DOKTORI ÉRTEKEZÉS

Közvetlen ionizációs tömegspektrometriás módszerek

fejlesztése – Biomedicinális alkalmazások

Dénes Júlia

Eötvös Loránd Tudományegyetem, Természettudományi Kar, Kémia Doktori Iskola

Vezető: Dr. Inzelt György

Analitikai, kolloid- és környezetkémiai, elektrokémiai program

Vezető: Dr. Záray Gyula

Témavezető: Dr. Takáts Zoltán

Semmelweis Egyetem, CellScreen Alkalmazott Kutatási Központ

Budapest

2010

1

Tartalomjegyzék

1. Irodalmi áttekintés 3

1.1. Bevezető 3

1.2. Biológiai minták tömegspektrometriás vizsgálata 4

1.2.1. Kapcsolt technikák 4

Gázkromatográfia-tömegspektrometria 5

Ionizációs technikák: EI, CI 6

Alkalmazások 7

Nagy teljesítményű folyadékkromatográfia-tömegspektrometria 8

Ionizációs technikák: ESI, APCI 10

Alkalmazások 12

1.2.2. Felületvizsgálati módszerek 15

A deszorpciós ionizációs módszerek rövid története 15

Secondary Ion Mass Spectrometry 17

Lézer deszorpciós ionizációs technikák 18

Az atmoszférikus nyomású deszorpciós ionizációs módszerek 22

Folyadék extrakciós módszerekkel kapcsolt technikák 23

Neutrális deszorpcióval kapcsolt technikák 27

1.2.3. Biológiai szövetek közvetlen vizsgálata 31

2. Az irodalmi bevezető összefoglalása, a témaválasztás indoklása 33

3. Kísérleti rész 36

3.1. Szilárd fázisú extrakció és deszorpciós ionizáció kombinációja 36

3.1.1. Bevezető 36

3.1.2. Az SPE patron fejlesztése 39

3.1.3. A SPEEDI-kártya fejlesztése 44

2

3.1.4. Az elútor egységek kifejlesztése 46

3.1.5. Műszeres eszközfejlesztés 50

3.2. Natív szövetminták vizsgálata DESI és REIMS módszerrel 52

3.2.1. Bevezető 52

3.2.2. Az interfész kifejlesztése, optimalizáció 55

4. Eredmények 61

4.1. A SPEEDI módszer 61

4.1.1. Optimalizálás egycsatornás elúcióra 61

4.1.2. Valós minták mérése, optimalizálás 96 csatornás elúcióra 68

4.1.3. Mérések kártyaformátumban 78

4.2. A REIMS módszer 83

4.2.1. Az ionizáció mechanizmusának tanulmányozása 83

4.2.2. Az ionforrás optimalizációja egészséges állati szövetekre 87

4.2.3. Szövetek azonosítása főkomponens analízissel 91

4.2.4. A táplálkozás hatása a szövetek foszfolipid összetételére 95

4.2.5. Tumoros szövetek vizsgálata 96

5. Következtetések 99

6. Irodalomjegyzék 100

7. Köszönetnyilvánítás 111

8. Összefoglalás 112

9. Abstract 113

3

1. Irodalmi áttekintés

1.1. Bevezető

A biológiai eredetű minták analitikai vizsgálata mind a biokémia, mind az

orvostudomány szempontjából alapvető jelentőségű. A jelenleg ismert biokémiai folyamatok

molekuláris szintű megismerése ugyanis csak ezen a módon valósítható meg, azaz minden

egyes biokémiai folyamat leírása mögött hatalmas mennyiségű analitikai információ áll, vagy

kell, hogy álljon. A tömegspektrometria (MS: mass spectrometry) ezen vizsgálatok területén

mindig is kitüntetett szerepet élvezett, köszönhetően a módszer molekuláris szelektivitásának,

a párhuzamos kvalitatív és kvantitatív meghatározás lehetőségének és nem utolsó sorban a

tömegspektrometriás adatok egyszerű értelmezhetőségének.

Bár a tömegspektrometria hagyományosan csak illékony vegyületek vizsgálatára volt

alkalmas, megfelelő származékképzéssel a biológiai szempontból fontos kisméretű molekulák

tömegspektrometriás vizsgálata már az 1960-as évektől fogva megoldható volt. A

tömegspektrometria bioanalitikai alkalmazásában az igazi forradalmat azonban a deszorpciós

és spray ionizációs technikák kifejlesztése hozta. Ezen ionizációs módszerekkel ugyanis

lényegében tetszőleges méretű, polaritású, és termikus stabilitású molekula ionizálhatóvá vált.

Ilyen módon lehetőség nyílt peptidek, fehérjék, oligoszacharidok, komplex lipidek,

nukleinsavak és egyéb fontos molekulák származékképzés nélküli közvetlen

tömegspektrometriás vizsgálatára, valamint ezen vegyületcsoportok elválasztására szolgáló

kromatográfiás technikák esetén a közvetlen tömegspektrometriás detektálásra.

A bioanalitikai tömegspektrometriában a következő fordulatot az úgynevezett

közvetlen ionizációs technikák megjelenése jelentette. Ezek a technikák fenomenológiailag az

atmoszférikus nyomású deszorpciós ionizációs technikák közé tartoznak, és közös

jellemzőjük, hogy képesek különböző minták előkészítés nélküli vizsgálatára. Bioanalitikai

alkalmazások szempontjából a mintaelőkészítés elhagyása egyrészt lehetővé teheti az ultra

nagy sebességű (HT: high-throughput) analízist, másrészt pedig az élő rendszerek közvetlen

vizsgálatát. Doktori munkám során az elsődleges cél ezen lehetőségek kihasználása volt, azaz

a direkt ionizációs tömegspektrometria alkalmazása biológiai minták nagy sebességű

vizsgálatára, valamint élő szövetek vizsgálatára alkalmas direkt ionizációs

tömegspektrometriás módszer kifejlesztése.

4

1.2. Biológiai minták tömegspektrometriás vizsgálata

A biológiai minták vizsgálata mind komplexitás, mind pedig a vizsgálandó molekulák

érzékenysége szempontjából komoly kihívást jelent a spektroszkópiai alapú analitikai

technikák számára. A spektroszkópiai módszerek ideálisan olyan módon alkalmazhatóak

minőségi illetve mennyiségi analízisre, hogy a vizsgálandó molekulát egymagában vagy egy

zavaró komponenseket nem tartalmazó egyszerű keverék formájában (tiszta oldat) juttatjuk a

vizsgálóműszerbe. Gyakorlati alkalmazások esetében ez általában nem megvalósítható,

mindazonáltal arra törekszünk, hogy a spektroszkópiás-spektrometriás eszközbe egy adott

időpillanatban bejutó minta minél egyszerűbb összetételű legyen, és minél kevesebb zavaró

komponenst tartalmazzon a vizsgálandó speciesz mellett. Ennek a leggyakoribb megvalósítási

módja a minták pre-frakcionálása (tipikusan extrakcióval vagy kicsapással), a megfelelő

frakció komponenseinek kromatográfiás elválasztása, majd a szétválasztott komponensek

spektroszkópiás-spektrometriás detektálása. Biológiai minták esetében – tekintettel a több

százezer komponensre, amelyek mintegy 15 nagyságrend koncentrációtartományban

fordulnak elő – ez a megközelítés a leginkább elfogadott.

1.2.1. Kapcsolt technikák

A tömegspektrometriás módszerek bár képesek többféle molekula párhuzamos

detektálására, ez szinte minden esetben csökkenti a módszer érzékenységét, illetve gyakran a

specificitását is. Az érzékenység csökkenése egyrészt magából az ionizációs folyamatból

következik (szupresszió), másrészt pedig a készülék működési ciklusából, mivel lecsökken az

egy molekulára jutó mérési idő. A szupressziós folyamatok általában a termodinamikailag

kontrollált ionizációs technikák esetében jelentkeznek, ahol a két speciesz közti töltéscsere-

reakció szabadentalpia változása (a koncentráció értékekkel együtt) meghatározza az ionok

intenzitás-arányát. További korlátozó tényezőt jelent a tömegspektrometriás módszer

felbontása. Az egyszerűbb (és ennek megfelelően olcsóbb) tömegspektrométerek csak

egységnyi m/z felbontásra képesek, így azonos nominális tömegű molekulák (pl. lizin-

glutamin) nem detektálhatóak külön. (Az adott példa esetében még MS/MS módszerrel sem,

lévén mind a két molekula elsősorban semleges ammóniavesztés útján fragmentálódik.)

Izomer molekulák esetében pedig az egyszerű tömegspektrometriás elkülönítés felbontástól

függetlenül nem valósulhat meg, bár a sztereoizomerek kivételével, tipikusan MS/MS

5

módban szelektíven detektálhatóak. Ezen faktorok ismeretében a meglehetősen komplex

biológiai rendszerek vizsgálatára szinte minden esetben kromatográfiával kapcsolt

tömegspektrometriás meghatározást alkalmaznak.

Gázkromatográfia-tömegspektrometria

A gázkromatográfiát (GC: gas chromatography) és a tömegspektrometriát külön-külön

már az ’50-es években rutinszerűen alkalmazták illékony vegyületek analízisére. A

tömegspektrometriában ekkor elterjedten alkalmazott elektronütközéses ionizációs eljárás

(lásd ionizációs technikáknál) azonban összetett minták esetén a kiterjedt fragmentáció miatt

nem szolgáltatott megfelelő molekulaspecifikus ionformációt. Ezért merült fel az igény az

elválasztástechnikai eljárás és a tömegspektrometriás analízis összekapcsolására [1-2]. A két

technika ötvözése ideális módszernek bizonyult az összetett minták vizsgálatában.

Gázkromatográfiásan illékony és kevésbé illékony vegyületek elválasztása valósítható meg

hatékonyan, míg a tömegspektrometriás detektálás lehetőséget biztosít a komponensek

azonosítására. A két technika a lényeges szempontokat tekintve kompatibilis, ugyanis kis

mennyiségű (tipikusan nanogramm), gázfázisú minták elemzésére alkalmasak; azonban fontos

különbség, hogy a GC esetében atmoszférikus körüli nyomáson, vivőgáz segítségével történik

a minta komponenseinek elválasztása, míg a tömegspektrometriás elemzés csak vákuumban

lehetséges. A kombinált technika legfontosabb része tehát az interfész, ennek technikai

megvalósítása volt a legnagyobb kihívás a módszer fejlesztésében. Interfésznek nevezzük

ebben az esetben tehát azt az összekötő elemet, mely a kromatográfiás elválasztás és a

tömegspektrometriás analízis közötti kapcsolatot biztosítja, vagyis a nyomásbeli különbség és

legtöbb esetben az ionizáció problémájára is szolgáltat megoldást. Az első interfész esetében a

GC-ből kiáramló gázelegy nagy részét (95-99 %) egyszerűen kiengedték a levegőbe, csak

annyit vezettek be a tömegspektrométerbe, amennyit a pumpák teljesítménye megengedett.

Így azonban jelentősen lecsökkent a módszer érzékenysége az anyagveszteség miatt, ezért

hamarosan megszületett az első olyan interfész technika, amely azután széles körben el is

terjedt. A jet szeparátornak nevezett eszköz azon az elven működik, hogy a vivőgáz és az

analit molekulák diffúziós együtthatója jelentősen eltér a méretkülönbségből adódóan [3]. A

GC oszlopról érkező gázelegyet egy szűk kapillárison vezetik keresztül, mely egy csökkentett

nyomású (kb. 10-2 torr) kamrába vezet. A nagy diffúziós együtthatóval rendelkező vivőgáz

(általában hélium vagy hidrogén) a kapillárisból széles szögben áramlik ki, míg a kisebb

együtthatójú szerves molekulák keskenyebb szögben. A kapilláris végével szemben lévő

tömegspektrométer bevezető nyílásába a szerves molekulák bejutnak, a vivőgáz részecskéi

6

elkerülik, míg végül a csökkentett nyomást létrehozó pumpa eltávolítja őket a kamrából.

Töltetes oszlopok esetén a gáz áramlási sebessége 10 ml/min nagyságrendű. A régebben

alkalmazott diffúziós vákuumpumpák teljesítménye ehhez nem volt megfelelő, ezért

alkalmazták a jet szeparátort interfészként. A mai GC-MS rendszerekben kapilláris oszlopot

alkalmaznak, kis vivőgáz áramlási sebességgel (1-2 ml/min), ami lehetővé teszi, hogy a GC-

ből egyenesen az ionforrásba juthasson a minta, mivel a mai turbószivattyúk teljesítménye

elegendő a vákuum fenntartásához.

Ionizációs technikák: EI, CI

A tömegspektrometriás analízis első lépése az ionképzés. Ez a folyamat többféle

módon valósulhat meg. A GC-MS esetében kétféle ionizációs technikát alkalmaznak

leggyakrabban, az elektronütközéses ionizációt (EI: electron impact), illetve a kémiai

ionizációt (CI: chemical ionization). Az EI az egyik legrégebbi és leggyakrabban alkalmazott

ionizációs technika [4]. Az ionforrásba bejutott molekulákat szabad elektronokkal

bombázzuk, ennek hatására a molekulákból M+. gyökionok jönnek létre. Mivel a keletkező

molekulaionok belső energiaszintje meglehetősen magas, ezért jól reprodukálható módon,

különböző fragmens ionokra esnek szét. A fragmentáció gyakran annyira kiterjedt, hogy a

spektrumban maga a molekulaion nem is jelenik meg; ennélfogva az EI ionizációt a kemény

ionizációs technikák közé soroljuk.

A kémiai ionizáció [5] során a szabad elektronok először egy úgynevezett reagens gáz

molekuláival ütköznek, amely az analit molekulákhoz képest nagy (általában 105-szeres)

feleslegben van jelen az ionforrásban. Reagens gázként leggyakrabban metánt, ammóniát

vagy izobutánt szoktak alkalmazni. A reagens gáz molekuláiból tipikusan EI ionizációs

mechanizmus, fragmentáció, illetve intermolekuláris proton transzfer útján protonált (vagy

deprotonált) páros elektronszámú (azaz nem gyök jellegű) ionok keletkeznek. A tényleges

ionizáció során az analitmolekulák proton-transzfer reakcióba lépnek az ilyen módon létrejött

reagens ionokkal és a reakció során ismételten páros elektronszámú, protonált vagy

deprotonált molekulaionok jönnek létre. A keletkezett molekulaionok kezdeti belső energiája

egyértelműen a proton transzfer reakcióhoz tartozó entalpiaváltozás függvénye. Ez tipikusan

lényegesen alacsonyabb, mint az EI ionizáció során keletkezett molekulaionok belső

energiája, valamint a protonált molekulaionok lényegesen stabilabbak; ennélfogva a kémiai

ionizációt csak kis mértékű fragmentáció kíséri. A kémiai ionizáció előnye, hogy egyféle

molekulából egyféle ion keletkezik, és az ion tömege egyértelműen mutatja a molekula

tömegét. Ez különösen előnyös összetett keverékek elemzésénél, azonban a kémiai ionizáció

7

során nyert spektrum – az EI spektrumokkal ellentétben – nem alkalmas a molekula

egyértelmű, szerkezeti szintű azonosítására.

Alkalmazások

A GC-MS módszert apoláris, termikusan stabil, illékony vegyületek analízisében

alkalmazhatjuk. Mivel a biológiai mintákat alkotó molekulák többsége nem ilyen, ezért az

analízist az esetek többségében származékképzési reakció előzi meg, melynek során az analit

polaritását csökkentjük; illetve növeljük a termikus stabilitást és az illékonyságot. Annak

ellenére, hogy így az analízis ideje jelentősen megnő, még mindig kiterjedt a technika

alkalmazási területe, mivel a GC oszlop hosszúsága miatt az elválasztás hatékonyságában

nehéz felvenni a versenyt a módszerrel. A biológiai minták analízisében könnyedén

találhatunk példát olyan alkalmazásra, melyekhez ma is szinte kizárólag a GC-MS technikát

alkalmazzák.

Ezek közül a legtipikusabb példa a vizelet szerves savtartalmának meghatározása,

mely az anyagcsere betegségek diagnosztikájának egyik alapvető módszere. Ennek GC-MS

technikával történő meghatározására 1971 óta [6] lényegében ugyanazt az analitikai módszert

alkalmazzák az orvosi laboratóriumi gyakorlatban. A vizelet szerves sav profilját

hidroxilaminnal és bisz(trimetilszilil)-trifluoroacetamiddal (BSTFA) való származékképzési

reakciót követően határozzák meg.

A szteroidok meghatározása mind az anyagcsere rendellenességek vizsgálatában, mind

az egyre nagyobb jelentőségű sportolói dopping analízisben fontos szerepet tölt be. Ma az

irodalomban már folyadékkromatográfiás-tömegspektrometriás (lásd az alábbiakban)

módszereket is találhatunk a detektálásukra, de a laboratóriumi gyakorlatban még mindig a

GC-MS technikát alkalmazzák rutinszerű meghatározásukhoz. A származékképzési reakció a

szteroidok esetén is általában szililezés (MSTFA: N-metil-N-(trimetilszilil)-

trifluoroacetamid), vagy fluoroacil származékokkal (pl. TFA: trifluoroecetsav anhidrid)

történő reakció [7-8].

Az élelmiszeranalitika és a mikrobiológiai kemotaxonómia egyik fontos módszere a

zsírsav-összetétel meghatározása. Mivel ezen vegyületeknek számos fajtája (2-től 26-ig

terjedő szénatomszám, kettőskötések száma, helyzete, térállása) fordul elő a természetben, a

vizsgálandó minták meglehetősen összetettek, így a mai napig GC vagy GC-MS módszert

használnak az analízisükre. A zsírsavak a szabad karboxil csoport jelenléte miatt kevéssé

illékonyak, ezért az analízist megelőzően metil-észter származékot képeznek belőlük,

katalitikus alkilezési reakcióban (leggyakrabban bórtrihalogenid és metanol jelenlétében) [9].

8

A tandem tömegspektrometria (MS/MS) megjelenésével a GC-MS technikának újabb

alkalmazásai is születtek [10]. Az MS/MS lényege, hogy a fragmensionok további

fragmentációjára van lehetőség a tömegspektrométer analizátorában, amely növeli a módszer

érzékenységét, több szerkezeti információt szolgáltat, s így az összetett minták hatékonyabb

vizsgálatára ad módot. Ezt technikailag úgy lehet megoldani, hogy vagy térben (mágneses

szektor, kvadrupól, repülési idő), vagy időben (lineáris ioncsapda, ioncsapda, ion ciklotron

rezonancia, orbitrap) elkülönülve történnek a fragmentációs lépések.

Az újabban fejlesztett elválasztási és detektálási technikák, mint a két dimenziós GC

(GC×GC), illetve a repülési idő analizátorral kapcsolt GC-k, növelni tudták az analízis

hatékonyságát [11], de a biológiai minták vizsgálatában a ’80-as évektől kezdve fokozatosan a

folyadékkromatográfiával kombinált módszerek vették át a vezető szerepet.

Nagy teljesítményű folyadékkromatográfia-tömegspektrometria

A GC-MS módszer mintaelőkészítése során alkalmazott származékképzési reakciók

sok esetben megfelelőek arra, hogy egy nem illékony molekulát illékonnyá tegyenek, azonban

számos olyan molekula létezik, melyek ezen az úton sem tehetők mérhetővé. Az ilyen típusú

molekulák esetében folyadékkromatográfiát célszerű alkalmazni. A folyadékkromatográfia

(LC: liquid chromatography) működési elve, hogy a vegyületeket az állófázishoz való

különböző mértékű adszorbciós affinitásuk alapján választjuk szét. A klasszikus

folyadékkromatográfiás eljárás elválasztóképessége – az oszlop hosszúsága és így az elméleti

tányérszám alapján – a gázkromatográfiás módszerhez képest meglehetősen gyenge. Nagyobb

nyomás alkalmazásával azonban a folyadék lineáris sebessége nő, ezért csökken az analit

lineáris diffúziója az oszlopon, és nő az elválasztás hatékonysága. A maximálisan 400 bar

nyomáson működő technikát nevezzük nagy teljesítményű folyadékkromatográfiának (HPLC:

high performance liquid chromatography). A közelmúltban kerültek kereskedelmi forgalomba

olyan HPLC rendszerek, melyek már 1000 bar körüli nyomást képesek elérni, ezeket UPLC-

nek nevezzük (ultra performance liquid chromatography, ultranagy teljesítményű

folyadékkromatográfia). Az UPLC oszlopok elméleti tányérszáma már nagyságrendileg

megközelíti a GC rendszerekét.

Az LC, vagy HPLC elválasztást követően a ’70-es évekig kizárólag UV detektálást

alkalmaztak. Ez a módszer azonban számos hátránnyal rendelkezik, úgymint UV-kromofór

molekulák jelenlétének szükségessége, kis érzékenység, a specifitás és az univerzalitás

hiánya. A tömegspektrometria, mint detektálási módszer azonban molekulaspecifikus és

univerzális, így a folyadékkromatográfiával összekapcsolva sok problémára megoldást tudott

9

nyújtani. A HPLC-MS széleskörű elterjedése, a GC-MS módszer visszaszorulásával szemben,

annak köszönhető, hogy egyrészt lehetővé vált a különböző polaritású vegyületek analízise

származékképzési reakció alkalmazása nélkül, másrészt a folyadék fázisú analízishez nem

szükséges magas hőmérsékletet és a vegyületek illékonysága sem. Mivel a HPLC módszerben

folyadékot alkalmazunk az elúcióhoz, ezért az interfész fejlesztése nagyobb kihívás volt, mint

a GC-MS rendszerek esetében. A legjobb megoldást erre a problémára a spray ionizációs

módszerek megjelenése jelentette, azonban érdemes megemlíteni a korábban alkalmazott

megoldásokat is. Az első kereskedelmi forgalomban is kapható interfész, az úgynevezett

moving-belt („futószalag”) volt [12]. Az LC-ből érkező folyadék egy mozgó, saválló acélból

készült szalagra kerül, ahonnan a folyadék nagy részét külső melegítéssel elpárologtatják. A

további illékony komponensek eltávolítása egymás után elhelyezett, egyre nagyobb vákuumot

biztosító pumpák segítségével történik. A szalagon visszamaradó analit bekerül az

ionforrásba, ahol termikus deszorpciós folyamat során kerül gáz halmazállapotba, illetve

ionizálódik. A módszer egyik hátránya, hogy a nem illékony vegyületek egy része nem képes

ionizálódni termikus deszorpcióval sem, később emiatt ötvözték a moving-belt interfészt a

FAB ionizációval (lásd 1.2.2.), de az egyszerűbb technikák megjelenésével a módszer nem

tudott széles körben elterjedni. A particle beam („részecske nyaláb”) nevű interfész típus

kifejlesztése volt a következő lépés a spray módszerek kialakulása felé [13]. A folyamat

három jól elkülöníthető lépésből áll, az első a porlasztás, melynek során aeroszol képződik a

folyadék halmazállapotú mintából. A cseppek deszolvatációja egy fűtött kamrában történik

vivőgáz segítségével, majd a mintát egy jet szeparátoron vezetik keresztül a

tömegspektrométer ionforrásába, ahol legtöbbször elektronütközéses ionizációval keletkeznek

a detektálható ionok, tehát a módszer eredményeként EI típusú spektrumhoz jutunk. A

thermospray ionizáció megjelenésével kezdődött el az a folyamat, melynek során az LC-MS

módszerek lassan átvették a GC-MS módszerek helyét, ugyanis az előzőekben ismertetett

technikák egyike sem bizonyult elég univerzálisan alkalmazható módszernek; valamint ez

volt az első olyan interfész, amely egyúttal ionforrásként is szolgált. A thermospray lényege,

hogy a folyadék fázisú minta egy kontrolláltan fűtött kapillárison halad át, és a hőmérséklet

hatására részben még a kapillárisban elpárolog. A keletkezett gőz a kapillárisból kilépve

porlasztógázként viselkedik a hőtágulás hatására, így kis cseppek képződését okozza. A

cseppek az interfész fűtött régióján áthaladva deszolvatálódnak. Az ionképződés módja függ

az analit és az oldószer minőségétől, illetve hogy alkalmazunk-e a spray után EI ionizációt is.

Leggyakrabban az ionok már a folyadékfázisban jelen vannak (hasonlóképpen az elektrospray

ionizációhoz, lásd az alábbiakban), és deszolvatáció útján kerülnek gáz halmazállapotba. Ha

10

azonban a sprayben a teljes minta elpárolog, akkor az ilyen módon keletkező gázfázisú minta

ionizálható EI/CI körülmények között is. A termospray interfész és ionizációs technika jóval

egyszerűbben, és szélesebb körben használható, mint az elődei, így számos publikáció

született az alkalmazásáról [14]. Egyik hátránya azonban, hogy nagyobb tömegű molekulák

analízisére nem alkalmas, és a jóval érzékenyebb elektrospray módszer megjelenésével mára

elveszítette jelentőségét.

Ionizációs technikák: ESI, APCI

Az elektrospray (ES: electrospray) tömegspektrometriás ionforrásként való

alkalmazása John B. Fenn nevéhez fűződik. A módszernek a biomolekulák analízisében

betöltött fontos szerepéért 2002-ben Nobel díjjal tüntették ki a feltalálóját [15]. Az

elektrospray lényege, hogy az analitot tartalmazó folyadékból, statikus nagyfeszültség

hatására kis cseppekből álló, elektromosan töltött aeroszol keletkezik. A folyadék

halmazállapotú mintát egy kapillárisba vezetjük, és a kapilláris, valamint a

tömegspektrométer atmoszférikus interfésze között néhány kV potenciálkülönbséget hozunk

létre. A folyadék a kapillárist elhagyva az elektrospray folyamat következtében nagy felületi

töltéssel rendelkező cseppekre szakad szét, melyek az interfész atmoszférikus régiójában az

ellenelektród felé haladva folyamatosan oldószert veszítenek. Egy bizonyos cseppméret

elérésekor, mikor a felületi töltések közötti taszítás nagyobb, mint a cseppet összetartó felületi

feszültség (Rayleigh-határ), a csepp szétrobban (Coulomb robbanás) és még kisebb cseppek

keletkeznek belőle. Ezt a folyamatot segédgázzal, leggyakrabban nagy sebességű nitrogén

árammal, illetve fűtéssel segítik. A gázfázisú ionok képződésére két fő elmélet létezik. Az

egyik az ion elpárolgási modell (IEM: ion evaporation model) [16], amely szerint a cseppek

mérete addig csökken, míg a felületi töltéstöbblet képes lesz az oldott ionokat a gáztérbe

taszítani. A töltött maradék modell (CRM: charged residue model) [17] szerint pedig a

Coulomb robbanások addig folytatódnak, míg már csak egy ion marad egy cseppecskében,

ebből pedig az oldószer elpárolgása révén jön létre a vizsgálandó ion. A módszerhez vizes

alapú oldószerelegyet használnak, több okból is. Egyrészt mivel a biomolekulák jellemzően

jól oldódnak vízben, másrészt fontos az ionizáció szempontjából, hogy az alkalmazott

oldószer vezetőképes legyen. A spray ezen kívül általában tartalmaz jobban párolgó szerves

oldószert is, amely a biomolekulák oldódását még inkább elősegíti, illetve csökkenti a víz

felületi feszültségét, így kisebb cseppek keletkeznek, melyek fajlagos felülete nagyobb lesz,

ezáltal az oldószer párolgása még könnyebben megvalósulhat. Nem utolsó sorban pedig a

fordított fázisú HPLC módszer is ezt a típusú oldószer keveréket igényli. Az elektrospray

ionizáció során molekulaionok jelennek meg a tömegspektrumban, melyek protonálódás,

11

deprotonálódás, illetve gyakran addukt képződés (pl. Na+, K+) útján keletkeznek, tehát a

technikát a lágy ionizációs módszerek közé soroljuk. Tipikusan azokat a molekulaionokat

látjuk, melyek már a folyadék fázisban ion formájában voltak jelen. Ezért kap fontos szerepet

az elektrospray technikában a savak (leggyakrabban ecetsav) jelenléte az oldószerben, mert a

megfelelő pH biztosításával erősen befolyásolható a szolvatált ionok képződése. Jellemző a

többszörösen töltött ionok megjelenése is, amely a nagy méretű biomolekulák analízisében

előnyös, mivel kisebb m/z értékeknél jelennek meg a csúcsok. Biológiai minták vizsgálatában

az ESI a leggyakrabban alkalmazott ionizációs eljárás, bár a semleges és kevéssé poláris

molekulák, mint például egyes lipidek (karotinoidok, egyes szteroidok) ionizációja ezzel a

technikával nem valósítható meg hatékonyan. Az ilyen típusú vegyületek ionizációjára

alkalmas módszer az APCI.

