LabLoeffler Ausgabe 10/2015 - openagrar.de · Workshop „Molekulare Infektionsdiagnostik in der Veterinärmedizin“ erfolgreich durchgeführt Seiten 26-29 Nationale Referenzlaboratorien

DER LABLOEFFLERNEWS für das LABORDER LABLOEFFLERNEWS für das LABOR

Heft 1 2015, Nr. 10

LABLOEFFLER 10.2015, Heft 1 Seite 2

Impressum

Herausgeber: Friedrich-Loe� er-Institut, Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit

Redaktion: Prof. Dr. Martin Beer, Elke Reinking, Wolfram Maginot

Anschrift der Redaktion: Friedrich-Loe� er-Institut, Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit, Südufer 10, 17493 Greifswald – Insel Riems,elke.reinking@fl i.bund.de

Gestaltung und Layout: Wolfram Maginot

Fotos: Friedrich-Loe� er-Institut, soweit nicht anders vermerkt:Seite 18 Abb.1a : Elektronenmikroskopische Aufnahme Trypanosoma (equiperdum)Prof. Dr. Elisabeth M. Liebler-Tenorio

Deckblatt und Rückseite: Trypanosoma (equiperdum)Prof. Dr. Elisabeth M. Liebler-Tenorio

Druck: Wicher Druck, Gera, www.wicher-druck.de

LABLOEFFLER Nr. 10, Ausgabe 1/2015ISSN 2190-7153

Juni 2015


I n h a l tSeite 2Vorwort, Impressum

Seite 3Inhaltsverzeichnis

Seiten 4-6Zum Auftreten von RHDV-2 in Deutschland – aktuelle Her-ausforderungen in der Diagnostik und Bekämpfung

Seite 7Tritt bovine Besnoitiose in Deutschland häufiger auf als bislang angenommen?

Seiten 8-9 Porzine epidemische Diarrhoe – aktuelle Situation und Diagnostik

Seiten 10-12Ergebnisse eines Ringversuchs zur Diagnostik der Aujeszkyschen Krankheit

Seiten 12-13Rotz – Epidemiologie und Diagnostik

Seiten 14-17Auswertung des nationalen Ringtests zur Diagnostik von viralen Fischseuchen-Erregern

Seite 177. Riemser Diagnostiktage am 26. und 27. November 2015 in Greifswald

Seiten 18-21Laborvergleichsuntersuchung zur serologischen Diagnostik der Beschälseuche 2015

Seiten 22-23Next-Generation Sequencing und Metagenomanalyse - Potential für die Diagnostik

Seite 24KSP-Markerimpfstoff „CP7_E2alf“ nach über 10 Jahren Entwicklungsarbeit zugelassen

Seite 25Workshop „Molekulare Infektionsdiagnostik in der Veterinärmedizin“ erfolgreich durchgeführt

Seiten 26-29Nationale Referenzlaboratorien

Seite 30Zulassungsstelle

Seite 31Redaktionsteam

Liebe Kolleginnen und Kollegen,

es ist endlich gescha� t. Nach vielen Forschungs- und Validierungsarbeiten und intensiven Diskus-sionen mit der euro-päischen Arzneimittel-behörde hat diese nun ein positives Votum zur Zulassung des neuen Marke r - L ebend impf -sto� s CP7-E2alf gegen die klassische Schweinepest abgegeben. Dies kann zu einem Meilenstein in der KSP-Be-kämpfung werden und, durch das verwendete DIVA-Prinzip in Verbindung mit dem Erns- ELISA, die im Seuchenfall notwendigen Tötungen drastisch reduzieren. Trotz vielem Neuen sollte man aber auch das Alte nicht aus den Augen verlieren! So fi nden Sie im vorliegenden „LABLOEFFLER“ Nr. 10 mit Rotz und Besnoitiose Themen, die schon lange nicht mehr präsent waren. Wir informieren aber auch über den aktuellen Stand zur porzinen epidemischen Diarrhoe und zur Verbreitung des Typs 2 des Erregers der RHD in Deutschland. Diese Infektionskrankheiten sind in der Ö� entlichkeit zwar nicht so bekannt wie Gefl ügel- oder Schweinepest, für die Veterinäruntersuchungsämter und uns am FLI aber ebenso bedeutsam. Die Berichte von drei Ringversuchen belegen die gute Qualität der Veterinärdiagnostik in den Untersuchungs-einrichtungen der Bundesländer und die e� ziente Zusam-menarbeit mit den nationalen Referenzlaboratorien am FLI, was mich besonders freut.Ich wünsche Ihnen eine interessante Lektüre des vorlie-genden „LABLOEFFLERS“.

Mit kollegialen Grüßen

Prof. Dr. Dr. h. c. Thomas C. Mettenleiter


Abb. 1 : Diagnostizierte RHDV-2 Fälle in Deutschland bei Haus- und Wildkaninchen sowie Feldhasen


Tab. 1 : Verfügbarkeit und E�zienz von Methoden für den RHDV-Nachweis

Tab. 2 : Primer und Sonden für den Nachweis von RHDV, RHDV-2 und EBHSV

Tab. 3 : Klinische Daten nach Challenge von immunisierten (OV und RV) Tieren sowie Kontrolltieren

Zum Auftreten von RHDV-2 in Deutschland – aktuelle Herausforderungen in derDiagnostik und Bekämpfung

Horst Schirrmeier

Friedrich-Loe�er-Institut (FLI) Institut für Virusdiagnostik, Greifswald – Insel Riems

Die durch ein Calicivirus verursachte Rabbit Haemorrhagic Disease (RHD) wurde erstmals 1984 in China bei zuvor aus Deutschland importierten Kaninchen festgestellt. In Deutschland seit 1988 bekannt, ist sie heute nahezu weltweit verbreitet. In Australien (1995) und Neuseeland (1997) wurde das Virus nach unbeabsichtigter bzw. illegaler Freisetzung durch Farmer zur Eindämmung der Wildkanin-chenplage eingesetzt. Während bis Ende der 90er Jahre die RHDV relativ einheitlich waren, fanden wir danach eine als RHDVa bezeichnete Virusvariante, die erstmals 1996 zeitgleich in Italien und Deutschland nachgewiesen wurde (Capucci et al.,1998, Schirrmeier et al., 1999) und in Europa in den Folgejahren die klassischen Stämme weitgehend verdrängte. Ein apathogenes Calicivirus (RCV) wurde 1996 in Italien nachgewiesen (Capucci et al., 1996), weitere apatho-gene, als RHDV-like, RCV-like oder auch non-pathogenic lagovirus (NP-LV) bezeichneten Stämme sind beschrieben, so das „Ashington“ Virus in UK (Moss et al., 2002) das „Lamby“ Virus in Irland (Forrester et al., 2007), „RRCV-A1“ in Austra-lien (Strive et al., 2009) und „MRCV“ in den USA (Bergin et al., 2009). Durch sie induzierte Antikörper waren protektiv gegenüber RHDV. Bei einem vor zwei Jahren in Frankreich festgestellten weiteren apathogenen Virus („France 06-11“) gab es diesen Kreuzschutz nicht mehr (LeGall-Recule, et al., 2011a).

