Upload
others
View
0
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
Kvantinių taškų panaudojimas
nanomedicinoje
Dr. V. Karabanovas
Kaunas, 2012
Vilniaus Universitetas
Proteomikos centras, Biochemijos institutas
Biomedicininės fizikos laboratorija, Onkologijos institutas
2007–2013 m. Žmogiškųjų išteklių plėtros veiksmų programos 3 prioriteto „Tyrėjų gebėjimų
stiprinimas“ VP1-3.1-ŠMM-05-K priemonės „MTTP tematinių tinklų, asociacijų veiklos
stiprinimas“ projektas „Lietuvos Biochemikų draugijos potencialo kurti žinių visuomenę
didinimas“ (Nr. VP1-3.1-ŠMM-05-K-01-022)
SEMINARO PLANAS
• Įvadas į nanomediciną. Nanodalelių įvairovė.
• Kvantiniai taškai. Sintezė ir optinės savybės.
• Kvantinių taškų taikymas in vitro: kaupimasis
ląstelėse, patekimo mechanizmų tyrimas,
viduląstelinis transportas, biologinis efektas.
• Kvantinių taškų taikymas in vivo: KT susikaupimas
odoje, panaudojimas limfmazgių vaizdinime bei
prasiskverbimas per placentos barjerą.
Įvadas. Nanomedicinos vizija
Robert A. Freitas Jr., “Current Status of Nanomedicine and Medical Nanorobotics” J.
Comput. Theor. Nanosci. 2(March 2005):1-25
Trumpiausią nanomedicinos apibrėžimą, matyt, yra
suformulavęs Robertas A. Freitas jaunesnysis:
„Nanomedicina – tai nanotechnologijų
panaudojimas medicinoje“
Ekspertai į nanomedicinos sritį žiūri labai plačiai
ir supranta, kad tai technologijos, kurios
naudoja molekulinius instrumentus ir žinias
apie žmogaus kūno sandarą medicininei
diagnostikai ir gydymui.
Nanotechnologijos pakeitė požiūrį į pacientą
Tikslingas vaistų pristatymas
Vaistų, baltymų ir genų lokalizavimas
kūne, ląstelėje, ląstelės viduje
Vaistų paieška
Didelio pralaidumo patikros (stebėjimo)
technologija. Rodmenys – ląsteliniai ir
biomolekuliniai
Novatoriškieji bioaktyvūs elementai,
aptinkami panaudojant nanotechnologijas
Novatoriškosios vaistų pristatymo
sistemos
Diagnostika
In vitro (sudėtinė detekcija) ir in vivo
Regeneracinė medicina
Medžiagos, skirtos ląstelių siunčiamų
signalų reguliavimui ir diferencijavimui.
Morfogenezės kontrolė, padedanti įvesti
funkcinę integraciją
1906 m. P.Erlichas pateikė koncepciją apie vaistus,
kurie labai tiksliai nukreipiami į pažaidos židinį, ir
pavadino juos magiškomis kulkomis (magic bullet).
Nanodalelių įvairovė
Plati medžiagų klasė. Junginiai, kurių dydis 1-100 nm:
Organinės ND: liposomos, “kietų” lipidų (solid lipid), dendrimerai, polimerinės ND,
hydrogelio ND ir kt...
Neorganinės ND: kvantiniai taškai, aukso, platinos, sidabro, feritinės ND,
nanokiautai
Nanodalelių charakteristikos
Užpildytos ar tuščiavidurės
Modifikuotas paviršius
Temperatūrai jautrus lipidai
Fotoliuminescencija
Šilumos sugėrimas
Magnetinės savybės ir kaitinimas
Vaizdinimo kontrastas
Kvantinis taškas – yra monodispersinė puslaidininkinė nanodalelė, kurios
dydis kinta nuo nuo 2 iki 10 nm. Dėka savo mažo dydžio jų energetinė struktūra
panaši į atomų struktūrą. Galima sutikti įvairios formos KT. Jie sudaryti iš kelių
dešimčių iki tūkstančių atomų.
~5 nm 5 nm 5 nm
Kvantiniai taškai. Sintezė ir optinės savybės.
1975m - Leo Esaki ir kt., krūvininkų judėjimo apribojimas vieną kryptimi kvantinėse
duobėse.