Az atmoszférikus nyomású kémiai ionizációs (APCI: atmospheric pressure chemical

ionization) technika esetében a folyadék fázisú minta szintén egy kapillárison keresztül

érkezik az ionforrásba, amely tulajdonképpen egy fűtött pneumatikus porlasztó. A minta nem

illékony komponenseiből aeroszol képződik, míg az illékony összetevők a magasabb

hőmérséklet és a porlasztógáz segítségével gáz halmazállapotba kerülnek. A gáz

halmazállapotú molekulák ionizációja koronakisülés létrehozásával valósul meg. Ez a

koronakisülés – ellentétben az elektrospray-vel, amely feszültség-kontrollált – áram-

kontrollált folyamat, mivel ellenkező esetben elektromos ív jönne létre, amely azon felül,

hogy a tömegspektrométer kisfeszültségű tápegységeit tönkreteszi, nem képes molekuláris

ionok képzésére sem. Az ionizáció kétféle módon valósulhat meg az APCI eljárás során. Egy

részről kémiai ionizációs folyamat zajlik, az oldószerből, illetve a levegőből képződő

reagensionok segítségével. Másrészt atmoszférikus nyomáson termikus elektronok is

keletkeznek, melyeket elektronbefogással (EC: electron capture) a nagy elektronaffinitású

vegyületek megkötnek, egyszeresen negatív ionokat képezve. Mivel gázfázisú ionizációs

folyamatról van szó, ezért a konszekutív ionizáció nem valósul meg, így kizárólag egyszeres

töltésű molekulaionok keletkeznek. Mivel minden olyan molekula ionizálható azonban ezzel a

technikával, amely minimális gőznyomás értékkel rendelkezik, ezért a módszer széles körben

elterjedt [18].

Az elektrospray újabban fejlesztett változata a nanospray vagy nanoelektrospray,

amely extrém kis mennyiségű minták érzékeny analízisére alkalmas [19]. Az ionizáció

mechanizmusa megegyezik az elektrospray módszernél ismertetettel, de amíg ott a folyadék

áramlási sebessége 1 μl/perc felett van, a nanospray esetében 1 nl/perc alatti az áramlási

sebesség, illetve nem alkalmaznak segédgázt sem. A spray kapilláris vége 1-2 μm átmérőjű,

12

ami lehetővé teszi, hogy a keletkező aeroszolban a cseppméret már elérje a nanométeres

nagyságrendet. Az ionizációs hatékonyság, és így az érzékenység nagyságrendekkel nagyobb,

mint a hagyományos elektrospray esetében. A spray-technikák sebességét jelentősen

lecsökkenti, hogy a minták között könnyen létrejöhet keresztszennyezés, mivel ugyanazon a

kapillárison haladnak keresztül. Azonban a high-throughput analitikában a mérés ideje sokkal

fontosabb tényező annál, mint hogy az analízis folyamatába a kapilláris mosását bele lehetne

venni. Erre a problémára jelentett megoldást az egyszer használatos nanospray kapillárisokat

alkalmazó ionforrások megjelenése, melyek esetében minden egyes mintához másik spray-tűt

használnak. A technika hátránya azonban, hogy a költségek messze meghaladják más mérési

módszerekét.

Fontos megemlíteni még két ionizációs technikát, melyek a folyadék minták

analízisében ma már szintén jelentős szerepet töltenek be. A szuperszonikus spray ionizációt

(SSI: sonic spray ionization) a ’90-es évek első felében írták le [20], kereskedelmi

forgalomban pedig egy évtizeddel később vált elérhetővé. Ez a szintén spray-típusú ionforrás

a nagy sebességű porlasztógáz energiáját használja fel gázfázisú ionok előállításához, így nem

szükséges nagyfeszültség és magas hőmérséklet a működéséhez. A technika elterjedése

részben ezek hiányának köszönhető, mivel ilyen úton a termikusan labilis, érzékenyebb

vegyületek analízise is megvalósítható, és ma már számos HPLC kromatográfiához

kapcsolódó alkalmazásával találkozhatunk az irodalomban [21]. Mivel nincs nagyfeszültség,

ezért a spray megközelítőleg semleges, vagyis azonos mennyiségű pozitívan és negatívan

töltött cseppet tartalmaz, így a polaritás változtatása nélkül lehet mérni pozitív és negatív

módban is.

A fotoionizációs folyamatot elsőként a GC technikában (majd később az LC-ben is)

alkalmazták detektálási módszerként. Amennyiben egy speciesz, melynek az ionizációs

energiája kisebb egy foton energiájánál, abszorbeál egy fotont, akkor ionizáció megy végbe,

melyet fotoionizációnak nevezünk. Az atmoszférikus nyomású fotoionizációs módszer (APPI:

atmospheric pressure photoionization) a fotoionizációra épül, kripton kisülési lámpából

kibocsátott 10 eV energiájú fotonok segítségével történik a LC-ből érkező beporlasztott minta

ionizációja. A technika alkalmas kevéssé poláris vegyületek ionizációjára, ezért viszonylag

széles körben használják ma is [22].

Alkalmazások

A biológiai minták analízisében ma az esetek túlnyomó többségében a HPLC-MS

módszert alkalmazzák. A tömegspektrometriás detektálás azonban speciális követelményeket

támaszt az elválasztástechnikai módszerrel szemben, ilyenek például a nem illékony

13

komponensek jelenlétének elkerülése, valamint a kisebb áramlási sebesség alkalmazása.

Érthető tehát, hogy egy HPLC-MS módszer kidolgozásának kiemelkedően fontos feladata a

minta előkészítésének kidolgozása [23], ráadásul a megfelelő választással a teljes analízis

ideje is jelentősen lecsökkenhet, ami egyben a mérési költségek csökkenését jelenti.

Fokozottan vonatkozik ez a biológiai mintákra, mivel ezek esetében meglehetősen összetett a

kiindulási rendszer. Az alábbi ábrán a mintaelőkészítés általános lépéseit tüntettem fel,

tipikusan biológiai minták esetére.

1. ábra: Az LC-MS módszer mintaelőkészítési lépései.

A teljes HPLC-MS módszer kidolgozásának első lépése a tömegspektrometriás

körülmények optimalizációja standard mintával, mely az ionizáció hatékonyságát, az analízis

érzékenységét befolyásolja. Ezután következik a mintaelőkészítés kidolgozása, mely gyakran

időigényesebb, mint az analitikai módszer optimalizációja. A minta tartósítása, szállítása és

tárolása azért része ennek a folyamatnak, mert biológiai minták esetén általában nem a

laboratóriumban állítják elő az analízisre szánt nyersanyagot. Az ábrán a szaggatott vonallal

jelölt területen feltüntetett lépések nem mindig szerepelnek a mintaelőkészítés folyamatában.

A folyadékkromatográfiás körülmények optimalizációja szintén először standard mintával

történik, majd adalékolt (spike-olt) mintákkal (ismert mennyiségű standard hozzáadása a

mintához), végül pedig következhet a valódi minták analízise.

minta tartósítása

szállítás, tárolás

felolvasztás

homogenizáció

belső standardhozzáadása

pre-frakcionálás (kicsapás,méretkiz. krom., elektroforézis)

reagens hozzáadása

oldószercsere

szűrés

behelyezés az autosampler-be

az analízis elindítása

minta tartósítása

szállítás, tárolás

felolvasztás

homogenizáció

belső standardhozzáadása

pre-frakcionálás (kicsapás,méretkiz. krom., elektroforézis)

reagens hozzáadása

oldószercsere

szűrés

behelyezés az autosampler-be

az analízis elindítása

14

A biológiai minták elemzésével foglalkozó analitikai irodalom túlnyomó többsége ma

már LC-MS módszereket ír le. Az alábbi táblázatban foglaltam össze a legfontosabb

alkalmazásokat, irodalmi referenciákkal együtt.

Vegyületcsoport Módszer Referencia

Aminosavak RPLC-ESI-MS/MS

LC-MS/MS

GC-MS

[24]

[25]

[26]

Acil-glicerolok LC-LC-MS/MS

ESI-MS/MS

[27]

[28]

Acil-karnitinek LC-MS/MS vérmintából

LC-MS/MS vizelet mintából

[29]

[30]

Epesavak GC-MS

LC-ESI-MS/MS vérmintából

[31]

[32]

Ceramidok LC-APCI-MS [33]

Eikozinoidok LC-APCI-MS/MS

LC-MS/MS

[34]

[35]

Zsírsavak GC-MS

LC-MS

[36]

[37]

Neurotranszmitterek GC-MS

LC-MS/MS

[38]

[39]

Nukleotidok LC-MS/MS

LC-LC-ESI-MS

[40]

[41]

Szerves savak GC-MS

GC-MS

TSP-LC-MS

[42]

[11]

[43]

Foszfolipidek ESI-MS

ESI-MS

LC-MS/MS

[44]

[45]

[46]

Szteroidok LC-MS/MS

GC-MS és LC-MS

[47]

[48]

Cukrok LC-MS [49]

1. táblázat: Fontos biológiai vegyülettípusok és vizsgálati módszereik.

15

1.2.2. Felületvizsgálati módszerek

A deszorpciós ionizációs módszerek rövid története

A származékképzés és a spray technikák mellett a biológiai eredetű minták

analízisében az úgynevezett deszorpciós ionizációs módszerek is jelentős szerepet játszanak

ma már. Ezen technikák közös jellemzője, hogy a fázisátmenet és az ionizáció a minta

felületén, egymással kapcsolt módon történik.

Az első próbálkozás nem illékony minták közvetlen, származékképzés nélküli

tömegspektrometriás vizsgálatára 1969-ben történt és Beckey nevéhez fűződik. Az

elektromos mezős deszorpciós ionizáció (FDI: Field Desorption Ionization) volt az első olyan

technika, amely kombinálta a deszorpciós és az ionizációs folyamatot, kiküszöbölte a minta

elpárologtatásának szükségességét az ionizáció előtt és lehetővé tette a nagy molekulatömegű

és/vagy termikusan labilis anyagok vizsgálatát [50].

2. ábra: Az elektromos mezős deszorpciós ionizáció működése.

A minta tömény oldatát felcseppentik egy wolfram vagy rénium szálra, amely szén

mikrotűkkel van beborítva, és az oldószert elpárologtatják. Az elektromos potenciál

különbség az emitter és egy elektród között jön létre, és elérheti akár a 108 Vcm-1 értéket is. A

megfelelő mértékű potenciál különbség és a megfelelő görbültségű felület esetében a

térgradiens képes kiszakítani a felületen képződött töltött részecskéket. Bár a technika

feltalálása elméletben forradalmasította a biokémiai molekulák tömegspektrometriás

kutatását, azonban az ionizációs folyamat nem igazán reprodukálható, így nem is

2 mm

ionforrás

emitter

MS analizátor

fókuszáló plate ellenelektród

16

automatizálható, és egyáltalán nem kombinálható semmilyen más módszerrel, ezért egyáltalán

nem terjedt el széles körben a használata.

McLafferty és Baldwin nevéhez fűződik [51] az úgynevezett deszorpciós kémiai

ionizáció (DCI: Desorption Chemical Ionization) módszerének kidolgozása. Ez a technika

tulajdonképpen csak fenomenológiai szempontból tartozik a deszorpciós ionizációk közé,

mert valójában termikus deszorpció és kémiai ionizációs folyamatok kombinációja. Azt

tapasztalták, hogy ha üveg vagy fém mintatartóban lévő mintát közvetlenül egy kémiai

ionizációs plazmába helyeznek, akkor csökkenthető a méréshez szükséges hőmérséklet, néha

akár 150 °C-kal is, ez pedig visszaszorítja a kevésbé illékony anyagok hőbomlását. A mintát

egy rénium vagy wolfram szálra felcseppentik, majd az oldószer elpárologtatása után,

behelyezik a tömegspektrométer ionforrásába. A fémszálba kontrollált elektromos áramot

vezetnek, és a keletkező hő hatására a minta termikusan deszorbeálódik. A gázfázisú

molekulák élettartama ugyan csekély, de a gyors, in-situ ionizáció és azonnali tömeganalízis

lehetővé teszi termikusan labilis molekulák vizsgálatát is . A módszer lehetséges alkalmazásai

között voltak az oligoszacharidok, kis méretű peptidek, nukleinsavak és egyéb szerves sók

mérései, melyeket mind pozitív, mind negatív ionmódban vizsgáltak a DCI technikával, ma

azonban már csak elvétve találkozhatunk az alkalmazásaival [52].

A plazma deszorpciós ionizációs módszer (PDI: plasma desorption ionization) során a

kalifornium radioaktív bomlásából származó nagy energiájú részecskék által alkotott plazma

segítségével valósul meg a deszorpciós és az ionizációs folyamat is [53]. Ez a technika mára

szintén feledésbe merült, de a jelentősége abban nyilvánult meg, hogy a második generációs

deszorpciós ionizációs módszerek közvetlen előfutára volt. A PDI módszerben már

úgynevezett analitikai nyaláb segítségével valósul meg az analit deszorpciós ionizációja, de ez

a nyaláb divergens, nincs a vizsgálandó felületre fókuszálva. A deszorpciós ionizációs technikák második generációjára jellemző, hogy egy

kollimált (párhuzamos nyalábokból álló) analitikai nyaláb segítségével történik a deszorpció

és az ionizáció folyamata. Az analitikai nyalábot nagy energiájú részecskék alkotják (atomok,

molekulák, atomi-, vagy molekulaionok, fotonok, stb.), melyeket a minta felületére

irányítunk. Az analitikai nyaláb becsapódása a felületen mikroméretű robbanásokat okoz,

melynek eredményeképp gázfázisú ionok és molekulák keletkeznek a mintából.

17

Secondary Ion Mass Spectrometry

A másodlagos ion tömegspektrometria (SIMS: secondary ion mass spectrometry)

technika kidolgozása és fejlődése a ’70-es években kezdődött [54]. Az eljárás lényege, hogy

egy elsődleges ionforrásból származó, nagy energiájú (keV nagyságrendű) ionnyalábbal

bombázzuk a vizsgálandó felületet. Az ütközések hatására részecskék szakadnak ki a

felszínből az ütközési zónában. A felülettől eltávolodó részecskék között vannak semleges

atomok, molekulák, elektronok és ionok. Ezeket az úgynevezett másodlagos ionokat mérjük a

tömegspektrométer analizátorában. A SIMS módszer kifejezetten szilárd felületek analízisére

alkalmas, ma a legfontosabb felhasználási területe a félvezetők felületi analízise az iparban.

Az elemanalízis mellett azonban találhatunk számos példát az irodalomban biológiai

szövetminták elemzésére[55], illetve az ehhez kapcsolódó képalkotásra (imaging) is. [56].

3. ábra: A SIMS technika működésének sematikus vázlata.

Alapvetően kétféle SIMS technikát különböztethetünk meg, a dinamikus és a statikus

SIMS-et. A dinamikus SIMS volt az első olyan módszer, amellyel biológiai minta esetén

sejtszintű felbontást lehetett elérni, és a mai napig is az egyik legjobbnak számít a felbontás

tekintetében. A dinamikus SIMS esetében az elsődleges ionnyaláb alatt a minta felülete

folyamatosan megújul, azaz az ionnyaláb folyamatosan erodálja a minta felületét. A módszer

molekuláris szinten is invazív és általában monoatomos ionokat eredményez, és ilyen módon

csak a minta elemi összetételéről ad információt. Ion-mikroszkóp néven került kereskedelmi

forgalomba olyan képalkotó műszer, mely hasonló lencserendszerrel van felszerelve, mint az

optikai mikroszkópok. A minta egy nagyobb területére (pár száz mikrométer) irányítják az

elsődleges ionsugár

ionoksemleges részecskék

minta

18

elsődleges ionnyalábot, a keletkező másodlagos ionok segítségével pedig előállítják a képet.

A módszer alkalmazásai között megtalálható az izotópjelzett molekulák kimutatása

(farmakológia) [57], sejtek tanulmányozása, képalkotás sejtszinten, mely a technika

mechanizmusának köszönhetően akár három dimenzóban is lehetséges.

Statikus SIMS esetében a minta felülete nem roncsolódik, és a kisebb

energiasűrűségnek köszönhetően a módszer molekuláris szinten is kevésbé invazív, azaz

lehetővé teszi kisebb molekulák (MW < 1000 Da) fragmentáció nélküli deszorpcióját is.

Biológiai minták analízisének tekintetében például a sejtek membránlipidjeinek

tanulmányozására található [58] irodalmi hivatkozás a módszerhez kapcsolódóan.

A gyors atomos bombázás (FAB: fast atom bombardment) nevű technika hasonló

elven működik, mint a SIMS és a ’80-as évektől kezdve már rutinszerűen használják nem

illékony, nagyobb tömegű molekulák analízisére [59-60]. A vizsgálandó oldatot feloldják egy

mesterséges mátrixban, ami általában glicerin, és ionok helyett semleges atomokkal

bombázzák (pl. Ar, Xe). Lágy ionizációs módszer, a spektrumban jellemzően a protonált

molekulaion jelenik meg. Szintén hasonló elven működik az úgynevezett folyadék

másodlagos ion tömegspektrometria (LSIMS: liquid secondary ion mass spectrometry) [61],

[62]. A módszerek közötti eltérés a felületre becsapódó részecskék méretében van, amely a

vizsgálható molekulák körét határozza meg [63].

Lézer deszorpciós ionizációs technikák

A lézerrel segített deszorpciós ionizációs (LDI: laser desorption ionization) módszerek

fejlődése a ’70-es években kezdődött. A deszorpciós folyamat szempontjából a lézer

besugárzás valójában hőközlésnek tekinthető, így tulajdonképpen csak olyan típusú

molekulák analízisében lehet használni, melyek hajlamosak termikus deszorpcióra. Ebbe a

csoportba azonban csak kis méretű, termikusan stabil molekulák tartoznak, így a módszer

fejlesztése abba az irányba indult el a ’80-as évek elején, hogy valamilyen módon alkalmassá

tegyék nagyobb tömegű molekulák vizsgálatára is. A lézer termikus hatásának másik

következménye a biológiai minták tekintetében, hogy a biológiai minták természetes,

makromolekuláris mátrixa karbonizálódik a hő hatására, és ez megakadályozza a deszorpciós

folyamatot. Ezek az okok vezettek ahhoz az elképzeléshez, hogy a természetes mátrixot

mesterségessel lenne célszerű helyettesíteni. A mesterséges mátrixnak egyértelműen

meghatározható követelményeknek kell megfelelnie, az ionizációs folyamat és a

tömegspektrometriás detektálás természetéből fakadóan. Ezek a következők: abszorbeálja a

lézersugárzást, ne lépjen reakcióba az analittal, hanem képes legyen azt beépíteni a

19

kristályrácsába, méghozzá ionos specieszként, illetve a lézer hatására kizárólag gázfázisú

bomlástermék képződjön belőle (vs. karbonizáció, lásd feljebb).

A leírt szempontok alapján létrehozott mátrix segített-lézerdeszorpciós (MALDI:

matrix-assisted laser desorption ionization) technikát Michael Karas és Franz Hillenkamp

1985-ben publikálták elsőként [64]. Úgy tapasztalták, hogy az alanin ionizációs küszöbértékét

jelentősen lecsökkenti, ha triptofánnal elegyítve sugározzák be 266 nm hullámhosszúságú

lézerrel. A triptofán képes abszorbeálni az ilyen hullámhosszúságú lézer energiát, és

megkönnyíti az abszorbcióra nem képes alanin ionizációját. A 2843 Da méretű melittin nevű

peptid volt a legnagyobb molekula, amellyel sikerült elérni ilyen típusú mesterséges mátrix

segítségével az ionizációs küszöb csökkenését. A módszer fejlődésében az áttörést 1988-ban

Tanaka és munkatársai hozták meg [65], az általuk „ultra finom fémpor és folyadék mátrix

eljárásnak” nevezett technika alkalmazásával, ugyanis ezzel képesek voltak 30 kDa-nál

nagyobb fehérjék detektálására is. Ezért a fejlesztésért 2002-ben Koichi Tanaka kémiai

Nobel-díjat kapott.

Az elmúlt két évtizedben a MALDI az egyik legelterjedtebb tömegspektrometriás

módszer lett, amellyel a nem illékony és termikusan instabil molekulákat (fehérjék,

oligonukleotidok, szintetikus polimerek) lehet vizsgálni. A módszer kulcsa a mesterséges

mátrix használata, mely mind a deszorpcióban, mind az ionizációban szerepet játszik. A

technika fő jellegzetességei: egyszerű mintaelőkészítés és nagyfokú tolerancia a sókkal,

pufferekkel és detergensekkel szemben.

A MALDI analízis két lépésből áll. Az első lépésben a vizsgálandó mintából és az

úgynevezett mátrix vegyületből közös oldat készül olyan módon, hogy az oldat a

mátrixmolekulára nézve mintegy 1000-10.000-szer töményebb legyen. Ezután az oldatot

beszárítják, hogy minden oldószermaradék, melyet az előkészítés során használtak,

elpárologjon. A szárítás eredménye egy „szilárd oldat” lesz, mely a mátrix és az analit

„együtt-kristályosodásával” jön létre, és mivel a mátrix koncentrációja nagyságrendekkel

nagyobb, ezért az analit molekulák egymástól teljesen izoláltan helyezkednek el, beágyazódva

a mátrixba. A klasszikus MALDI analízis második lépése a minta behelyezése a

tömegspektrométer ionforrásába, vákuum körülmények közé. Ezután következik a lézerrel

történő besugárzás, mely nem folyamatos, hanem impulzus üzemmódú. A deszorpció és

ionizáció pontos mechanizmusa még ma is vitatott a szakértők körében, a szakirodalomban

két főbb mechanisztikus leírást tartanak elfogadottnak. A fotokémiai ionizációs modell [66]

szerint a folyamat két részből áll. Először a mátrix molekulák a lézersugár energiájának

hatására gerjesztett állapotba kerülnek – ez a folyamat három különböző úton mehet végbe

20

(4.ábra) – majd fotoelektronokkal való fotoionizációs reakcióban keletkeznek a molekulaion

gyökök (pirossal jelölve az ábrán), melyek az analit molekulákkal történő ütközések útján

stabilizálódnak, vagyis az analit ionok a gázfázisban képződnek protonálódás vagy

deprotonálódás útján.

4. ábra: A fotokémiai ionizációs mechanizmus működése (M: mátrix molekula).

A klaszter ionizációs modell [67] szerint a savas jellegű mátrix molekulákkal az analit

molekulák nagy méretű protonált klaszterekké állnak össze már a kondenzált fázisban. A

lézersugárzás hatására ezek deszorbeálódnak a szilárd fázisból a gáz fázisba, ahol a semleges

mátrix molekulák deszolvatációja által keletkeznek az analit ionok.

(M – H)˙

hν

M M MM MMhν hν

M* M* M*

M** + M

2 hν

M+˙ M–˙

- e– + e–

+ M

M+˙

+ H˙

(M + H)+ (M – H)+

H˙ H˙

(M + H)+

(M + 2H)+˙ (M – H)–

(M – H)˙+ e–

– H2

(M – 2H)–˙ M–˙

gerjesztés

fotoionizáció

fotokémiaireakciók

detektálhatóionok

21

5. ábra: A klaszter ionizációs mechanizmus működési sémája.

A MALDI technika más lézer ionizációs technikához viszonyítva nagyságrendekkel

érzékenyebb és sokkal univerzálisabban alkalmazható; mindez tulajdonképpen a mesterséges

mátrix jelenlétének köszönhető. Az érzékenység egyik oka a mátrixmolekulák nagy

koncentrációja a mintában, ami miatt az analit molekulák gyakorlatilag egyesével elszigetelve

fordulnak elő az előkészített mintában. Így az analitmolekulák klaszterképzési reakciója –

amely lényegesen lecsökkentené a módszer érzékenységét – gátolt folyamat. Ezen kívül a

mátrix abszorbciós képessége minimalizálja a minta roncsolódását, melyet a lézersugár

energiája okozna, viszont növeli az energiaátmenet hatékonyságát az analitmolekulák

ionizációjának irányába. Mivel a folyamat független a mérendő molekula abszorbciós

tulajdonságaitól és a méretétől is, ezért lehetséges kis koncentrációjú (akár 10-15 M), akár

300000 Da-os biomolekulák, tipikusan fehérjék detektálása is a MALDI technikával. Ennek

ellenére ma a MALDI módszer legfontosabb felhasználási területe a peptid- és

fehérjeanalízishez kapcsolódóan a triptikus emésztmények vizsgálata.

Az elektrospray módszerrel összehasonlítva megállapíthatjuk, hogy a két technika a

legtöbb szempontból kiegészíti egymást. A szilárd fázisú mintából induló MALDI ionizáció

eredményeképp gyakorlatilag kizárólag egyszeresen töltött molekulaionok jelennek meg a

spektrumban, így a módszer jól alkalmazható keverékek analízisében (ehhez az

alkalmazáshoz tipikusan TOF analizátorral kombinálják), viszont nehezebben oldható meg az

elválasztástechnikai módszerekhez való kapcsolása. Valamint nagyon jól automatizálható az

analízis folyamata, mivel a minták keveredése akadályozott. Az elektrospray ionizációhoz

+

[ ]H+

lézer sugárzás

deszorpció

deszolvatáció

proton-transzfermátrixanalit

22

folyadék fázisú mintára van szükség, így könnyen használható kromatográfiás módszerekkel

kombinálva, többszörösen töltött ionokat eredményez. A képalkotás (imaging) az a terület,

melyben jelenleg a spray módszerek nehezen veszik fel a versenyt a MALDI, illetve SIMS

technikával. A MALDI imaging fejlesztésekről és alkalmazásokról szóló cikkek száma az

utóbbi években jelentősen megnőtt [68].

Az atmoszférikus nyomású deszorpciós ionizációs módszerek

Az atmoszférikus nyomású MALDI (AP-MALDI: atmospheric pressure-MALDI) volt

az első olyan ionizációs technika, amely lehetővé tette szilárd fázisú minták atmoszférikus

nyomáson történő vizsgálatát [69]. Ennek ellenére a használata nem terjedt el széles körben,

mivel az analízis érzékenysége a legtöbb alkalmazáshoz nem megfelelő mértékű. A

hagyományos MALDI módszer során is (összehasonlítva például az elektrospray-vel)

viszonylag kicsi az ionképződés hatékonysága, és az atmoszférikus nyomáson lejátszódó

ionizációs folyamat esetén ez az arány tovább csökken, az érzékenység nagymértékű

csökkenését okozva. Más ionizációs módszerek atmoszférikus nyomáson történő

alkalmazásával részben sikerült erre a problémára is megoldást találni.

Az atmoszférikus nyomású deszorpciós ionizációs módszerek csoportjába ma már

nagyon sok technikát sorolhatunk be, ezek egy része az alábbiakban bemutatásra kerül.

Többségük azonban, ahogyan azt már a DCI módszernél is láthattuk, csak fenomenológiai

szempontból tartozik ide, mivel nem a hagyományos értelemben vett deszorpciós folyamatra

épülnek. Az irodalmi forrás az atmoszférikus nyomású ionizációs technikákat négy nagy

csoportra osztja a mintavétel, illetve az ionizáció szempontjából: a termikus deszorpciós, a

lézer deszorpciós, a folyadék- és gázsugár deszorpciós és a folyadék extrakciós ionizációs

technikákra [70]. Ezzel ellentétben én csak két nagyobb csoportot különböztetnék meg,

amelyek az analit fázisváltásának mechanizmusa alapján különíthetők el: a neutrális

deszorpcióval kapcsolt ionizációs technikák, illetve a folyadék extrakciós módszerekkel

kapcsolt ionizációs technikák. Közös jellemzőjük azonban, hogy már létező és jól bevált

technológiákat használnak fel. Az újítás lényege minden esetben az, hogy a „deszorpciós” és

az ionizációs folyamatok térben közelebb kerülnek egymáshoz, ami lehetővé teszi a rövid

élettartamú specieszek vizsgálatát, így szélesítve a módszerek alkalmazási körét.

23

Folyadék extrakciós módszerekkel kapcsolt technikák

A deszorpciós elektrospray ionizáció (DESI: desorption electrospray ionization) 2004-

es publikációja indította el azt a folyamatot, melynek során az érdeklődés középpontjába

kerültek a felületi ionizációs módszerek és ezek tömegspektrometriás felhasználása [71], ezért

ennek részletes tárgyalása következik elsőként a témában.

