Készítette: Czermann Mónika

OECD 215

A teszt céljaAz OECD 215-ös számú irányelv célja, hogy

értékelje a vizsgálandó vegyi anyag halivadékok növekedésére gyakorolt hosszú távú hatásait.

2

[1.]

A TESZT LEÍRÁSAA TESZT LEÍRÁSA

3

[2.]

Ajánlott halfajok a teszthezAz Európai Unión belül kifejlesztettek egy

úgynevezett „gyűrűs tesztet” szivárványos pisztrángok ivadékaira (Oncorhynchus mykiss) átfolyásos rendszerben.

4

Szivárványos pisztráng (Oncorhynchus mykiss)

A szivárványos pisztráng a leginkább javasolt faj erre a tesztre.

[3.]

5

Más, jól dokumentált fajok is használhatók, de ekkor a vizsgálati eljárást esetlegesen módosítani kell, hogy a megfelelő feltételeket biztosítani tudjuk.

Ilyen fajok; zebra dánió/zebrahal (Danio rerio) medaka (Oryzias latipes)

Zebra dánió/zebrahal (Danio rerio)

Medaka(Oryzias latipes)

[5.][4.]

Halivadékok tartásaA teszthez használt halegyedeket egyetlen

állomány populációjából kell kiválasztani, lehetőleg ugyanabból az ívásból.

A halivadékokat a teszt megkezdése előtt 2 hétig a tesztnél alkalmazott minőségű vízben és megvilágításban kell tartani.

csak azt a populációt használhatjuk fel a teszthez, melynek halálozási arány kisebb, mint a populáció 5%-a

A vizsgálatot megelőző 2 hetes felkészítés során, illetve a vizsgálat teljes időtartama alatt a halivadékok nem kaphatnak semmiféle kezelést betegség esetén.

6

A vizsgálandó vegyi anyag tulajdonságai Ismerni kell a vizsgálandó vegyi anyag;

vízoldhatóságát gőznyomását egy megbízható analitikai módszert a vegyi anyag

mennyiségi meghatározásához

Hasznos információk közé tartozik a vegyi anyag; szerkezeti képlete tisztasága stabilitása vízben és fényben disszociációs állandói (pKa, Pow ) biológiai bonthatósága

7[6.]

Oldat készítéseA megfelelő koncentrációjú oldatok a törzsoldat

hígításával készülnek.

Az oldat általában a tesztelt vegyi anyag hígító vízbe történő keverésével vagy rázásával állítható elő (pl. keverővel vagy ultrahangos berendezéssel).

Oldószerek vagy diszpergálószerek alkalmazása is szükséges lehet bizonyos esetekben a megfelelő koncentrációjú oldat elkészítéséhez.

megfelelő oldószer; aceton, etanol, metanol, dimetil-szulfoxid, dimetil-formamid, trietilénglikol

megfelelő diszpergálószer; Cremophor RH40, Tween 80, metilcellulóz (0,01%-os), HCO-40

8

Ügyelni kell a biológiailag gyorsan lebomló vegyszerekre (pl. aceton) és erősen illékony vegyületekre, mert ezek bakteriális felhalmozódási problémákat okozhatnak az átfolyásos vizsgálatoknál.

Az alkalmazott diszpergálószer nem lehet hatással a halegyedek növekedésre és nem okozhat látható mellékhatásokat sem.

9

[7.]

Hígító víz minőségeMinden olyan víz használható hígító víznek;

mely biztosítja a vizsgált egyedek hosszú távú kényelmes túlélést

a halivadékok növekedést mutatnak benne

A vízminőségnek a vizsgálat alatt állandónak kell lennie.

A hígító vízből meghatározott időközönként (pl. 3 havonta) mintát kell venni a következő komponensek ellenőrzésére;

lebegő szilárd anyagok összes szerves szén peszticidek nehézfémek (pl. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni) főbb anionok és kationok (pl. Ca, Mg, Na, K, Cl, SO4) 10

[8.]

Az elfogadható hígító víz néhány kémiai jellemzője a táblázatban látható;

11

Teszthez szükséges készülékekA következő készülékek szükségesek a teszt

elvégzéséhez; oxigén és pH mérő keménység és lúgosság kimutatására alkalmas

műszer megfelelő készülék a hőmérséklet-szabályozásához,

és a folyamatos megfigyeléséhez kémiailag semleges anyagból készült tartályok

(megfelelő kapacitással) analitikai mérleg

12

[9.]

