LA REGULATION DU CYCLE CELLULAIRE

LES INHIBITEURS

EXEMPLE : les protéines codées par le locus ink4a/arf

par Anne di Tommaso et Dr Véronique Ladevèze

Ce cours est de niveau master (Bac+4/5),

Les diapositives sont soit des « informations textes », soit des figures.

Les figures sont expliquées précédemment dans les informations textes.

Les 36 diapositives permettent d’expliquer la transcription alternative, le rôle des 2 protéines obtenues à partir du locus ink4a/arf.

Les publications sont notées par ordre alphabétique dans la dernière diapositive et nous pouvons être contactées sans problème si il y a besoin par mel.

Régulation de l’expression génique chez les eucaryotes :

- de l’activation de la structure des gènes : gènes actifs déméthylés

- de l’initiation de la transcription : facteurs de transcription, séquences régulatrices (enhancers et silencers)

- de la maturation du transcrit :épissage

- du transport de l’ARN messager vers le cytoplasme

- de la traduction de l’ARN messager

La plus courante : la transcription

Introduction générale

Cas particulier : la transcription alternative

Cas unique chez les eucaryotes supérieurs : le locus ink4a/arf

1- présentation du locus

2- p16ink4a

3- ARF (p14arf ou p19arf)

4- autres intervenants

5- altération spécifique du locus ink4a/arf aboutissant à des tumeurs

6- conclusion

Le locus ink4a/arf comprend une organisation très rare dans un génome eucaryote. En effet, ce locus présente deux gènes chevauchants, ce qui permet l’expression de 2 protéines différentes.

Le premier produit découvert de ce gène a été p16ink4a. Cette protéine est codée par les exons 1, 2 et 3.

Puis en 1993 un produit alternatif est mis en évidence : ARF obtenu après fusion des exons 1 et 2. Les exons 1 et 1 sont exclusifs et chacun possède un promoteur spécifique.

Les deux messagers n’utilisent pas le même cadre de lecture et par conséquent les deux protéines ont des séquences totalement différentes (Quelle et al. 1995). Ces deux messagers sont obtenus par transcription alternative.

Structure génomique du locus ink4a/arf chez l'homme

Région chromosomale 9p21

Zhang et Xiong 1999arf : alternative reading frame

ATG

ATG

Exon 1 Exon 1 Exon 2

*

*

ARF

p16

Exon 3

E1E1ß E2 E3

AUG ***

P16

ARNm

AUG ***

ARF

ARNm

LES DIFFERENTS INTERVENANTS :

- cycline : protéine complexante, ainsi appelée parce que leur taux varie lors du cycle cellulaire,

- CDK : serine/threonine Kinase Dépendantes des Cyclines

- ink4 : inhibiteur des kinases de la famille des CDK4

- p53 : protéine ubiquitaire, transactivateur des gènes lors d’un stress cellulaire, ce qui induit par cascades, soit l’arrêt du cycle cellulaire, soit l’apoptose

- MDM2: mouse double mouse

- pRB : proteine rétinoblastome

- E2F : facteur d’initiation de la transcription

- p21: cible transcriptionnelle de p53, a un effet pro-apoptotique

9 differentes CDKs et 15 différentes cyclines

dans les cellules de mammifères,

- 3 cyclines de type D (D1, D2 et D3)

interagissent avec

CDK4 et CDK6

progression du cycle cellulaire : passage G1 à S

- cyclines A et B

interagissent avec CDK1

progression du cycle cellulaire : passage de G2 à M

La protéine p16

suppresseur de tumeurs

inhibe le cycle cellulaire

au niveau du point de contrôle G1 S

Ce transcrit n’est pas ubiquitaire.

p16ink4a possède quatre domaines Ankyrine, chacun composé de 32

résidus. Les ankyrines sont des protéines se liant à la spectrine au niveau de la

face cytoplasmique de la membrane des globules rouges. Elles possèdent des

motifs spécifiques à la fixation de protéines transmembranaires. Par analogie,

ces domaines jouent un rôle important au niveau de la liaison au complexe

cycline/CDK. En effet, de nombreuses mutations ont été décrites dans ces

domaines conduisant à une perte d’activité de p16ink4a.

p16ink4a est un gène suppresseur de tumeurs et un inhibiteur spécifique des

cyclines CDK4 et CDK6.

Ainsi, des mutations ponctuelles conduisent à une protéine incapable de

se lier aux CDKs.

la voie Rb

Il s’agit d’une protéine « pocket », c’est-à-dire qu’elle forme une poche

d’interaction qui permet la liaison à d’autres protéines. Ce type de protéine est

connu pour changer de configuration selon son état de phosphorylation.

La phosphorylation induit l’ouverture de la poche et la libération de la

protéine retenue.

pRb est l’un des substrats des kinases CDK4 et CDK6.