6. ábra: A deszorpciós elektrospray ionizációs tömegspektrometria működése, és a mérés

paraméterei: α: a spray beesési szöge, β: az ionok begyűjtési szöge, d1: a spray csúcs és a

felszín távolsága, d2: a tömegspektrométer bemeneti nyílás és a felszín távolsága.

A módszer lényege, hogy egy hagyományos elektrospray ionizációs forrást a

vizsgálandó felületre irányítunk. A spray-ben keletkezett elektromosan töltött mikrocseppek a

felülettel ütköznek, majd az ütközés során keletkezett, felületi molekulákat tartalmazó

másodlagos cseppecskék az ESI esetében leírt módon alakulnak gázfázisú ionokká. A DESI

ionforrást bármilyen tömegspektrométerhez lehet csatlakoztatni, amely rendelkezik

atmoszférikus interface-szel, majd a műszer képességeitől függően különböző módon

végezhető a mérés (tandem, selected ion monitoring, pontos tömeg mérése). Gyakorlati

tapasztalatokból kiindulva két különböző mechanizmus feltételezhető, hasonlóan a

hagyományos LC-MS mérésekhez [72]. Az egyik típusba tartoznak a peptidek, fehérjék,

oligoszacharidok, melyeket elektrospray-vel lehet ideálisan analizálni. A másik csoportot

olyan vegyületek alkotják, melyeket hagyományosan APCI típusú ionizációval lehet mérni,

ilyen például a koleszterin, karotin és a TNT.

Voldószer

N2

nagyfeszültségű tápegység

α β

porlasztó kapilláris

spraykapilláris

gázsugár

spray

felület

mintadeszorbeáltionok

tömegspektrométer bemenet

d1 d2

24

Az első csoportba tartozó vegyületek analízisének optimálása során a kis d1 távolság

(6. ábra) és a közepesen nagy gáz, illetve oldószer áramlási sebesség bizonyultak ideálisnak,

ami azt bizonyítja, hogy elengedhetetlen feltétele az ionizációnak az elektromosan töltött

cseppecskék ütközése a felszínnel. A cseppek becsapódása után a folyadék szétterül a

felszínen, mintegy 3-10-szer nagyobb területen, mint az eredeti csepp átmérője. A becsapódás

okozta lökéshullám (shockwave) következtében újabb kis cseppek keletkeznek a szétterülő

folyadékfilm szélén („jetting”). Ezt a jelenséget már egy, a SIMS-hez hasonló elven működő

ionizációs technikához kapcsolódóan is leírták már (lásd feljebb). A folyamat

hatékonyságához elengedhetetlen a becsapódó cseppek nagy sebessége. A DESI analízis

során alkalmazott tipikusan pár száz m/s sebességnél a jetting a folyadék jelentős részét

felemészti. A kezdeti összes töltés egy része elvész a felszínen, emiatt az újonnan keletkezett

cseppek össztöltése kevesebb, mint a kiindulási cseppeké. A keletkező kisebb töltött cseppek

a spray gázáramával, vagy elektrosztatikus kölcsönhatás segítségével, vagy a vákuum

szívóhatásával jutnak be a tömegspektrométerbe. A pneumatikus rásegítés fontossága a

mechanizmusban ott mutatkozik meg, hogy a peptidek abban az esetben is ionizálódnak, ha a

felszínt is azon a potenciálon tartják, amely a spray-re van adva. Ebben az esetben a

másodlagos cseppek elektromos feltöltődése a felszín és a tömegspektrométer bemenete közti

régióban történik. A második csoport vegyületei az elsőhöz hasonló paraméterek mellett nem

ionizálódnak. Ezeknél a méréseknél szükséges, hogy potenciálkülönbség legyen a spray és a

felszín között, ellenben nem szükséges a töltött cseppek jelenléte. A spektrum

karakterisztikájának és a jelintenzitásnak a függése a d1 távolságtól, illetve a felszín

hőmérsékletétől azt jelzi, hogy az ionképződés elsődleges módja az oldószer és az analit

közötti töltésátmenet. A heterolitikus töltésátadási reakció proton- illetve elektroncserét jelent

egy gázfázisú ion és egy felszínen tartózkodó molekula között. A tisztán gázfázisú ion-

molekula reakciók előfordulása sem kizárható ezekben az esetekben, mivel a jelintenzitáshoz

való hozzájárulásuk egyre nagyobb, ha növekszik a gőznyomás ugyanolyan kísérleti

körülmények között. Heterogén fázisú töltésátadás során általában proton transzfer reakciók

mennek végbe (chemical sputtering) [73], melyet a jelenlévő specieszek relatív

protonaffinitása határoz meg. Például a koronén ionizálódik metanol (PA = 754 kJ/mol)

jelenlétében, ám ha acetont (PA = 816 kJ/mol) alkalmazunk spray oldószerként, akkor nem

jelenik meg a koronén ion a pozitív DESI spektrumban. A heterogén töltésátadási reakció

jelenléte az úgynevezett deszorpciós APCI (DAPCI) forrás segítségével bizonyítható. Ebben a

rendszerben gázfázisú ionok keletkeznek a reagensgázként alkalmazott illékony oldószer

gőzéből a koronakisülés hatására (lásd alább). Az ionok a nagy sebességű nitrogén vivőgáz

25

segítségével ütköznek a felszínnel, ahogyan a DESI esetében is. A koleszterin, karotin,

koronén és egyéb vegyületek esetén is metanollal, mint protonáló reagenssel DAPCI

ionizációs módszerrel is ugyanolyan spektrumot adtak, mint DESI-vel. Negatív ionmódban,

amikor toluolt használtak reagensnek, a TNT ionizálódott elektron transzfer reakció útján. A

jelintenzitás erősen függ a forrásra adott nagyfeszültség mértékétől, ami azt jelenti, hogy az

elektronbefogásos ionizáció elsődleges elektronforrása a koronakisülés. A TNT-t nem sikerült

pozitív ion módban detektálni, mivel a protonaffinitása számottevően kisebb, mint a

metanolé. Az első csoportba tartozó vegyületek, a peptidek, szénhidrátok, nukleotidok és

egyéb tipikus ESI vegyületek esetében pedig nem jelenik meg csúcs a spektrumban, ha

DAPCI ionizációs módszerrel vizsgáljuk őket. A két kísérleti tapasztalat (a felszínre adott

potenciál és a DAPCI módszer) alapján valószínűsíthető, hogy a fent említett kétféle

ionizációs mechanizmus valósulhat meg a DESI analízis során.

Ma már az irodalomban számtalan példát találhatunk a DESI módszer felhasználására,

melyeket két nagy csoportba oszthatunk. Az egyik a direkt analízis, melynek során a

legfontosabb szempont a minta épségének megőrzése. A DESI technika nagy előnye, hogy

nincs szükség sem mintaelőkészítésre, sem a minta vákuumba való behelyezésére, ilyen

módon pedig könnyen eleget lehet tenni a minimális károkozás igényének. Ebbe a csoportba

tartoznak az élelmiszeranalitikai [74], törvényszéki analitikai [75], reptéri biztonsági

vizsgálatok [76], biológiai szövetek analízise [77] és képalkotás [78-79]. A másik csoportba a

nagy hatékonyságú, vagy high-throughput alkalmazások tartoznak, melyeknél a fő szempont

az analízis sebessége. A mintaelőkészítés hiánya, és a méréshez szükséges rövid analízis idő

miatt a DESI módszer ennek az igénynek is megfelelhet [80], habár ezek a tulajdonságok

gyakran az érzékenység rovására mennek. Ebbe a csoportba tartoznak a gyógyszeranalitikai

mérések [81] és biológiai eredetű folyadékminták vizsgálatai [82].

Amennyiben nem adunk nagyfeszültséget a spray-re, de megnöveljük a gáz áramlási

sebességét, akkor az úgynevezett deszorpciós szuperszonikus spray ionizációs technikát

(DeSSI: desorption sonic spray ionization) kapjuk [83]. A szuperszonikus spray ionizáció egy

folyadék bevezetésű ionforrás (lásd fentebb), amely csak a nagy sebességű porlasztógáz erejét

használja fel gázfázisú ionok képződéséhez. Ha a nagyfeszültséget és a porlasztó gáz

sebességét változtatható paramétereknek tekintjük, akkor a DeSSI a DESI technika egy

speciális esete. A vegyületek nagy része, melyek mérhetők a DeSSI módszerrel, DESI-vel is

mérhetők, ám az állítás ellentéte nem igaz. A gyakorlati tapasztalatok azt mutatják, hogy az

erősen savas vagy bázikus jellegű anyagok esetében jobb mérési eredményt lehet elérni a

DeSSI technikával, ellenben a gyengén poláris analitoknál nem ad jobb eredményt. Ennek

26

okait a mechanizmusban kell keresni [84-85], méghozzá a felület és a spray

elektrokémiájában.

Tulajdonképpen egy másik szélsőséges esete a deszorpciós elektrospray ionizációnak,

amikor nem használunk porlasztógázt, viszont extrém nagy folyadék áramlási sebességgel

dolgozunk, ezt a technikát jet deszorpciós ionizációnak (JeDI: jet desorption ionization)

nevezik [86]. Vékonyra húzott kapillárissal, melynek a belső átmérője 1-20 μm, lehet

létrehozni a folyamatos folyadék sugarat, mely a felület egy pontjára irányítható, ahogyan ez a

spray technikák esetén is történik, csak ebben az esetben a folyadék áramlási sebessége 0.05-

0.15 ml/min között van. A nagy sebességű jet sugár folyamatosan roncsolja a felületet,

melyből gázfázisú ionok szakadnak ki. A technika ígéretes tulajdonságai közé tartoznak a

mélységi profil vizsgálatának lehetősége, illetve a kiváló, 1-5 μm-es térbeli felbontás.

A spray segítségével működő technikák mellett ebbe a csoportba sorolhatjuk a valódi

folyadék extrakciót alkalmazó módszereket, melyek működési elve azon alapul, hogy a

felületen lévő vizsgálandó anyagot extrahálják a felülettel érintkező folyamatos folyadék

áramlással, tehát valójában nem deszorpciós folyamat során szakadnak ki a felületből a

részecskék. A folyadékáram szerepe nem csak az extrakció, hanem az analit eljuttatása az

ionforrásba, vagyis szükséges spray-technika alkalmazása is. Mivel a porlasztás előtt történik

az analit extrakciója, ezért a deszorpciós módszerekhez képest az érzékenység

nagyságrendekkel jobb, viszont a mintavevő rendszer mérete korlátozott, ami a térbeli

felbontást határozza meg, amennyiben képalkotásra alkalmazzuk a módszert. Két alapvető

típusa van ennek a módszernek, a Sealing Surface Sampling Probe (SSSP) és a Liquid

Microjunction Surface-Sampling Probe (LMJ-SSSP). A Luftmann-féle SSSP [87] legfőbb

felhasználási területe ma a vékonyréteg kromatográfiás lapok analízise [88]. A technikát

alkalmazták többféle felület típusra is (üveg, többféle műanyag felület, porózus felületek,

biológiai szövetek), ami lehetőséget ad a felhasználási területek széleskörű kibővítésére. Az

alábbi ábrán látható a módszerhez szükséges automata mintavevő felépítése. A bemenő (inlet)

kapilláris a HPLC pumpához csatlakozik és a kimenő (outlet) kapillárissal együtt egy saválló

acél szelepbe van beépítve, amely mintavételkor rázár a felszínre. A kimenő kapilláris pedig a

tömegspektrométer ionforrásába vezet. A vizsgálni kívánt felületet a mintavevő alá kell

pozícionálni, majd az extrakciós pozícióba tenni a mintavevőt. A HPLC injektor extrakciós

állásában a pumpából jövő oldószer, mely eddig egyenesen az ionforrásba ment, most a

felszín felé megy, onnan extrahálja az analitot, majd szállítja az ionforrásba. Két mintavétel

között a mintavevő is standby pozícióba áll, mialatt a mintával érintkező része letisztítódik, a

keresztszennyezések elkerülése érdekében. A mintavevő tipikus átmérője 2 vagy 4 mm.

27

7. ábra: A Luftmann-féle SSSP automata mintavevő rendszerének sémája.

Az LMJ-SSP működési elve egyezik az előzőekben ismertetett rendszerével, csak a

kivitelezésben különböznek egymástól. A koaxiális mintavevő rendszert két kutatócsoport

publikálta egymástól függetlenül 2001-ben [89-90]. A külső kapillárisokban jön az oldószer a

HPLC pumpából, míg a belső kapilláris tulajdonképpen felszívja a felületről visszaérkező

folyadékot. Ezzel a technikával sikeresen vizsgáltak hidrofób vékonyréteg kromatográfiás

lapokat, ám a módszer hátránya, hogy normál fázisú lapok esetén nem volt sikeres a vizsgálat,

mivel a vékonyréteg nedvesedése által okozott kapillárishatás miatt az eluáló oldószer és az

analit egy része szétterült a felületen. Sikeresen alkalmazták viszont a módszert

gyógyszerhatóanyagok és metabolitok kimutatására biológiai szövetekből [91].

Neutrális deszorpcióval kapcsolt technikák

Az ebbe a csoportba tartozó technikák alapvetően két részre oszthatók a deszorpció

típusa alapján: termikus és lézer által kiváltott folyamatokra épülő módszerekre. A neutrális

deszorpciót követően jellemzően az ionizációhoz is kétféle technikát lehet alkalmazni: az

elektrospray-t és az APCI-t.

A termikus deszorpciós atmoszférikus nyomású kémiai ionizáció (TD/APCI: thermal

desorption atmospheric pressure chemical ionization) a legrégebbi és legtöbbet

tanulmányozott AP technika, melyet tömegspektrometriával kapcsolva használnak. A ’70-es

évek közepén fejlesztették ki Horning és munkatársai [92], kereskedelmi forgalomban a ’80-

as években lett elérhető. Az 1990-es években mellőzötté vált, de napjainkban újra előtérbe

került. A módszer során a kondenzált és a gőzfázis közötti átmenet hőközlés hatására történik,

majd ezt APCI posztionizációs folyamat követi. A hőközlés megvalósítása tipikusan a minta

minta

bemenő kapilláriskimenő kapilláris

szűrő filtertömítőgyűrű

mozgó fej

acél szeleptest

minta

bemenő kapilláriskimenő kapilláris

szűrő filtertömítőgyűrű

mozgó fej

acél szeleptest

minta

bemenő kapilláriskimenő kapilláris

szűrő filtertömítőgyűrű

mozgó fej

acél szeleptest

28

felett vezetett forró gázárammal vagy egy ellenállással fűtött felülettel történhet. A

deszorpciós folyamat természete miatt ez az eljárás csak viszonylag kis molekulatömegű

(maximum 2000 Da) specieszek vizsgálatára alkalmas, ugyanis termikusan instabil, erősen

poláris, illetve nagy molekulatömegű molekulákat nem lehet gáz halmazállapotba jutattni hő

hatására. Bebizonyították már régebben [93], hogy keletkeznek ionok hő hatására is, ezt a

jelenséget nevezik termikus elpárologtatásnak és kvaterner ammónium és foszfónium sókból

keletkezett ionokat tudtak detektálni ilyen módon. Napjainkban újra fejlesztenek

alkalmazásokat az atmoszférikus nyomású termikus deszorpciós ionizáció (APTDI:

atmospheric-pressure thermal desorption ionization) módszerhez is. Cooks és munkatársai

például szerves sók és ezek gázfázisú reakciói esetében használták fel [94].

Az utóbbi időben megjelent publikációk közül kiemelném először azokat, melyeket

McEwen és munkatársai közöltek [95-96]. A módszert, melyet kidolgoztak és alkalmaztak,

atmoszférikus nyomású szilárd fázisú analízisnek nevezték el (ASAP: atmospheric pressure

solids analysis probe). A vizsgálandó anyagot egy olvadáspontmérő kapillárisban helyezik el,

ebben történik a termikus deszorpció, majd egy APCI forrásban az ionizáció, és végül az

analízis a tömegspektrométerben. Ezzel a technikával olyan specieszeket lehet mérni,

amelyeket hagyományos APCI módszerrel nem lehet ionizálni, például lipideket,

karotinoidokat friss biológiai mintákból, valamint zsírsavakat.

Szintén a TD/APCI módszerek közé tartozik a direkt analízis valós időben (DART:

direct analysis in real time) [97]. Nagy előnye, hogy olyan anyagokat is lehet vizsgálni ezzel a

módszerrel, amelyeknek nagyon alacsony a gőznyomásuk, mind poláris, mind apoláris

típusúakat, és gyakorlatilag bármilyen felületről. Egy kisülési cellán hélium vagy nitrogén

gázt vezetnek keresztül, melyből a cellában található tűre adott nagyfeszültség hatására ionok,

elektronok és metastabil állapotú specieszek keletkeznek. Ezek több elektródon haladnak át,

melyek elválasztják a töltött részeket a semlegesektől, és ez utóbbiak kerülnek be egy fűtött

kamrába, melyből egy rácselektródon keresztül jutnak ki mintához, amely atmoszférikus

nyomáson található. Tehát a metastabil, gerjesztett állapotú semleges hélium atomok (He*

(23S1)) ionizálják a mintát, amely lehet szilárd, folyadék vagy akár gáz halmazállapotú is. A

deszorpció és az ionizáció teljes mechanizmusa még nem ismert, de az eddigi adatok azt

mutatják, hogy a termikus deszorpció a domináns folyamat. A módszer felhasználási területe

nagyon kiterjedt, az irodalomban találhatunk példákat a következőkre: vékonyréteg-

kromatográfiás lapok analízise, hamisított gyógyszerek összetételének vizsgálata,

reakciókövetés a gyógyszerkutatásban, zsírsav profil meghatározása ép baktériumsejtekből.

29

Egy másik módosított TD/APCI technika a deszorpciós atmoszférikus nyomású

kémiai ionizáció (DAPCI: desorption atmospheric pressure chemical ionization) [98]. Ebben

az esetben az elektrospray emitter helyett koaxiálisan beépített hegyes saválló acél elektród

található az ionforrásban, melyre ±3 és 6 kV közötti feszültséget kapcsolnak. Az inert

vivőgázba különböző oldószergőzöket vezetnek be, amelyeket az elektródon kialakuló

koronakisülés ionizál. Néhány esetben a vivőgázt melegítették is. Az ionizációs mechanizmus

a DAPCI esetében hasonló, mint az APCI forrásoknál. A deszorpció folyamata azonban nem

ennyire tisztán érthető. Fűtött vivőgáz esetében egyértelműen a termikus deszorpció a

domináns folyamat. Egyéb esetekben viszont a nagy sebességű gáz kiszakíthat részecskéket a

felszínről, amelyek a gáz fázisban ionizálódhatnak. Publikáltak azonban olyan eredményeket,

hogy nem alkalmaztak nagy sebességű gázáramot. Ezekben az esetekben azt feltételezik, hogy

a sztatikus töltés felhalmozódás lép fel a minta felszínén, ami megkönnyíti az ionizációt (vö.

FDI). A DAPCI-MS módszer felhasználási területei között kis molekulatömegű ionok

detektálása szerepel, gyógyszerhatóanyagoké, mezőgazdasági vegyszereké [99-100],

robbanószereké [101], valamint élemiszerek vizsgálata [102].

A módszer, melyet deszorpciós atmoszférikus nyomású fotoionizációnak (DAPPI:

desorption atmospheric pressure photoionization) neveztek el, hasonló elven működik, mint a

DAPCI, azzal a különbséggel, hogy a reagens ion populáció fotoionizációs folyamat

eredményeképp keletkezik a koronakisülés helyett. Haapala és munkatársai fejlesztették ki a

forrást [103]. Egy mikrochip-es porlasztó segítségével forró oldószergőz áramot juttatnak a

minta fölé, amelyben UV-lámpa segítségével indítják meg az ionképződési reakciót. A

deszorpciós folyamat ebben az esetben is főleg termikus, az ionizáció mechanizmusa azonos

az atmoszférikus nyomású fotoionizációs módszerével folyadék bevezetésű ionforrás esetén.

A hőmérséklet emelésével a jelintenzitás nő, ami arra enged következtetni, hogy a folyamat

termikus, de az oldószer változtatásával is erősen befolyásolható a hatásfok. Azt tapasztalták,

hogy toluol, aceton, illetve ezek keverékének a használatával jelentősen megnövelhető az

ionizáció hatásfoka, amely ezen molekulák UV abszorpciós sajátosságaival hozható

összefüggésbe.

Az úgynevezett plazmával segített deszorpciós ionizációs technikákat is itt kell

megemlíteni, mert legalábbis részben termikus deszorpciós folyamaton alapulnak. Két

hasonló módszer tartozik ide: a plazmával segített deszorpciós ionizáció (PADI: plasma-

assisted desorption ionization) [104] és a dielektrikus határkisülés deszorpciós ionizáció

(DBDI: dielectric barrier discharge ionization) [105]. Mindkét esetben hélium gáz áramból

keletkezik a deszorpciós / ionizációs plazma két elektród között, váltóáram segítségével, és a

30

felülettel való kölcsönhatása révén keletkeznek a mintából az ionok. A legtöbb esetben

molekulaionok képződését tapasztalták, ritkábban keletkeznek fragmens ionok is. A

deszorpció és ionizáció pontos mechanizmusa még nem tisztázott.

A lézer deszorpciós / ionizációs forrás, mely alkalmas a felületi mintavételezésre –

függetlenül attól, hogy vákuumban, vagy atmoszférikus nyomáson zajlik ez a folyamat –

viszonylag egyszerűen működő szerkezet. A pulzus üzemmódú lézersugarat a felszín egy

pontjára fókuszálják, melyet analizálni szeretnének; az anyag deszorbeálódik és ionizálódik a

lézersugár hatására; és a keletkező ionokat egy megfelelő tömegspektrométerrel lehet

detektálni. A folyamat tényleges mechanizmusa azonban ennél sokkal összetettebb, és nem

teljesen tisztázott még, ahogy ezt már a MALDI módszer leírásánál is említettem. Ami

azonban biztos, hogy a folyamat során ideális esetben is több semleges részecske keletkezik,

mint amennyi ion. Így amennyiben egy jól definiált másodlagos ionizációs módszerrel

kombináljuk a lézer deszorpciót, akkor az ionizációs körülményeket független módon

optimálhatjuk. Ennek eredményeképp nőhet az ionizáció hatékonysága, befolyásolható a

keletkező ionok típusa (atomi- vagy molekulaion), egyszerűsödhet a mintaelőkészítés (akár a

mátrix elhagyása) és új variációs lehetőségek adódnak az alkalmazások terén. A legrégebbi

típusa a másodlagos ionizációval kombinált atmoszférikus nyomású lézer deszorpciós

technikának a lézer ablációs induktív csatolású plazma (LA-ICP: laser ablation inductively

coupled plasma) módszer, melyet 1985-ben publikáltak először [106], és azóta széles körben

használt módszerré nőtte ki magát [107]. Kereskedelmi forgalomban évek óta elérhető a

módszer alkalmazásához szükséges készülék, melyet a legtöbbször úgy állítanak össze, hogy

automata analízisre alkalmas; mind felületen lévő egyes pontokéra, mind az egész felület

leképezésére. Egy tipikus analízis során a minta egy zárt ablációs kamrában van elhelyezve,

melyet átöblítenek argonnal vagy héliummal. A lézersugarat a kamra ablakán keresztül

fókuszálják a mintára, majd a besugárzás után deszorbeáló anyagot argon szállítja az ICP

égőbe. Az ICP egy szeparált külső forrás, amely a lézer által generált részecskéket

deszolvatálja, porlasztja, atomizálja és ionizálja. Az ionok ezután egy atmoszférikus-vákuum

interfészen keresztül kerülnek a tömegspektrométerbe. Mivel az ICP atomi ionforrás, ezért a

módszer csak elemek analízisére alkalmas, ellenben az érzékenysége kiváló. Az

anyagtudományokban, környezeti tudományokban, törvényszéki, archeológiai és biológiai

minták analízisében alkalmazzák leggyakrabban.

A lézer deszorpciós atmoszférikus nyomású kémiai ionizáció (LD/APCI: laser

desorption atmospheric pressure chemical ionization) módszerben a másodlagos ionizáció

31

eredményeképp molekulaionok keletkeznek [108]. A módszer gél elektroforézissel

kombinálva hasznosnak bizonyult a fehérje analízisben.

Az első lézer deszorpciós elektrospray ionizációs (ELDI: laser desorption electrospray

ionization) módszer publikációja Shiea és munkatársai nevéhez fűződik [109]. A módszer

működési elve hasonló az LD/APCI-hoz, kivéve abban, hogy a deszorbeált részecskék

ionizációja a töltött cseppekkel, protonált oldószer specieszekkel vagy gázfázisú ionokkal

végbemenő reakció útján valósul meg, melyek az elektrospray folyamatban keletkeznek. Az

elektrospray másodlagos ionizációként való alkalmazása abból a szempontból bizonyult

előnyösnek a többi módszerhez képest, mert így előfordulhat többszörösen töltött ionok

képződése is makromolekulákból. A többszörösen töltött fehérje ionok megjelenése a

spektrumban arra utal, hogy van olyan fehérje molekula, amelyet a töltött cseppek feloldanak,

majd ezután az ionképződés az ESI mechanizmus szerint zajlik. A technikát sikeresen

alkalmazták különböző kémiai összetevők direkt analízisére, például egész fehérjemolekulák

detektálására biológiai folyadékokból (vér, könny, nyál, szérum), baktérium tenyészetekből és

szövetekből anélkül, hogy kémiai mátrixot kellett volna a mintához adni a deszorpciós

folyamat hatékonyságának növelése érdekében. Az irodalomban található arra is példa, hogy

ugyanezt az eljárást kémiai mátrix segítségével végezték (MALDESI) [110]. Míg az ELDI és

a MALDESI technikákban UV lézer forrást alkalmaznak, addig a LAESI (laser ablation with

electrospray ionization: lézer abláció elektrospray ionizációval) technikában IR lézert

használnak. Ennek legfőbb előnye, hogy akár a minták víztartalma is felhasználható

mátrixként az OH-csoport megfelelő rezonancia frekvenciája miatt. Ez indokolja, hogy a

módszernek több biológiai minták analízisével kapcsolatos alkalmazása is született az elmúlt

években [111].

1.2.3. A biológiai szövetek analízise

A tömegspektrometriás alapú szövetvizsgálat mintegy 20 éves múltra tekint vissza.

Hagyományosan a vizsgálat meglehetősen bonyolult, magában foglalja a szövetminták

homogenizálását, szelektív extrakcióját, és kromatográfiás elválasztását a tényleges

tömegspektrometriás analízist megelőzően. Ezen vizsgálatok általában jól definiált

molekuláris komponensek mennyiségi meghatározását célozzák, és a rutin diagnosztikai

gyakorlat területén nem kerültek alkalmazásra. A deszorpciós ionizációs módszerek fejlődése

azonban lehetővé tette a mikroszkópos metszetek közvetlen vizsgálatát, és ilyen módon

32

lehetőség nyílt egyes molekuláris komponensek szövetmintán belüli eloszlásának vizsgálatára

is.

A biológiai szövetanalízisnek analitikai kémiai szempontból nézve két alapvető fajtája

van: a proteomikai, illetve a lipidomikai alkalmazások. Az első típus a szövetek fehérje

összetételét vizsgálja, míg a második a különböző lipidek előfordulását. Mindkét területet

forradalmasította a MALDI és a SIMS tömegspektrometria megjelenése, mivel ezekkel a

módszerekkel a nagyméretű biomolekulák vizsgálata ideálisan megvalósítható [112-113].

A kémiai képalkotás (imaging) során a mintáról olyan kép készül, amelynek minden

egyes képpontjához (pixel) egy individuális tömegspketrum tartozik. A legtöbb irodalmi

példát fehérjékre találhatunk [114], de folyamatosan nő a száma a lipidomikával foglalkozó

publikációknak is [115]. Mind a MALDI, mind a SIMS módszerek ma már klasszikusnak

számítanak a képalkotásra alkalmas technikák között. Az előzőekben ismertetett

atmoszférikus deszorpciós ionizációs eljárások közül pedig még a DESI [116], a JeDI, a

LAESI [117], illetve az SSSP [118] módszerek esetében találhatunk irodalmi példát biológiai

szövetek képalkotó analízisére. Az atmoszférikus nyomáson működő módszerek magukban

hordozzák azt a lehetőséget, hogy gyors képalkotást biztosítsanak, mely akár egy műtéti

beavatkozás számára is információt szolgáltathat. A tömegspektrometriás analízis sok

speciesz párhuzamos vizsgálatára ad lehetőséget, amely az ennyire összetett minták esetében

különösen előnyös tulajdonság. Azonban a hisztológiához és az autoradiográfiás eljárásokhoz

hasonlítva éppen az számít hátránynak, hogy nem specifikus, ezáltal pedig nem elég egyszerű.