[10.]

A vizsgálat elveTömegük lemérését követően az exponenciális

növekedési fázisban levő halivadékok tartályba kerülnek.

A halivadékok a vizsgálandó, vízben oldott vegyi anyag különböző koncentrációinak lesznek kitéve.

Átfolyásos, vagy ha az nem lehetséges megfelelően beállított fél-statikus rendszert használjunk.

átfolyásos rendszernél a víz és a vizsgálandó oldat folyamatosan cserélődik

fél-statikus rendszernél nincs áramlás, a vizet és a vizsgált oldatot adott időközönként teljesen kicserélik (általában naponta)

A vizsgálat időtartama minimum 28 nap. 13

A halegyedeket naponta etetik.

A napi eleség mennyisége az egyes halegyedek kezdeti tömegétől függ a és 14. napot követően újraszámolható.

A kísérlet végén a halegyedek tömegét ismét lemérik.

14

[11.]

[12.]

A mérés végpontjának számításaA növekedési ütemre gyakorolt hatás egy

regressziós modell segítségével elemezhető. ezáltal megbecsülhető az a koncentráció (ECx), mely egy x

%-os eltérést okoz a fejlődési ütemben (ECx = hatásos koncentráció)

pl. EC10, EC20, EC30, EC50

15

Az adatokat összehasonlítva a kontroll értékekkelmeghatározható az a legnagyobb koncentráció, mely megfigyelhető hatást nem okoz (NOEC) és az a legkisebb koncentráció, mely már hatást okoz (LOEC).

[13.]

A teszt érvényességeA teszt érvényességéhez a következő feltételeknek

kell teljesülniük; a kontrollcsoport halálozási aránya nem haladhatja meg a

10%-ot a vizsgálat végén a kontrollcsoport halegyedeinek átlagos tömegét

megfelelően meg kell növelni ahhoz, hogy a növekedési ütem minimális eltérését ki tudjuk mutatni

a „gyűrűs teszt” során megállapították, hogy a szivárványos pisztrángoknál a kontrollcsoportok halegyedeinek átlagos tömege legalább a másfélszeresére kell nőjön

az oldott oxigén koncentrációja legfeljebb a levegő telítettségi értékének 60%-a lehet

a víz hőmérséklete legfeljebb ±1°C-al térhet el a kísérleti tartályok között

16

A TESZT A TESZT ELVÉGZÉSÉNEK ELVÉGZÉSÉNEK

MENETEMENETE

17

[14.]

A halegyedek kiválasztása és tömegmérése

24 órával a teszt megkezdése előtt a halállomány etetését szüneteltetni kell.

A halegyedeket véletlenszerűen kell kiválasztani.

A halivadékokat óvatosan kell kezelni, elkerülve a stresszt okozó helyzeteket és sérüléseket.

Egyszerű altatót használva megmérjük a halak nedves tömegét.

egyszerű altató lehet pl. tricain-metán-szulfonát (MS 222) 100 mg/l-es vizes oldata szódabikarbónával semlegesítve(a semlegesítés aránya 2 egység szódabikarbóna egy egység MS 222-höz)

18

A halegyedek tömegének szórásának minimálisnak kell lennie.

a középsúlytól (számtani középtől) mért ±10%-os tartományon belülre kell esnie

19

Azon halegyedek, melyek tömege beleesik az ajánlott tartományába (lásd a táblázatban), véletlen-szerűen szétosztjuk a vizsgálati tartályok között.Az egyes tartályokban a halegyedek összesített nedves tömegét fel kell jegyezni.

ÁllománysűrűségAz állománysűrűségnek megfelelőnek kell lennie

a vizsgálathoz használt halegyedek számára. ha túl nagy, akkor a túlzsúfoltság miatt stressz léphet fel,

mely a növekedési ráta visszaesését okozza, illetve betegségekhez vezet

ha túl kicsi, az territoriális viselkedést eredményezhet, mely szintén befolyásolja a növekedést

20

[15.]

EtetésA halakat megfelelő mennyiségű és minőségű

eleséggel kell táplálni, hogy elfogadható növekedési rátát érjünk el.

A napi adag szétosztható két egyenlő részre, és legalább 5 órás különbséggel adagolható.

21

[16.]