Auftreten von RHDV-2Im Oktober 2010 wurden im Nordwesten Frankreichs vermehrt RHD-Fälle diagnostiziert, die sowohl Wildkanin-chen als auch ungeimpfte und geimpfte Hauskaninchen betrafen (LeGall-Recule, et al., 2011b, 2013). Als Erreger wurde eine neue, sowohl von den RHDV als auch von den RHDVa und apathogenen Lagoviren abgrenzbare, als RHDV-2 bezeichnete Calicivirusvariante festgestellt. Die Homologie des RHDV-2 zu anderen RHDV beträgt zwischen 80 und 85 % auf Nukleotidebene. Als charakteristisch wurden ein protra-hierter Krankheitsverlauf, eine vergleichsweise niedrige Mortalität, die Empfänglichkeit auch sehr junger Tiere (~4 Wochen) und der fehlende oder stark eingeschränkte Schutz nach Impfung herausgestellt. Ein Jahr später wurde ein nahezu identisches Virus in der Provinz Navarra in Spanien nachgewiesen, das bis Januar 2013 in insgesamt 78 Kaninchenhaltungen von 23 spanischen Provinzen sowie in Portugal zu Ausbrüchen führte (Dalton et al., 2012, Lopez et al., 2015). Das Virus wurde als RHDVb bezeichnet, RHDV-2 und RHDVb werden derzeit synonym verwendet. In Italien gibt es seit 2012 RHDV-2-Feststellungen, allerdings ist, im Gegensatz zu Fankreich, keine landesweite Verbreitung und

Verdrängung des bisherigen RHDV zu verzeichnen (Capucci, pers. Mitteilung). Nachweise der neuen Virusvariante gibt es auch von den britischen Inseln (Westcott; 2014) und von den Azoren (Duarte 2015). Bestimmte Feldhasenspe-zies, die normalerweise gegenüber RHDV refraktär sind, erwiesen sich als empfänglich für RHDV-2 (Puggioni, et al., 2013; Carmada et al., 2014). In Deutschland wurde RHDV-2 erstmals im Juni 2013 in einem Kaninchenbestand im Kreis Unna, Nordrhein-Westfalen, nachgewiesen. Der Bestand war 6 Wochen zuvor gegen RHD geimpft worden. Etwa 50 % der Tiere mit Erstimpfung verendeten an der Erkran-kung, während Alttiere, die teilweise bereits mehrfach vakziniert worden waren nicht erkrankten bzw. Rekonvales-zenz zeigten. Außerdem verendeten 25 zwischen 4 und 11 Wochen alte ungeimpfte Jungtiere. Ab März 2014 wurden weitere Ausbrüche diagnostiziert, inzwischen sind mehr als 40 Fälle bei Haus- und Wildkaninchen registriert und es gibt zwei Fälle bei Feldhasen (Totfunde) aus Rheinland-Pfalz. Insgesamt sind 10 Bundesländer betro�en (Abb. 1). Da die diagnostische Dichte bei auftretenden Kaninchenverlusten in Deutschland relativ gering ist und die Di�erenzierung der Virusvarianten bisher ausschließlich am FLI durchgeführt wurde, ist jedoch von einer beträchtlich höheren Zahl von Ausbrüchen auszugehen. Aus an uns eingesandten Proben aus Dänemark konnten wir ebenfalls RHDV-2 nachweisen.

DiagnostikPrinzipiell gestaltet sich die Diagnostik des RHDV-2 wie bei den „klassischen“ RHDV, d.h. Hämagglutinationstest, Elektronenmikroskopie und Antigen-ELISA sind einsetzbar, erlauben jedoch keine Di�erenzierung zwischen RHDV und RHDV-2. Die Immunfluores-zenz mit einem marktverfügbaren FITC-Konjugat zeigt dagegen lediglich eine geringe Reaktivität (Tab. 1). Die als Referenzmethode nach OIE-Manual geltende Real-Time PCR nach Gall et al. (2007) detektiert das RHDV-2 überhaupt nicht, ebenso nicht die gelbasierte RT-PCR aus der AVID-Me-thodensammlung. Daher wurde ein neues RHDV-2 spezifisches Protokoll entwickelt. Durch die Empfänglich-keit von Feldhasen war eine Erweite-rung der Di�erentialdiagnostik bei Calicivirusinfektionen bei Leporiden generell angezeigt. Daher wurde eine Real-Time RT-PCR für den spezifischen Nachweis von EBHSV-Genom etabliert. Primer und Sondendesign sind der nachstehenden Tab. 2 zu entnehmen, das komplette Protokoll ist in der AVID-Methodensammlung nachlesbar:

http://avid.dvg.net/fileadmin/Bilder/PDF_AVID_Alt/website/Methodenkan-d i d a t e n / A V I D - M K - V I R 0 1 _RHD-EBHS_V_2014_11.pdf

Molekulare EpidemiologieVon allen festgestellten RDDV-2 wurde ein 592 bp langer Genomabschnitt aus dem Bereich der hypervariablen Region E des Kapsidproteins VP60 sequen-ziert und mittels MEGA 5 Programm analysiert. Von einigen Stämmen liegen auch Gesamtgenome vor. Das in Deutschland vorkommende Virus ist nicht einheitlich, die Variabilität auf Nukleotid-, wie Aminosäureebene liegt bei ca 3 %. Allerdings konnten wir in der Umgebung des ersten Ausbruches über einen Zeitraum von fast zwei Jahren Viren feststellen, die eine 100 %ige Identität aufwiesen, was eher gegen eine schnelle Veränderung spricht und einen mehrfachen Eintrag unterschiedlicher RHDV-2 nach Deutschland vermuten lässt. In einigen Fällen ließen sich aufgrund der Sequenzdaten Übertragungswege zwischen Wild- und Hauskaninchen sowie zwischen Kaninchenbeständen nachvollziehen.

Forward Primer Reverse Primer Sonde

RHDV(Gall et al. 2007)

5`-ACY TGA CTG AAC TYA TTG ACG-3`

5`- TCA GAC ATA AGA AAA GCC ATT GG-3`

5`- FAM-CCA ARA GCA CRC TCG TGT TCA ACC T-TAMRA

RHDV-2(unpublished)

5’–ACT TGT CAG AAC TTG TTG ACA-3’

5’-TCA GAC ATA AGA AAA GCC ATT AG-3’

5’-FAM-CCA CAA GCA CGC TTG TGT ACA ACT TG-BHQ1-3‘

EBHSV(unpublished)

5’-ACA GAY CTC ATT GAC GTK CG-3’

5’ CAG ACA TAG GAR TAY CCR GTG -3’

5’-FAM ACA CTC GTG TTC AAC CTT RCC GGA GT-BHQ1-3’


Abb. 2 : Leber eines nach experimenteller RHDV-2 Infektion ver-endeten Kaninchens . Die Leber ist aufgehellt, die Läppchenzeich-nung prominent und die Konsistenz brüchig (« wie gekocht »)


Die Mortalität ist zwar gering, jedoch lassen sich stark befallene Tiere aufgrund ihres schlechten Gesundheitszu-stands nur schlecht vermarkten. Die Haut befallener Tiere weist nur noch einen geringen Wert auf. Bullen, die mit dem Erreger infiziert sind, können zeitweilig oder auch dauerhaft infertil werden.

Besnoitia besnoiti kann durch blutsaugende Insekten, wie zum Beispiel Bremsen und Stechfliegen, übertragen werden. Dies ist der einzige bislang gesicherte Übertragungsweg. Der Endwirt des Parasiten ist nicht bekannt. Endwirte sind Tierarten, welche die umweltresistenten Dauerstadien des Parasiten im Kot ausscheiden. Feliden werden als mögliche Endwirte von Besnoitia besnoiti diskutiert; experimentelle Untersuchungen konnten ihre Rolle als Endwirte aber bisher nicht bestätigen.

Der klinische Verdacht einer Besnoitiose kann durch die histologische Untersuchung von Hautbiopsien und den Einsatz spezifischer DNA-Nachweisverfahren bestätigt werden. Nach dem Ende der akuten Phase ist ein sicherer Nachweis spezifischer Antikörper in einer Reihe serologischer Tests möglich. Serologische Tests können auch genutzt werden, um die Freiheit von Rindern von Besnoitiose vor dem Erwerb bzw. der Eingliederung in eine Herde zu prüfen (http://www.bundestieraerztekammer.de/downloads/dtbl/2010/artikel/dtb_04_s_482-491_besno.pdf) .

Falls weitere Fälle boviner Besnoitiosen bekannt werden, wäre die Einbeziehung des Friedrich-Loe�er-Insti-tuts wünschenswert, um diese Fälle epidemiologisch aufzuarbeiten und wirksame Maßnahmen zur Sanierung der Herden zu entwickeln.

Literatur beim Verfasser

Tritt bovine Besnoitiose in Deutschland häufiger auf als bislang angenommen?