A műtét közbeni szövetazonosítás egyetlen jól bevált módszere még napjainkban is az

intraoperatív hisztopatológiai vizsgálat. Ebben az esetben a műtét során eltávolított

szövetrészletekből történik az úgynevezett fagyasztott metszetkészítés. A metszeteket a

patológus mikroszkóposan vizsgálja, majd a vizsgálat eredménye alapján születik döntés a

műtét folytatásáról. A módszer egyik hátránya, hogy a műtét idejét mintegy fél órával

hosszabbítja meg, mivel nagyjából ennyi időt vesz igénybe a vizsgálat. A további hátrányok

közé tartozik, hogy a fagyasztásos technikával készült metszetek minősége elmarad a

hagyományos beágyazásos technikával készült metszetekétől, valamint az eljárás a műtéti

beavatkozás során csak korlátozott számú minta (általában egy minta) esetében vehető

igénybe.

A közelmúltban számos kísérlet történt a tumoros területek fluoreszcenciás

vizualizálására [119]. Bár ezen kutatási projektek során számos olyan, szövetspecifikus

fluoreszcens festék került kifejlesztésre amely akár a műtétek során is alkalmazható lenne, a

technológia mégsem terjedt el a gyakorlatban. Ennek legfőbb oka, hogy a nagy mennyiségben

33

beadott festék minden esetben okoz bizonyos mellékhatásokat, valamint egy festéktípus csak

egy bizonyos, jól definiált tumor típus esetében használható.

2. Az irodalmi bevezető összefoglalása, a témaválasztás indoklása

Biológiai minták tömegspektrometriás vizsgálatára jelenleg elsősorban

folyadékkromatográfiás – tömegspektrometriás, másodsorban gázkromatográfiás –

tömegspektrometriás módszereket használnak. Ezek a módszerek – különös tekintettel a minta

előkészítésre – meglehetősen idő- és munkaigényesek, azonban megbízható eredményekkel

szolgálnak. Mivel ezen alkalmazások legfőbb felhasználási területe a gyógyszerfejlesztés és a

klinikai diagnosztika, a módszerek megbízhatósága tipikusan minden további szempontot

felülbírál. Egy módszer megbízhatóságát azonban kizárólag nagy mennyiségű, hosszú idő

alatt összegyűlt tapasztalat alapján lehet megítélni, ezért a közlemúltban kidolgozott,

alapvetően deszorpciós ionizáción alapuló közvetlen tömegspektrometriás módszerek nem

jelentek meg a gyakorlati analitikai munkában.

A közvetlen ionizációs tömegspektrometriás módszerek azonban nem csak az

analitikai feladat megoldásának az időigényét csökkentik, hanem lehetővé teszik olyan

alkalmazások kifejlesztését is, amelyek esetében eddig más módszereket alkalmaztak (pl.

centralizált labordiagnosztika) vagy fel sem merült az analitikai kémiai megoldás lehetősége.

A doktori munkám alapvető célkitűzése az volt, hogy olyan, közvetlen ionizációs

(elsősorban deszorpciós elektrospray ionizáción alapuló) módszereket fejlesszek ki, amelyek

segítségével biológiai minták közvetlenül vagy minimális előkészítés után vizsgálhatóak.

Mivel analitikai szemszögből a biológiai minták egyértelműen biológiai fluidumokra (vér,

vizelet, plazma, szérum, liquor, stb.) és szövetmintákra oszlanak, a doktori munkám

kezdetétől fogva párhuzamosan foglalkoztam ezen két mintacsoport közvetlen ionizációs

tömegspektrometriai vizsgálatának lehetőségeivel.

Mind a fluidumok, mind pedig a szövetminták esetében megpróbáltunk olyan

alkalmazást találni, ahol a jelenleg használt módszerek problémákkal küzdenek, és

mindenképpen szükséges valamilyen alapvető metodikai változtatás a közeljövőben. A

biológiai fluidumok esetében kézenfekvő választásnak látszottak a klinikai kémiai-

labordiagnosztikai alkalmazások. Jelenleg az ilyen meghatározások esetében alapvetően

kémcsőbe levett vérmintákat használnak, amelyek tesztenként néhány ml vért igényelnek, de

összességében egy teljes kivizsgálás mintaigénye elérheti a deciliteres mennyiséget. A

34

mintákat egy meglehetősen bonyolult, de analitikai szempontból nézve primitív, úgynevezett

labordiagnosztikai automata dolgozza fel. Az automaták jórészt klasszikus színreakciókon

alapuló kolorimetriás meghatározásokat alkalmaznak. Emellett – egyszerűbb analitok

esetében – elektrokémiai (tipikusan potenciometriás) meghatározás is szerepelhet. Az

automaták nagy hátránya, hogy limitált mennyiségű teszt elvégzésére képesek, a diagnosztikai

vizsgálatok köre nem vagy csak igen bonyolult módon bővíthető. A direkt ionizációs

tömegspektrometriás módszerek ezzel szemben képesek minimális mintamennyiségből

kiindulva lényegében tetszőleges számú paraméter meghatározására, amennyiben megfelelő

érzékenységet tudunk elérni. Azonban, amint azt az irodalmi áttekintésben leírtam, a

módszerek (DESI, DART, DAPCI) érzékenysége szignifikánsan elmarad a hagyományos

ionizációs technikák érzékenységétől, ami a biológiai fluidumokból meghatározható

komponensek körét nagy mértékben leszűkíti. Ilyen módon a biológiai fluidumok közvetlen

ionizációs tömegspektrometriás vizsgálata esetében egy olyan módszer kidolgozása volt a cél,

amelynek segítségével viszonylag egyszerűen, de lényegében tetszőleges mértékben

megnövelhető az említett módszerek érzékenysége.

Szövetminták esetében a szöveti komponensek gyors, kvantitatív meghatározásának

lehetőségét kezdettől fogva elvetettük, ugyanis ez nem kivitelezhető a minták homogenizálása

és extrakciója nélkül. Bár szövettani metszetek vizsgálhatóak ezekkel a módszerekkel (lásd

irodalmi áttekintés), de ezek a vizsgálatok a megfelelő belső standard hiányában nem

nevezhetőek kvantitatívnak. A korlátot elsősorban az jelenti, hogy egy szövetminta esetében

nem érhető el, hogy a belső standard vegyületet a minta egyenletes eloszlásban tartalmazza. A

korábbi, deszorpciós ionizációs módszerekkel elért eredmények és a DESI-alapú kémiai

képalkotás eredményei alapján egyértelmű volt, hogy ha egyes komponensek nem is

határozhatóak meg a szövetmintákból, a kapott tömegspektrumok alapján a szövetek

hisztológiai besorolása viszont egyértelműen megállapítható. Ez a felismerés magában

azonban nem ekvivalens a módszerek gyakorlati alkalmazhatóságával, ugyanis a szövettani

metszetek hisztológiai besorolására a közönséges optikai mikroszkópiás vizsgálat is alkalmas.

A mikroszkópos vizsgálat emellett gyorsabb, olcsóbb, és lényegesen jobb térbeli felbontásra

képes.

A hisztológiai módszerek azonban – a közvetlen ionizációs tömegspektrometriás

módszerekkel ellentétben – kizárólag megfelelően elkészített és festett szövettani metszetek

esetében működnek, natív szöveti blokkminták vagy élő szövetrészletek nem vizsgálhatóak

ilyen módon. Ez a probléma leginkább a tumor eltávolító műtétek esetében merül fel, ahol

35

szükséges volna az azonnali szövettani diagnózis felállítása, ideálisan még a műtéti

beavatkozás közben.

Mivel a DESI módszer alkalmas lényegében tetszőleges minta felületének

vizsgálatára, és a szöveti DESI spektrumok hisztológiai specificitása ismert (bár csak

metszetek esetében), kézenfekvőnek látszott egy, sebészeti környezetben működő DESI alapú

technika kifejlesztése. A technika kifejlesztése azzal a reménnyel kecsegtetett, hogy a

sebészeti beavatkozás közben feltárt szövetrészletek azonnal azonosíthatóvá válnak, és ilyen

módon csökkenthető a tumor eltávolító beavatkozások időigénye, szintén csökkenthető az

eltávolított szövet mennyisége, valamint javítható a szöveteltávolítás specificitása. Bár a

DESI esetében alkalmazott nagy feszültség, valamint a nagy sebességű gázáram megoldandó

problémaként jelentkezett, célként egy olyan módszer kifejlesztését tűztük ki, amely

közvetlen ionizációs tömegspektrometrián alapszik, és képes élő szövetek vizsgálatára, illetve

a vizsgálati eredmények alapján lényegében valós idejű azonosítására.

36

3. Kísérleti rész

3.1. Szilárd fázisú extrakció és deszorpciós ionizáció kombinációja

3.1.1. Bevezető

Doktori munkám során egy újfajta mintaelőkészítési és mérési eljárást dolgoztam ki,

amely elsősorban folyadékminták szerves mikrokomponenseinek mennyiségi és minőségi

meghatározására szolgál. A kifejlesztett módszer előnye, hogy a tömegspektrometriás

mérések időigényét a töredékére csökkenti oly módon, hogy a mérés érzékenysége és

szelektivitása nem sérül. A módszer kivitelezéséhez szükséges eszközöket is

laboratóriumunkban fejlesztettük.

Az irodalmi bevezetőben bemutatott atmoszférikus nyomású deszorpciós ionizációs

technikák előrevetítették egy, a jelenlegi tömegspektrometriás technikáknál mintegy 2-3

nagyságrenddel gyorsabb alkalmazás kifejlesztésének a lehetőségét. A deszorpciós ionizációs

technikák előnye a nagy sebességű analitikai alkalmazásokhoz képest az, hogy az egymás

után mért minták nem keveredhetnek egymással (8. ábra b). Ilyen módon a minták közti

keresztszennyeződés teljes mértékben kiküszöbölhető. A gázfázisú ionizációs és spray

ionizációs technikák esetében az egymás után következő minták ugyanazokon a

csővezetékeken áramlanak keresztül (8. ábra a), ami mindenképpen limitálja az egységnyi idő

alatt lemérhető minták számát.

8. ábra: A spray (a) és a deszorpciós ionizációs (b) módszerek működési elve.

Az atmoszférikus nyomású deszorpciós ionizációs módszerek esetén emellett a minta

tömegspektrométerbe történő bejuttatása is kiküszöbölhetővé válik, így nincs szükség a

minta1 minta2

gázfázisú ionok

minta1 minta2

analitikai nyalábgázfázisú ionok

a. b.

spray

37

minták módosítására sem, és ilyen módon nagyobb mérési sebesség érhető el. Ellenben

ezeknek a technikáknak az érzékenysége messze elmarad a konkurrens spray illetve gázfázisú

ionizációs technikák esetében tapasztalt érzékenységtől, ami nagy mértékben korlátozza a

módszerek alkalmazhatóságát. Végeztem egy egyszerű szemléltető kísérletet, melynek során a

kotininre vonatkozó abszolút érzékenységre jellemző LLOQ (lower limit of quantification)

értéket mértem metanolos oldatból a hagyományos elektrospray forrással, illetve a DESI

módszerrel. Az elektrospray analízis eredménye 500 pg/ml lett, míg DESI-ve 500 ng/ml-nek

adódott az abszolút érzékenység. Ennek a három nagyságrendbeli különbségnek több oka is

van, melyek nagy részét a DESI technika alapvető működésében kell keresni (9. ábra). A

módszer geometriájából adódik, hogy az ionoknak csak egy töredéke kerül be a

tömegspektrométerbe az analízis során. Egyrészt amiatt, hogy kicsi a felületi sűrűség, mivel a

felcseppentés során a minta szétterül a felületen. Másrészt pedig a felülettel való ütközés után

a töltött részecskék különböző irányokba szóródnak, így kis hányaduk jut be a fűtött

kapillárisba.

9. ábra: Az ionizációs hatásfok csökkenésének okai a DESI módszer esetében.

Az másik nyilvánvaló ok, amely ennél a kísérletnél nem is érvényesülhetett, a

mintaelőkészítés hiánya, ami miatt a fellépő mátrixeffektus még jobban lecsökkenti az analit

detektálásának hatékonyságát.

Doktori kutatómunkám célja egy olyan mintaelőkészítési módszer kifejlesztése volt,

melynek alkalmazásával az atmoszférikus nyomású deszorpciós ionizációs technikák

érzékenysége 2-4 nagyságrenddel megnövelhető, anélkül hogy a módszer időigényét

lényegesen megnövelnénk. A mintaelőkészítési módszer esetében az egyik fontos szempont

V

szétterülés a felületen

szóródás

V

szétterülés a felületen

szóródás

38

az volt, hogy valamilyen módon helyettesítse az időigényes, és a deszorpciós technikáknál

csak körülményesen alkalmazható kromatográfiás eljárásokat. Természetesen szükséges

tervezési szempont volt az is, hogy a minta formátuma kompatibilis legyen a deszorpciós

elektrospray ionizációs detektálással, ami azt jelenti, hogy az analitnak egy olyan felületen

kell elhelyezkednie, amely megfelelő az analízishez. Ezen kívül a mintaelőkészítés legyen

gyors, egyszerű és nagy mintaszámmal is kivitelezhető, vagyis legyen alkalmas high-

throughput analitikai célok megvalósítására is. Az eljárás kidolgozásához a jól bevált szilárd

fázisú extrakciós technikát kombináltam az atmoszférikus nyomású deszorpciós ionizációs

tömegspektrometriával. A szilárd fázisú extrakció folyamatának csak az utolsó, elúciós

lépését kellett módosítani olyan módon, hogy az oldat fázisú minta helyett egy szabad

felületen elhelyezkedő szilárd fázisú mintát kapjak. Így jött létre a szilárd fázisú extrakcióval

kapcsolt deszorpciós elektrospray ionizációnak (SPEEDI: solid phase extraction enhanced

desorption electrospray ionization) elnevezett módszer, melynek vázlatos működési elve az

alábbi ábrán látható.

10. ábra: A SPEEDI eljárás működése.

Az eljárás három fő lépésből áll. Először a klasszikus szilárd fázisú extrakciós eljárás

szerint az SPE töltet kondícionálása után a vizsgálandó anyagot felvittem az adszorbensre

deszorbeált ionok

1. 2. 3.

+

++ +

oldószer

felső porózusmembrán

alsó porózusmembrán

minta

fűtött gázcső

forró nitrogén

eluens

ionforrás

sprayeluens gőze

adszorbens

39

folyadék fázisú minta formájában. A következő lépés a módszer kulcsa, a vizsgált vegyületet

koncentráltam a töltet felett található frit felszínére úgy, hogy az egyik irányból oldószert

áramoltattam keresztül a tölteten, míg a másik oldalon fűtött nitrogén áramot használtam az

oldószer elpárologtatásához. A felületre rászárított mintát DESI technikával analizáltam.

3.1.2. Az SPE patron fejlesztése

A mintavevő/mintahordozó SPE patron fejlesztésének első lépése az volt, hogy a

kereskedelmi forgalomban kapható szilárd fázisú extrakciós eszközök kínálatát

megvizsgáltam abból a szempontból, hogy melyik típus lenne alkalmas a tervezett feladatra.

A deszorpciós ionizációs vizsgálat biztosításának igénye miatt fontos volt, hogy a töltetet

lezáró legalább egyik frit (porózus polimerből készült lemez) hozzáférhető legyen a

deszorpciós ionizációs analitikai nyaláb számára. A kereskedelmi forgalomban beszerezhető

SPE patronok vázlatos felépítése az alábbi ábrán látható.

11. ábra: Kereskedelmi forgalomban kapható SPE patron vázlatos felépítése.

Az ábrán látható felépítés a DESI analízis számára sajnos nem jelent megoldást, mivel

a töltetet lezáró fritek a polipropilén cső belsejében helyezkednek el. Alternatívaként

felmerültek egyéb, kereskedelmi forgalomban szintén beszerezhető SPE eszközök, amelyek

nem a hagyományos módon két frit közé töltve tartalmazzák az SPE töltetet, hanem egy

egységes üvegszál mátrixba ágyazva (12. ábra). Ezekben a patronokban a töltet, illetve a

töltetet hordozó üvegrost hozzáférhető a deszorpciós ionizációs analitikai nyaláb számára. A

kezdeti vizsgálatok azonban azt mutatták, hogy bár az analit elúciója sikeresen végbement a

felületre, az eluált anyag jelentős része egyedi üvegszálakon illetve a töltetet körülvevő

polipropilén cső peremén koncentrálódik, ami meglehetősen nehézzé teszi a deszorpciós

polimer fritek

mintatartó

adszorbenstöltet

lueres csatlakozó

40

ionizációt azokban az esetekben, ahol nem illékony vegyületek kimutatása illetve

meghatározása a cél.

12. ábra: Üvegszálas mátrixba ágyazott töltetet tartalmazó patron.

Az SPEEDI patron fejlesztése során az első lépésként a kereskedelmi forgalomban

kapható különböző fritanyagokat teszteltem. Különböző pórusméretű saválló acél (SS),

polietilén (PE), poli-(vinilidén-difluorid) (PVDF), üveg, cellulóz, kevert cellulóz észter

(MCE), Nylon és poli-(tetrafluor-etilén) (PTFE) fritanyagok álltak rendelkezésre. A tesztelés

első szakaszában a különböző fritanyagok mintahordozókénti viselkedését vizsgáltam DESI

ionizációs módszer esetében, rodamin 123, atrazin, cyclosporin A és angiotenzin II

vegyületekkel. A vizsgálatok eredményeit a 2. táblázat tartalmazza. Minden vizsgálat

esetében teszteltem a reprodukálhatóságot, a dinamikus tartományt és az abszolút kimutatási

határt is. Az SS frit esetében az ionforrás módosításra szorult olyan módon, hogy az SS fritre

mintegy 3-4 kV egyenfeszültséget kellett kapcsolni a megfelelő ionizációs hatásfok

eléréséhez. Az eredményekből látható, hogy a PVDF, a cellulóz és a Nylon membránok

további vizsgálata értelmetlen lett volna. A mérések tapasztalatai szerint ezek a fritanyagok

ugyanis egyrészt irreverzibilisen kötnek bizonyos anyagokat (pl. PVDF-angiotenzin),

másrészt megduzzadnak az ionizáció során használt oldószertől. Legjobbnak a PTFE és az

üveg frit bizonyult, különös tekintettel az abszolút érzékenységre. Bár a reprodukálhatóság

tekintetében a PTFE csak a harmadik legelőnyösebbnek bizonyult, mechanikai tulajdonságai

és általános kémiai inertsége miatt a továbbiakban ezt használtam. Az SS frit – bár előnyös

tulajdonságokat mutatott – kikerült az érdeklődési körből, ugyanis a tömegspektrométer

atmoszférikus bemenetéhez közel elrendezett, magas elektromos potenciálon tartott

fémeszköz folyamatos ívkisüléseket, valamint esetenként a perem körül kialakuló stabil

koronakisülést eredményezett, amelyek egyrészt elektronikus zajt okoztak, másrészt

veszélyeztették a tömegspektrométer kisfeszültségű tápegységének működését. Következő

lépésként a fritanyagok oldószertűrését teszteltem. Mivel az MCE igen rossz oldószertűrési

üvegszállal elkevert szemcsés adszorbens

polipropilén mintatartó rész

üvegszállal elkevert szemcsés adszorbens

polipropilén mintatartó rész

41

sajátságokkal rendelkezik, ezért csak speciális esetekben lehetne alkalmazni. A deszorpciós

ionizációs és az oldószertűrési kísérletek eredményeképpen három fritanyagot, a PE-t, a

PTFE-t és az üveget használtam a további fejlesztési kísérletek során.

Atrazin Cyclosporin A Angiotensin

II

Rhodamin

123

PE 79 83 66 108

Üveg 93 85 94 76

Cellulóz 65 25 27 46

MCE 40 56 54 21

Nylon 72 61 65 38

PTFE 112 105 128 141

PVDF 28 33 7 82

Saválló acél (SS) 69 85 92 90

2. táblázat: Különböző minőségű fritek tesztelésének eredményei; az értékek a standardnak

számító tömör PTFE felülethez mért relatív érzékenységet mutatják.

Az SPEEDI patron esetében – a kereskedelmi forgalomban kaphatókhoz hasonlóan –

olyan eszközt terveztem, amely két részből, egy mintatartó és egy töltet tartó részből áll. A

vákuum manifoldhoz történő egyszerű csatlakoztatás érdekében a töltet tartó rész kúpos

geometriája (luer) célszerűnek tűnt, így végül az egyszerű, 1 ml-es polipropilén fecskendőre

esett a választás. Annyi módosítást igényelt csak az eredeti állapotához képest, hogy a végét

mindig pontosan ugyanannál a méretnél le kellett vágni. Így az eszköz előállítása teljesen

reprodukálható lett. A luer részbe két 2 mm átmérőjű frit korong közé töltöttem az

adszorbenst. A hengeres rész mérete lehetővé teszi pontosan 25 mg 40-60 μm átlagos

szemcseméretű szilikagél betöltését, így a kísérletek jelentős részében 25 mg-os töltetekkel

dolgoztam. Az eszköz felépítése a következő ábrán látható.

42

13. ábra: Az általunk fejlesztett SPE patron felépítése.

A patronok összeállítása során az üvegfritek, nem megfelelő mechanikai

tulajdonságuk következtében, általában nem tömítettek, és a minta illetve az elúcióhoz

használt oldószer a frit mellett folyt ki, ezért végül a további kísérletekhez csak PE illetve

PTFE friteket használtam. A fritek optimális pórusméretének meghatározásához többféle

valós mintát használtam, különböző pórusméretű PE és PTFE fritekkel. Az alábbi táblázat az

1 ml minta átáramoltatásához szükséges időt mutatja másodpercben, 2 db egymás fölé

rétegzett 2 mm átmérőjű friten keresztül, miközben a friteket tartó csővezeték vákuum

manifoldhoz van csatlakoztatva, azaz a nyomáskülönbség ~ 1 bar. A teszteléshez tiszta vizet,

felszíni vizet (Duna), vizeletet, vérplazmát, és szűrt gyümölcslevet használtam.

Fritanyag Pórusméret

(μm)

HPLC

víz

Duna

víz

Vizelet Plazma Szűrt

gyümölcslé

0.1 15 > 600 130 > 600 > 600

0.22 12 > 600 15 > 600 310

0.45 4 > 600 10 > 600 150

1 4 > 600 3 > 600 20

2 2 95 3 430 12

5 2 40 3 380 15

10 1 25 2 320 8

PE

20 1 10 2 370 3

20 μm-es PTFE fritek

25 mg SPE töltet

PP mintatartó rész

43

0.1 440 > 600 > 600 > 600 180

0.22 370 > 600 > 600 > 600 260

0.45 310 > 600 > 600 > 600 120

1 280 > 600 > 600 > 600 65

2 290 240 520 > 600 70

5 230 320 390 > 600 75

10 125 130 220 > 600 60

PTFE

20 100 150 105 > 600 10

3. táblázat: A fritek pórusméretének optimalizálása.

A mérési eredményekből egyértelműen kiderül, hogy a 0.45 μm alatti pórusméretű

PTFE fritek nem használhatók lényegében egyik alkalmazásnál sem, míg a PE általában

lényegesen nagyobb áramlási sebességet enged meg. Optimálisnak PE frit esetében az 1 μm –

20 μm tartomány tekinthető, míg PTFE esetében a 10 μm – 20 μm tartomány. Ebből a

tapasztalatból kiindulva a további kísérleteknél általában a 20 μm pórusméretű friteket

használtam. A 20 μm-nél nagyobb pórusméret esetében már az SPE töltet kis méretű frakciója

képes eltömni a frit pórusait. A töltet esetében nem volt szükség az optimális anyagok egyedi

megválasztására, ugyanis ebben az esetben is az SPE töltet ugyanazt a szerepet tölti be, mint a

hagyományos SPE-töltet.

Mivel mind az analitikai kémiában, mind a biokémiában, molekuláris biológiában, sőt

még a sejtbiológia területén is a 8 x 12-es formátumú mintatartó plate-eket használják

leggyakrabban, ezért a laboratóriumunkban megterveztünk és kiviteleztünk egy olyan plate-et,

melyben elhelyezhető 96 általunk készített patron (14. ábra). A minták távolsága ebben a

plate-ben egyezik a szabványos távolsággal. A mintatartó plate elkészítése azért volt fontos,

hogy high-throughput méréseket is meg lehessen valósítani a kifejlesztett módszerrel.

44

14. ábra: 96 lyukú plate az SPE patronokhoz.

3.1.3. A SPEEDI-kártya fejlesztése

A patron mellett felmerült egy kártya formátumú mintahordozó kifejlesztésének

igénye, amely méretét tekintve megegyezik egy bankkártyával. A fő alkalmazási területe

ennek a típusnak a központosított, minimálisan invazív orvosi diagnosztika területe lehetne. A

beküldő intézmények ebben az esetben néhányszor 10 μl biológiai fluidomot, általában teljes

vért vennének le a kártyára, hagynák megalvadni/megszáradni, majd postai úton juttatnák el a

központi laboratóriumba. Itt történne a minta elúciója, majd a deszorpciós ionizációs

tömegspektrometriás vizsgálata. A kártya fejlesztése során praktikus követelmény, hogy

tartalmazzon valamilyen mintaazonosítót is.

A kártyához felhasználtam a patron kifejlesztése során nyert tapasztalatokat. Egy

polipropilén kártyába ágyaztam be az egyes esetekben porózus membránokkal határolt

adszorbenst. Az esetenként több rétegű adszorbens beillesztése és rögzítése a maximálisan 2

mm vastag kártyába nem volt egyszerű feladat. Ennél a mintahordozó típusnál, ha lehet, még

fontosabb a megfelelő adszorbens kiválasztása. A legegyszerűbbnek ezek közül az

újszülöttkori anyagcsereszűrésben is használatos Whatman 903 szűrőpapír (cellulóz)

bizonyult. A papírból 4 mm-es korongokat vágtam ki, majd a polipropilén kártyában

kialakított 4 mm átmérőjű kerek lyukakba helyeztem, és további, előre lyukasztott PP fólia

ráhelyezésével és rápréselésével rögzítettem. Az előre lyukasztott PP fóliák közül az egyiken

3.8 mm átmérőjű, míg a másik oldalra kerülő fólia esetén a lyuk átmérője csak 1 mm volt. A

mintafelviteli oldalon értelemszerűen akkora lyukat kellett hagyni, hogy mindenképpen

45

megtartsa a szűrőpapír korongot, amíg azon az oldalon, ahol a vizsgálat történt, célszerű volt

az elúciós felületet akkorára csökkenteni, amekkora területet a DESI ionforrás képes

egyszerre vizsgálni a minta további mozgatása nélkül. A SPEEDI-kártyát a 15. ábra

szemlélteti.

15. ábra: A SPEEDI-kártya.

A szűrőpapírkorongokkal ellátott kártyára további, módosított cellulózból készült,

peremén ragasztós csíkkal ellátott fedőfólia került. Mivel a sem a cellulóz, sem a

véralvadékkal átitatott cellulóz nem ideális felület a DESI ionizáció számára, a szűrőpapírral

ellátott kártya továbbfejlesztésének első lépése volt egy porózus, 10 μm vastag PTFE

membrán behelyezése a szűrőpapír azon oldalára, ahol a deszorpciós ionizáció történt. Ilyen

módon az elúció a PTFE felületre történik, majd az ionizáció is innen megy végbe. A

különböző adszorbens kialakításokat az alábbi ábra mutatja.

16. ábra: A SPEEDI-kártyáknál használt adszorbens struktúrák.