Le passage de la phase G1 à S est réalisé par la phosphorylation de pRb, elle-

même catalysée par le complexe cycline D – CDK4/6.

La protéine Rb est couplée à E2F (facteur de transcription) et, sous forme

phosphorylée, pRb n’a plus d’affinité pour E2F qui est ainsi libéré.

Ce facteur de transcription peut donc à son tour activer l’expression des

protéines nécessaires à la poursuite du cycle cellulaire. p16ink4a est capable de se

lier au complexe cycline D – CDK4/6, inhibant ainsi l’activité kinase des CDKs,

pRb restant déphosphorylée et liée à E2F.

Cette voie d’inhibition du cycle cellulaire est directe. En effet, des

expériences d’exclusion mutuelle de p16ink4a et pRb ont montré une absence du

contrôle du cycle dans les deux cas.

La régulation du transcrit n’est pas totalement élucidée.

D’une part, une relation directe entre l’hyperméthylation et

l’expression de p16ink4a existe. Ainsi, la méthylation du promoteur au

niveau des îlots CpG (Cytidine phosphate Guanosine) provoquerait une

condensation de la région.

D’autre part, pRB semble jouer un rôle de régulation de l’expression

de p16ink4a..

cycAcdc2

cdk2cycE

cycAcdk2

cdc2 cycB

M

G1

G2

S

cp

cp

p18INK4c

p15INK4b

p16INK4a

p19INK4d

p27kip1

p21cip1

p21cip1

cdk3

cdk2

cdk4

cdk6cycD

cycD

cycD

cycE

VOIE DE P16 via pRBVOIE DE P16 via pRB

E2F

PPP

P

Cdk4/6Cdk4/6 cycDcycD

P16

Gènes codants pour des protéines nécessaires à l’entrée en phase S

E2f

pRB

DNA

PPP

P

PPP

P

PPP

PPP

PP

PPP

PPP

PP

La protéine ARF

(p19arf chez la souris, p14arf chez l’homme)

suppresseur de tumeurs

inhibe le cycle cellulaire

au niveau du point de contrôle G2 M

Le transcrit est ubiquitaire et possède une séquence

totalement différente de p16ink4a , ce qui entraîne la disparition

des domaines ankyrines responsables de l’interaction avec le

complexe cycline/CDK.

Comme ARF est incapable de fixer les CDKs, une autre

voie d’action doit être envisagée.

Domaines responsables de la localisationnucléolaire de ARF chez l'homme

Exon 1β Exon 2 1 132

1MVRRFLVTLRIRR 13 80

PRRGAQLRRPRHSHPTRARRCP 101

d'après Rizos et al. (2000)

Interaction physique entre MDM2 et p53

Mdm2 (hMDM2 chez l’homme) est un proto-oncogène découvert dans

une lignée cellulaire murine spontanément transformée. Cette protéine

nucléaire possède un domaine N-terminal essentiel pour la liaison avec le N-

terminal de p53, et une domaine SLNo (correspondant à un signal

nucléolaire) côté C-terminal

La fixation de MDM2 occulte le site de transactivation de p53 et inhibe

ainsi son action. De ce fait, MDM2 est un régulateur négatif de l’activité

transcriptionnelle de p53

MDM2 induit la dégradation de p53. En effet, le complexe binaire

formé est exporté du noyau vers le cytoplasme, où p53 est dégradée

MDM2P53

MDM2

P53

Inhibition du cycle cellulaire

NOYAU CYTOPLASME

ARF

ARF

MDM2

MDM2

MDM2P53ARF

Inhibition du cycle cellulaire ?

nucléole

MDM2P53

MDM2P53

MDM2P53

MDM2P53

MDM2P53

MDM2P53

MDM2P53

MDM2P53

MDM2P53

MDM2P53

MDM2P53

MDM2P53

MDM2P53

Protéasome

Le protéasome :

complexe multiprotéique, constitué de protéases

forme cylindrique

détruit protéine lorsqu’elle est liée à l’ubiquitine

p53 peut être activée par deux voies dans la cellule : l’une est

dépendante d’un mécanisme de phosphorylation, l’autre implique

directement l’action de ARF .

ARF est activée par des oncogènes comme myc ou ras

Le complexe MDM2/p53 phosphorylé est le meilleur substrat pour

ARF . Une fois le complexe ternaire formé, ce dernier reste localisé dans le

noyau et p53 est stabilisée. Ceci montre l’importance du locus ink4a puisque

lors d’une délétion de ce locus, la cellule est alors incapable de réagir lors de

l’activation d’un oncogène

p53 contrôle négativement ARF . Cette double boucle de contrôle

(MDM2-p53 d’un côté, p53-ARF de l’autre) permet le contrôle des trois

partenaires du complexe ternaire

- MDM2 peut se lier à deux autres molécules qui sont directement impliquées dans le contrôle de la croissance cellulaire via p16ink4a/pRb : pRb et E2F-1 (E2F-1 fait partie de la famille des facteurs de transcription E2F). MDM2 est capable d’activer ce facteur soit directement, soit en se complexant à pRb pour libérer alors E2F-1. E2F-1 est capable d’induire l’apoptose en mettant en jeu des voies dépendantes ou indépendantes de p53.