1980m. Teorinis darbas Dr. Ekimov ir Efros (Rusija)
bei Dr. Brus iš Bell lab. (Jav) pirma karta nustatė dydžio
kvantavimo efektus stikle turinčiame PbS.
1982m. Rosetti ir Brus pirmieji kvantinių taškų
liuminescencinių savybių tyrimai. Tyrinėjo CdS
kvantinių taškų koloidus ir pirmieji pasiūlė CdS
dengti ZnS, kadangi pamatė kad ženkliai padidėja fluorescencijos kvantinė išeiga.
1989m. Bell Lab. CdS-ZnS kvantinis taškas vandenyje.
1993m. Pirmoji aukštos kokybės monodispersinių CdS, CdSe ir CdTe
sintezė.
1995m. Dr. Guyot-Sionnest ir jo studentas Peggy Hines išvystė CdSe
padengimo ZnS metodą. Pirmieji pagamino aukštos kokybės CdSe-ZnS
kvantinį tašką.
1996m. Vandenyje tirpių CdTe kvantinių taškų sintezė.
1998m. Pirmieji kvantinių taškų taikymai biologijoje. (mikroskopija)
Istorija
Medžiagų įvairovė iš kurių galima pagaminti
kvantinius taškus
• Puslaidininkiai
– II-VI: CdSe, CdS, ZnSe,
– CdTe, PbS, PbSe
– III-V: GaAs, GaP, InP
– I-VII: CuCl, CuBr, AgBr
– Netiesiajuostis: Si
• Galima pagaminti iki 3.0±0.3 nm (CdTe)
Sintezės metodai
Pirolizė metaloorganinių junginių pvz: Cd(CH3)2 ir
SeTOP, TOPO 250-350oC.
Nusodinimo metodas CdSe KT iš vandeninių tirpalų
pvz: CdCl2 ir Na2Se, ligandai polifosforo ar merkapto
rūgštys.
KT sintezė terminio skaidymo metodu
Tai organometalinių junginių skaidymas
koordinuojančiuose tirpikliuose, esant atinkamam
chalkogenidui, 250 – 350 C temperatūroje. Kadmio
selenido sintezės pradinai junginiai - kadmio oksidas
ir selenas, koordinuojantys tirpikliai: trioktil fosfinas
(TOP), trioktil fosfino oksidas (TOPO) stearino
rūgštis (SA).
Temperatūros ir reakcijos laiko kontrolė !
400 450 500 550 600 6500,0
0,5
1,0
1,5
A
Op
tin
is t
an
kis
(op
t.t.
vn
t)
Bangos ilgis (nm)
CdSe 1 sintezė
CdSe 2 sintezė
CdSe 3 sintezė
CdSe 4 sintezė
CdSe 5 sintezė
CdSe 6 sintezė
Susintetintų CdSe KT optinės savybės
400 450 500 550 600 650 700 7500
100
200
300
400
500
600
700
B
CdSe 1 sintezė
CdSe 2 sintezė
CdSe 3 sintezė
CdSe 4 sintezė
CdSe 5 sintezė
CdSe 6 sintezė
Fo
toliu
min
esce
ncijo
s in
ten
syvu
ma
s(s
.v.)
Bangos ilgis(nm)
Sferinių
(CdSe)ZnS
nanodalelių
sintezė
2-50 nm
II_VI, IV-VI, III-V B gr.:
CdSe, CdS, CdTe,
ZnS, ZnSe, InSe, InS
ZnS, CdS
Pliusai
Puiki dydžio pasiskirstymo kontrolė
Puikus kvantinių taškų stabilumas
FL kvantinis našumas, padengus apvalkalu
padidėja >70%
Minusai
Netirpūs vandenyje
Didžiausia blogybė
Daug sunkiųjų metalų
Metalo organinės pirolizės metodas
Charakteringa KT struktūra
Branduolys/apvalkalas
(CdSe)ZnS KT
Šerdis CdSe KT
Organinis sluoksnis
(TOPO)
Hidrofobinis
Paviršiaus modifikacija
Ligando pakeitimas
TDPA
Oleino r.