Gereon Schares, Jens Peter Teifke, Franz J. Conraths

Friedrich-Loe�er-Institut (FLI), Institut für Epidemiologie, Abteilung für experi-mentelle Tierhaltung und Biosicherheit, Greifswald – Insel Riems

Im Jahr 2008 wurde ein erster Ausbruch boviner Besnoitiose in Deutschland diagnostiziert. Nachdem es längere Zeit keine Hinweise auf neue Infektionen mit Besnoitia besnoiti gab, wurden im laufenden Jahr weitere Fälle akuter und chronischer boviner Besnoitiose in wertvollen Fleischrin-derherden beobachtet und vom FLI bestätigt. Derzeit wird untersucht, auf welchem Wege der Erreger in die neu betro�enen Herden gelangt sein könnte, ob Verbindungen zur Ausbruchsherde aus dem Jahre 2008 bestanden oder ob Zukäufe aus Ländern mit endemischer Besnoitiose die neuen Fälle verursacht haben. Da sich die bovine Besnoitiose in Europa weiter ausbreitet (http://www.efsa.europa.eu), ist zu befürchten, dass sich die Infektion in Deutschland bereits etabliert hat und häufiger vorkommt als bislang angenommen.

Die bovine Besnoitiose ist eine protozoäre Erkrankung, die durch Besnoitia besnoiti hervorgerufen wird. Akut infizierte Tiere zeigen Fieber und oft schmerzhafte, entzündlich-öde-matöse Schwellungen, auch im Unterbauchbereich und an den Beinen. Ursache hierfür ist die Vermehrung der Protozoen in Gefäßendothelien. Weiterhin können bei den Tieren geschwollene Lymphknoten, reduzierte Fresslust, Lichtscheu-heit, Nasenausfluss, Durchfall, Lahmheit und Symptome einer Hodenentzündung beobachtet werden. Die akute Phase kann mehrere Tage andauern und geht in eine subklinische Phase über. In der chronischen Phase kommt es nach Befall von Bindegewebszellen zur Bildung zahlreicher Gewebezysten, beispielsweise in der Haut, aber auch in der Unterhaut, in Blutgefäßwänden, in Faszien und Sehnenscheiden. Die ca. 0,1 mm großen Zysten sind von einer sekundären Zystenwand aus Bindegewebe umgeben und daher häufig makroskopisch als kleine weißliche Erhebungen sichtbar, wie zum Beispiel in den Schleimhäuten der Nase (Abb. 1), in Sehnenscheiden (Abb. 1B), in den skleralen Konjunktiven oder in der Schleimhaut des Vestibulum vaginae (http://www.bundestieraerzte-kammer.de/downloads/dtbl/2010/artikel/dtb_04_s_482-491_besno.pdf ). Zu den verschiedenen Phasen der Infektion sowie labordiagnostischen und pathologisch-histologischen Veränderungen liegen aktuelle Berichte aus Deutschland vor (http://www.biomedcentral.com/1746-6148/11/32; http://www.biomedcentral.com/1746-6148/11/35 ).

Ist die Haut chronisch infizierter Tiere stark von Gewebezysten befallen, kann dies zu Sklerodermie, Hyperkeratose und Alopezie führen. Histologisch findet sich eine unterschied-lich stark ausgeprägte eosinophile und lymphoplasmazel-luläre Dermatitis (Abb. 1C). In betro�enen Herden kann die Besnoitiose erhebliche wirtschaftliche Schäden verursachen.

Abb. 1: Zwei Gewebezysten von Besnoitia besnoiti im Quet-schpräparat der Nasenschleimhaut eines infizierten Rindes (A). Makroskopisch sichtbare Gewebezysten von Besnoitia besnoiti in der Sehnenscheide eines Rindes (B). Massiver Befall der Haut mit Gewebezysten von Besnoitia besnoiti (C). Weitere Bilder finden sich bei Gollnick et al. (Besnoitia besnoiti auf der Spur – Ein Diagnostikleitfaden. Deutsches Tierärzteblatt 4/2010, http://www.bundestieraerztekammer.de/downloads/dtbl/2010/artikel/dtb_04_s_482-491_besno.pdf ).

ÜbertragungsversuchNach der Erstfeststellung wurden zur Ermittlung biologischer Parameter zwei Kaninchen mit dem Stamm « WE 2013 « oronasal infiziert. Die Tiere verendeten nach 36 bzw 40 Stunden perakut, eine Fieberphase war wegen des rasanten Verlaufes nicht feststellbar, das Sektionsbild entsprach dem für RHD bekannten (Abb. 2). Die Untersuchung von Leberma-terial mit den di�erenzierenden RT-PCR-Protokollen verlief

mit der RT-PCR nach Gall negativ, mit dem neu etablierten spezifischen RHDV-2 Protokoll wurden hohe Genomlasten (ct 10) festgestellt. Die aus Frankreich mitgeteilten Informa-tionen über einen milderen und protrahierten Verlauf mit geringerer Mortalität konnten wir in diesem wie auch in weiteren Versuchen nicht bestätigen. Vermutlich handelte es sich dabei teilweise um geimpfte Tiere, die zu einer Reduzierung der Bestandsmortalität führen, wobei aber ungeimpfte Einzeltiere akut und perakut verenden. Diese Beobachtungen gibt es auch bei Ausbruchsbeständen in Deutschland.

Untersuchungen zum KreuzschutzDa die Mehrzahl der uns erreichten Einsendungen von geimpften Tieren stammen, teilweise im Rahmen des Verfolgs von Pharmakovigilanzmeldungen, wurde ein erster orientierender Versuch zum protektiven Wert von zwei unterschiedlichen Impfsto�en durchgeführt. Dazu wurden jeweils vier Kaninchen mit einem auf Leberhomogenaten basierenden konventionellen (OV) und einem rekombi-nanten (RV) Impfsto� nach Herstellerangeben immunisiert und nach 5 Wochen mit dem Stamm « WE2013 » testin-fiziert. Alle geimpften Tiere zeigten eine Serokonversion, gemessen in einem indirekten ELISA gegen den RHDV Stamm « Eisenhüttenstadt ». Ein ELISA unter Verwendung eines gereinigten RHDV-2 Antigens zeigte erwartungsgemäß deutlich niedrigere Werte an. Nach Challenge verendeten sowohl die vier ungeimpften Kontrolltiere als auch die mit RV geimpften Kaninchen am 2. Tag nach der Infektion an RHD. Drei der vier OV geimpften Tiere zeigten Fieber über

einen Zeitraum von bis zu drei Tagen und Anorrhexie, eines verendete am 4. Tag p.i. nach scheinbarer Genesung (Tab. 3). Wegen der geringen Tierzahlen sind die Ergebnisse allerdings nicht repräsentativ, deuten aber unterschied-liche Wirksamkeiten der sich auf dem Markt befindlichen Impfsto�e an. Inzwischen wurde für zumindestens einen der zugelassenen Impfsto�e gezeigt, dass eine zweimalige Impfung eine deutlich bessere Protektion vermittelt, was mit den Beobachtungen aus dem Feld über den Schutz älterer, bereits mehrfach geimpfter Tiere übereinstimmt.

