krebs- gefahren, die yon der Konsumierung yon an Krebs leidenden Fischen resultieren k6nnten. In einer Antwort an einen Fischzfichter in bezug auf dieses Problem hat die Food and Drug Administration darauf hingewiesen, dab der Verka~f kranker Fische gegen das Gesetz verst6Bt (Section 402 (a) (5) des Food, Drug and Cosmetic Act 1960), ganz gleich, ob das Handhaben und Essen yon solchen Fischen eine Gesundheitsgefahr ffir ihren Verbraucher mit sich bringt oder nicht. Die Food and Drug Administration hat es damals abgelehnt, eine Ausnahme fiir den Verkauf yon Regenbogenforellen mit Leberkrebsen und ihre Versehiffung fiber Staatsgrenzen zuzulassen. Das Department of Health, Education and Welfare (1962) hat dagegen 2 Jahre spi~ter in einer grundsatzliehen Erkli~rung zu diesem Problem festgestellt, dab das Essen des Fleisches soleher Fisehe nicht zu einer Ubertragung yon Krebs auf den Konsumenten fiihren kann und somit kein direktes Problem ffir die menschliche Gesundheit darstellt. Bei der weiter bestehenden Unsicherheit fiber die aktuelle Ursaehe der Forellcnkrebse ist diese Stellungnahme der Regierungs- behSrde unberechtigt, da mit dem Fleisch yon solchen Fischen exogene krebs- erzeugende Substanzen auf den Konsumenten fibertragen werden kSnnen. Diese Tatsache ist erwiesen ffir Nahrungsmittel, die yon Tieren kommen, welche radio- aktive Substanzen, Arsen, und andere ancrkannte Umweltcarcinogene zu sieh genommen hatten (HvwP~, 1963). Die Gefahr besteht nieht im Krebs, weleher dadurch fiber~ragen werden kSnnte, sondern in der Ubersetzung der Carcinogene.

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