TOPO TOP
HS-(CH2)n-COOH1
HS-CH2-CH2-NH22
Oligomeriniai fosfinai6,7
6. J.Am.Chem.Soc., 125 (2003) 14652-14653.
7. Nature Biotechn., 22 (2004) 93-97.
8. J.Am.Chem.Soc., 126 (2004) 6115-6123.
9. Chem. Mater., 15 (2003) 3125-3133.
Sintetiniai peptidai8
Dendrimerai9
1. J.Nanosci.Nanotechnol., 8 (2008) 1-7.
2. Nano Lett., 3 (2003) 503–507.
3. Anal.Biochem., 334 (2004) 257-265.
4. J.Am.Chem. Soc., 123 (2001) 4103–4104.
5. J.Am.Chem. Soc., 122 (2000) 12142-12150.
4
5
3
L-DPPC2
Micelių formavimas per hidrofobinę sąveiką
(fosfolipidai)
DSPE1
Hidrofilinis
Hidrofobinis
Hidrofilinis
1. Science, 298 (2002) 1759–1762.
2. Nano Lett., 5 (2005) 645–648.
Micelių formavimas per hidrofobinę sąveiką
(amfifiliniai polimerai)
1. Nat. Biotechnol., 21 (2003) 41–46.
2. Nano Lett., 4 (2004) 703–707
1, 2
CdSe-GSH sintezė vandeninėje
terpėje1
* glutationas
CdCl2 . 2,5H2O
Na2SeO3
Na3C6H5O7 . 2H2O
GSH*
Sintezė vyksta 20 min. 900C
temperatūroje.
DNR peptidas
baltymas antikūnas
KT apvalkalas
KT biomedicinininiams tyrimams
KT šerdis
Organinis sluoksnis
Modifikacija
KT – idealus fluoroforas nanovaizdinimui
Platus sugerties spektras
Didelis ekstinkcijos koeficientas (103-105M-1cm-1)
FL modifikuojama keičiant dydį
Ilgą sužadintos būsenos gyvavimo trukmė
Didelis fotostabilumas
Lengvai modifikuojamas paviršius hidrofiliniais ligandais
Paviršius lengvai modifikuojamas specifinio atpažinimo molekulėmis
Michalet, X. et al .Science, 2005, 307, 538; Bruchez, M.; et al. Science, 1998, 281, 2013, Chan,
W. C. W.; Nie, S. M. Science, 1998, 281, 2016.
Fluorescencinis vaizdinimas
Vištos embriono kraujagyslių vaizdinimas panaudojus organinį fluoroforą (FITC-
dextraną) – A ir kvantinius taškus – B. (Smith et al. 2007)
Fluorescencinis žmogaus epitelio ląstelių vaizdas. Dažyta 5 tipų (spalvų) KT,
kurie konjuguoti su skirtingais antikūnais (Delehanty et al. 2009).
Klasikinis Alexa-488 dažiklis (žalias), greit išblykšta, o KT (raudoni) – ne.
KT taikymas in vitro. Klausimai?
• Identifikuoti KT savybes kurios yra svarbios sąveikai
su ląstelėmis
• KT patekimo mechanizmai
• Viduląstelinis transportas
• Biologinis efektas
• Kaip KT paviršiaus modifikavimas gali padidinti ar
sumažinti jų patekimą
KT patekimas
500 550 600 650 700 7500
200000
400000
600000
549nm
630nm
QDs DME mediaP
L inte
nsity (
a.u
.)
Wavelength (nm)
Pagrindinis objektas :
CdSe
ZnS
COOH
CdSe/ZnS-COOH KT kaupimasis
NIH3T3 ląstelėse
Endocitozės mechanizmai
0 5 100 200 300 4000
50
100
150
200
250
300
350
PL inte
nsity (
a.u
.)
Incubation time (min)
4 0C Red-QD
37 0C Red-QD
40C
370C
Red-QD
Red-QD
KT susikaupimas energetiškai priklausomas?
Endocitozė ar difuzija? GFP kontrastas; KT mikroinjekcija
Red-QD Red-QD GFP
COOH-KT patekimo dinamika į NIH3T3 ląsteles
30’ 3 h 6 h 24 h
Struktūra
24h
3h
Priklausomai nuo patekimo
mechanizmo susidaro skirtingo
dydžio endosomos klatrino –
(~120 nm), kaveolino – (~60 nm)
ir klatrino –bei kaveolino-
nepriklausomos (~90 nm).