ZusammenfassungSeit dem Erstnachweis der RHD in Deutschland im Jahre 1988 in einem Bestand bei Potsdam wurden am FLI mit wechselnder Intensität Arbeiten zum Erreger und zur Erkrankung durchgeführt. Das umfasste das Anpassen des diagnostischen know hows an die jeweiligen epidemio-logischen Gegebenheiten, die morphologische, phänoty-pische und molekulare Charakterisierung des Erregers, die Impfsto�entwicklung, die Bereitstellung von monoklonalen Antikörpern für Diagnostik und Erregercharakterisierung sowie Forschungsarbeiten zur Etablierung von rekombi-nanten Systemen für die Expression des Hauptstruktur-proteins VP60 des RHDV. Mit den ersten Informationen über das Auftreten einer neuen RHDV-Variante wurden Arbeiten zur Anpassung der Diagnostik vorgenommen, wobei wir uns in der frühen Phase auf die Hilfe und Unterstützung der französischen Arbeitsgruppe um Gislaine LeGall-Recule, später auch spanischer und italienischer Kollegen stützen konnten. Im Ergebnis konnten zeitnah eine funktionelle Diagnostik etabliert und preliminäre Daten zur Wirksamkeit von Impfsto�en erhalten werden. Dadurch waren wir in der Lage, unterstützend und aufklärend bei Kaninchenhaltern, Tierärzten und diagnostischen Einrichtungen zu wirken. Gleichzeitig zeigt die Geschichte der RHD beispielhaft, wie Viren, die auf Grund ihres enorm hohen Virulenzpotenzials der Gefahr der « Selbstausrottung » ausgesetzt sind, es verstehen, sich dieser immer wieder durch Veränderung und Anpassung zu entziehen.

Literatur beim Verfasser


Porzine epidemische Diarrhoe – aktuelle Situation und Diagnostik

Sandra Blome und Anne Pohlmann

Friedrich-Loe�er-Institut (FLI), Institut für Virusdiagnostik, Greifs-wald – Insel Riems

Die epizootische Virusdiarrhoe des Schweins (engl. porcine epidemic diarrhea; PED) ist eine hochansteckende Coron-avirusinfektion. Sie geht mit einer schweren Darmentzün-dung, wässrigem Durchfall, Erbrechen und Dehydrierung einher. Während alle Altersklassen von Schweinen erkranken können, sinkt die Sterblichkeit mit zunehmendem Alter. Bei Saugferkeln kann die Infektion mit dem Virus der PED (PEDV) zu sehr hohen Verlusten (bis zu 100 % in den ersten Lebens-wochen) führen. Die Erkrankung ähnelt damit der transmis-siblen Gastroenteritis des Schweins (TGE), die eine wichtige Di�erentialdiagnose darstellt und ebenfalls durch ein Co-ronavirus hervorgerufen wird (TGEV). Während die TGE der Meldepflicht unterliegt, gibt es für die PED keine Auflagen.

Zur Situation Die PED trat erstmals 1971 in Europa auf, verbreitete sich rasch und verursachte in den darau�olgenden Jahren große Verluste, insbesondere in Asien. Während nur wenige euro-päische Länder dauerhaft Erkrankungsfälle verzeichneten, war die PED ein konstantes Problem in asiatischen Ländern. Seit 2010 wurde dort von hoch-virulenten Stämmen be-richtet, die mit besonders hohen Verlustraten einhergingen. Seit Mai 2013 sorgt die PED auch in den USA für Aufsehen. Immense Ferkelverluste führten zu deutlichen Einbußen im Schweinesektor und beunruhigten Schweinehalter und Tier-ärzte weltweit. Vor dem Hintergrund dieser Sensibilisierung wurden auch in Deutschland vermehrt Proben von durchfallerkrank-ten Schweinen zur diagnostischen Abklärung eingesandt. Es stellte sich heraus, dass in Deutschland seit Mai 2014 PED-Fälle auftreten, wobei es zu steigenden Fallzahlen im Winter 2014/15 kam. Insgesamt wurden zwischen Mai 2014 und März 2015 ca. 120 Fälle diagnostiziert. Betro�en sind bisher v.a. die Bundesländer Baden-Württemberg, Bayern, Rheinland-Pfalz, Nordrhein-Westfalen, Niedersachsen und Schleswig-Holstein (siehe Abbildung 1), wobei die Dunkel-zi�er unter Umständen sehr hoch ist.

In den meisten Fällen standen sehr hohen Erkrankungsraten (i. d. R. 100 %) geringen Verlustraten gegenüber. In diesem Zusammenhang ist allerdings anzumerken, dass vorwiegend

Abb.1: Von PED betro�ene Gemeinden in Deutschland (Mai 2014 - März 2015)

Abb. 2: Die Sequenzanalyse zeigt die enge Verwandtschaft der in Deutschland auftretenden PEDV-Stämme (in rot) sowie deren Abgrenzung zu den in den USA festgestellten hochvirulenten Stämmen (in grün). In blauer Schrift sind die so genannten S INDEL-Stämme aus den USA dargestellt, zu denen der erwähnte Stamm OH851 gehört.


Mastschweine betro�en waren, die, wie oben aufgeführt, generell mildere Verläufe zeigen. Einige Zucht- und Kombi-betriebe berichten über eine hohe Sterblichkeit bei jungen Saugferkeln (> 80 %). Es wird berichtet, dass einzelne Be-triebe nach einer ersten Erkrankungswelle auch ein zweites Mal betro�en waren und Tiere, die als Saugferkel erkrankt waren, erneut Symptome zeigten. Generell ist wenig über die Herdenimmunität bekannt.

SequenzanalysenDie Volllängensequenzierung (Next-Generation Sequen-cing, NGS) repräsentativer PEDV-Stämme aus dem aktuellen PED-Geschehen in Deutschland zeigte, dass alle Virusstäm-me eng miteinander verwandt sind und eine Gruppe bilden, die sich von den historischen PEDV-Stämmen (Prototyp wäre der Stamm CV777) deutlich unterscheidet (siehe Abbildung 2). Sie lassen sich zudem von den hochvirulenten US-ame-rikanischen und asiatischen Stämmen abgrenzen. Eine sehr hohe Ähnlichkeit besteht mit einem Stamm, der ebenfalls in den USA in Fällen mit milderer Klinik beschrieben wurde (OH851). Die Abgrenzung zu den hochvirulenten Stämmen erfolgt anhand einiger Sequenzmuster im Spike-Gen des PEDV-Genoms. Hier gruppieren sich die deutschen Stämme zu den sogenannten S INDEL Stämmen, wobei INDEL für In-sertion und Deletion steht. In den USA kozirkulieren diese Stammvarianten. Stämme, die den deutschen PEDV-Varian-ten ähneln, wurden auch in den Niederlanden, Frankreich, Italien und Österreich gefunden.

Der Vergleich von PEDV-Stämmen, die aus Be-ständen mit geringer bzw. hoher Mortalität stammten, zeigte keine sequenzseitigen Viru-lenzmerkmale. Der mögliche Einfluss von vira-len und bakteriellen Sekundärinfektionen bzw. Managementfaktoren wird derzeit untersucht. Kürzlich wurde von sehr verlustreichen Ausbrü-chen in ukrainischen Schweinebetrieben be-richtet. Das dort gefundene PEDV ist sehr eng mit den hoch-virulenten US-amerikanischen Stämmen verwandt und unterscheidet sich so-mit von den Stämmen, die in Deutschland ge-funden wurden.

DiagnostikDie PED kann mittels Real-Time RT-PCR pro-blemlos in Kot- und Darmproben erkrankter Schweine diagnostiziert werden. Am FLI werden zu diesem Zweck zwei PCR-Systeme verwendet, die vom Veterinary Diagnostic Lab der Univer-sität von Minnesota entwickelt und intensiv validiert wurden. Die PCRs amplifizieren ein S- bzw. N-Gensegment des PEDV. Die entspre-chenden Methoden wurden am FLI geprüft und an den Arbeitskreis für veterinärmedizinische Infektionsdiagnostik (AVID) der Deutschen Ve-terinärmedizinischen Gesellschaft übergeben. Sie können dort als Methodenkandidat herun-tergeladen werden (http://www.avid.dvg.net/index.php?id=1767).

Ein PCR-System, das zwischen TGEV und PEDV unterscheidet, wird von der Firma Qiagen ver-trieben und befindet sich derzeit in der Zu-lassung. Referenzmaterial für die molekulare Diagnostik kann vom FLI in begrenztem Maß bereitgestellt werden.

Eine Anzucht des Virus gelingt nur selten, ist jedoch unter Trypsinzugabe auf Verozellen und PK15-Zellen möglich.

Mittels Elektronenmikroskopie können Corona-viruspartikel detektiert werden, die jedoch kei-ne weitere Di�erenzierung erlauben.