Az adagokat minden tartály esetén a kezdeti össztömeg alapján ki lehet számítani.

a halivadékok testtömegének 4%-a (de minimum 2%-a) naponta

Amennyiben a halegyedek tömegét a vizsgálat 14. napján újra lemérik, a napi eleség adag is újraszámolható.

A tömegmérést megelőző 24 órában a halegyedek etetését fel kell függeszteni.

Kerüljük el a mikrobák elszaporodását és víz zavarossá válását.

22

minden nap a tartályok aljáról el kell távolítani az el nem fogyasztott eleséget és ürüléket

[17.]

Fény és hőmérsékletA megvilágítási időszakot, illetve a víz

hőmérsékletét a vizsgált fajhoz kell igazítani.

23

Vizsgált koncentrációkA tesztelt vegyi anyag minimum 5 koncentrációját

vizsgálni kell. a megfelelő koncentrációk kiválasztásában segítséget nyújthat a

vizsgált anyag toxicitására vonatkozó előzetes adatok

A legmagasabb vizsgált koncentráció nem haladhatja meg a tesztelt anyag oldhatósági határát.

Amennyiben a törzsoldat előállításához diszpergálószerre

24

van szükség, a végső koncentrációja nem lehet magasabb 0,1 ml/l-nél, és lehetőleg minden vizsgálati tartály esetén azonos mértékű kell legyen.

[18.]

Kontrollok számaA hígító víz kontrollok száma függ a vizsgálati

oldattól (minimum 1).

Ha diszpergálószert is használunk, akkor ugyanannyi diszpergálószeres kontrollra van szükség, mint ahány hígító vizes kontrollunk van.

25

a diszpergálószeres kontrollnak a diszpergálószert a legmagasabb vizsgált koncentrációval kell tartalmaznia [19.]

Analitikai ellenőrzésekA tesztelés alatt, mind az átfolyásos, mind a fél-

statikus vizsgálatok során a hígító és a mérgező törzsoldat áramlási sebességét naponta ellenőrizni kell.

A vizsgálat teljes időtartama során az anyag-koncentrációk értéke nem változhat több mint 10%-ot.

ha az anyagkoncentrációk várhatóan a névleges értékek20%-ba esnek, a legnagyobb és legkisebb koncentrációkat kell kielemezni

ahol a vizsgált anyag koncentrációja nem esik a névleges érték 20%-os tartományába (pl. a vizsgált anyag stabilitási adatai alapján), az összes vizsgálati koncentrációt elemezni kell

26

A vízkémiai paraméterek közül az alábbiakat kell mérni;

27

Folyamatos vizsgálatokA halakat naponta meg kell vizsgálni a

tesztelési időszakban és bármilyen külső rendellenesség (pl. vérzés, elszíneződés), vagy rendellenes magatartás feljegyzendő.

28

Az egyedpusztulásokat is fel kell jegyezni, majd a halegyedet a lehető leghamarabb el kell távolítani a tartályból.

az elpusztult halegyedeket nem szabad pótolni az eleségmennyiséget a megváltozott helyzetnek megfelelően módosítani kell

[ 20.]

A teszt befejezéseA vizsgálatot követően (28. nap után) az

összes életben maradt halegyedet lemérjük, mint nedves tömeget.

egyenként, egymástól függetlenül

Csoportokban is lemérhetjük őket a tartályok segítségével (ez a praktikusabb).

29

[ 22.]

[ 21.]

Eredmények értékeléseEredmények értékelése

30

[ 23.]

Növekedési rátaA növekedési rátát (r) többféleképpen lehet

meghatározni attól függően, hogy a halegyedeket egyedenként mértük le vagy tartályokkal együtt csoportosan.

Azon tartályok esetében, melyeknél a halálozási ráta magasabb, mint 10%, a növekedési rátát nem szükséges kiszámolni.

31

Mindegyik vizsgálati koncentrációhoz fel kell tüntetni a halálozási rátát.

[ 24.]

Eredmények értékelése regresszióanalízissel(koncentráció-hatás görbe)

Összefüggést teremtünk a specifikus növekedési ráta és a koncentráció között, ezáltal lehetővé téve az ECx értékek becslését.

Kiszámítjuk a tartályok átlagos specifikus növekedési rátáját (r2 értékét).

Ezzel a módszerrel számolhatunk kisebb méretű halfajok alkalmazása esetén is.