Inhibitorinė
analizė
Kolokalizacija
Kas atsakingas klatrinas ar kaveolinas?
Cav1 QD LacCer QD Clathrin QD
Viduląstelinis vėzikulių transportas
• Rab baltymų šeima: Rab GTPases reguliuoja membranos
transportą, įskaitant vezikulių formavimąsi, vezikulių judėjimą,
membranų susiliejimą.
NIH3T3 ląstelių transfekcija e-GFP vizualizuojant Rab5-wt
Rab5wt
1h
3h
EE
24h
Viduląstelinis vezikulių transportas
• Rab5 baltymas: ankstyvos endosomos, klatrinų dengtos vezikulės,
Viduląstelinis vezikulių transportas
• RQDs and Trf-Alexa susikaupimas NIH3T3 ląstelėse
Trf-FITC konjugatas 1h 2h
Vezikulių susiliejimas ir sortavimas
3h 3h
Vezikulių susiliejimas ir sortavimas
480 500 520 540 560 580 600 620 640 6600
500
1000
1500
2000
2500
RQDs
Trf-Alexa conjugate
FL
in
ten
sit
y (
a.u
.)
Wavelength (nm)
1
2
3
24h su Trf-Alexa 24h su Trf-Alexa
Kodėl KT vėzikulės po susiliejimo su klatrino
vėzikulėmis kaupiamsi MVK
COOH-ND viduląstelinis transportas NIH 3T3 ląstelėse
COOH-KT viduląstelinis transportas NIH 3T3 ląstelėse
Ankstyvosios endosomos Vėlyvosios endosomos Lizosomos
COOH-ND galutinė lokalizacija: multivezikulinės struktūros
(MKV)
QD QD
• KT fotoatsistatymas and fotoblukimas Trf-FITC konjugatų
0min Po 2 min.
0min 10min 25min
Švitinimas 488nm po 24h ND
inkubavimo ląstelėse
Vėlyvoji patekimo fazė: inhibavimo signalo generavimas
Inhibavimas nuo cholesterolio raftu/kaveolino
priklausomos endocitozės
Cav-1 kiekis (žalias) po 24h poveikio su KT
Kas atsakingas už
inhibavimą?
Kaip KT kaupiasi vėžinėse ląstelėse?
MCF-7
HepG2
24h 48h 60h
Vaizdas iš viršaus
Vaizdas iš apačios
Receptoriai ekspresuojami
vėžinių ląstelių membranoje
Adaptuota iš A.H Shim et al., PNAS, 2010
Trombocitų kilmės augimo veiksniu (PDGF)-modifikuoti KT
COOH-KT modifikavimas PDGF-BB
QD
QD-PDGF
PDGF-KT
COOH-KT
30’ 3 h 24 h
PDGF-KT patekimo dinamika
Inhibitorinė analizė
PDGF-KT viduląstelinis transportas NIH 3T3 ląstelėse
Klatrinas Ankstyvosios
endosomos
Vėlyvosios endosomos Lizosomos
Clathrin QD EEA1 QD
Vps4 QD Lysotracker QD
2h 48h COOH-QD
Kaupimasis PDGF-KT HepG2 ląstelėse
PDGF-QD
KT (PDGF-KT) aktyvuoja PDGF receptoriaus autofosforilinimą
Biologinis efektas
24h ND 24h PDGF-ND
ND (PDGF-ND) indukuoja DNR sintezė
COOH-KT poveikis ląstelių migracijai
Apibendrinimas
COOH-KT poveikis proteomai
Atsparumas stresui Ląste
lių g
yvybin
gum
as (
pro
c.)
K K K KT KT
0,075 μg/ml CisPlatina 24 h.
0,5 μg/ml CisPlatina 24 h.
KT taikymas in vivo. Klausimai?
• Pasiskirstymas organizme priklausomai nuo KT
įvedimo būdo
• Farmakokinetika
• KT prasiskverbimas per placentos barjerą
Suleidimas į paodę. KT susikaupimas odoje.
KT neprasiskverbia per bazinę membraną, nepatenka į plauko
folikulus, prakaito liaukas ir kt. – jų migracija iš esmės skiriasi nuo
mažų organinių junginių.
KT yra endocituojami odoje esančių ląstelėje. Tai sąlygoja jų ilgalaikį
susikaupimą odoje, galimą vaisto pristatymą į ląstelę arba priešingai
– toksiškumą.