Für serologische Untersuchungen stehen meh-rere ELISA-Systeme und Präparate für die indi-rekte Immunfluoreszenz zur Verfügung.

BekämpfungDerzeit steht in Europa kein PED-Impfsto� zur Verfügung, so dass insbesondere der Biosicher-heit der Betriebe eine große Bedeutung zu-kommt. Aktuelle Fälle, in denen das Virus bin-nen eines Tages mehrere Produktionseinheiten eines Betriebes durchseuchen konnte, haben gezeigt, dass es anscheinend noch deutlichen Spielraum für Verbesserungen hinsichtlich der Betriebshygiene und Biosicherheit gibt.


Ergebnisse eines Ringversuchs zur Diagnostik der Aujeszkyschen Krankheit

Conrad Freuling, Bernd Ho�mann, Kerstin Wernike und Thomas Müller

Friedrich-Loe�er-Institut (FLI), Institut für molekulare Virologie und Zellbiologie, Institut für Virusdiagnostik Greifswald – Insel Riems

Die Aujeszkysche Krankheit (AK) ist eine anzeigepflichtige Tierseuche, die zu großen wirtschaftlichen Verlusten bei Hausschweinen führt. Sie wird durch das Suid Herpesvirus 1 (SHV-1), auch als Pseudorabies Virus (PrV) oder Virus der Aujeszkyschen Krankheit (AKV) bezeichnet, hervorgerufen. Deutschland ist seit dem Jahr 2003 nach OIE-Kriterien o�ziell anerkannt frei von AK in Hausschweinebeständen. Trotz der Freiheit im Hausschweinebereich zirkulieren, wie in vielen anderen europäischen Ländern auch, hoch-adaptierte SHV-1 Varianten in Schwarzwildpopulationen Deutschlands. Bis auf einige wenige Fälle von AK bei Hunden und einzelnen Virusnachweisen bei Schwarzwild wurden SHV-1-positive Tiere seit Jahren nicht mehr diagnostiziert. Aufgrund der mehr als 10-jährigen AK-Freiheit geriet auch die AK-Diagnostik auf Bundesebene ein wenig in Vergessenheit. Deshalb diente der in 2014 durchgeführte Ringversuch, neben der Überprüfung der serologischen Routinediagnostik, gleichzeitig der Einführung hoch sensitiver molekularer Methoden zum Nachweis virusspezi-fischer DNA. Dabei handelte es sich um zwei von Dr. Kerstin Wernike und Dr. Bernd Ho�mann (FLI, IVD) neuentwickelte Triplex-Real-Time PCR-Systeme zur Unterscheidung von Feld- und Impfvirusstämmen.

Im Rahmen des Ringversuches wurden jeweils ein Panel von 8 kodierten, lyophylisierten Serumproben sowie DNA Proben (8 Referenzproben für die PCR Validierung, 24 Ringtestproben, 1 Probe IC2-DNA) für die Real-Time PCR an die Untersu-chungseinrichtungen der Länder übersandt. Den teilneh-menden Laboratorien wurden vorab die entsprechende SOP für die Triplex-Real-Time PCR sowie Informationen zu Primer- und Sondensequenzen, die im FLI erzielten Ct-Werte der 8 DNA-Referenzproben mit zwei verschiedenen PCR Kits

als auch die jeweiligen Protokollvorlagen zugesandt.Die Ringversuchsseren sollten mit den in den jeweiligen Laboratorien etablierten ELISA Kits getestet werden, die routinemäßig für die jährlichen serologischen Stichproben-untersuchungen zur Aufrechterhaltung des AK-freien Status benutzt werden. Zudem wurde darum gebeten, die Testseren, ausgehend von der vom Testhersteller angegebenen Testver-dünnung, weiter in einer seriellen log2 Verdünnungsreihe zu untersuchen, um zusätzlich Informationen über die analytische Sensitivität der Testkits zu bekommen. Darüber hinaus sollte der Titer virusneutralisierender Antikörper durch Endpunkttitration im Serumneutralisationstest (SNT) entsprechend der in den jeweiligen Labors gültigen Standard Operating Procedures (SOP) bestimmt werden. Am Ringversuch nahmen insgesamt 26 Untersuchungsein-richtungen der Bundesländer sowie die AGES Mödling (Österreich) teil.

Ergebnisse

SerologieVon den 27 teilnehmenden Laboratorien übermittelten 24 Ergebnisse für den ELISA sowie 18 für den SNT.Von den insgesamt sieben der nach § 32 TierImpfStV zugelassenen ELISA Tests kamen fünf im Rahmen des Ringver-suches zum Einsatz, wobei die Mehrheit der Labore gB bzw. Vollvirusantigen ELISAs verwendeten. Vier bzw. drei Labore untersuchten die Testseren in zwei bzw. drei verschiedenen ELISA Tests. Sämtliche Referenzseren wurden durch die teilnehmenden Labore richtig erkannt. Die Verdünnungsreihe lieferte vergleichbare Ergebnisse für die beiden am häufigsten einge-setzten ELISAs, den ID Screen Aujeszky gB Competition (ID VET) und den IDEXX PRV/ADV gB (IDEXX). Hier konnten bis auf jeweils eine Probe in einem Labor die positiven Seren bis zu einer Verdünnungsstufe von mindestens 1:256 als positiv erkannt werden. Die darüber hinaus von einigen Teilnehmern gelieferten Daten zur analytischen Sensitivität zeigten dann aber eine größere Schwankungsbreite (Tab. 1).Bei den serologischen Untersuchungen im SNT variierten neben der Inkubationszeit (N=5) die einzelnen Testpro-tokolle unter anderem auch in den verwendeten Zelllinien (N=10) sowie in der Anzahl verwendeter AK-Testvirus-stämme (N=11). Am häufigsten wurden Feldvirusstämme auf Verozellen benutzt (Tab. 2). Zwar wurden alle Referenzseren von den 18 Teilnehmern richtig erkannt, allerdings wiesen die ermittelten Titer virusneutralisierender Antikörper (VNA) zum Teil erhebliche Unterschiede auf (Abb. 1). Dabei scheint die Inkubati-onsdauer einen wesentlichen Einfluss auf den gemessenen VNA-Titer zu haben. Die VNA-Titer waren bei einer Langzei-tinkubation (>18h) deutlich höher als bei einer 2-stündigen Inkubationszeit. In vielen Fällen war die im SNT eingesetzte Testvirusmenge (TCID50) in Bezug auf die Volumenmenge nicht klar definiert (Tabelle 2).

Real-Time PCRVon den 16 am PCR Ringversuch teilnehmenden Laboratorien etablierte die große Mehrzahl die vom FLI vorgeschlagenen Triplex Real-Time PCR-Systeme unter Nutzung der Qiagen-Chemie. Darüber hinaus kam auch ein kommerzielles Testkit


Tab.1: Ergebnisse für ELISAs

Tab. 2: Ergebnisse der Serumneutralisationstests

Abb.1: Die Titer virusneutralisierender Antikörper (VNA) wiesen zum Teil erhebliche Unterschiede auf

von Adiagene (ADIAVET PRV REALTIME) sowie ein nicht-kom-merziell erhältliches Testsystem zum Einsatz.Alle 24 Ringtestproben sind von allen Versuchsteilnehmern mit allen verwendeten Testsystemen richtig als positiv oder negativ erkannt worden. Die während der Validierung festge-stellte Übereinstimmung der Ergebnisse der einzelnen Zielre-gionen der zwei unabhängigen Triplex-PCR (gB+gE1+IC bzw.

UL19+gE2+IC) konnte durch die Ergebnisse des Ringver-suches bestätigt werden. Die Schwankungsbreite der ct/cq-Werte war dabei sehr gering (Abb. 2). Interessanterweise konnte zwischen der Qiagen-Chemie und der von Quanta innerhalb des Ringversuchs kein Unterschied festgestellt werden.