Amennyiben a mintafelviteli oldalra egy 0.45 μm pórusméretű hidrofil membránt

helyezünk, a membrán képes visszatartani a vér sejtes elemeit, így a szűrőpapírra lényegében

csak plazma kerül. A sejtes elemekben feldúsult vérminta a felületről letörölhető. Teszteltem

cellulóz hidrofób PTFE

hidrofil PTFE0,45 μm

hidrofil PTFE20 μm

C18 SPE disc

46

továbbá a hagyományos SPE töltetek kártyába történő beépíthetőségét is. A patronok esetében

használt módszer ebben az esetben is alkalmazható, azonban a patronokban használt 1 mm-es

fritvastagság ebben az esetben nem használható. A vékonyabb fritanyagok problémája a

lecsökkent mechanikai stabilitás, ami egyrészt a minta szállításakor, másrészt pedig a minta

elúciója során jelent problémát, ugyanis az oldószer tölteten való átpréselésekor a membránok

átszakadhatnak. A probléma kiküszöbölésének érdekében az ún. SPE diszkek és

„monolitikus” SPE töltetek esetében használt, felületmódosított üveg vagy kvarcgyapotba

ágyazott SPE töltetet használtam. Ezen töltetek mechanikai stabilitása jó, és ilyen módon nem

szükséges a vastag fritanyag használata. Az üvegszálas hordozóba ágyazott különböző

töltetekkel sikerült megvalósítani a többrétegű adszorbenst tartalmazó eszközt is.

3.1.4. Az elútor egységek kifejlesztése

A minta felvitelének és szárításának módja függ a mintaformátumtól. A patron

esetében ezek a folyamatok vákuum manifoldban történnek, ahogyan a klasszikus szilárd

fázisú extrakció folyamán is, majd ezt követően kerül a minta az elútor egységbe.

17. ábra: Patron formátumban történő mintaelőkészítés.

A kártyák elúciója az ionforrásban történik olyan módon, hogy a kártyába épített

adszorbenskorongon átáramoltatott folyadékot az ionforrásban használt nagy sebességű

gázáram segítségével el lehet párologtatni. Ehhez egy olyan elútor és egyben mintatartó

egység tervezésére volt szükség, amely a folyamat során végig rögzített állapotban tartja a

kártyát, és biztosítja az oldószer hozzávezetést az elúciós lépéshez. Ezzel az egységgel

47

egyidejűleg egy minta elúciója és közvetlenül utána az analízise valósítható meg, de ezután

elegendő a kártyát egyszerűen egy pozícióval odébb helyezni, hogy sorra kerülhessen a

következő minta.

18. ábra: A kártyához használt elútor és mintatartó egység.

A patron jellegű mintahordozók elúciójához azonban külön elútor egységet kellett

tervezni. Az elúciós lépéshez, valamint a szárításhoz történő oldószer, illetve gáz

hozzávezetést a következő ábrán látható hengeres, PEEK-ből (poly-ether-ether-ketone)

készült betéttel oldottam meg, amely lényegében tökéletesen kitölti a patron mintatartó részét,

minimálisra csökkentve a rendszer holttérfogatát. A patront egy luer csatlakozó méretű kúpos

furattal ellátott alumínium tömb tartja az elúció során. A patron felfele néző végével szemben

helyezkedik el a fűtött gázt kibocsátó, vörösréz csőből készült fúvóka. A fúvóka és a patron

végének a távolsága egy csavar segítségével beállítható. A készülék vázlatos felépítését,

valamint a fényképét a 19. ábra mutatja.

48

19. ábra: Az egycsatornás elútor felépítése.

Szerves oldószerrel történik az elemzendő anyag elúciója a patront lezáró fritre, majd

levegő segítségével ki kell űzni a patronból a benne levő szerves oldószer maradékát. Ez

utóbbi lépés elmulasztása általában azt eredményezi, hogy az adszorbensben, illetve fritben

maradt oldószer visszaoldja a felületen felhalmozódott elemzendő anyagot, a szembe fújt

fűtött gáz pedig visszaszorítja az oldószert az adszorbens belsejébe. Ennek elkerülése

érdekében az oldószert egy váltószelepen (Rheodyne, 6-port diverter valve) keresztül

vezettem a patronba, amely A állásban az oldószert tartalmazó, fecskendőpumpába helyezett

fecskendővel köti össze a patron betétjét, B állásban viszont az ugyanabba a

fecskendőpumpába helyezett, levegőt tartalmazó fecskendővel köti össze a betétet. A

tapasztalatok azt mutatták, hogy az oldószer kiűzésére nem használható szabályozott

nyomású, gázpalackból nyert gáz, ugyanis a patron ellenállása annyira kicsi, hogy csak

szabályozott áramlási sebességű, mintegy 50-100 μl/min gázáram az, ami lehetővé teszi az

eltávolított oldószer tökéletes elpárologtatását. Ha ugyanis az oldószermaradék túl gyorsan

TC

SPE patron

fűtött gázcső

pozícionáló csavar

nitrogén

eluens

minta

49

hagyja el a patront, akkor a hirtelen megjelenő oldószercseppet a fűtött gáz egyben lefújja a

fritről, ami az elemzendő anyag teljes elvesztését jelentheti.

A 96-os mintaformátum esetében az előzőekben ismertetett elútor egység

természetesen nem használható. A mintahordozó eszköz ebben az esetben a 8 x 12 luer típusú

lyukkal ellátott 1 cm vastag polimer tábla, amibe 96 db patron illeszthető be. Ehhez

mintaformátumhoz egy 96 csatornás elútort építettünk.

20. ábra: A 96-os mintaformátumhoz tartozó elúciós berendezés.

A 96-os plate-be 8 csatornás sorozatpipettával pipettáztam be az elúcióhoz szükséges

oldószert (az előző módszerhez képest itt fordítva helyezkednek el a patronok), majd egy 96

lyukkal ellátott feltét segítségével, fecskendőpumpa által szabályozott áramlási sebességű

levegővel nyomtam át a patronokon az oldószert, miközben a plate alatti, 96 lyukkal ellátott,

szabályozottan fűtött alumínium tömbön keresztül fűtött gáz áramlott a patronokat lezáró

fritekre. A gáz ebben az esetben levegő, amely egy nagy teljesítményű ventilátor segítségével

áramlik keresztül a fűtött fémtömbön. A 96 csatornás elútor segítségével 96 db minta mintegy

3-5 perc alatt készíthető elő, ami mintánként 2-3 másodpercet jelent.

50

3.1.5. Műszeres eszközfejlesztés

Az analízist két különböző tömegspektrométerrel végeztem. Az egyedi patronok

mérése egy TSQ Quantum Discovery (ThermoFinnigan) típusú készülékkel, míg a 96-os plate

mérése egy API 4000 Q-TRAP hybrid triple quadrupole/iontrap (Applied Biosystems/MDS

Sciex) típussal történt.

A TSQ készülék egy kereskedelmi forgalomban kapható DESI forrással volt

felszerelve (OmniSpray, Prosolia). Ez a forrás a lehető legnagyobb flexibilitás érdekében kézi

manipulátorokkal van ellátva, amelyek gondoskodnak az elektrospray, a minta és a

tömegspektrométer megfelelő egymáshoz viszonyított pozíciójáról. A mintatartó, illetve az

elektrospray három dimenzióban szabadon mozgatható, és ez utóbbi a tömegspektrométer

ionoptikájának síkjában is tetszőleges szögben elforgatható, mivel az analitikai nyaláb

becsapódási szöge igen fontos paraméter az atmoszférikus nyomású deszorpciós ionizációs

technikák esetében. A tömegspektrométer viszont eredeti formájában csak korlátozottan

alkalmazható deszorpciós ionizációs kísérletekhez, mivel a fűtött kapilláris külső vége nagyon

rövid, ezért szükség volt az atmoszférikus interfész módosítására. A módosított atmoszférikus

interfész fejlesztése során első lépésként egy olyan saválló acél csatlakozót kellett

kifejleszteni, amelynek segítségével tetszőleges hosszúságú 1/16 hüvelyk külső átmérőjű

saválló acél cső csatlakoztatható a készülékhez, és használható atmoszférikus interfészként.

Ezután viszont meg kellett oldani a meghosszabított saválló acél cső készüléken kívüli

részének a fűtését. Ugyanis a fűtés hiánya két okból is megnehezíti az analízist. Egyrészt a

fűtetlen szakasz illékony vegyületek esetében könnyen elszennyeződhet, így a minták közt

nagy fokú keresztszennyeződés léphet fel. Másrészt a gázfázisú ionok fémfelületen történő

semlegesítődésének folyamatát alapvetően meghatározza a felület hőmérséklete. A fűtést úgy

lehetett megvalósítani, hogy a saválló acél csőre üvegszövetből készült harisnya került, majd

erre egy fűtőellenállás lett rátekerve, amely mellé 100 Ohmos platina ellenálláshőmérőt

rögzítettünk. A fűtőellenállást és a hőmérőt egy hőfokszabályozó egységhez kapcsoltuk, egy,

a fűtőkörbe iktatott relé segítségével. A fűtött kapilláris interfész hőmérséklete ilyen módon

elektronikusan szabályozhatóvá vált a szobahőmérséklet és 400°C között. A legtöbb ion

esetében az optimális interfész hőmérséklet a 250–300°C tartományban volt.

51

21. ábra: Az új és az eredeti atmoszférikus interfész kapilláris.

A 96 férőhelyes mintaformátumhoz külön ionforrást is kellett építeni, amely a Sciex

API 4000 Q-trap készülékhez lett megtervezve. A 96 férőhelyes mintaformátum mozgatása 2

db, számítógép által vezérelt lineáris mozgatóasztal (Newmark Instruments) segítségével lett

megoldva, amely képes a 96 minta programozott egymás utáni vizsgálatának az elvégzésére.

Mivel a készülék eredetileg nem fűtött kapilláris típusú atmoszférikus interfésszel működik,

ezért itt szükséges volt egy teljesen új atmoszférikus interfész megtervezése és megépítése is.

22. ábra: Az analízishez tervezett atmoszférikus interface vázlata.

Az új ionforrás pedig a következő ábrán látható. Ezzel az összeállítással a 96

férőhelyes mintaformátum mintegy 5 perc alatt végigmérhető, ami mintánként 3-4

másodperces mérési időt jelent, így összességében 96 darab mintát nagyjából 10 perc alatt

lehet előkészíteni és analizálni. Ez az időtartam, összehasonlítva egy HPLC módszer

időigényével, abszolút versenyképes módszerré teszi a SPEEDI technikát a high-throughput

analízisben.

skimmer

fűtött kapilláris PEEK ház

Q0IONOK Q1

TC

1/16” Swagelok nutcsatlakozó a tömegspektrométerhez

új kapilláris

eredeti Thermo fűtött kapilláris

tetszőleges hosszú acélcső

52

23. ábra: Az általunk tervezett ionforrás felépítése.

3.2. Natív szövetminták vizsgálata DESI és REIMS módszerrel

3.2.1. Bevezető

Doktori munkám másik részében a biológiai szövetek in situ vizsgálata állt a

módszerfejlesztés középpontjában. A DESI módszer által biztosított lehetőséget, miszerint a

módszer atmoszférikus nyomáson működik, szerettük volna kihasználni olyan módon, hogy

létrehozunk egy rendszert, mely azonnali szövetazonosításra képes. Így akár egy műtét

közben folyamatosan információt nyújthat a sebész számára a vágott szövet kémiai

jellegzetességeiről, és így a szövet hisztológiai jellegéről.

A kutatást elindító egyik elképzelés az volt, hogy ma a SIMS és a MALDI technikák

esetében leginkább elterjedt módszert – a fehérjeösszetétel alapján történő azonosítást –

elvetettük, és a tömegspektrometriásan egyszerűbben mérhető membránlipid összetétel

alapján kívántuk elkülöníteni az egyes szövettípusokat. Az irodalmi adatok alapján a

különböző szövetekre nézve a membránlipidek összetétele és aránya eltérő [120].

53

Az első kísérleteket során élelmiszeripari minőségű állati szövetmintákat vizsgáltunk

DESI módszerrel.

24. ábra: Sertés máj DESI tömegspektruma (negatív ionmód).

A mérések elsődleges célja az volt, hogy a spektrumban a glicerofoszfolipidek csúcsai

jelenjenek meg azonosítható módon, ennek érdekében nagyfelbontású méréseket végeztem

egy LTQ Orbitrap (ThermoFinnigan) készüléken. A keresett vegyületek a 700-1000 m/z

tömegtartományban találhatók, az ábrán kinagyítva látható ez a rész. A glicerofoszfolipidek

valóban láthatók és azonosíthatók a spektrumban, közülük a legjellemzőbb a 885.55, amely a

foszfoinozitol (18:0/20:4) molekulához tartozik. A kisebb tömegtartományban pedig a

zsírsavak csúcsai jelennek meg, például 255.23-nál a palmitinsav (16:0) és 303.23-nál az

arachidonsav.

A következő módszerfejlesztési lépés az élő szövetek analízise volt, melyet

laboratóriumi patkányokon teszteltem. A tapasztalatok azonban azt mutatták, hogy az élő

szövetekből DESI módszerrel foszfolipid spektrumot nem lehet előállítani. Ennek oka

feltehetően az, hogy az elektrospray nem roncsolja szét kellő mértékben a sejteket ahhoz,

hogy a foszfolipidek ionizációját lehetővé tegye. Az üzletben vásárolt szöveteket ezzel

ellentétben minden esetben fagyasztva tároltam a mérések előtt, így a sejtek megfelelő

100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500m/z

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

279.23

255.23

885.55535.47

559.47

303.23

583.47498.29 810.53723.48327.23

857.51

157.12221.08

607.47 1210.49979.80 1334.83 1415.71928.86

1053.76453.36

700 720 740 760 780 800 820 840 860 880 900 920 940 960 980m/z

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

885.55

810.53

887.55

723.48 766.54 857.51738.50

714.50 747.51 794.53 979.80808.54

928.86917.54861.55834.52 904.86 990.60764.52 940.88780.51

812.53

961.95883.53

851.59

100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500m/z

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

279.23

255.23

885.55535.47

559.47

303.23

583.47498.29 810.53723.48327.23

857.51

157.12221.08

607.47 1210.49979.80 1334.83 1415.71928.86

1053.76453.36

700 720 740 760 780 800 820 840 860 880 900 920 940 960 980m/z

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

885.55

810.53

887.55

723.48 766.54 857.51738.50

714.50 747.51 794.53 979.80808.54

928.86917.54861.55834.52 904.86 990.60764.52 940.88780.51

812.53

961.95883.53

851.59

54

mértékű degradációja megvalósulhatott. A DESI technika tehát fagyasztott szöveti analízisre

alkalmas, melyet irodalmi példák is igazolnak, azonban sajnálatos módon az in situ

vizsgálatokat nem lehet ilyen módon megvalósítani.

A probléma megoldása érdekében másik ionizációs technikát kellett találni, amely az

ép sejteket szétroncsolja olyan mértékben, hogy az ionizáció végbemehessen. Ezenkívül az

eszköznek kompatibilisnek kell lennie a sebészi munka folyamatával. Az in situ, illetve in

vivo ionizáció megvalósítására potenciális módszer lehet a gyors termikus elpárologtatás.

Szilárd fázisból keletkezett szerves ionok képződését, amely tisztán termikus folyamat

eredménye volt, először Holland és munkatársai publikálták [121], majd ezután sikeres

alkalmazásai is születtek a módszernek [93, 122-123]. A fűtés gyorsasága azért fontos

szempont, mert megfelelő sebességnél a molekuláris elpárolgás összehasonlítható mértékű a

bomlással, így számottevő mennyiségű gázfázisú molekula, illetve molekulaion keletkezik,

vagyis alkalmas ionforrásnak a rendszer. A hatékony termikus elpárologtatási módszerek

kutatása több, termikusan segített ionizációs módszer kidolgozását eredményezte, köztük a

termospray ionizációt [124]. Mivel az ionok magasabb nyomáson nagyobb számú ütközésre

hajlamosak, és ez a folyamat nem kedvező az analízis szempontjából, ezért úgy tűnik, hogy az

atmoszférikus nyomású termikus elpárologtatás a megfelelő módszer, mivel ezen

körülmények közt visszaszorul a termikus bomlás. Az atmoszférikus nyomású termikus

deszorpciós ionizációnak napjainkban is születnek felhasználásai, például szerves kationok

deszorpciója, minimális degradációval [94, 125].

Az úgynevezett elektrosebészetben elterjedt módszer a termikus elpárologtatás. Az

elektrosebészet lényege, hogy az élő szövetbe kis felületen nagy frekvenciájú váltakozó

áramot vezetnek, így a szövet vágását, illetve elpárologtatását, vagy koagulálását lehet

megvalósítani. Az alkalmazott elektromos teljesítményt nem csak nagy frekvencián, de nagy

feszültségen is közlik a biológiai szövettel. Ha csak a feszültség lenne nagy, járulékos

problémák (pl. izomrángás, kémiai bomlás) lépnének fel. A szövet elektromos ellenállásának

hatására az elektromos energia hővé alakul (disszipálódik), amely a szövet víztartalmának

felmelegedését, majd végül felforrását okozza. Ha a termikus hatás kisebb mértékű, akkor a

szövet fehérjéi denaturálódnak, ezt nevezik termikus koagulációnak. A diatermiás eszköznek

általában két funkciója van, a vágás, amikor a termikus hatás nagyon gyors, a szövetet

gyakorlatilag elpárologtatják; illetve a koagulálás, amikor a termikus hatás lassabb, és a

bekövetkező koagulációt leginkább a vérzés megszűntetésére használják a sebészeti

gyakorlatban. A gyakorlatban használt lézersebészeti eszközök alkalmazása úgyszintén a

szövetek termikus evaporációján alapul, ugyanis ebben az esetben általánosságban 10.6 μm

55

hullámhosszon dolgozó szén-dioxid lézert használnak. Az infravörös tartományban működő

lézer lényegében mellőzi a fotokémiai effektusokat, és a diatermiához hasonlóan tisztán

termikus kölcsönhatásba lép a szövetekkel.

A további kutatás alapja az a megfigyelés volt, hogy a biológiai szövetek gyors

termikus elpárologatása a fő szövetalkotókból, így a foszfolipidekből is gázfázisú molekula

ionokat hoz létre. Ez alapján célszerűnek látszott a használatban lévő sebészeti eszközöket

felhasználni a módszer fejlesztéséhez. A tömegspektrometriás és a sebészeti eljárások

kombinációja lehetőséget nyújt arra, hogy in situ analízis történjen egy sebészeti műtét során.

Mivel a módszer kulcsa a gyors elpárologtatás, ezért a technikát „Gyors Elpárologtatású

Ionizációs Tömegspektrometriának” neveztük el (REIMS: rapid evaporative ionization mass

spectrometry). A kutatás során különböző, a gyakorlatban használt sebészi eszközök és a

tömegspektrométer között hoztunk létre kapcsolatot. A különböző eszközökkel történő vágás

során a szövet elroncsolódik, és a roncsolódás során képződött ionok tömegspektrometriás

elemzésével nyerünk információt a szövet típusát illetően. A tömegspektrometriás vizsgálat

optimális kivitelezéséhez új típusú interfész építésére volt szükség, amely alkalmas a vágási

folyamat során keletkező minta valós idejű ionizációjára.

3.2.2. Az interfész kifejlesztése, optimalizáció

A módszer lényege tehát, hogy ionforrásként a sebészeti eszköz szolgál, amely lehet

diatermiás vágóeszköz vagy CO2 lézer. Arra a kérdésre kellett először megoldást találni, hogy

a vágás során keletkező ionok milyen módon jussanak be a tömegspektrométerbe. Erre a célra

alkalmasnak bizonyult a Bernoulli törvény alapján működő Venturi-cső. A Bernoulli törvény

azt mondja ki, hogy egy közeg áramlásakor (a közeg lehet folyadék vagy gáz is) a sebesség

növelése a nyomás csökkenésével jár. Ez alapján a Venturi-cső úgy működik, hogy egy

szűkülő keresztmetszetű csőben nagy sebességű nitrogén gáz áramlik, és az áramlás

felgyorsulása a szűkebb résznél az oldalról csatlakozó csőben nyomásesést, vagyis szívó

hatást okoz. A cső szerkezete az alábbi ábrán látható.

56

25. ábra: A Venturi-cső keresztmetszete.

A kifejlesztett technika teljes működése a következő: az elektrosebészeti eszközzel

való vágás során keletkező aeroszolt, mely tartalmaz ionokat is, a Venturi-szivattyú

segítségével elszívjuk egy tefloncsövön keresztül. Az ionok bekerülnek a tömegspektrométer

belsejébe, míg a semleges részecskéket a készülék ionoptikája kiszűri.

nitrogén

szívó hatás

57

26. ábra: A REIMS módszer működésének vázlata.

Az első kísérletek célja az volt, hogy a módszerhez egy optimálisan működő rendszert

sikerüljön összeállítani. Ehhez először szükség volt egy megfelelő Venturi-szivattyúra, illetve

egy csőre, mely összeköti a tömegspektrométerrel, így biztosítva az ionok továbbítását a

sikeres analízis érdekében. A kereskedelmi forgalomban beszerezhető Venturi-csövek közül

több típust is teszteltem a következő szempontok alapján: méret, a szívóerő függése a nitrogén

nyomásától, tisztíthatóság. Ez utóbbi tulajdonság azért került be a választási szempontok

közé, mert a vágás során keletkező nagy mennyiségű aeroszol gyorsan elszennyezi a

szivattyú, majd ezután a készülék alkotórészeit, így viszonylag gyakran kell tisztítani a

rendszert. Az alábbi fényképen látható az összeállított rendszer a Venturi-szivattyúval, illetve

az atmoszférikus interfésszel.

nitrogén

biológiai szövet

elektrokauter

Venturi-csőfűtött kapilláris

tube lens

skimmer

teflon cső

aeroszol

58

27. ábra: A Venturi-forrás képe.

Az ionok továbbítására szolgáló elszívócsőként flexibilis és szintén könnyen

tisztítható csövet célszerű használni, így a polietilén (PE), illetve a teflon (PTFE) jöhetett

szóba. Mivel a csőben bekövetkezhet a keletkezett ionok rekombinációja, így a

tömegspektrometriás jel intenzitása a cső hosszának növelésével esik. Ezért a következő

feladat a cső anyagának és az optimális (a laborkísérletekhez), illetve a maximálisan

alkalmazható (műtéti alkalmazáshoz) csőhossz meghatározása volt. Az eredményeket a 4.

táblázatban foglaltam össze. Élettartam alatt a tisztítás nélkül a cső eldugulásáig eltelt időt

értettem. A mérések eredményéből kiindulva az 1/8 hüvelyk átmérőjű PTFE cső használata

mellett döntöttem, a laborban végrehajtott kísérletekhez pedig mindig 50 cm hosszúságú

csövet használtam.

Anyag Külső átmérő Belső átmérő Hosszúság Átlagos ion

intenzitás

Élettartam

(perc)

PE 1/16 hüvelyk 0.5 mm 50 cm 12x108 10

PE 1/16 hüvelyk 0.75 mm 50 cm 11x108 12-15

PE 1/16 hüvelyk 1 mm 50 cm 11x108 20-25

PTFE 1/16 hüvelyk 1 mm 50 cm 11x108 25-30

PTFE 1/8 hüvelyk 2.4 mm 50 cm 10x108 50-60

PTFE 1/8 hüvelyk 2.4 mm 100 cm 9x107 50-60

PTFE 1/8 hüvelyk 2.4 mm 150 cm 7x107 50-60

PTFE 1/8 hüvelyk 2.4 mm 200 cm 4x107 50-60

PTFE 4 mm 3 mm 50 cm 10x108 20-25

4. táblázat: Az elszívócső paramétereinek tesztelése.

59

Az itt bemutatott eredmények az Erbotom ICC 350 (ERBE Elektromedizin GmbH)

típusú diathermiás sebészeti vágóeszköz használatával születtek (a készülék max. 300 MHz

frekvencián működik). A fejlesztés során más típusokat is kipróbáltam, mindegyik alkalmas

volt spektrumfelvételre, a spektrális sajátságok készülékfüggőnek, illetve paraméterbeállítás

függőnek bizonyultak, ám a szövetfelismerés hatékonyságát nem befolyásolták. A kipróbált

elektrosebészeti eszközök mindegyikén a 30-90 W vágóteljesítmény tartomány volt a

megfelelő a mérésekhez.

A megfelelő alkatrészek kiválasztása után a következő feladat az optimális geometriai

paraméterek beállítása volt. Ezek a paraméterek a következők: a Venturi-forrás kimenetének

távolsága a tömespektrométer atmoszférikus interfészétől, illetve a forrás beesési szöge. Az

értékek megfelelő beállításával érhető el a spektrumban a legkedvezőbb jel/zaj arányt, mivel

ilyen módon bizonyos mértékben csökkenthető a tömegspektrométer belsejébe bejutó

szennyezők mennyisége. Az optimalizációs kísérletek során 2 bar nitrogénnyomás mellett a

forrás beesési szögének nagysága 75°-nak adódott, míg a forrás és a készülék távolsága 2-3

cm esetén volt a legjobb, így a további kísérletek során ezekkel a beállításokkal dolgoztam.

A szöveti analízist egy LCQ Deca XP (ThermoFinnigan) típusú készüléken végeztem.

A tömegspektrométer beállításait olyan módon határoztam meg, hogy standard mintának

választottam a sertés májszövetet, amely egyrészt a leginkább homogén szöveti jellegű szerv,

másrészt nagyobb mennyiségben rendelkezésemre állt. Májszövet analízis során határoztam

meg, hogy a jelintenzitás milyen módon függ a készülék különböző paramétereinek

beállításától. Az optimális készülék beállításokat negatív ionmód esetére az alábbi táblázatban

tüntettem fel.

Készülék paraméter Optimális érték

Kapilláris hőmérséklet 200 °C

Kapilláris feszültség - 10 V

Tube Lens Offset - 30 V

Ion injektálási idő 10-500 ms

5. táblázat: Optimális készülékbeállítások az LCQ Deca XP készülékre.

A készülékbe jutó ionok mennyiségét szabályozó úgynevezett ion injektálási idő

optimális értéke szövetenként nagyon eltérő, 10-500 ms között változhat. Az ion injektálási

idő azt az időintervallumot jelöli, amennyi ideig a tömegspektrométer gyűjti az ionokat

60

analízis előtt. Nagy ion injektálási idő esetén sokáig gyűjti az ionokat, így az ionok összes

intenzitása megnő, azonban egy bizonyos határ felett ez a spektrum csúcsainak

összeolvadásához vezet, vagyis romlik a jel minősége. A paraméterek optimális beállításai

nem jelentenek feltétlenül globális optimumot, különösen nem a vágási teljesítmény és az ion

injektálási idő értékeinek az esetében, hanem egyes szövet típusokra érdemes az optimumot

meghatározni. Például májszövet vágásához elég 30 W teljesítmény és 10 ms ion injektálási

idő, míg ez a beállítás a izomszövet esetében nem bizonyult megfelelőnek. Izomszövet vágása

esetén 90 W vágóteljesítmény és a 250 ms ion injektálási időt találtam optimálisnak. Az ion

injektálási idő változtatása egy bizonyos határig nem befolyásolja a méréseket, mert az csak

az ionok mennyiségét növeli meg és nem torzítja a spektrumot. Az adatok összehasonlítása

pedig normalizált spektrumokon történt, pontosan azért, hogy az egyes spektrumok közötti

intenzitás különbség ne befolyásolja az eredményeket. A diathermiás vágóeszköz

teljesítményének változtatása pedig egy szükséges lépés a megfelelő vágás biztosítása

érdekében, ami szintén nem változtatja meg kedvezőtlenül az eredményeket, esetleg

részletgazdagabb spektrumokat ad, ami kifejezetten segíti az adatok feldolgozását.

61

4. Eredmények

4.1. A SPEEDI módszer

4.1.1. Optimalizálás egycsatornás elúcióra

Az első kísérleteket, valamint a szisztematikus optimalizálást egy festékanyaggal, a

Rodamin 116-tal végeztem. Azért esett a választásom erre a vegyületre, mert egyrészt szabad

szemmel nagyon jól látható (ami hasznos az elúciós paraméterek optimalizációjánál), piros

színű, másrészt tömegspektrometriásan is jól detektálható. A vegyület szerkezete az alábbi

ábrán látható.

ONH

CH3NH+

CH3

OH

O

28. ábra: A Rodamin 116 szerkezete.

Az elúciós folyamat optimalizálandó paraméterei a következők: a fűtött gáz (nitrogén)

hőmérséklete és áramlási sebessége, az eluáló szerves oldószer típusa és áramlási sebessége, a

fúvóka és a patron távolsága, valamint a maradék oldószert kiűző levegő áramlási sebessége.

Az optimalizációs kísérleteket 100 ng festékanyag 10 ml vízben való feloldásával végeztem.