- l’une des activations de p19arf est dépendante de l’activité de ce facteur de transcription. De plus, l’activation par E2F-1 accroit la stabilité de p19ARF dans la cellule. Dans le cas d’une dérégulation de la voie p16ink4a/pRb (voie habituelle d’E2F), E2F-1 peut activer la voie p19ARF/p53 et ainsi induire l’apoptose.

E2F-1 intervient aussi bien dans la première que dans la seconde voie.

Les protéines codées par le locus ink4a/arf régulent les anti-oncogènes pRb et p53

ADN

ink4a

Mdm2-

Mdm2

ARF

Ubiquitine ligase

inhibée

p53Pi

Activation de p53

Transcription alternative

ARF

p16ink4a

Cdk4Cdk6

- -

Arrêt en G1

pRb

Pi

Inhibition de l’inactivation de

pRb

Arrêt en G2

P16 CDK6/4CYCD

RB E2F

ARF MDM2 P53

LES ACTIONS DE P16 ET ARFLES ACTIONS DE P16 ET ARF NE SONT PAS INDEPENDANTESNE SONT PAS INDEPENDANTES

Autres intervenants

Topoisomérase1 : ARF s’associe à la topoisomérase et stimule son activité. Localisation du complexe dans les granules.

Pex19p : interaction de Pex19p avec ARF engendrant la relocalisation de ARF dans le cytoplasme.

Spinophiline : interaction avec ARF, nouvelle voie dans la régulation du cycle cellulaire.

HIF-1α

Autres intervenants possibles ?

p14arf

• Sequestre HDM2 dans le nucléole

• Rôle Navette HDM2 disparaît

• P53 non dégradé

• Cycle cellulaire inhibé

• Stabilise HDM2-SUMO-1 (small ubiquitine modifier)

• HDM2 non dégradé par protéasome

• Complexe binaire active dégradation de p53

• Cycle cellulaire activé

ARF et SUMO-1 : Xirodimas et al. (2002)

ALTERATIONS SPECIFIQUES DU LOCUS ink4a/arf aboutissant à des tumeurs

- la région chromosomique 9p21 est connue depuis une dizaine d’années comme cible touchée dans des cellules tumorales

- de nombreuses altérations sont associées à des familles de mélanomes (mutations faux-sens, non sens)

Changement AA modifié Familles p16

de nucléotide

g>c -33 in 5 ’UTR 2

ins24bp add8AA 4

delC W15+9AA 1

TGG>TAG W15ter 1

CTG>CCG L16P 1

ins6bp Add T19A20 1

GGT>GAT G23D 1

CGG>CCG R24P 4

delG R29>22AA 1

CTG>CCG L32P 1

GGG>GCG G35A 2

CCG>CTG P48L 1 Liste non exhaustive

.....

Changement AA modifié Familles ARF

de nucléotide

ATG>ATC M531 7

AGC>ATC S561 1

del58 G55 to +1 70AA 1

GCC>GTC A57V 1

CCGA>TTGA R58ter 1

GTG>GGG V59G 1

CTG>CCG L62P 1

GCG>TTG A68L 1

AAC>AGC N71S 1

AAC>AAA N71K 1

del 19 bp A73 to +1 65AA Founder

del 14bp R80 to C100 ARF 3 Liste non exhaustive

.....

INCIDENCE DES DELETIONS ET MUTATIONS HOMOZYGOTES DU LOCUS ink4a/arf

dans des cancers primaires

Exemple les plus caractéristiques

Type de cancer Del % Mut %

A- Tumeurs liquides

T-all 216/373 57.9 9/128 7

B- Tumeurs solides

pancréas 26/126 20.6 35/128 27.3

CONCLUSIONS

IMPORTANCE DU LOCUS ink4a/arf

dans la régulation du cycle cellulaire

et donc dans

les mécanismes de cancérisation

LABORATOIRE DE GENETIQUE CELLULAIRE ET MOLECULAIRE

CHU de Poitiers, Université de Poitiers,

TEL : 33 5 49 45 49 77

FAX : 33 5 49 45 49 72

Email : veronique.ladeveze@univ-poitiers.fr

Email : anne.di_tommaso@club-internet.fr

BIBLIOGRAPHIE

1. Bates S, Phillips AC, Clark PA, Stott F, Peters G, Ludwig RL, Vousden KH. (1998). p14ARF links the tumour suppressors RB and p53. Nature. 10, 395 :124-5. 