KT susikaupimas limfmazgyje
Suleidimas į kraujotaką KT
farmakokinetika kraujyje
550 600 650 700 7500
20
40
60
FL
in
ten
syvu
ma
s,
s.v
.
Bangos ilgis, nm
Kontrole
0.5 h
1 h
1.5 h
2 h
2.5 h
3 h
4 h
5 h
6 h
Kraujo plazmos tirpalų fluorescencijos ir sugerties spektrai. FL spektrai
normuoti ties 590 nm, λžad=480nm.
350 400 450 500 550 600 6500.0
0.5
1.0
1.5
2.0
Optinis
tankis
, o.t
.v.
Bangos ilgis, nm
Kontrole
0.5 h
1 h
1.5 h
2 h
2.5 h
3 h
4 h
5 h
6 h
zad=480nm
KT farmakokinetika kraujyje
0 3 6 9 12 15 18 21 240
20
40
60
FL m
aks,
s.v
.
Laikas, val
0309
0301
1216
1220
0322
Originalios ir normuotos FLmaks kitimo kreivės. Didžiausia KT
koncentracija kraujyje stebima praėjus 2-4 val po suleidimo.
0 3 6 9 12 15 18 21 240.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
FL
in
ten
syvu
ma
s,
s.v
.Laikas, val
0309
0301
1216
1220
0322
KT pasiskirstymas kraujagyslėje.
Histologinis bandinys.
KT kompleksai kraujagyslėje:
Naudojant 457nm lazerį ir x60/1,4 objektyvą, Dteor.~200 nm.
Taigi KT kompleksai yra mažesni už mikroskopo skiriamąją
gebą. Jų dydis gali būti nuo <0,4 μm iki 3 μm.
0 200 400 600 800 1000 12000
50
100
150
200
FL
in
ten
syvu
ma
s,
s.v
.
x, nm
375 nm
KT kraujo plazmoje aplipę eritrocitus
KT pasiskirstymas žiurkės organuose po 3h
550 600 650 700 7500.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
FL
in
ten
syvu
ma
s,
s.v
.
Bangos ilgis, nm
Sirdis
Raumuo let
Plauciai
Kepenys
Ciobrialiauke
Bluznis
Inkstas
balta šviesa UV (atspindys) (fluorescencija)
Gimdos ragai
su embrionais
KT prasiskverbimas per placentos barjera:
550 600 650 700 7500
1
2
3
PL
in
tensity,
a.u
.
Wavelength, nm
Gimda
Gimdos kontrole
KT
550 600 650 700 7500
1
2
3
FL
in
ten
syvu
ma
s,
s.v
.
Wavelength, nm
Placenta
Placenta control
550 600 650 700 7500
1
2
3
PL inte
nsity,
a.u
.
Wavelength, nm
Embrionas
Embrionas kontrole
KT susikaupimas reprodukciniuose organuose:
550 600 650 700 7500
1
2
3
PL inte
nsity,
a.u
.
Wavelength, nm
Trynio maiso placenta
Trynio maiso placenta kontrole
Žiurkės organų FL spektrai, praėjus 3 val po KT injekicjos. Kontroliniam
gyvūnui nebuvo leista KT.
Konfokalinė mikroskopija: KT (raudoni) susikaupimę placentoje,
bet ne embrione.
“Tobula” nanodalelė:
Ateitis
Toksiškumas
Turi būti ištirtas, kadangi yra žinoma,
kad kai kurios nanodalelės yra
sudarytos
iš sunkiųjų metalų junginių, kurie yra
toksiški.Nanodalelių toksiškumą galima
reguliuoti,naudojant skirtingas jų
Paviršiaus padengimus.
Nanodalelių ateitis – biovaizdinimo ir terapijos
agentai. Po injekcijos nanodalelės patenka į
naviką ir yra detektuojami PET/MRI/NIR.
Realiame laike navikas diagnozuojamas
panaudojant konfokalinį kateterių arba imant
biopsiją fluorescencinei analizei. Gydymas
realizuojamas dėka nanodalelių rentgeno arba
infraraudonų spindulių sugerties, kurios metu
generuojami laisvieji radikalai.
Nanotechnologijų klinikinis taikymas
Dabar 2020
Ačiū už dėmesį!