A legjobb elúciós oldószernek a Rodamin 116-hoz a metanol bizonyult, szilika alapú, C18

oldalláncokat tartalmazó adszorbens esetén. A megfelelő oldószer kiválasztását minden

esetben a megfelelő adszorbens réteggel rendelkező vékonyréteg kromatográfiás lapon történő

futtatással oldottam meg. Először meghatároztam azt az oldószer mennyiséget, ami az összes

oldatban lévő, meghatározni kívánt anyagmennyiség felületre való feljuttatásához szükséges.

Ez a mennyiség leginkább az eluáló oldószer és az analit polaritásától és H-kötésre való

hajlamától függ, de kisebb eltéréseket okozhat a longitudinális diffúzió jelensége is. A

62

szükséges elúciós térfogatot a konkrét oldószer-analit-adszorbens rendszerhez hozzá lehet

rendelni, és ezután annak az oldószer mennyiségnek a meghatározása következett, amely

elpárologtatható időegység alatt a frit felszínéről. Az alábbi grafikonok esetében a mért

eredmények a Rodamin 116 metanollal történt elúciójából származnak.

Ha az optimalizációs folyamat során, egy jól kiválasztott gáz hőmérsékletnél

elkezdtem növelni az eluens áramlási sebességét, akkor egy bizonyos sebességig a párolgás

sebessége a felületen szintén nőtt. De egy jól definiált áramlási sebességnél a frit felületén

kialakult egy összefüggő folyadék film, és egy katasztrófajelenség következett be, a felületen

lévő anyagot újra feloldotta az oldószer, a gázáram pedig szétfújta a folyadékot. Ezt a

folyamatot szemlélteti a 29. ábra. A képen látható, hogy így az összes anyag a frit szélére

kerül, így a DESI vizsgálatra alkalmatlan lesz a minta (29. ábra c). A 30. ábrán látható az

elúcióhoz szükséges idő a folyadék áramlási sebesség függvényében. A kisebb áramlási

sebességeknél az ideális görbétől való eltérést a longitudinális diffúzió okozza. A nagyobb

áramlási sebességeknél pedig egyszer el kell érni ahhoz a határhoz, amikor már nem képes

több oldószer elpárologni a felszínről, ezt neveztem a maximális párolgási kapacitásnak, és ez

meghatározza az elúcióhoz szükséges minimális időtartamot, mivel a szükséges térfogat már

előzőleg meghatározott mennyiség. A maximum párolgási kapacitás (MER: maximum

evaporation rate) tehát az időegység alatt, egységnyi felszínről elpárologtatható térfogat az

adott folyadékra nézve. Ebből következik, hogy ez az érték függ a folyadék fajtájától, a

párologtatást segítő gáz hőmérsékletétől és áramlási sebességétől. A 31. ábra grafikonján az

elpárologtatható mennyiségeket láthatjuk a gáz áramlási sebességének függvényében,

különböző hőmérsékleteken. Piros vonal jelzi a MER értéket. Egyértelmű, hogy minél

nagyobb a gáz sebessége, annál több oldószert képes elpárologtatni, és minél nagyobb a

hőmérséklete, annál gyorsabb a párolgás. De bizonyos áramlási sebesség felett már nem nő

tovább a párolgási kapacitás, és ez az érték jelenti a módszer maximális analitikai

áteresztőképességét.

63

29. ábra: Az elúció lehetséges eredményeinek összehasonlítása a maximum párolgási

sebesség alatti (a), illetve feletti (b és c) értékeknél.

Látható tehát, hogy a módszer korlátja az eluens áramlási sebessége, pontosabban

maximum párolgási kapacitás. Tehát az optimálás fő feladata mindig az volt, hogy a lehető

legnagyobb áramlási sebességet megtaláljam az egyes oldószerekre, a megfelelő gáz

hőmérséklettel és gáz áramlási sebességgel együtt.

0.0E+00

5.0E+05

1.0E+06

1.5E+06

2.0E+06

2.5E+06

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2

frit átmérője (mm)

rela

tív in

tenz

itás

gas

gas

gas

gas

gas

gas

gas

gas

gas

0.0E+00

2.0E+05

4.0E+05

6.0E+05

8.0E+05

1.0E+06

1.2E+06

1.4E+06

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2

frit átmérője (mm)

rela

tív in

tenz

itás

a.

c.

b.

64

30. ábra: A maximum párolgási kapacitás függése a folyadék áramlási sebbességétől

és az elúciós időtartamtól.

31. ábra: A folyadék áramlási sebessége a gáz áramlási sebességének függvényében,

különböző hőmérsékleteken (metanol oldószerrel).

Az optimális értékeket, melyek a Rodamin 116 metanolos elúciójára vonatkoznak, a 6.

táblázatban foglaltam össze. Ezekkel a beállításokkal egy patron elúciója 1.5 perc alatt

megvalósulhat.

65

Eluens térfogata 180 μl

Eluens áramlási sebessége 200 μl/min

Gáz hőmérséklete 200 °C

Gáz áramlási sebessége 3000 ml/min

Oldószer maradékát kiűző levegő áramlási

sebessége 100 μl/min

6. táblázat: A Rodamin 116 elúciójára vonatkozó optimális paraméterek.

Ahhoz, hogy a módszert rutinanalitikai, illetve high-throughput alkalmazásokban

lehessen alkalmazni, szükséges volt kvantitatív mérési lehetőségek kidolgozása is. Már a

DESI módszerrel történt vizsgálatok eredménye is azt mutatta, hogy korrekt kvantifikálás

csak olyan módon valósítható meg, hogy az analithoz kémiailag nagy mértékben hasonló

belső standardet a még folyadékfázisú mintához adjuk. Ilyen módon a belső standard

elkeveredik a mintával, és az analit molekuláéhoz hasonló körülmények között ionizálódik.

Ezt az elvet alkalmaztam a SPEEDI módszerrel végzett kvantitatív vizsgálatok során is, és a

Rodamin 116-hoz a Rodamin 123-t választottam belső standardként.

ONH2 NH2+

O

OMe

32. ábra: A Rodamin 123 szerkezete.

A megfelelő belső standard kiválasztásához szintén a vékonyréteg kromatográfiás

futtatást alkalmaztam a további kísérletek esetében is. Ennél a vizsgálatnál is 10 ml térfogatú

vizes mintákkal dolgoztam. Az optimális elúciós körülmények között végeztem a minta

előkészítését. A Rodamin 116-ra nézve a 0.3; 1.0; 3.0; 10.0; 20.0; 30.0 ng/ml-es

koncentrációknál vettem fel a mérési pontokat. A Rodamin 123 belső standard koncentrációja

66

15.0 ng/ml volt. Az alábbiakban látható a két vegyület tömegspektruma, valamint a felvett

kalibrációs görbe.

33. ábra: A Rodamin 116 tömegspektruma.

305 310 315 320 325 330 335 340 345 350 355 360 365 370m/z

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

358.89

336.76 359.38337.32344.75

346.78 359.73352.73 367.02300.77 338.02335.15331.86321.08317.23310.78 369.19

67

34. ábra: A Rodamin 123 tömegspektruma.

A kalibrációs egyenes pontjainak mérése során nem Full Scan üzemmódban mértem,

hanem SRM-ben (Single Reaction Monitoring), melynek során csak kiválasztott ionok, és a

legjellemzőbb fragmenseik közti átmenetek intenzitását mérjük. A Rodamin 116 esetében ez

az átmenet a 359→272, míg a Rodamin 123 esetében a 345→285.

p [ ]

310 320 330 340 350 360 370 380 390 400m/z

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100R

elat

ive

Abu

ndan

ce345.31

344.82

345.80337.18

346.01300.70 331.86 392.86315.27 319.19 367.30337.39 353.36 379.27 395.31385.01

68

35. ábra: SPEEDI módszerrel felvett kalibrációs egyenes vizes oldatból Rodamin 116-ra.

4.1.2. Valós minták mérése, optimalizálás 96 csatornás elúcióra

A Ciklosporin A nevű gyógyszer hatóanyag egy 11 aminosavból álló ciklopeptid,

immunoszupresszáns hatású, szervátültetés után adják a pácienseknek a kilökődés

megakadályozására. Tömegspektrometriásan jól detektálható. A kimutatási határa a DESI

módszerrel végzett analízis során 1000 ng/ml körüli értéknek adódott, ami azért

problematikus, mivel a terápiás koncentrációja plazmában 50-500 ng/ml-ig terjed. Így adott

volt a lehetőség egy gyakorlati probléma megoldására az általam fejlesztett módszer

segítségével. Az első feladat a megfelelő belső standard kiválasztása volt. A kezdeti

kísérleteket a Valinomicin nevű, hasonló szerkezetű ciklopeptiddel végeztem.

y = 0.1978x - 0.0248R2 = 0.9999

0

1

2

3

4

5

6

7

0 5 10 15 20 25 30 35

c R116 / c R123 (ng/ml)

terü

let R

116

/ ter

ület

R12

3

69

36. ábra: Ciklosporin A mérése Valinomicin belső standard alkalmazásával.

Ahogy a spektrumon is látható, ezek a vegyületek szívesen képeznek adduktot alkáli

fémekkel. Az 1134-nél, illetve az 1150-nél látható csúcsokat a Valinomicin, az 1224-nél és

1240-nél láthatókat a Ciklosporin A nátrium ionnal, illetve kálium ionnal képzett adduktjai

adják. Az ionizáció szempontjából láthatóan megfelelő belső standard lett volna a

Valinomicin, ám az elúciós kísérletek azt mutatták, hogy a vegyületek szerkezete mégsem

mutat elég hasonlóságot. A legjobban alkalmazható belső standard végül a Ciklosporin D

nevű vegyület lett, amelyet a gyógyszerszint meghatározásának HPLC-s módszereiben is

használnak [126]. Vizelet vagy plazma mintákhoz hozzáadtam a Ciklosporin A (CsA), illetve

a Ciklosporin D (CsD) megfelelő mennyiségű vizes oldatát úgy, hogy a minta végső térfogata

1 ml legyen. A szilika alapú C18-as adszorbenst tartalamzó SPE-patront először 0.5 ml

metanollal, majd 0.5 ml metanol – víz 5:95 eleggyel kondícionáltam, majd a minta felkerülése

után 0.5 ml metanol – víz 5:95 eleggyel mostam, és hagytam kiszáradni teljesen. Az elúció

optimális paramétereit és a készülékbeállításokat a következő táblázatban foglaltam össze.

1120 1140 1160 1180 1200 1220 1240 1260 1280 1300m/z

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

1133.601149.99

1224.69

1129.261212.371142.92 1240.37

1244.64 1254.231195.071184.57 1273.131165.391119.74 1288.82

70

Elúciós paraméterek:

Eluens: hexán – izopropanol 1:1

Eluens térfogata: 180 μl

Gáz hőmérséklete: 150 °C

Készülék paraméterek: TSQ Quantum API 4000 QTRAP

Spray beesési szöge 60° 60°

Felület-spray távolság ~2 mm ~2 mm

Felület-tömegspektrométer

bemenetének távolsága ~2 mm ~2 mm

Spray feszültség 4000 V 3000 V

Nitrogén nyomása 7 bar 8 bar

Spray oldószer metanol – víz 1:1 metanol – víz 1:1

Spray oldószer áramlási

sebessége 2 μl/min 10 μl/min

Ion mód pozitív pozitív

Kapilláris feszültség 30 V 300 V (declustering

potential)

Kapilláris hőmérséklet 300 °C 180 °C

Tube lens offset 100 V -

7. táblázat: A Ciklosporin A elúciós paraméterei és a készülékbeállítások.

Ahogy a táblázatban is látható, a méréseket két készüléken végeztem. Az egycsatornás

elúcióval előkészített minták mérése a TSQ Quantum készüléken történt. Ugyanolyan

paraméterek mellett sikerült a 96 csatornás formátumban is a minták előkészítése, és mivel az

ehhez tartozó ionforrás a másik készülékhez lett tervezve, ezért ezeket a mintákat az API 4000

QTRAP tömegspektrométerrel analizáltam. A felvett kalibrációs görbék a következő ábrákon

láthatók. Spike-olt humán plazma, illetve vizelet mintából is sikerült kalibrációs egyenest

felvenni úgy, hogy SIM (Selected Ion Monitoring) üzemmódban mértem, melynek során csak

kiválasztott ionok intenzitását méri a készülék. Az általam megadott tömegtartományok a

következők voltak: 1202.5-1203.9 (CsA+H+); 1224.5-1225.9 (CsA+Na+); 1240.5-1241.9

(CsA+K+); 1216.5-1217.9 (CsD+H+); 1238.5-1239.9 (CsD+Na+); 1254.5-1255.9 (CsD+K+).

Ezek közül minden esetben csak a Na-adduktokra vonatkozó arányt használtam fel a

71

kalibrációs egyeneshez, mert ezek voltak a legintenzívebb csúcsok, és így volt a legkisebb az

adatok szórása.

37. ábra: Kalibrációs egyenes vizelet minták Ciklosporin A tartalmának méréséhez,

a TSQ készülékkel mérve (BST: Ciklosporin D, 250 ng/ml).

y = 0.0024x + 0.1905R2 = 0.9999

0

1

2

3

4

5

6

0 500 1000 1500 2000 2500

cCsA (ng/ml)

terü

let C

sA/te

rüle

t CsD

72

38. ábra: Ciklosporin A tömegspektruma az API 4000 QTRAP készüléken mérve Full Scan

üzemmódban.

1210 1215 1220 1225 1230 1235 1240 1245 1250 1255 1260 1265 1270 1275 1280 1285m/z, amu

1.0e4

2.0e4

3.0e4

4.0e4

5.0e4

6.0e4

7.0e4

8.0e4

9.0e4

1.0e5

1.1e5

1.2e5

1.3e5

1.4e5

1.5e5

1.6e5

1.7e5

1.8e5

1.9e5

2.0e5

2.1e5

2.2e5

2.3e5

2.4e5

2.5e52.6e5

Inte

nsity

, cps

1224.9

1225.9

1240.8

1226.8

1241.8

1238.9

1239.81242.81227.9

1216.81217.8 1254.8

1212.91209.8 1228.71257.91244.2 1255.21229.7 1263.21215.0 1270.61245.0 1272.6 1282.81236.91222.9 1284.51215.5 1279.81264.31238.0

73

39. ábra: Kalibrációs egyenes vizelet minták Ciklosporin A tartalmának méréséhez,

az API 4000 QTRAP készülékkel mérve (BST: Ciklosporin D, 25 ng/ml).

y = 0.0741x - 0.2075R2 = 0.999

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0 20 40 60 80 100 120

cCsA (ng/ml)

terü

let 1

225

/ ter

ület

1239

74

40. ábra: Kalibrációs egyenes plazma minták Ciklosporin A tartalmának méréséhez,

az API 4000 QTRAP készülékkel mérve (BST: Ciklosporin D, 25 ng/ml).

A TSQ Quantum tömegspektrométerrel készült mérések esetén a vizeletmintákból a

következő koncentrációknál vettem föl a pontokat a kalibrációs egyeneshez: 20, 40, 200, 400

és 2000 ng/ml. Mivel az API 4000 QTRAP készülék jobb érzékenységi paraméterekkel

rendelkezik, illetve a terápiás koncentráció értékek miatt is a kisebb koncentráció tartományra

szerettem volna nagyobb figyelmet fordítani, ezért ezeknél a méréseknél kisebb koncentráció

értékeket választottam. A vizelet mintáknál: 5, 10, 20, 50 és 100 ng/ml, a plazma mintáknál

pedig: 2, 10, 20, 40 és 100 ng/ml.

Az adatok azt is mutatták, hogy a módszer alkalmazható a terápiás koncentráció

tartományában, mivel a kimutatási határ a SPEEDI módszerrel 100 pg/ml-nek adódott, ami

egy nagyságrenddel alacsonyabb, mint a legkisebb terápiás dózis. A mérés

reprodukálhatósága is megfelelő, 50 ng/ml-nél átlagosan 10.3 %-nak adódott a standard

deviáció, ez összehasonlítható a jelenleg Ciklosporin A detektálásra használatos ELISA-

módszerével.

Az optimalizáció után összehasonlító méréseket végeztem az általam fejlesztett

SPEEDI módszer és a DESI technika között, melynek során a Ciklosporin A szintjét spike-olt

humán plazma mintákból mértem. A DESI analízis esetében 1 μl mintát cseppentettem fel és

szárítottam rá a porózus PTFE fritre, míg a SPEEDI módszer mintaelőkészítéséhez 100 μl

plazma mintát használtam fel. Az alábbi ábrán látható a mért eredmények összefoglalása. A

y = 0.0209x + 0.3042R2 = 0.998

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

0 20 40 60 80 100 120

cCsA (ng/ml)

terü

let C

sA/te

rüle

t CsD

75

grafikonon logaritmikus skálát használtam, mert így szemléletesebb a módszerek közti

különbség.

41. ábra: A DESI és SPEEDI módszerekkel mért CsA analízis eredménye.

Az ábrán feltüntetett mérési eredményekből az derül ki, hogy a direkt analízis

érzékenysége nagyjából két nagyságrenddel kisebb abban a tartományban (3-30 μl/ml), ahol

mindkét módszer lineáris; amely különbség abból adódik, hogy a SPEEDI módszerben a

felületre ennyivel több analit kerül a mintaelőkészítés során. A következő ábrán pedig a

módszerek kimutatási határát ábrázoltam a minták térfogatának függvényében. Érthető módon

a DESI analízis esetében a minta térfogata nem lehet nagyobb 1-2 μl-nél, mivel a

felcseppentés és megszárítás folyamata egyébként nem lenne megfelelő az analízishez. Ezért

az egyenes, amely a grafikonon látható, egy elméleti munkavonal, melyet a valódi mérési

eredményekből extrapoláltam. A DESI módszer dinamikus tartományát tehát korlátozza a

felcseppentéses mintafelvitel, míg a SPEEDI módszerrel felvett pontok egyenest alkotnak a

10 ng/ml – 30 μg/ml koncentrációs tartományban. Látható, hogy kis mintatérfogatnál az

analízis érzékenysége jobb a SPEEDI esetében. Ennek egyik oka az SPE-effektus, vagyis a

minta elválasztása a mátrixtól a tölteten, a másik ok pedig, hogy koncentráljuk a mintát a

felületre. Nagyobb mintatérfogatoknál a DESI jobb lenne mint a SPEEDI, de ezt a kísérletet

10 100 1000 10000100

1000

10000

100000

1000000

1E7

SPEEDI/DESI Direct DESI

Koncentráció (ng/ml)

Inte

grál

t csú

cste

rüle

t

76

nem érdemes elvégezni a már említett ok miatt. A DESI hatékonysága abból adódna ebben az

esetben, hogy az SPE töltet már telítődik ekkora térfogatnál a mátrix és a minta

komponenseivel és nem képes több anyagot adszorbeálni.

42. ábra: A kimutatási határ mintatérfogattól való függése

a DESI és a SPEEDI módszerek esetében.

A következő vegyület, melynek mérése környezetvédelmi okokból fontos, az atrazin

volt. Ezt a triazin vázas molekulát növényvédőszerként alkalmazták sokáig, de az Európai

Unióban az 1990-es években betiltották a használatát.

N N

N NH

Cl

NH

43. ábra: Az atrazin szerkezete.

Minta térfogata (μl)

Kim

utat

ási h

atár

(ng/

ml)

77

Felszíni vizekből azonban még ma is sok helyen kimutatható, ezért szükséges módszer

fejlesztése a kimutatására. Belső standardnak a simazin nevű, hasonló szerkezetű vegyületre

esett a választásom, amely megfelelőnek bizonyult mind az elúció, mind az ionizáció

szempontjából. 10 ml vizes oldatból indult a mintaelőkészítés, az elúció 200 °C-os

gázhőmérséklet mellett 200 μl metanollal történt. Az analízis paraméterei ugyanazok voltak,

mint a Ciklosporin A esetében. Az alábbi ábrákon látható az atrazin és a simazin

tömegspektruma, valamint a felvett kalibrációs egyenes, amelynek felvételekor MRM

üzemmódban dolgoztam, és az atrazinra a 216→174, simazinra pedig a 202→132 átmenet

intezitását mértem.

44. ábra: Atrazin és simazin tömegspektruma az API 4000 QTRAP készüléken.

190 195 200 205 210 215 220 225 230 235 240 245 250m/z, amu

5.0e4

1.0e5

1.5e5

2.0e5

2.5e5

3.0e5

3.5e5

4.0e5

4.5e5

5.0e5

5.5e5

6.0e5

6.5e5

7.0e5

7.5e5

8.0e5

8.5e5

9.0e5

Inte

nsity

, cps

216.1

202.1

218.1

247.2204.1

245.3 249.2217.1 228.2225.1

231.1

219.1 221.1 240.2 243.2203.1 223.1 248.2237.2226.2 229.3214.2 233.2215.2 235.2210.1 244.2209.1 241.2202.4 205.2 222.1198.1 232.2199.1 220.2197.1 224.2218.8 236.1 247.6209.7 227.7191.2 242.6195.0 234.6213.7 240.6210.5

78

45. ábra: Kalibrációs egyenes vízminták atrazin tartalmának méréséhez,

az API 4000 QTRAP készülékkel mérve (BST: simazin, 25 ng/ml).

4.1.3. Mérések kártyaformátumban

A kártya formátumban történő mintaelőkészítés optimalizációja szintén a Ciklosporin

A analízisével történt. 10-1000 ng/ml koncentrációjú spike-olt humán plazma mintákat

használtam három különböző módon előkészítve. Kontrollként egyszerű, szűrőpapírra

felcseppentett minták szolgáltak. A kártyában pedig kétféle megoldást alkalmaztam, egyszer

csak magából a szűrőpapírból eluáltam az analitot, másodszor pedig a szűrőpapír fölötti PTFE

membránra történt az elúció. A kártya formátumú mintahordozóra minden esetben 20 μl

mintát cseppentettem fel, a felesleget letöröltem, majd egy órát hagytam száradni. Az elúció

50 μl aceton – izopropanol eleggyel történt. A mérési eredményekből levont tapasztalatokat a

8. táblázatban foglaltam össze. A szűrőpapír esetében a direkt felületi analízis azért nem ad

megfelelő értékeket, mert az analit felületi eloszlása nagyon egyenetlen, ami több tényezőnek

is köszönhető, például a szűrőpapír inhomogenitásának. Az elúció ezen tényezők nagy részét

y = 0.115x + 0.1295R2 = 0.9982

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

0 5 10 15 20 25 30 35

catrazin/csimazin (ng/ml)

terü

let a

traz

in/te

rüle

t sim

azin

79

kiküszöböli, de a szűrőpapír inhomogenitása ellen a legjobb megoldás a SPEEDI-kártya,

melyben az elúció során az analit a PTFE membránra kerül át. A relatív standard deviációs

értékek a kártya esetében is bizonyítják, hogy a kvantitatív analízishez szükséges a belső

standard alkalmazása. A kártya esetében azonban nem szükséges a belső standardot még a

folyadék mintához hozzáadni. Ugyanis a kártyára felvitt vérminta mennyiségét

tömegméréssel meghatároztam, és a mért értékek eltérése 5%-on belül volt. Ami azt jelenti,

hogy ez a mennyiség reprodukálható, és így a belső standard hozzáadható a már megszárított

mintához is. A táblázat utolsó sorában látható értékeket ezzel a módszerrel kaptam, és látható,

hogy a relatív standard deviáció ilyen módon a legkedvezőbb.

Szűrőpapír Szűrőpapír

elúcióval

SPEEDI-kártya

elúcióval

Kimutatási határ

(ng/ml) 800 120 50

Relatív standard

deviáció

Belső

standard

nélkül

45% 18% 12%

CsD belső

standarddal26% 12% 4.2%

8. táblázat: A SPEEDI-kártya összehasonlítása a hagyományos szűrőpapíron történt direkt

analízissel, illetve elúciós analízissel Ciklosporin A mérésekre.

A kártya formátumú mintahordozó eszköz elsődleges alkalmazási területe az orvosi

diagnosztika lehet, ezért egy ilyen alkalmazást teszteltem az új módszerrel. A szűrőpapíron

beszárított vérmintákat legelterjedtebben az újszülöttkori anyagcsere-betegség szűrésnél

használják, de már egyre több alkalmazási területe van ennek a mintatípusnak. Az

újszülöttkori anyagcsere-betegségek szűréséhez a laboratóriumba érkezett mintákból egy 4-6

mm átmérőjű korongot vágnak ki, melyet metanollal extrahálnak, majd a beszárított

extraktumot sósavas butanollal butil-észterezik, ismét szárazra párolják, majd az acetonitril-

víz elegyben felvett mintát elektrospray ionizációs tandem tömegspektrometriával analizálják.

A módszer meglehetősen körülményes és időigényes, így ennek a kiváltására szerettem volna

kidolgozni a SPEEDI-kártyás technikát. A mérésekhez egyik oldalon PTFE membránnal

80

borított Whatman 903 szűrőpapírt tartalmazó kártyát használtam. A kártyára 20 μl friss,

alvadásgátló mentes teljes vért vittem fel, majd azt a mennyiséget, amit a korong nem szívott

be, letöröltem a felületről. A vért alvadni hagytam 1 órára, majd 10 μl sósavas butanolt

cseppentettem rá, és mikrohullámú sütőben megszárítottam. A száraz kártyát a mintatartóba

helyeztem, és 50 μl metanollal eluáltam, miközben 100 ml/min szobahőmérsékletű nitrogént

fújattam rá. A mérés során aminosavakat és acil-karnitineket kell detektálni, mert ezek vérből

mért koncentrációjának normálistól való eltérése utal az anyagcsere rendellenességekre. A

mérés MRM (Multiple Reaction Monitoring) módban történt, melynek során összesen 73

darab átmenet intenzitását mértem. Az alábbi ábrákon láthatók egy egészséges vérmintából

felvett aminosav, illetve acil-karnitin spektrumok.

46. ábra: Aminosavak mérése szárított vérmintából SPEEDI-kártyás módszerrel.

132.1/76.0146.1/44.0

174.2/72.1186.1/84.0

191.2/89.1191.2/72.1

206.1/104.1222.2/120.1

231.2/70.1232.2/113.1

238.1/136.1246.2/144.1

260.2/158.1459.3/70.1

146.0/90.0192.0/90.0

Q1/Q3 Masses, amu

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

550

592

81

47. ábra: Acil-karnitinek mérése szárított vérmintából SPEEDI-kártyás módszerrel.

A fenilketonuria (PKU) a leggyakrabban előforduló anyagcsere rendellenesség,

melynek során a fenilalanin felhalmozódik a vérben, és az agyra kifejtett mérgező hatása

miatt értelmi visszamaradottságot okoz. Az alábbi ábrán látható egy fenilketonuriás vérminta

mérési eredménye. A 222→120 átmenet tartozik a fenilalaninhoz.

218.2/85.1260.2/85.1

274.2/85.1288.2/85.1

300.2/85.1304.2/85.1

316.3/85.1344.3/85.1

360.2/85.1370.3/85.1

374.3/85.1400.3/85.1

424.3/85.1428.4/85.1

444.4/85.1456.4/85.1

472.4/85.1482.4/85.1

496.4/85.1500.4/85.1

508.4/85.1

Q1/Q3 Masses, amu

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

220

240

260

280

300

320

340

360

380392

82

48. ábra: Fenilketonuriás minta tömegspektruma.

132.1/76.0146.1/44.0

174.2/72.1186.1/84.0

191.2/89.1191.2/72.1

206.1/104.1222.2/120.1

231.2/70.1232.2/113.1

238.1/136.1246.2/144.1

260.2/158.1459.3/70.1

146.0/90.0192.0/90.0

Q1/Q3 Masses, amu

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

1100

1200

1300

1400

1500

1600

1700

1800

1900

2000

2100

2200

2300

2400

83

4.2. A REIMS módszer

4.2.1. Az ionizáció mechanizmusának tanulmányozása

Az elektrosebészeti szöveti elpárologtatás mechanizmusának alapja a Joule-hő általi

felmelegedés, melyet az elektromos áram bevezetése indukál a szövetben. Ez okozza a

víztartalom elpárolgását és termikus ionizációját, végül pedig bekövetkezik a szövet

degradációja, melyet az intenzív üregesedés és a buborékok kiszakadása okoz. Az

ionképződés két különböző módon valósulhat meg. Az egyik elmélet szerint semleges

molekulák lépnek ki a gázfázisba, ahol az ionizált vízmolekulákkal protontranszfer reakcióba

lépnek. A folyamat fenntartásához nagy mennyiségű ionizált víz jelenléte szükséges, ezért a

fenti mechanizmus szerinti ionképződés valószínűleg megjelenik az elektrosebészeti

folyamatban. Ez az út az atmoszférikus nyomású kémiai ionzációhoz (APCI) hasonlít. A

pozitív ionmódban 369.3522 m/z-nél megjelenő molekulaion, amely a [koleszterin+H]+-H2O

addukt, alátámasztja ennek a mechanizmusnak a végbemenetelét.