LABLOEFFLER 10.2015, Heft 1 Seite 12 LABLOEFFLER 10.2015, Heft 1 Seite 13

Abb. 2: Vergleich ct/cq-Werte aus der Real-Time PCR

Rotz – Epidemiologie und Diagnostik

Mandy C. Elschner

Friedrich-Loe�er-Institut (FLI), Institut für Bakterielle Infektionen und Zoonosen, Nationales Referenz-labor für Rotz, Jena

Die Zoonose Rotz, verursacht durch Burkholderia mallei, gehört zu den ältesten, bereits durch Hippokrates erwähnten, anzeigepflichtigen Tierseuchen. Friedrich Loe�er entdeckte 1886 das auslösende Agens. Infizierte Tiere dürfen nicht therapiert werden, sondern sind zu töten und unschädlich zu beseitigen. Von einer natürlichen Infektion sind vor allem Pferd, Esel, Maultier und Kamel betro�en. Infizierte, insbesondere latent und subklinisch erkrankte Tiere sind die einzige Quelle für Neuinfektionen. Die Übertragung erfolgt durch direkten Kontakt, gemeinsame Futtereinrichtungen und Personen oder Gegenstände, die mit infizierten Pferden in Kontakt kommen. Die Erreger-Eintrittspforten sind Schleimhäute, Hautläsionen sowie der Respirations- und Magendarmtrakt. Je nach Bakterienstamm, Infektionsdosis, Infektionsort, Wirtstierart und Immunstatus des Individuums kann es

zum akuten, chronischen oder latenten Verlauf kommen. Körperliche Überlastung, Mangelernährung, vorangegan-gene Infektionen und Immunsuppression begünstigen den Ausbruch der Krankheit bzw. den Übergang von latenter oder chronischer zur akuten Form. Die Inkubationsdauer beträgt wenige Tage bis mehrere Wochen, bei chronischen Erkrankungen bis zu mehreren Monaten und Jahren. Rotz wird als wiederau�ammende Tierseuche betrachtet. In Westeuropa wurde die Erkrankung durch konsequente Eradi-kationsprogramme getilgt, in Ländern Afrikas, Asiens und Südamerikas gibt es jedoch noch endemische Gebiete bzw. immer neue Ausbruchsmeldungen (Tab. 1). Die EU schützt ihren Handelsraum vor der Einschleppung durch Importverbote oder die Forderung von Export-Ge-sundheitszertifikaten, die eine serologische Untersuchung auf Rotz mittels Komplementbindungsreaktion mindestens 30 Tage vor dem Verbringen der Tiere zwingend vorsieht. Zudem sind bei importierten Tieren gründliche klinische Untersuchungen durchzuführen sowie Quarantänemaß-nahmen empfehlenswert. Dass mit dem Einschleppen der Krankheit nach Europa gerechnet werden muss, wird durch einen Fall 2014 in Nieder-sachsen deutlich. Auch wenn in diesem Fall die Infektions-quelle nicht gefunden werden konnte, müssen sich Behörden und Tierärzte beim Handel mit Tieren oder bei Kontakt mit Tieren aus endemischen Gebieten des Risikos bewusst sein.

Je nach primärer Lokalisation der Symptome wird von Lungen-, Haut- und Nasenrotz als klinische Formen der Erkrankung gesprochen. Die Symptome gehen jedoch meist ineinander über oder treten parallel auf. Die Vielfalt der möglichen klinischen und pathologischen Veränderungen wurde seitens des FLI ausführlich in einem Artikel beschrieben, der über die Internetseite des Nationalen Referenzlabors für Rotz (https://www.fli.bund.de/de/startseite/institute/insti-tut-fuer-bakterielle-infektionen-und-zoonosen/referenzla-bore/oie-und-nrl-fuer-rotz.html) verlinkt ist.Für die Identifikation infizierter Tiere, Handels- und Über-wachungsuntersuchungen werden komplementbindende Antikörper im Blutserum nachgewiesen (KBR). Die Spezifität und Sensitivität der KBR wird in hohem Maße durch das verwendete Antigen bestimmt. Mit dem für Deutschland zugelassenen Diagnostikum werden ca. 3,5 - 5,5 % falsch positive Ergebnisse erzielt. Für KBR-positive Befunde wird deshalb im Referenzlabor am FLI ein Westernblot als sero-logischer Bestätigungstest durchgeführt (Abb. 1). Andere serologische Methoden, wie Agglutinationstests und ELISA sind beschrieben, teilweise auch kommerziell erhältlich, jedoch aufgrund mangelnder Daten zu Spezifität und Sensitivität in Deutschland nicht zugelassen.

Abb.1: Westernblot zur Detektion von Rotz-Antikörpern: 1: positives Kontrollserum 2: negatives Kontrollserum; 3+4 Seren infizierter Pferde aus Pakistan

Tab. 1: Rotz-Status OIE, gemeldete Rotz-Fälle von 2005-2014. (OIE World Animal Health Information System Online im Internet: http://www.oie.int/wahis_2/public/wahid.php/Diseaseinformation/Diseasetimelines; Stand: 04.05.2015)

Für den Erregernachweis bei bestätigten positiven sero-logischen Befunden am lebenden Tier gibt es bisher keine verlässlichen Verfahren. Im Falle des Vorliegens klinischer Symptome kann der Nachweis aus dem Nasentupfer oder Hautläsionen durch Anzucht oder PCR gelingen. Eine weiterführende Diagnostik kann nur post mortem durch die Anzucht aus veränderten Bereichen insbesondere der Leber, Lunge, Milz sowie den Lymphknoten mit anschlie-ßendem PCR-Nachweis erfolgen. Da der Erreger oft nur in geringer Anzahl im Gewebe vorkommt, langsam wächst und keine Selektivmedien zur Verfügung stehen, ist die mikro-biologische Diagnostik schwierig. An Isolaten von B. mallei sind durch molekularbiologische Typisierungsmethoden forensische Ausbruchsanalysen zur Aufdeckung epidemiolo-gischer Zusammenhänge möglich. Sind alle Untersuchungen ohne Ergebnis geblieben, stellt der diagnostische Tierversuch mit männlichen Meerschweinchen die letzte Möglichkeit dar. Die Tiere werden intraperitoneal mit Aufarbeitungen von verdächtigem Probenmaterial infiziert, um eine Orchitis (Strauß-Reaktion) zu induzieren. Die Nachweisrate des Erregers konnte mit dieser Methode beispielsweise bei einem Rotzausbruch in Dubai 2004 erhöht werden. Für eine finale Diagnosestellung sollten so viele verschie-dene Untersuchungsmethoden wie möglich miteinander kombiniert werden. Bei Verdacht auf oder Ausbruch von Rotz werden die Verfahren in der nach § 27 Absatz 4 Nummer 1 des Tiergesundheits-gesetzes verö�entlichten Amtlichen Methodensammlung sowie die Falldefinition im Tierseuchennachrichtensystem angewendet. Demzufolge bedürfen positive serologische Befunde in der KBR immer einer sofortigen Abklärungsun-tersuchung und ziehen 3 Nachuntersuchungen des Tieres im Abstand von 2 bis 3 Wochen nach sich. Voraussetzungen für den Verdacht sind das Vorliegen klinischer Symptome oder positiver serologischer Befunde, insbesondere nach Kontakt mit Tieren aus endemischen - oder Ausbruchsgebieten. In betro�enen Beständen werden von allen empfängli-chen Tieren Blutproben entnommen und mit der KBR auf Antikörper untersucht. Serologische Abklärungsuntersu-chungen in Verdachts- oder Ausbruchsbeständen müssen mindestens 3 mal im Abstand von 2 bis 3 Wochen negativ verlaufen, bevor eine Bestandssperre aufgehoben werden kann. Ein Fall von Rotz liegt bei positivem serologischem Befund in der KBR vor, der mittels Westernblot bestätigt wurde oder bei kulturellem Nachweis und molekularer Iden-tifizierung oder bei ausschließlichem molekularem Nachweis des Erregers.