32

r2 = tartály átlagos specifikus növekedési rátája

w1, w2 = egy adott halegyed tömege t1 és t2 időpontokban

t1, t2 = a vizsgálati időszak eleje és vége (nap)

A tartályok átlagos specifikus növekedési rátáját(r2 értékeit) grafikusan ábrázoljuk a koncentrációk függvényében.

így megkapjuk a koncentráció-hatás összefüggés görbéjét, melyről leolvashatóak az ECx értékek

33[ 25.]

Eredmények értékelése varianciaanalízissel (ANOVA)

Minden vizsgált koncentráció esetében párhuzamos méréseket kell indítani.

Párhuzamos mérési sorozat esetén a NOEC és LOEC becslése a tartályok átlagos specifikus növekedési rátájának varianciaanalízisén alapszik (ANOVA).

A koncentrációkra vonatkozó átlagos növekedési rátákat (r) összemérjük a kontroll tartályokra vonatkozó átlagos növekedési rátákkal (0,05-ös szignifikancia szint mellett).

34

Ha a vizsgálat során nem indítunk párhuzamos méréseket, akkor a varianciaanalízis érzéketlenné válik.

Ebben az esetben a varianciaanalízist a halegyedekre értelmezett „látszólagosan” specifikus növekedési rátákra (r3) alapozzuk.

Minden egyes koncentráció átlagos „látszólagosan” specifikus növekedési rátáját (r3) a kontroll tartályok átlagos „látszólagosan” specifikus növekedési rátájával hasonlítjuk össze.

35

r2 = „látszólagosan” specifikus specifikus növekedési rátája

w1, w2 = egy adott halegyed tömege t1 és t2 időpontokban

t1, t2 = a vizsgálati időszak eleje és vége (nap)

Felhasznált irodalom:OECD GUIDELINE FOR THE TESTING OF

CHEMICALS (215) - Fish Juvenile Growth Test

36

Képek forrása: [1.]: http://www.geographic.hu/index.php?act=napi&rov=3&id=10233 [2.]: http://www.welcome.city.sapporo.jp/english/sites/sakekagaku.html [3.]: http://ucce.ucdavis.edu/datastore/datastoreview/

/showpage.cfm?surveynumber=241&usernumber=69 [4.]: http://fishindex.blogspot.com/2009/08/zebra-danio-danio-rerio.html [5.]: http://www.pwri.go.jp/team/suisitsu/index_e.htm [6.]: http://www.eduport.hu/cikk.php?

id=19065&PHPSESSID=kgcriugomqr [7.]: http://www.vanderbilt.edu/vicb/DiscoveriesArchives/

/focus_on_fish.html?ID=8272 [8.]: http://www.wellnesskozmetikum.com/szepsegapolas/

/egeszseges_ivoviz_lugos_alkalikus_ionizalt_viz/ [9.]: http://www.labornite.hu/index.php

37

[10.]: http://www.shigen.nig.ac.jp/medaka/medakabook//index.php?1.1.1%20tanks%20used%20in%20Nagoya%20Univ.

[11.]: http://www.umesc.usgs.gov/aquatic/drug_research/capabilities.html

[12.]: http://www.fws.gov/ennis/information.htm [13.]: http://blogs.clemetparks.com/rocky-river-fishing-report/2010/8/2/

/rocky-river-fishing-report-august-2010.html [14]: http://zebrafish.med.utah.edu/facility.php [15]: http://www.ars.usda.gov/is/AR/archive/oct10/fish1010.htm?pf=1 [16.]:

http://good-times.webshots.com/photo/2144686260089279034OXuAhn [17.]: http://www.understandinganimalresearch.org.uk/resources/

/images_library/details/37/rainbow_trout_aquarium_7/ [18.]: http://www.netambulancia.hu/erdekessegek?cPage=7 [19.]: http://conservationbytes.com/2010/11/25/

/environmental-testing-to-the-test/ [20.]: http://www.fws.gov/ennis/information.htm 38

[21.]: http://www.alohaecowas.com/talapia1.html [22]: http://www.northernwilds.com/pages/Explore/animals/

/bile-isnt-vile-identifying-the-scent-that-lures-tr.shtml [23.]: http://www.ars.usda.gov/is/AR/archive/oct10/fish1010.htm?

pf=1 [24.]:

http://www2.seattle.gov/util/tours/CedarRiverBiodiversity/BullTrout/

/slide3.htm

39