Az alternatív mechanizmus a szövet gyors termikus elpárologtatásán alapul, amely

rendszer ebben az esetben semleges és ionos molekulák vizes oldatának tekinthető. Mivel a

párolgás és a hőbomlás sebessége összemérhető, ezért mind az analit molekulaionok, mind az

elsőrendű hőbomlásból származó molekulák jelen lesznek a gázfázisban. Ez az út a

termospray ionizációhoz hasonlít, melynek során az oldatfázisban képződött ionok lépnek

közvetlenül a gőztérbe. Számos [M-H]- foszfoetanolamin (PE) ion és PE-NH3 típusú

molekula megjelenése a spektrumban kapcsolatba hozható ezzel a mechanizmussal. A PE és

PE-NH3 ionok intenzitása összemérhető, mely nagyfokú hődegradációra utal a gázfázisú

ionképződés mellett. A PE [M-H]- ionok ammónia vesztése nem figyelhető meg MS/MS

mérések során, tehát ez a folyamat valószínűleg még a gázfázisú ionképződés előtt

végbemegy. Hasonló, hőbomlásból származó molekulák jelenléte figyelhető meg

foszfoinozitolok esetén is, melyekből víz lép ki hő hatására. Lizofoszfolipidek szintén

származhatnak termikus degradációs folyamatból. Ezek esetében a viszonylag kisfokú

hőbomlás (a detektált ionok legnagyobb mennyisége kapcsolatba hozható az intakt foszfolipid

molekulaionokkal) összefüggésben van a kísérlet során alkalmazott atmoszférikus nyomással.

Az analit molekula ionok ezen körülmények között ütközések során (collisional cooling)

kinetikus energiát vesztenek, ilyen módon az esély a gázfázisú degradációra csökken. További

vizsgálatokat végzetem a feltételezés bizonyítására, valamint a kétfajta vázolt mechanizmus

84

ionképződési folyamathoz való hozzájárulásának tisztázására. Alternatív eljárásokat

próbáltam ki a termikus elpárologtatásra. Az egyik eljárás az egyenáramból származó Joule-

hővel történő melegítés volt, a másik pedig a tisztán termikus hőközlési folyamat. Mindkét

eljárást teszteltem korona kisüléses posztionizációval, illetve anélkül is. Különböző vizes

oldatokkal teszteltem az összeállításokat: anilin, bradikinin, fenilalanin, foszfoetanolamin,

bradikinin+PE, illetve homogenizált májszövet oldatával. Az anilin hexánnal készült oldatát is

megvizsgáltam a közvetlen fűtéses módszerrel.

Az egyenárammal történő termikus elpárologtatás esetén jelentősen kevesebb ionizált

vízmolekula képződése várható, mint amikor rádiófrekvenciás váltóáramot használunk (ami

az intenzív elektromos kisülések hiányából adódik), de még mindig több, mint a tiszta

hőközlés esetén (T ≤ 400°C). Ahogyan az alábbi táblázatban is látható, posztionizáció

hiányában a bradikininből és a fenilalaninból molekulaionok keletkeznek. A PE mix is

molekulaionokat ad (protonált, illetve deprotonált), és negatív módban ammóniavesztés is

tapasztalható.

Minta típusa Joule-hő Közvetlen fűtés Korona kisüléses

posztionizáció

Anilin hexánban - - [M+H]+ / -

Anilin vízben [M+H]+ / - [M+H]+ / - [M+H]+ / -

Fenilalanin

vízben

[M+H]+ / [M-H]- [M+H]+ / [M-H]- [M+H]+ / [M-H]-

Bradikinin (BK) [M+H]+, [M+2H]2+ /

[M-H]-

[M+H]+, [M+2H]2+ /

[M-H]-

-

Glicero-

foszfoetanolamin

ok keveréke (PE

mix)

[M+H]+ / [M-H]-,

[(M-NH3)-H]-

[M+H]+ / [M-H]-,

[(M-NH3)-H]-

[M+H-141]+ /

FA [M-H]-

(16:0, 18:0, 18:1, 20:4)

BK+PE PE: [M+H]+ / [M-H]-,

[(M-NH3)-H]-

BK:-

PE: [M+H]+ / [M-H]-,

[(M-NH3)-H]-

BK:-

[M+H-141]+ /

FA [M-H]-

(16:0, 18:0, 18:1, 20:4)

9. táblázat: A különböző termikus elpárologtatási módszerek során keletkezett ionok típusai.

85

Az intakt és a hődegradációt szenvedett foszfoetanolaminok aránya erősen függ az

elpárologtatás hőmérsékletétől, ahogyan a következő ábrán látható.

49. ábra: Az intakt és hődegradációt szenvedett foszfoetanolaminok keletkezésének

hőmérsékletfüggése.

Azok a minták, melyek PE, illetve PE+BK keveréket tartalmaztak, ugyanolyan

spektrumot szolgáltattak, vagyis a bradikinin még ekvimoláris mennyiségben sem volt

detektálható.

A jelek intenzitása erősen függött a minták pH-jától is. A fenilalanin

molekulaionjainak intenzitása a pH függvényében az alábbi ábrán látható.

Hőmérséklet (°C)

Inte

nzitá

s

86

50. ábra: A fenilalanin molekulaionjainak pH-függése.

Az ionok intenzitása erősen lecsökkent az izoelektromos pontnak megfelelő pH

tartományban, amely a fenilalanin esetében pH = 5.5 . Ez a megfigyelés igazolta, hogy az

oldatfázisban történő disszociáció kapcsolatba hozható a spektrumban megjelenő csúcsokkal.

Az összes minta esetében megfigyelhető volt valamilyen összetett pH függés. Annak

érdekében, hogy ez az összefüggés világosabb legyen, megvizsgáltam az anilin 10 mM-os

hexános oldatát a közvetlen fűtéses módszerrel (mivel ez a minta nem vezeti az elektromos

áramot, ezért Joule-hő nem keletkezhet benne). Az eredmények azt mutatták, hogy a hexános

oldat gyors termikus elpárologtatásakor nem képződnek ionok, ez a tapasztalat is alátámasztja

azt a feltételezést, hogy az ionok már a kondenzált fázisban jelen vannak, és az elpárologtatás

során jutnak a gázfázisba.

A korona kisüléses posztionizáció a fenilalanin és az anilin oldatok esetében

molekulaionokat eredményezett, mivel a folyamat mechanizmusa feltehetően kémiai

ionizáció, mely az ionizált oldószermolekulák segítségével megy végbe, ez jelen esetben a

víz. A PE és a PE+BK minták mérésekor karboxilát és lizofoszfolipid fragmensek képződését

tapasztaltam. A homogenizált májszövet analízisekor számos kisebb molekulatömegű ion

(nagyrészt [M-H]- típusú zsírsav ion) képződött, és a 600-as m/z felett nem is jelentek meg

pH

Inte

nzitá

s

87

csúcsok a spektrumban. A legintenzívebb jel a 369.3522 m/z-nél látható koleszterin csúcs

volt.

Ezek a megfigyelések arra engednek következtetni, hogy az ionizált víz molekulák

jelenléte nem szükséges a foszfolipidek elektrosebészeti ablációjához, habár a potenciális

szerepük az ionizációban nem zárható ki teljes mértékben. Ha a kondenzált fázisú mintát,

mely szolvatált ionokat tartalmaz, gyors termikus elpárologtatásnak vetjük alá, akkor

párhuzamosan történik a gázfázisú ionok képződése és a hődegradáció. Az alkalmazott

hőmérséklet mértéke befolyásolja a kétféle termék keletkezésének arányát.

Fontos befolyásoló tényező lehet még a gázfázisú részecskék ütközések általi

energiavesztése (collisional cooling) atmoszférikus nyomáson. Ugyan nem történt még

próbálkozás arra, hogy REIMS méréseket alacsonyabb nyomáson hajtsanak végre, de

feltételezhető, hogy a gyors ütközéses energiavesztés atmoszférikus nyomáson előnyös

folyamat, ami hozzájárul a termikusan képződött molekulaionok nagyszámú túléléséhez.

4.2.2. Az ionforrás optimalizációja egészséges állati szövetekre

A kísérleti részben bemutatott optimalizált paraméterek mellett értékelhető,

reprodukálható eredmények születtek. Az alábbi ábrán látható egy tipikus sertés májszöveti

spektrum.

51. ábra: Egy tipikus májszöveti spektrum elektrokauterrel vágva, negatív ionmódban.

620 640 660 680 700 720 740 760 780 800 820 840 860 880 900m/z

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

723.53

699.53

749.60725.60

885.60

727.60766.60697.60

721.53

737.60673.53

770.53 810.47713.67794.60 861.53687.53 773.53 820.53 834.47 868.67 890.53642.33 849.40

657.67629.67617.07

88

A membránlipidek elsősorban 600-900 m/z között találhatók, ezért a spektrumok

felvételét nagyrészt erre a tartományra szűkítettem le a vizsgálatok során. Először különböző

sertés szervek szöveteit vizsgáltam, ugyanolyan kísérleti körülmények között. A vizsgálatok

során beigazolódott hogy a különféle szövetek membránlipid összetétele nagymértékben

specifikus. Az eredményeket mutatja a következő ábra.

52. ábra: A különböző sertés szervekből felvett spektrumok összehasonlítása.

Az ábrán látható tömegspektrumokon szabad szemmel is látható különbség van a

különböző csúcsok egymáshoz viszonyított arányában, azonban az adatok összehasonlítására

matematikai alapú módszert is alkalmaztam, melyet a következő részben mutatok be. A

600 650 700 750 800 850

020406080

1000

20406080

1000

20406080

1000

20406080

1000

20406080

100

600 650 700 750 800 850

Inte

nzitá

s

m/z

lép

Inte

nzitá

s

tüdõ

Inte

nzitá

s

máj

Inet

nzitá

s

vese

Inte

nzitá

s

hasnyálmirigy

89

következő lépés a módszer fejlesztésében azonban a csúcsok azonosítása volt. Ehhez nagy

felbontású tömegspektrométerre volt szükség, mivel a pontos tömeg ismerete nagyban

megkönnyíti a molekulatípus tömeghez való egyértelmű hozzárendelését. A nagy felbontású

mérések egy LTQ Orbitrap Discovery (ThermoFinnigan) típusú tömegspektrométerrel

készültek. Az alábbi ábrákon láthatók a negatív, illetve pozitív ionmódban rögzített,

standardnak választott sertés máj szövetről készült felvételek.

53. ábra: Nagy felbontású tömegspektrum negatív ionmódban sertés máj szövetről.

600 620 640 660 680 700 720 740 760 780 800 820 840 860 880 900 920 940m/z

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

699.4919725.5073 749.5067

766.5331 885.5433

742.5332

794.5641

673.4764

713.5074

775.5211687.4916

834.5968642.4824

810.5233 863.5579 911.5627894.5920

607.4645

880.5925

939.4755659.4689

90

54. ábra: Nagy felbontású tömegspektrum pozitív ionmódban sertés máj szövetről.

A csúcsok egyértelmű azonosításához fragmentációs (MS/MS) méréseket is végeztem.

Negatív módban a zsírsavból származó RCOO- ionok alapján, pozitív módban pedig a [M+H-

RCOOH]+ ion tömege alapján történt az azonosítás az esetek többségében. A pontos

tömegmérések esetén a pontosság minden esetben 1 ppm alatt volt. Az eredményeket az

alábbi táblázatban foglaltam össze.

Pozitív ionmód

Foszfatidil-kolinok (PC) 16:0, 16:1, 18:1, 18:2, 20:4, 20:2, 20:3, 22:6

Foszfatidil-etanolaminok (PE) 14:0, 16:0, 16:1, 18:1, 18:2, 20:4, 20:2, 20:3 22:6

Szfingomielinek (SM) 18:0, 18:1, 20:4, 22:6

Trigliceridek (NH4+ adduktok) 16:0, 16:1, 18:1, 18:2, 20:4, 20:2, 20:3 22:6

Negatív ionmód

Zsírsavak 2:0, 3:0, 4:0, 8:0, 8:1, 10:0, 10:1, 12:0, 12:1, 14:0, 14:1, 16:0, 16:1, 18:0, 18:1, 18:2, 20:2, 20:3, 20:4, 22:6

500 550 600 650 700 750 800 850 900 950m/z

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

806.5036

628.6086

782.5641772.5781 839.6202

746.5638

737.4448

653.3544

855.6253

533.5079

815.6229

895.6548688.6649879.6254

602.5947 919.6629541.5466 716.5198667.3897 947.6840590.4533504.0207

91

Foszfatidil-etanolaminok (PE) 14:0, 16:0, 16:1, 18:1, 18:2, 20:4, 20:2, 20:3 22:6

Foszfatidil-etanolaminok –NH3 (PE-NH3) ugyanazok, mint a PE-k esetében

Foszfatidil-szerinek (PS) 16:0, 18:1, 18:0

Foszfatidil-inozitolok (PI) 16:0, 18:0, 20:4

Plazmalogének 16:0, 18:1

Foszfatidsavak 16:0, 18:1, 18:0

10. táblázat: A spektrumok alapján eddig azonosított vegyületek listája.

4.2.3. Szövetek azonosítása főkomponens analízissel

A főkomponens analízis (PCA: principal components analysis) a többváltozós

statisztikában gyakran alkalmazott matematikai eljárás. A lényege, hogy úgy redukálja az

adatok mennyiségét, hogy közben minél kisebb legyen az információ veszteség, ami úgy

valósulhat meg, hogy a nagyszámú korreláló változók számát le kell csökkenti kisebb számú

korrelálatlan változóra. Ez úgy történik, hogy meg kell keresni a minta kovariancia

mátrixának (ha standardizált adatok vannak, akkor a korrelációs mátrixának) a sajátértékeit,

majd azokat a főkomponenseket el lehet hanyagolni, amelyek az adatoknak csak csekély

arányú varianciáját magyarázzák. A 600-900 tömegtartományban felvett tömegspektrum 300

dimenziós adatnak minősül matematikai szempontból, amennyiben egységnyi

tömegfelbontással dolgozunk. A PCA analízis végeredményeképpen a dimenziók számát

lecsökkentjük kettőre, illetve háromra, ezeket szemléltetjük az alábbiakban bemutatott

ábrákon. Az adatok feldolgozásához egy erre a célra megírt szoftvert használtam. Az alábbi

ábrán látható az előzőekben bemutatott öt különböző, sertésből származó szövet PCA-val

végzett kiértékelésének eredménye.

92

55. ábra: Különböző sertés szövetek spektrális különbségének szemléltetése

PCA módszer segítségével.

A REIMS módszer és a PCA analízis segítségével a szerven belüli különbségek is jól

szemléltethetők, ahogyan az alábbi ábrán látható a vese különböző részei esetében.

hasnyálmirigy

tüdő lép

vese

máj

93

56. ábra: A vesében található különböző szövettípusok PCA kiértékelése.

A legtöbb kísérletet a diathermiás sebészeti eszközzel végeztük, volt lehetőségünk

azonban egy sebészeti széndioxid lézer (Dream Pulse 3 system) tesztelésére is. A készüléket

10 ms-os impulzus szélesség és 100 ms-os impulzus intervallum mellett maximum 30 W

teljesítménnyel használtuk. A mérési tapasztalatok, összhangban az előzetes feltételezésekkel,

azt mutatták, hogy a két technika által szolgáltatott adatok eltérnek egymástól, ugyanis a

spektrumokat a PCA kiértékelési módszerrel el tudjuk egymástól különíteni. A lézer technika

alkalmazásával, a lézersugárzás természetéből adódóan, rövidebb működési idő alatt

hatékonyabb a szövet vágása, illetve elpárologtatása, ami ráadásul több ion képződésével jár

együtt. Így a lézer vágás során felvett spektrumok ugyanazokat a csúcsokat tartalmazzák

eltérő intenzitással, emellett, emellett a jel/zaj arány csökken. A kifejlesztett módszer

szempontjából azonban a spektrumok reprodukálhatóak, tehát szintén alkalmasak

szövetazonosításra. Az alábbi ábránkon sertés máj szövet lézeres vágással készült spektruma,

illetve PCA kiértékeléssel különféle sertés szövetek, különböző technikákkal előállított

spektrumainak összehasonlítása látható.

vesemedence

vesevelő

vesekéreg

94

57. ábra: Sebészeti lézerrel készült sertés máj szöveti spektrum, negatív ionmódban.

58. ábra: Elektrokauterrel és sebészeti széndioxid lézerrel vágott szövetek spektrumbeli

eltérései PCA módszer segítségével szemléltetve.

LÉZER

ELEKTROKAUTER

máj

tüdő

vesekéreg

vesevelővesemedence

620 640 660 680 700 720 740 760 780 800 820 840 860 880 900m/z

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

767.47737.60

723.47

713.53 885.47743.60

770.47699.40

794.67

687.53 763.47

685.60816.47751.47

773.60876.67834.33

849.80671.40 874.20 891.93775.53 806.40 865.27633.33

661.33647.47611.47

95

4.2.4. A táplálkozás hatása a szövetek foszfolipid összetételére

A szöveti foszfolipid összetétel nagymértékben specifikus az adott szövet sejttípusaira,

ez elengedhetetlen a megfelelő membránműködés szempontjából. Emellett a bizonyos

zsírsavakban gazdag táplálkozás kismértékben képes befolyásolni az összfoszfolipid-tartalom

zsírsavösszetételén keresztül a membránlipid kompozíciót. A szakirodalomban erre a

jelenségre számos példa található [127], így számunkra a kérdés az volt, hogy a különböző

diéták a szöveti spektrumokat milyen mértékben befolyásolják. Ennek érdekében egy 10

hetes, zsírsavfelvételt monitorozó kísérletsorozatot végeztünk patkányokon.

A kísérletben 60 darab Wistar patkány vett részt, ezeket húszas csoportokra

elkülönítve, különböző takarmányokkal etettük a kísérlet ideje alatt. Az első csoport

kontrollként teljes értékű alaptakarmányt, a második csoport telített zsírokban gazdag

(sertészsírral átitatott) alaptakarmányt, harmadik csoport pedig telítetlen zsírsavakban gazdag

(étolajjal átitatott) alaptakarmányt a kapott. A különböző takarmányok zsírsav profilját GC-

MS méréssel állapítottuk meg, az eredmények a következő táblázatban láthatók.

Telítetlen

kötések száma

Kontroll Zsíros Olajos

0 (telített) 19 31 11

1 27 32 28

2 24 20 25

3 12 6 10

4 18 11 26

11. táblázat: A patkánytakarmányok százalékos zsírsav összetétele.

Az első hét után minden héten csoportonként két egyedből történt in vivo mintavétel,

különböző szervekből: máj, szív, vesék, lép, tüdő, herék. A műtét egy része mély narkózisban

történt, az előzetesen lemért tömegű állatokat intraperitoneálisan adott, testsúlyuknak

megfelelő mennyiségű fenobarbitál injekció segítségével altattuk el. A szív kauterezése előtt

az állatot intrakardiális KCl injekcióval extermináltuk. A mintavételt az optimalizációnál leírt

körülmények között végeztük, ERBE ICC 300 diathermiás készülékkel és LCQ Deca XP

96

tömegspektrométerrel. Minden szervből a méretétől függően 20-30 másodpercnyi spektrum

került felvételre. Ezeket, normalizálás után, főkomponens analízis segítségével értékeltük ki.

59. ábra: Szívből és májból készült felvételek PCA elemzésének eredménye.

Méréseink alapján kiderült, hogy REIMS módszerrel is kimérhetőek a szélsőséges

táplálkozás hatásai a szövetek foszfolipid összetételére. Ezek az eltérések azonban nem

befolyásolják a szövetazonosítást. Az egyes szerveken belül a táplálkozási csoportok

statisztikailag elkülöníthetőek voltak. Legszélsőségesebb eredmények a szív esetében

mutatkoztak, ez összefüggésben van a szív fokozott zsírsav metabolizmusával [128]. A máj

esetében, a várttal ellentétben, nem volt nagy különbség az eltérő zsírsav összetételű

táplálékot fogyasztó csoportok között. A táplálkozási csoportok közötti különbségek ellenére

nem látszik indokoltnak bármilyen korrekciót alkalmazni a szövetfelismerés során, mivel a

leírt eltérések nem befolyásolják a szövetek foszfolipid spektrum alapján történő

elkülönítését.

4.2.5. Tumoros szövetek vizsgálata

A kifejlesztett módszert, elképzeléseink szerint, a rákos daganatok műtéti

eltávolításában lehetne elsősorban felhasználni. Egyrészt a kimetszés közbeni folyamatos

szövetazonosítás jöhet szóba, illetve a tumor eltávolítása után a tumorágy szondázása. Az

előzőekben leírtak alapján a tumoros szövetek is specifikus foszfolipid profillal rendelkeznek,

97

ugyanis ezek a sejtek a kiindulási szövethez képest más differenciáltsági szinten állnak,

emellett számos egyébb funkcionális változáson mentek keresztül, ami miatt külön

szövettípusként kezelhetőek.

A REIMS módszer előnye az alternatív, szövetanalízisre használt tömegspektrometriás

technikákkal (pl. DESI, MALDI) szemben, hogy nincs szükség nagyfeszültség alkalmazására,

nagysebességű gázáramra, illetve nem igényel mintaelőkészítést. A sebész munkafolyamatát a

tömegspektrometriás adatgyűjtés közvetlenül nem befolyásolja, a kissé módosított

vágóeszközön kívül nem kell egyéb eszközöket használnia.

Az első tumor minták vizsgálatát ex vivo végeztük, a minták állatorvosi műtétek során

eltávolított daganatokból származtak. A tumoros minták mindegyike kutyákon végzett

műtétek során keletkezett. Ahogy az alábbi ábrán is látható, a főkomponens analízis

segítségével az egészséges és a rákos szövet jól elkülöníthető egymástól.

60. ábra: Kutyából származó egészséges és tumoros szövetek 3 dimenziós főkomponens

analízise.

A következőkben sor került in vivo mérésre is, melynek során a tumor eltávolítását

diathermiás vágóeszközzel végezte a sebész, miközben a tömegspektrometriás adatrögzítés

folyamatosan zajlott. A műtét során az izmokat infiltráló mastocytomát a szövetazotosítás

98

segítségével sikerült épszélben kimetszeni. A kutya egy 4 év körüli kaukázusi juhász, 6 héttel

a műtét után teljesen tünetmentes.

61. ábra: Tumor és a körülötte lévő szövet spektrális különbségének szemléltetése PCA

módszerrel és fényképen (1: izom, 2: bőr, 3: bőr alatti kötőszövet, 4: tumor).

99

5. Következtetések

Doktori munkám során olyan módszerek fejlesztésén dolgoztam, melyek a biológiai

minták analízisének gyakorlatát egyszerűbbé, gyorsabbá és költséghatékonyabbá tehetik.

A szilárd fázisú extrakcióval kapcsolt deszorpciós elektrospray ionizációs módszerrel

a biológiai fluidumok vizsgálata hatékonyan megvalósítható. A kifejlesztett kártyaformátum

vagy akár a – diagnosztikai laboratóriumokban gyakorlatban használt – 96-os

mintaformátumú típus a laboratóriumi diagnosztikában alkalmazható, a tömegspektrometriás

detektálás érzékenysége összehasonlítható a jelenlegi LC-MS/MS módszerekével, miközben

az egy mintára jutó analízis idő a töredékére csökken (2-8 másodperc/minta). A kifejlesztett

mintaelőkészítési módszer kombinálható egyéb, az irodalmi bevezetőben bemutatott

atmoszférikus nyomású ionizációs technikákkal is, ami szélesíti a módszer alkalmazási

területét.

A gyors elpárologatáson alapuló direkt tömegspektrometriás szövetvizsgálat

alapvetően új módszer az in vivo vizsgálatok területén. A bemutatott kísérleti adatok alapján

egyértelműen megállapítható, hogy a technika teljes mértékben kompatibilis az

elektrosebészetben, illetve a lézersebészetben alkalmazott orvosi eszközök használatával,

valamint a mért adatok és azok kiértékelési algoritmusa alkalmas az egészséges és tumoros

szövetek azonnali differenciálására. Az eredmények fényében azt reméljük, hogy a módszer

alkalmazása valódi alternatívát jelenthet az intraoperatív szövetazonosítás területén.

100

6. Irodalomjegyzék

1. Gohlke, R.S., Time-of-Flight Mass Spectrometry and Gas-Liquid Partition

Chromatography. Analytical Chemistry, 1959. 31(4): p. 535-541.

2. Gohlke, R.S. and F.W. McLafferty, Early Gas-Chromatography Mass-Spectrometry.

Journal of the American Society for Mass Spectrometry, 1993. 4(5): p. 367-371.

3. Ryhage, R., Use of a Mass Spectrometer as a Detector and Analyzer for Effluent

Emerging from High Temperature Gas Liquid Chromatography Columns. Analytical

Chemistry, 1964. 36(4): p. 759-764.

4. Dempster, A.J., A new Method of Positive Ray Analysis. Physical Review, 1918. 11(4):

p. 316.

5. Munson, M.S.B. and F.H. Field, Chemical Ionization Mass Spectrometry. I. General

Introduction. Journal of the American Chemical Society, 1966. 88(12): p. 2621-2630.

6. Horning, E.C. and M.G. Horning, Metabolic Profiles: Gas-Phase Methods for

Analysis of Metabolites. Clin Chem, 1971. 17(8): p. 802-809.

7. Wolthers, B.G. and G.P.B. Kraan, Clinical applications of gas chromatography and

gas chromatography-mass spectrometry of steroids. Journal of Chromatography A,

1999. 843(1-2): p. 247-274.

8. Noppe, H., et al., Novel analytical methods for the determination of steroid hormones

in edible matrices. Analytica Chimica Acta, 2008. 611(1): p. 1-16.

9. Thurnhofer, S. and W. Vetter, A Gas Chromatography/Electron Ionization-Mass

Spectrometry-Selected Ion Monitoring Method for Determining the Fatty Acid Pattern

in Food after Formation of Fatty Acid Methyl Esters. Journal of Agricultural and Food

Chemistry, 2005. 53(23): p. 8896-8903.

10. Larsson, L. and A. Saraf, Use of gas chromatography ion trap tandem mass

spectrometry for the detection and characterization of microorganisms in complex

samples. Molecular Biotechnology, 1997. 7(3): p. 279-287.

11. Pasikanti, K.K., P.C. Ho, and E.C.Y. Chan, Gas chromatography/mass spectrometry

in metabolic profiling of biological fluids. Journal of Chromatography B-Analytical

Technologies in the Biomedical and Life Sciences, 2008. 871(2): p. 202-211.

12. McFadden, W.H., H.L. Schwartz, and S. Evans, Direct analysis of liquid

chromatographic effluents. Journal of Chromatography A, 1976. 122: p. 389-396.

101

13. Creaser, C.S. and J.W. Stygall, Particle-beam Liquid-Chromatography Mass-

Spectrometry - Instrumentation and Applications - A Review. Analyst, 1993. 118(12):

p. 1467-1480.

14. Arpino, P., Combined Liquid-Chromatography Mass-Spectrometry. 2. Techniques and

Mechanism of Thermospray. Mass Spectrometry Reviews, 1990. 9(6): p. 631-669.

15. Fenn, J., et al., Electrospray ionization for mass spectrometry of large biomolecules.

Science, 1989. 246(4926): p. 64-71.

16. Iribarne, J.V. and B.A. Thomson, On the evaporation of small ions from charged

droplets. The Journal of Chemical Physics, 1976. 64(6): p. 2287-2294.

17. Dole, M., et al., Molecular Beams of Macroions. The Journal of Chemical Physics,

1968. 49(5): p. 2240-2249.

18. Byrdwell, W.C., Atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry for

analysis of lipids. Lipids, 2001. 36(4): p. 327-346.

19. Gibson, G.T.T., S.M. Mugo, and R.D. Oleschuk, Nanoelectrospray emitters: Trends

and perspective. Mass Spectrometry Reviews, 2009. 28(6): p. 918-936.

20. Hirabayashi, A., M. Sakairi, and H. Koizumi, Sonic spray mass spectrometry.

Analytical Chemistry, 1995. 67(17): p. 2878-2882.

21. Dams, R., et al., Sonic Spray Ionization Technology: Performance Study and

Application to a LC/MS Analysis on a Monolithic Silica Column for Heroin Impurity

Profiling. Analytical Chemistry, 2002. 74(13): p. 3206-3212.