Literatur bei der Verfasserin

2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014

Brasilien BrasilienEritreaIndien

BrasilienIndienIranMongoleiRussland

BrasilienIndienIranMongolei

BrasilienIndienIranKuwaitMongoleiMyanmar

BahrainBrasilienEritreaIndienIranKuwaitMongoleiMyanmarPakistan

AfghanistanBahrainBrasilienIndienIranLibanonMyanmarPakistan

AfghanistanBrasilienIndienIranPakistan

BrasilienIndienIranPakistanRussland

BrasilienDeutschlandIndienIranIrak

ZusammenfassungDie Ergebnisse dieses Ringversuchs zeigen, dass die Unter-suchungseinrichtungen der Länder auch in Zeiten der AK-Freiheit in den Hausschweinebeständen die Diagnostik der Aujeszkyschen Krankheit hervorragend abdecken können. Unter der Berücksichtigung der Tatsache, dass das neuentwi-ckelte Triplex-Real-Time PCR-System im Zuge des Ringver-suches zum ersten Mal an den Untersuchungseinrichtungen etabliert wurde, ist die extrem geringe Schwankungsbreite der ct/cq-Werte zwischen den Untersuchungseinrichtungen ein äußerst bemerkenswertes Ergebnis, welches für die Robustheit des Testsystems spricht.Im Hinblick auf die Varianz der im SNT erzielten VNA-Titer ist gemeinsam zu diskutieren, ob ein einheitliches Protokoll

durch die Methodensammlung vorgegeben werden sollte oder modifizierte SNTs akzeptiert werden, sofern diese schwach-positive Seren noch richtig erkennen. Dazu müssen zukünftige Ringversuche beitragen.

DanksagungAllen teilnehmenden Laboratorien sei an dieser Stelle für ihre Unterstützung und die schnelle Übermittlung der Ergebnisse gedankt. Ein besonderer Dank geht an Jeannette Kliemt (Institut für molekulare Virologie und Zellbiologie), Christian Korthase (Institut für Virusdiagnostik) sowie Anette Beidler (Institut für molekulare Virologie und Zellbiologie), welche maßgeblich an der Probenvorbereitung, dem Versand sowie der Übermittlung der Zertifikate beteiligt waren.


Auswertung des nationalen Ringtests zur Diagnostik von viralen Fischseuchen-Erregern

Heike Schütze, Sven M. Bergmann und Uwe Fischer

Friedrich-Loe�er-Institut (FLI), Institut für Infektionsmedizin, Nationale Referenzlabore für Fischseuchen, Greifswald – Insel Riems

Der Fischverbrauch in Deutschland wird vorrangig durch Importe abgedeckt. Lediglich ca. 10 % des Gesamtauf-kommens werden in Deutschland durch die See- und Binnenfischerei sowie Aquakulturen abgedeckt. Aquakultur bezeichnet die kontrollierte Aufzucht von Karpfen, Forellen und zahlreichen anderen Arten. Zum Erhalt einer gesunden Aquakultur wurden gesetzliche Rahmenbedingungen auf nationaler und internationaler Ebene gescha�en (Tiergesund-heitsgesetz, Fischseuchenverordnung, Richtlinie 2006/88EG und deren Verordnungen). Eine Maßnahme betri�t die Anzeigepflicht hochansteckender viraler Erkrankungen wie die Virale Hämorrhagische Septikämie (VHS), die Infektiöse Hämatopoetische Nekrose (IHN), die Infektiöse Anämie der Lachse (ISA), die Koi-Herpesvirus Infektion (KHV-I) und die Epizootische Hämatopoetische Nekrose (EHN) (Anon. 2). Jährlich verursachen Erkrankungen der IHN, VHS und KHV-I Verluste in der deutschen Aquakultur. Der Erreger der exotischen und anzeigepflichtigen Fischseuche EHN (EHNV) wurde in Europa bislang nicht nachgewiesen. Ebenso ist Deutschland frei von ISA. Im Rahmen der Seuchenbe-kämpfung sind standardisierte diagnostische Verfahren unerlässlich und regelmäßig zu prüfen. Auf Grundlage des Tierseuchengesetzes §27 (Anon. 1) führten die nationalen Referenzlabore (NRL) für anzeigepflichtige Fischseuchen einen Ringversuch zur Diagnostik der viralen Erreger der IHN, VHS, ISA und der KHV-I durch. Der Nachweis der Erreger der exotischen Erkrankung EHN sowie der nicht anzeigepflichtigen, nicht exotischen Erkrankungen der Früh-jahresvirämie der Karpfen (SVC) und der Ranavirus-Infek-tion des Welses (ECV) war optional. EHNV ist genetisch eng verwandt mit den Ranaviren der Welse (ECV und ESV), die in Deutschland, Frankreich und Italien Krankheitsgeschehen verursachen. Deshalb und auf Grund von Interessenbekun-dungen einzelner Untersuchungsämter enthielt der Ringtest ebenfalls Ranaviren.

AufgabenstellungDer nationale Ringtest umfasste zwei Teile. Negativkont-rollen wurden beiden Teilen beigefügt. Alle Proben enthielten jeweils 2 x 2 ml virushaltigen bzw. nicht virushaltigen Zell-kulturüberstand. Vor dem Versand wurden alle Proben am FLI mit den empfohlenen Testverfahren untersucht.Teil FLI_RT2014_A enthielt insgesamt 6 Proben. Ziel war die Diagnostik der Erreger IHNV, VHSV und ISAV. Der Nachweis dieser Pathogene sollte auf Grundlage der EU-Entschei-dung 2001/183/EC (Anon. 4) und den amtlichen Methoden (Amtliche Methodensammlung) erfolgen. Die Diagnostik der Ranaviren EHNV und ECV war fakultativ.Teil FLI_RT2014_B bestand aus 4 Proben. Aufgabe der Teilnehmer war der Nachweis von KHV und optional des SVCV.Eine detaillierte Beschreibung der standardisierten diagnos-

tischen Verfahren aller Erreger wurde den Teilnehmern im Rahmen des Ringvergleichs übermittelt.

TeilnahmeInsgesamt beteiligten sich 18 amtlich zugelassene Labore der Bundesländer. Laut Abfrage gaben 17 Labore einen Akkredi-tierungsstatus an. Alle 18 Labore erklärten eine Teilnahme zur Diagnostik von KHV (Teil FLI_RT2014_B) und 16 Labore beteiligten sich am Nachweis von IHNV und VHSV. Tab. 1 fasst die Beteiligung der Landeslabore zum Nachweis der Fischseuchen-Erreger zusammen.

Ergebnisse FLI_RT2014_ADie Erreger der anzeigepflichtigen Erkrankungen der IHN und VHS wurden von allen 16 teilnehmenden Laboren korrekt

RT_2014 Nachweis Erreger Beteiligung

A Pflicht IHNV 16

Pflicht VHSV 16

Pflicht ISAV 12

Optional EHNV 6

Optional ECV/ ESV 6

B Pflicht KHV 18

Optional SVCV 15

Tab.1: Teilnahme der Landeslabore an der Diagnostik der Ringtestproben

nachgewiesen. Entsprechend den gesetzlichen Vorgaben und Empfehlungen (Amtliche Methodensammlung, Anon.1, - 6) wurden diese Erreger in der Zellkultur isoliert und anschließend in der Immunfluoreszenz oder im Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) identifiziert. Zusätzlich erfolgte in 14 Laboren der Genomnachweis in der RT-PCR mit anschließender nested-PCR und/oder der Real-Time RT-PCR (RT-qPCR). In zwei Landeslaboren kam auch die Elektronen-mikroskopie zur Diagnostik dieser Erreger zum Einsatz. Die ermittelten Titer (TCID50) lagen zwischen 104.75 und 107.75 je ml für IHNV (FLI: 107.5) bzw. 106.75 und 108.43 je ml für VHSV (FLI: 106.75). An der Diagnostik von ISAV beteiligten sich 12 Landeslabore. Der Erreger wurde von den Teilnehmern korrekt identifiziert. Zur Anwendung kamen die Virusisolie-rung, der Antigennachweis mittels Immunfluoreszenz oder der Genomnachweis (RT-PCR oder RT-qPCR).Sechs Teilnehmer nutzten die Option zum Nachweis des Erregers der exotischen anzeigepflichtigen Erkrankung EHN und des Ranavirus ECV. Elf von 16 Teilnehmern des Teils A identifizierten nach entsprechender Inokulation von Zellkulturen mit den Proben 5 (EHNV) und 6 (ECV) einen zytopathogenen E�ekt (CPE). Der Genomnachweis erfolgte in vier Laboren mit anschließender Restriktionsanalyse und/oder Sequenzierung des PCR-Produktes. Vier Labore bestätigten den Nachweis von Iridoviren nach Analyse in der Elektronenmikroskopie.Die Negativkontrolle wurde von allen beteiligten Laboren korrekt bewertet.