2.     Di Tommaso A, Soler C, Roos C, Kitzis A. and Ladeveze V, The ink4a/arf locus evolution in primates : characterization of three ARF sequences. En révision. 

3.     Eymin B, Karayan L, Séité P, Brambilla C, Brambilla E, Larsen C.J, Garrezi S. (2001) Human ARF binds E2F1 and inhibits its transcriptional activity. Oncogene. 20 : 1033-1041.  

4.     Fatyol K, Szalay AA. (2001) The p14ARF tumor suppressor protein facilitates nucleolar sequestration of hypoxia-inducible factor-1alpha (HIF-1alpha ) and inhibits HIF-1-mediated transcription. J Biol Chem 276:28421-9 

5.    Kamijo T, Zindy F, Roussel MF, Quelle DE, Downing JR, Ashmun RA, Grosveld G, Sherr CJ. (1997). Tumor suppression at the mouse Ink4a locus mediated by the alternative reading frame product p19ARF. Cell. 91 : 649-659. 

6.     Kamijo T, Weber JD, Zambetti G, Zindy F, Roussel MF, Sherr CJ (1998). Functional and physical interactions of the ARF tumor suppressor with p53 and Mdm2. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95 : 8292-8297. 

7.     Karayan L, Riou J.F, Séité P, Migeon J, Cantereau A, Larsen C.J.(2001) Human ARF protein interacts with Topoisomerase I and stimulates its activity. Oncogene. 20 : 836-848.

Korgaonkar C., Zhao L., Modestou M., Quelle DE. (2002) ARF Function does not require p53 stabilization or Mdm2 relocalization. Molecular and Cellular Biology 22 : 196-206 

9.     Lohrum MA, Ashcroft M, Kubbutat MH, Vousden KH. (2000) Contribution of two independent MDM2-binding domains in p14(ARF) to p53 stabilization. Curr Biol. 4, 10 (9) : 539-542. 

10.   Palmero I, Pantoja C, Serrano M. (1998). p19ARF links the tumour suppressor p53 to Ras. Nature. 395 : 125-126. 

11.  Pomerantz J, Schreiber-Argus N, Liegeois NJ, Silverman A, Alland L, Chin L, Potes J, Chen K, Orlow I, Lee HW, Cordon-Cardo C, DePinho RA. (1998) The Ink4a tumor suppressor gene product, p19 Arf, interacts with MDM2 and neutralizes MDM2’s inhibition of p53. Cell. 92  : 713-723. 

12.   Prives C. (1998). Signaling to p53 : breaking the MDM2-p53 circuit. Cell. 95 : 5-8.  

13.   Quelle DE, Zindy F, Ashmun RA, Sherr CJ. (1995). Alternative reading frames of the INK4a tumor suppressor gene encode two unrelated proteins capable of inducing cell cycle arrest. Cell. 83 : 993-1000. 

14.   Rizos H, Darmanian AP, Mann GJ, Kefford RF. (2000) Two arginine rich domains in the p14ARF tumour suppressor mediate nucleolar localization. Oncogene 19: 2978-2985. 

15.   Rubin E, Tamrakar S, Ludlow JW. (1998) Protein phosphhatase type 1, the product of the retinoblastoma susceptibility gene, and cell cycle control. Front Biosci. 3 : D1209-1219. 

16.   Stott FJ, Bates S, James MC, McConnel BB, StaRborg M, Brookes S, Palmero I, Ryan K, Hara E, Vousden KH, Peters G. (1998). The alternative product from the human CDKN2A locus, p14(ARF), participates in a regulatory feedback loop with p53 and MDM2. EMBO J. 17 : 5001-5014 

17.   Sugihara T, Kauls SC, Kato JY, Reddel RR, Nomura H, Wadhwa R. (2001) Pex19p Dampens the p19ARF-p53-p21WAF1 Tumor Suppressor Pathway. J. Biol. Chem. 276 : 18649-18652.

18.   Tao W et Levine AJ. (1999). P19(ARF) stabilizes p53 by blocking nucleo-cytoplasmic shuttling of Mdm2. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96 : 6937-6941. 

19.   Vivo M, Calogero RA, Sansone F, Calabro V, Parsisi T, Borrelli L, Saviozzi S, La Mantia G. (2001) The Human tumor suppressor arf interacts with spinophilin/neurabin II, a type 1 protein-phosphatase-binding protein. J. Biol. Chem. 276 : 14161-14169.  

20.   Zhang Y., Xiong Y. et Yarbrought W.G. (1998). ARF promotes MDM2 degradation and stabilizes p53: ARF-INK4a locus deletion impairs both the Rb and p53 tumor suppression pathways Cell. 92 :725-734.