22. Marchi, I., S. Rudaz, and J.L. Veuthey, Atmospheric pressure photoionization for

coupling liquid-chromatography to mass spectrometry: A review. Talanta, 2009. 78(1):

p. 1-18.

23. Chang, M.S., et al., Historical review of sample preparation for chromatographic

bioanalysis: Pros and cons. Drug Development Research, 2007. 68(3): p. 107-133.

24. Piraud, M., et al., Ion-pairing reversed-phase liquid chromatography/electrospray

ionization mass spectrometric analysis of 76 underivatized amino acids of biological

interest: a new tool for the diagnosis of inherited disorders of amino acid metabolism.

Rapid Communications in Mass Spectrometry, 2005. 19(12): p. 1587-1602.

25. Gaut, J.P., et al., Artifact-free quantification of free 3-chlorotyrosine, 3-bromotyrosine,

and 3-nitrotyrosine in human plasma by electron capture-negative chemical ionization

gas chromatography mass spectrometry and liquid chromatography-electrospray

ionization tandem mass spectrometry (vol 300, pg 252, 2002). Analytical

Biochemistry, 2002. 304(2): p. 275-275.

102

26. Valerio, A., G. Baldo, and P. Tessari, A rapid method to determine plasma

homocysteine concentration and enrichment by gas chromatography/mass

spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry, 2005. 19(4): p. 561-567.

27. Byrdwell, W.C., Dual parallel liquid chromatography with dual mass spectrometry

(LC2/MS2) for a total lipid analysis. Frontiers in Bioscience, 2008. 13: p. 100-120.

28. Duffin, K.L., J.D. Henion, and J.J. Shieh, Electrospray and tandem mass

spectrometric characterization of acylglycerol mixtures that are dissolved in nonpolar

solvents. Analytical Chemistry, 1991. 63(17): p. 1781-1788.

29. Van Hove, J.L.K., et al., Acylcarnitines in plasma and blood spots of patients with

long-chain 3-hydroxyacyl-coenzyme A dehydrogenase defiency. Journal of Inherited

Metabolic Disease, 2000. 23(6): p. 571-582.

30. Vernez, L., et al., Determination of carnitine and acylcarnitines in urine by high-

performance liquid chromatography-electrospray ionization ion trap tandem mass

spectrometry. Journal of Chromatography A, 2003. 984(2): p. 203-213.

31. Bove, K.E., et al., Bile acid synthetic defects and liver disease: A comprehensive

review. Pediatric and Developmental Pathology, 2004. 7(4): p. 315-334.

32. Tagliacozzi, D., et al., Quantitative analysis of bile acids in human plasma by liquid

chromatography-electrospray tandem mass spectrometry: A simple and rapid one-step

method. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine, 2003. 41(12): p. 1633-1641.

33. Pettus, B.J., et al., Mass spectrometric analysis of ceramide perturbations in brain and

fibroblasts of mice and human patients with peroxisomal disorders. Rapid

Communications in Mass Spectrometry, 2004. 18(14): p. 1569-1574.

34. Lee, S.H., et al., Targeted lipidomics using electron capture atmospheric pressure

chemical ionization mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry,

2003. 17(19): p. 2168-2176.

35. Mesaros, C., S.H. Lee, and I.A. Blair, Targeted quantitative analysis of eicosanoid

lipids in biological samples using liquid chromatography-tandem mass spectrometry.

Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life

Sciences, 2009. 877(26): p. 2736-2745.

36. Vallance, H. and A. Derek, An improved method for quantification of very long chain

fatty acids in plasma. Clinical Biochemistry, 1994. 27(3): p. 183-186.

37. Johnson, D.W., Contemporary clinical usage of LC/MS: Analysis of biologically

important carboxylic acids. Clinical Biochemistry, 2005. 38(4): p. 351-361.

103

38. Watson, D.G., et al., Analysis of biogenic amines and their metabolites in biological

tissues and fluids by gas chromatography--negative ion chemical ionization mass

spectrometry (GC-NICIMS). Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis,

1990. 8(8-12): p. 899-904.

39. Hows, M.E.P., et al., High-performance liquid chromatography/tandem mass

spectrometric assay for the simultaneous measurement of dopamine, norepinephrine,

5-hydroxytryptamine and cocaine in biological samples. Journal of Neuroscience

Methods, 2004. 138(1-2): p. 123-132.

40. Nordstrom, A., et al., Derivatization for LC electrospray ionization-MS: A tool for

improving reversed-phase separation and ESI responses of bases, ribosides, and intact

nucleotides. Analytical Chemistry, 2004. 76(10): p. 2869-2877.

41. Klawitter, J., et al., Development and validation of an assay for the quantification of

11 nucleotides using LC/LC-electro spray ionization-MS. Analytical Biochemistry,

2007. 365(2): p. 230-239.

42. Kuhara, T., Diagnosis and monitoring of inborn errors of metabolism using urease-

pretreatment of urine, isotope dilution, and gas chromatography-mass spectrometry.

Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life

Sciences, 2002. 781(1-2): p. 497-517.

43. Buchanan, D.N., J. Muenzer, and J.G. Thoene, Positive-ion thermospray liquid

chromatography--mass spectrometry: detection of organic acidurias. Journal of

Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications, 1990. 534: p. 1-11.

44. Pulfer, M. and R.C. Murphy, Electrospray mass spectrometry of phospholipids. Mass

Spectrometry Reviews, 2003. 22(5): p. 332-364.

45. Han, X.L. and R.W. Gross, Global analyses of cellular lipidomes directly from crude

extracts of biological samples by ESI mass spectrometry: a bridge to lipidomics.

Journal of Lipid Research, 2003. 44(6): p. 1071-1079.

46. Houjou, T., et al., A shotgun tandem mass spectrometric analysis of phospholipids

with normal-phase and/or reverse-phase liquid chromatography/electrospray

ionization mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry, 2005.

19(5): p. 654-666.

47. Thevis, M. and W. Schanzer, Current role of LC-MS(/MS) in doping control.

Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2007. 388(7): p. 1351-1358.

48. Sjovall, J., Fifty years with bile acids and steroids in health and disease. Lipids, 2004.

39(8): p. 703-722.

104

49. Hammad, L.A., et al., Multiple-Reaction Monitoring Liquid Chromatography Mass

Spectrometry for Monosaccharide Compositional Analysis of Glycoproteins. Journal

of the American Society for Mass Spectrometry, 2009. 20(6): p. 1224-1234.

50. Beckey, H.D., Field desorption mass spectrometry: A technique for the study of

thermally unstable substances of low volatility. International Journal or Mass

Spectrometry and Ion Physics, 1969. 2(6): p. 500-502.

51. Baldwin, M.A. and F.W. McLafferty, Direct chemical ionization of relatively

involatile samples. Application to underivatized oligopeptides. Organic Mass

Spectrometry, 1973. 7(12): p. 1353-1356.

52. Vincenti, M., The renaissance of desorption chemical ionization mass spectrometry:

characterization of large involatile molecules and nonpolar polymers. International

Journal of Mass Spectrometry, 2001. 212(1-3): p. 505-518.

53. Macfarlane, R. and D. Torgerson, Californium-252 plasma desorption mass

spectroscopy. Science, 1976. 191(4230): p. 920-925.

54. Benninghoven, A., Beobachtung von oberflächenreaktionen mit der statischen

methode der sekundärionen-massenspektroskopie. I die methode. Surface Science,

1971. 28(2): p. 541-562.

55. Belu, A.M., D.J. Graham, and D.G. Castner, Time-of-flight secondary ion mass

spectrometry: techniques and applications for the characterization of biomaterial

surfaces. Biomaterials, 2003. 24(21): p. 3635-3653.

56. Fletcher, J.S., Cellular imaging with secondary ion mass spectrometry. The Analyst,

2009. 134(11): p. 2204-2215.

57. Lorey, D.R., G.H. Morrison, and S. Chandra, Dynamic Secondary Ion Mass

Spectrometry Analysis of Boron from Boron Neutron Capture Therapy Drugs in Co-

Cultures: Single-Cell Imaging of Two Different Cell Types within the Same Ion

Microscopy Field of Imaging. Analytical Chemistry, 2001. 73(16): p. 3947-3953.

58. Sostarecz, A.G., et al., Phosphatidylethanolamine-Induced Cholesterol Domains

Chemically Identified with Mass Spectrometric Imaging. Journal of the American

Chemical Society, 2004. 126(43): p. 13882-13883.

59. Barber, M., et al., Fast Atom Bombardment Mass-Spectrometry. Analytical Chemistry,

1982. 54(4): p. 645A-657A.

60. Murphy, R.C. and K.A. Harrison, Fast-Atom-Bombardment Mass-Spectrometry of

Phospholipids. Mass Spectrometry Reviews, 1994. 13(1): p. 57-75.

105

61. Gibson, B.W. and P. Cohen, Liquid Secondary-Ion Mass-Spectrometry of

Phosphorylated and Sulfated Peptides and Proteins. Methods in Enzymology, 1990.

193: p. 480-501.

62. Cornett, D.S., et al., Matrix-free desorption of biomolecules using massive cluster

impact. Rapid Communications in Mass Spectrometry, 1994. 8(12): p. 996-1000.

63. Garrison, B.J. and Z. Postawa, Computational view of surface based organic mass

spectrometry. Mass Spectrometry Reviews, 2008. 27(4): p. 289-315.

64. Karas, M., D. Bachmann, and F. Hillenkamp, Influence of the wavelength in high-

irradiance ultraviolet laser desorption mass spectrometry of organic molecules.

Analytical Chemistry, 1985. 57(14): p. 2935-2939.

65. Tanaka, K., et al., Protein and polymer analyses up to <I>m/z</I> 100 000 by laser

ionization time-of-flight mass spectrometry. Rapid Communications in Mass

Spectrometry, 1988. 2(8): p. 151-153.

66. Ehring, H., M. Karas, and F. Hillenkamp, Role of photoionization and photochemistry

in ionization processes of organic molecules and relevance for matrix-assisted laser

desorption lonization mass spectrometry. Organic Mass Spectrometry, 1992. 27(4): p.

472-480.

67. Karas, M. and R. Kruger, Ion Formation in MALDI: The Cluster Ionization

Mechanism. Chemical Reviews, 2003. 103(2): p. 427-440.

68. McDonnell, L.A. and R.M.A. Heeren, Imaging mass spectrometry. Mass Spectrometry

Reviews, 2007. 26(4): p. 606-643.

69. Laiko, V.V., M.A. Baldwin, and A.L. Burlingame, Atmospheric Pressure Matrix-

Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry. Analytical Chemistry, 2000.

72(4): p. 652-657.

70. Van Berkel, G.J., S.P. Pasilis, and O. Ovchinnikova, Established and emerging

atmospheric pressure surface sampling/ionization techniques for mass spectrometry.

Journal of Mass Spectrometry, 2008. 43(9): p. 1161-1180.

71. Takats, Z., et al., Mass Spectrometry Sampling Under Ambient Conditions with

Desorption Electrospray Ionization. Science, 2004. 306(5695): p. 471-473.

72. Takáts, Z., J.M. Wiseman, and R.G. Cooks, Ambient mass spectrometry using

desorption electrospray ionization (DESI): instrumentation, mechanisms and

applications in forensics, chemistry, and biology. Journal of Mass Spectrometry, 2005.

40(10): p. 1261-1275.

106

73. Cooks, R.G., S.-C. Jo, and J. Green, Collisions of organic ions at surfaces. Applied

Surface Science, 2004. 231-232: p. 13-21.

74. García-Reyes, J.F., et al., Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry for

Trace Analysis of Agrochemicals in Food. Analytical Chemistry, 2008. 81(2): p. 820-

829.

75. Ifa, D., et al., Forensic applications of ambient ionization mass spectrometry.

Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2009. 394(8): p. 1995-2008.

76. Takats, Z., et al., Direct, trace level detection of explosives on ambient surfaces by

desorption electrospray ionization mass spectrometry. Chemical Communications,

2005(15): p. 1950-1952.

77. Wiseman, J.M., et al., Mass Spectrometric Profiling of Intact Biological Tissue by

Using Desorption Electrospray Ionization. Angewandte Chemie International Edition,

2005. 44(43): p. 7094-7097.

78. Kertesz, V. and G.J.V. Berkel, Improved imaging resolution in desorption

electrospray ionization mass spectrometry. Rapid Communications in Mass

Spectrometry, 2008. 22(17): p. 2639-2644.

79. Wu, C., et al., Molecular imaging of adrenal gland by desorption electrospray

ionization mass spectrometry. The Analyst, 2010. 135(1): p. 28-32.

80. Barbula, G.K., et al., Desorption Electrospray Ionization: Achieving Rapid Sampling

Rates. Analytical Chemistry, 2009. 81(21): p. 9035-9040.

81. Soparawalla, S., et al., Pharmaceutical cleaning validation using non-proximate large-

area desorption electrospray ionization mass spectrometry. Rapid Communications in

Mass Spectrometry, 2009. 23(1): p. 131-137.

82. Ma, X., et al., Versatile Platform Employing Desorption Electrospray Ionization Mass

Spectrometry for High-Throughput Analysis. Analytical Chemistry, 2008. 80(15): p.

6131-6136.

83. Haddad, R., R. Sparrapan, and M.N. Eberlin, Desorption sonic spray ionization for

(high) voltage-free ambient mass spectrometry. Rapid Communications in Mass

Spectrometry, 2006. 20(19): p. 2901-2905.

84. Pasilis, S.P., V. Kertesz, and G.J. Van Berkel, Unexpected Analyte Oxidation during

Desorption Electrospray Ionization-Mass Spectrometry. Analytical Chemistry, 2008.

80(4): p. 1208-1214.

85. Volny, M., et al., Surface effects and electrochemical cell capacitance in desorption

electrospray ionization. The Analyst, 2008. 133(4): p. 525-531.

107

86. Takats, Z., et al., Jet desorption ionization. Proceedings of the 54th ASMS Conference

on Mass Spectrometry, 2006(Seattle, May 28-June 1).

87. Luftmann, H., A simple device for the extraction of TLC spots: direct coupling with an

electrospray mass spectrometer. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2004.

378(4): p. 964-968.

88. Van Berkel, G.J., A.D. Sanchez, and J.M.E. Quirke, Thin-Layer Chromatography and

Electrospray Mass Spectrometry Coupled Using a Surface Sampling Probe. Analytical

Chemistry, 2002. 74(24): p. 6216-6223.

89. Wachs, T. and J. Henion, Electrospray Device for Coupling Microscale Separations

and Other Miniaturized Devices with Electrospray Mass Spectrometry. Analytical

Chemistry, 2001. 73(3): p. 632-638.

90. Modestov, A.D., et al., Scanning Capillary Microscopy/Mass Spectrometry for

Mapping Spatial Electrochemical Activity of Electrodes. Analytical Chemistry, 2001.

73(17): p. 4229-4240.

91. Van Berkel, G.J., et al., Liquid microjunction surface sampling probe electrospray

mass spectrometry for detection of drugs and metabolites in thin tissue sections.

Journal of Mass Spectrometry, 2008. 43(4): p. 500-508.

92. Dzidic, I., et al., Atmospheric pressure ionization (API) mass spectrometry. Formation

of phenoxide ions from chlorinated aromatic compounds. Analytical Chemistry, 1975.

47(8): p. 1308-1312.

93. Stoll, R. and F.W. Röllgen, Thermal evaporation of intact positive ions of quaternary

ammonium and phosphonium salts. Journal of the Chemical Society, Chemical

Communications, 1980. 16: p. 789.

94. Chen, H., Z. Ouyang, and R.G. Cooks, Thermal Production and Reactions of Organic

Ions at Atmospheric Pressure. Angewandte Chemie International Edition, 2006.

45(22): p. 3656-3660.

95. McEwen, C.N., R.G. McKay, and B.S. Larsen, Analysis of Solids, Liquids, and

Biological Tissues Using Solids Probe Introduction at Atmospheric Pressure on

Commercial LC/MS Instruments. Analytical Chemistry, 2005. 77(23): p. 7826-7831.

96. McEwen, C. and S. Gutteridge, Analysis of the Inhibition of the Ergosterol Pathway in

Fungi Using the Atmospheric Solids Analysis Probe (ASAP) Method. Journal of the

American Society for Mass Spectrometry, 2007. 18(7): p. 1274-1278.

108

97. Cody, R.B., J.A. Laramee, and H.D. Durst, Versatile New Ion Source for the Analysis

of Materials in Open Air under Ambient Conditions. Analytical Chemistry, 2005.

77(8): p. 2297-2302.

98. Williams, J.P. and J.H. Scrivens, Rapid accurate mass desorption electrospray

ionisation tandem mass spectrometry of pharmaceutical samples. Rapid

Communications in Mass Spectrometry, 2005. 19(24): p. 3643-3650.

99. Williams, J.P., et al., The use of recently described ionisation techniques for the rapid

analysis of some common drugs and samples of biological origin. Rapid

Communications in Mass Spectrometry, 2006. 20(9): p. 1447-1456.

100. Chen, H., et al., Surface desorption atmospheric pressure chemical ionization mass

spectrometry for direct ambient sample analysis without toxic chemical contamination.

Journal of Mass Spectrometry, 2007. 42(8): p. 1045-1056.

101. Song, Y. and R.G. Cooks, Atmospheric pressure ion/molecule reactions for the

selective detection of nitroaromatic explosives using acetonitrile and air as reagents.

Rapid Communications in Mass Spectrometry, 2006. 20(20): p. 3130-3138.

102. Chen, H., et al., Rapid Differentiation of Tea Products by Surface Desorption

Atmospheric Pressure Chemical Ionization Mass Spectrometry. Journal of Agricultural

and Food Chemistry, 2007. 55(25): p. 10093-10100.

103. Haapala, M., et al., Desorption Atmospheric Pressure Photoionization. Analytical

Chemistry, 2007. 79(20): p. 7867-7872.

104. Ratcliffe, L.V., et al., Surface Analysis under Ambient Conditions Using Plasma-

Assisted Desorption/Ionization Mass Spectrometry. Analytical Chemistry, 2007.

79(16): p. 6094-6101.

105. Na, N., et al., Direct detection of explosives on solid surfaces by mass spectrometry

with an ambient ion source based on dielectric barrier discharge. Journal of Mass

Spectrometry, 2007. 42(8): p. 1079-1085.

106. Gray, A.L., Solid Sample Introduction by Laser Ablation for Inductively Coupled

Plasma Source-Mass Spectrometry. Analyst, 1985. 110(5): p. 551-556.

107. Mokgalaka, N.S. and J.L. Gardea-Torresdey, Laser ablation inductively coupled

plasma mass spectrometry: Principles and applications. Applied Spectroscopy

Reviews, 2006. 41(2): p. 131-150.

108. Coon, J.J., K.J. McHale, and W.W. Harrison, Atmospheric pressure laser

desorption/chemical ionization mass spectrometry: a new ionization method based on

109

existing themes. Rapid Communications in Mass Spectrometry, 2002. 16(7): p. 681-

685.

109. Shiea, J., et al., Electrospray-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry

for direct ambient analysis of solids. Rapid Communications in Mass Spectrometry,

2005. 19(24): p. 3701-3704.

110. Sampson, J.S., A.M. Hawkridge, and D.C. Muddiman, Generation and Detection of

Multiply-Charged Peptides and Proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption

Electrospray Ionization (MALDESI) Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance

Mass Spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry, 2006.

17(12): p. 1712-1716.

111. Nemes, P. and A. Vertes, Laser Ablation Electrospray Ionization for Atmospheric

Pressure, in Vivo, and Imaging Mass Spectrometry. Analytical Chemistry, 2007.

79(21): p. 8098-8106.

112. Eijkel, G.B., et al., Correlating MALDI and SIMS imaging mass spectrometric

datasets of biological tissue surfaces. Surface and Interface Analysis, 2009. 41(8): p.

675-685.

113. Altelaar, A.F.M., et al., Imaging mass spectrometry at cellular length scales. Nat.

Protocols, 2007. 2(5): p. 1185-1196.

114. Stoeckli, M., et al., Imaging mass spectrometry: A new technology for the analysis of

protein expression in mammalian tissues. Nat Med, 2001. 7(4): p. 493-496.

115. Schiller, J., et al., MALDI-TOF MS in lipidomics. Frontiers in Bioscience, 2007. 12: p.

2568-2579.

116. Dill, A.L., et al., Mass spectrometric imaging of lipids using desorption electrospray

ionization. Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical

and Life Sciences, 2009. 877(26): p. 2883-2889.

117. Nemes, P., A.S. Woods, and A. Vertes, Simultaneous Imaging of Small Metabolites

and Lipids in Rat Brain Tissues at Atmospheric Pressure by Laser Ablation

Electrospray Ionization Mass Spectrometry. Analytical Chemistry, 2010. 82(3): p.

982-988.

118. Van Berkel, G.J. and V. Kertesz, Application of a Liquid Extraction Based Sealing

Surface Sampling Probe for Mass Spectrometric Analysis of Dried Blood Spots and

Mouse Whole-Body Thin Tissue Sections. Analytical Chemistry, 2009. 81(21): p.

9146-9152.

110

119. Kosaka, N., et al., Clinical implications of near-infrared fluorescence imaging in

cancer. Future Oncology, 2009. 5(9): p. 1501-1511.

120. Belsare, D. and D. Roy Chowdhuri, Phospholipid distribution in blood and tissues of

some submammalian species. Lipids, 1968. 3(1): p. 21-23.

121. Holland, J.F., B. Soltmann, and C.C. Sweeley, Model for Ionization Mechanisms in

Field Desorption Mass-Spectrometry. Biomedical Mass Spectrometry, 1976. 3(6): p.

340-345.

122. Gaffney, J.S., R.C. Pierce, and L. Friedman, Mass spectrometer study of evaporation

of .alpha.-amino acids. Journal of the American Chemical Society, 1977. 99(13): p.

4293-4298.

123. Cotter, R.J. and A.L. Yergey, Thermal desorption of quaternary ammonium cations.

Journal of the American Chemical Society, 1981. 103(6): p. 1596-1598.

124. Blakley, C.R., J.J. Carmody, and M.L. Vestal, A new soft ionization technique for

mass spectrometry of complex molecules. Journal of the American Chemical Society,

1980. 102(18): p. 5931-5933.

125. Takats, Z. and R.G. Cooks, Thermal formation of serine octamer ions. Chemical

Communications, 2004(4): p. 444-445.

126. Taylor, P.J., et al., Evaluation of 3 Internal Standards for the Measurement of

Cyclosporin by HPLC-Mass Spectrometry. Clin Chem, 2005. 51(10): p. 1890-1893.

127. Turner, N., et al., Greater effect of diet than exercise training on the fatty acid profile

of rat skeletal muscle. Journal of Applied Physiology, 2004. 96(3): p. 974-980.

128. Stein, O. and Y. Stein, Metabolism of fatty acids in the isolated perfused rat heart.

Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Specialized Section on Lipids and Related

Subjects, 1963. 70: p. 517-530.

111

7. Köszönetnyilvánítás

Szeretnék köszönetet mondani témavezetőmnek, Takáts Zoltánnak, valamint

munkatársaimnak, Szaniszló Tamásnak, Balog Júliának, Czuczy Noéminek, Szabó Eszternek,

Szekeres Ákosnak, Hosszú Ádámnak, Katona Máriának, Albrecht Katalinnak és Dobos

Juditnak a szakmai és baráti támogatásért. Köszönöm Kertész Vilmosnak, Szalay Dánielnek,

Gödörházy Lajosnak, Szendrei Eszternek, Patikásné Krisztinának és Balogh Lajosnak a

munkám technikai hátterének megteremtését. Valamint szeretném megköszönni

Édesanyámnak, hogy mindenben számíthatok rá.

112

8. Összefoglalás Doktori munkám során olyan közvetlen ionizációs módszereket fejlesztésén

dolgoztam, melyek segítségével biológiai minták közvetlenül vagy minimális előkészítés után

vizsgálhatóak. Mivel analitikai szemszögből a biológiai minták egyértelműen biológiai

fluidumokra és szövetmintákra oszlanak, párhuzamosan foglalkoztam a két mintacsoport

közvetlen ionizációs tömegspektrometriai vizsgálatának lehetőségeivel.

Mind a fluidumok, mind pedig a szövetminták esetében megpróbáltunk olyan

alkalmazást találni, ahol a jelenleg használt módszerek problémákkal küzdenek, és

mindenképpen szükséges valamilyen alapvető metodikai változtatás a közeljövőben. A

biológiai fluidumokkal kapcsolatban a klinikai kémiai-labordiagnosztikai alkalmazásokra

esett a választás, mivel a nagy mintaszámú vizsgálatok alapvetően megkövetelik a minél

gyorsabb, egyszerűbb és olcsóbb analitikai megoldásokat. A módszer fejlesztése során az

egyik fontos szempont az volt, hogy valamilyen módon helyettesítse az időigényes, és a

deszorpciós technikáknál csak körülményesen alkalmazható kromatográfiás eljárásokat. Az

eljárás kidolgozásához a szilárd fázisú extrakciós technikát kombináltam az atmoszférikus

nyomású deszorpciós ionizációs tömegspektrometriával. A szilárd fázisú extrakció

folyamatának csak az utolsó, elúciós lépését kellett módosítani olyan módon, hogy az oldat

fázisú minta helyett egy szabad felületen elhelyezkedő szilárd fázisú mintát kapjak. Így jött

létre a szilárd fázisú extrakcióval kapcsolt deszorpciós elektrospray ionizációnak (SPEEDI:

solid phase extraction enhanced desorption electrospray ionization) elnevezett módszer. Az

eljáráshoz szükséges laboratóriumi eszközök tervezése és kivitelezése is doktori munkám

részét képezte.

Szövetminták vizsgálatával kapcsolatban célként egy olyan módszer kifejlesztését

tűztük ki, amely közvetlen ionizációs tömegspektrometrián alapszik, és képes élő szövetek

vizsgálatára, illetve a vizsgálati eredmények alapján lényegében valós idejű azonosítására. Az

elektrosebészetben használt módszerek biológiai szövetek gyors termikus elpárologatásán

alapulnak, amely a fő szövetalkotókból, így a membránalkotó lipidekből is gázfázisú

molekula ionokat hoz létre, melyeket egy új típusú interfész beiktatásával

tömegspektrometriásan analizálhatunk. Matematikai módszer segítségével a különböző

egészséges és tumoros szöveteket el tudtuk különíteni egymástól. Mivel a módszer kulcsa a

gyors elpárologtatás, ezért a technikát „Gyors Elpárologtatású Ionizációs

Tömegspektrometriának” neveztük el (REIMS: rapid evaporative ionization mass

spectrometry).

113

9. Abstract My PhD work was focused on the development of direct ionization methods, which

are capable of the analysis of biological samples with minimal or no sample preparation. As

biological specimens represent two, fundamentally different sample types (biological fluids

and tissue samples) my research was divided into two parallel sub-projects.

In case of biological fluids the objective was to enhance the sensitivity and

reproducibility of Desorption Electrospray Ionization (DESI)-based methods to the level of

practical applicability, while we intended to keep all the advantages of DESI regarding

simplicity and speed of analysis. The novel method is based on the on-line coupling of solid

phase extraction (SPE) technique with the atmospheric pressure desorption ionization mass

spectrometry. The last step of the solid phase extraction was modified in order to present a

perfectly accessible solid phase sample for DESI-MS analysis. Using this approach (termed

Solid Phase Extraction Enhanced Desorption Ionization: SPEEDI) sensitivities similar to

those of LC-MS/MS methods have been achieves, while the analysis still remained in the

2-8 s/sample range. My PhD work also included the design and construction of the sample

preparation equipment and consumables needed for the technique.

Analysis of intact tissue samples has been attempted by using various direct ionization

methods (or combination of them), however it was concluded soon, that introduction of a

novel approach is necessary to fully achieve our objectives. Already, at relatively early stage

of my PhD work, thermal tissue evaporation has emerged as a promising solution. Since

surgery widely employs these techniques in the form of electrosurgery and laser surgery, ion

formation during thermal evaporation was studied in details and it was concluded that the

method indeed yields considerable ion current consisting predominantly intact molecular ions

of complex lipids. The corresponding data was found to show high tissue-specificity, hence, a

rapid statistical analysis method was developed to fully utilize this feature. It was

demonstrated that (1) the overall method is fully compatible with approved surgical

equipment and (2) the data evaluation algorithm is capable of differentiating malignant

tumors from healthy tissue parts in real time, thus the method has real potential on the field of

intraoperative tissue identification.