Ergebnisse FLI_RT2014_BAn der Identifizierung des Erregers der anzeigepflichtigen KHV-I beteiligten sich alle 18 Labore mit Erfolg. Der Erreger wurde in allen Laboren unter Anwendung der qPCR nach Gilad et al., 2004 nachgewiesen. Die Cq-Werte variierten zwischen 20.95 und 25.95 der Ampulle B1 bzw. 23.5 und 29.75 der Ampulle B2. Vier Landeslabore bestätigten den positiven Genomnach-weis zusätzlich mit unterschiedlichen (nested-) PCR-Methoden. Die Negativ-kontrolle (Ampulle B4) wurde in allen Laboren als KHV-negativ identifiziert.Eine Zusammenfassung der Ergebnisse zur Diagnostik der Ringtestproben durch die Landeslabore ist in (Tab. 2) aufgelistet. Die Ergebnisse des diesjährigen nationalen Ringtestes verdeutlichen, dass die Erreger der anzeigepflichtigen Erkrankung IHN, VHS und KHV-I von den teilneh-menden Laboren korrekt identifiziert wurden. Die Diagnostik zum Nachweis des ISAV ist bereits in 12 Landesla-boren etabliert. Einige Landeslabore nutzten im Rahmen des Ringtestes auch erfolgreich Verfahren zur Identi-fizierung von Ranaviren einschließlich des Erregers der exotischen und anzei-gepflichtigen EHN. Hervorzuheben ist, dass 14 Labore bei einer entspre-chenden diagnostischen Fragestellung die Proben gemäß den gesetzlichen Vorgaben unverzüglich ans FLI weiterleiten würden.

VirusanzuchtDer Virusnachweis von IHNV und VHSV erfolgte in den teilnehmenden Laboren auf den vorgeschriebenen Zelllinien EPC bzw. FHM der Elritze (CCLV Rie 173 und 057) und BF-2 vom Sonnenbarsch (CCLV Rie 057 und 088) bzw. RTG der Regenbogenforelle (CCLV Rie 38). Zum Nachweis des ISAV wurden SHK- (CCLV Rie 489) und/oder ASK- (CCLV Rie 926) Zellen mit dem Probenmaterial inokuliert.Die Angaben zu den verwendeten Zellpassagen variierten zwischen den Teilnehmern z.T. sehr deutlich. Aus der Befragung der teilnehmenden Labore geht hervor, dass die Zellen in der Regel bei der Zellbank des FLI bestellt wurden. Nur in wenigen Laboren war die Herkunft der verwendeten Zellen nicht eindeutig. Im Rahmen der Diagnostik ist es notwendig, sowohl Erreger als auch Zellen regelmäßig auf

Tab. 2: Zusammenfassung der Ergebnisse der teilnehmenden Labore am nationalen Ringtest 2014+: korrekter Nachweis, *: keine Teilnahme, CPE: zytopathogener E�ekt in der Zellkultur

Teilnehmer

A1:ISAV

A2:K-

A3:VHSV

A4:IHNV

A5:EHNV

A6:ECV

B1:KHV

B2:KHV

B3:SVCV

B4:K-

1 + + + + + + + + + +

2 + + + + + + + + +

3 + + + + *CPE *CPE + + + +

4 + + + + + + + + + +

5 + + + + + + + + + +

6 + + + + + + + + + +

7 + + + + * * + + + +

8 + + + + *CPE *CPE + + + +

9 + + + + *CPE *CPE + + + +

10 + + + + *CPE *CPE + + + +

11 + + + + *CPE *CPE + + + +

12 + + + + *CPE *CPE + + + +

13 * + + + + + + + + +

14 * + + + * * + + + +

15 * + + + *CPE *CPE + + + +

16 * + + + *CPE *CPE + + + +

17 * * * * * * + + * +

18 * * * * * * + + * +

∑ 12/16 16/16 16/16 16/16 6-14/16 6-14/16 18/18 18/18 15/16 18/18

ihre Eignung zu überprüfen. Die Qualität der Zellen, die Anzahl der Zellpassagen, das Medium bzw. dessen Zusätze wie z.B. FKS können den Virusnachweis stark beeinflussen (z.B. Titerreduktion).

GenomnachweisDie RNA- bzw. dann-Isolierung erfolgte unter Verwendung von unterschiedlichen kommerziellen Kits der Firmen Qiagen, Roche und Macherey-Nagel entsprechend den Herstellerangaben bzw. den Empfehlungen des FLI.Der qualitative Genomnachweis von RNA-Viren wurde einheitlich unter Verwendung des One Step RT-PCR Kits der Firma Qiagen durchgeführt. Das Genom von DNA-Viren wurde unter Verwendung von Produkten der Firmen Qiagen (Hot Star Taq bzw. Hot Star Master Mix), Thermo Scientific (Ready PCR Master Mix), Fermentas (Dream Taq DNA Polymerase) und 5-Prime (Hot Master Taq Mix) nachgewiesen.Produkte der Firmen Qiagen, Applied Biosystems, Invitrogen und Life Technology kamen beim quantitativen Genomnachweis der Erreger (Real-Time (RT-) PCR) zum Einsatz. Die angewandten Methoden zum Genomnachweis der zu untersuchenden Erreger sind in (Tab. 3) aufgeführt.Alle teilnehmenden Labore nutzten zum Nachweis von KHV-Genom die qPCR nach Gilad et al. (2004). Zusätzlich zum quantitativen Nachweisverfahren wurden auch drei qualitative PCR-Methoden zum Nachweis des KHV-Genoms angewendet. Amplifizierungsverfahren zum Nachweis von IHNV und VHSV Genom sollen demnächst von der EU als diagnostische Methoden zugelassen werden. Entspre-chende Nachweisverfahren sind in der Mehrzahl der teilnehmenden Labore bereits etabliert. Mit Hilfe der RT-PCR und/oder der RT-qPCR wurde der Virusnachweis dieser Erreger bestätigt. In 10 teilnehmenden Laboren sind Amplifizierungsver-fahren zur Diagnostik von ISAV etabliert.Generell ist anzumerken, dass die Reaktionsbedingungen gleicher Amplifizierungs-verfahren in den Laboren variieren.


Erreger ∑ n

(RT)-(nested)PCR RT-(q)PCR

Methode ORF n Methode ORF n

IHNV 12 Miller et al., 1998 G 11 Purcel et al., 2013 N 1

Emmenegger et al., 2000;

OIE

G 1 Lui et al., 2007 N 1

Knüsel et al., 2007 N 1 Overturf et al., 2001 N 1

Williams et al., 1999 N 1

VHSV 13 Miller et al., 1998 G 12 Chico et al., 2006 N 1

Emmenegger et al., 2000 N 1 Jonstrup et al., 2012 N 2

Lui et al., 2007 N 2

KHV 18 Bergmann et al., 2010 (sn) 89/90* 2 Gilad et al., 2004 89* 18

Gilad et al. 2002; Bergmann

et al., 2006

89/90* 3

Engelsma et al., 2013 79* 1

ISAV 10 Mjaaland et al., 1997 M (sg8) 4 Snow et al., 2006 M (sg8) 4

EU RL Fish HE (sg6) 1

OIE HE (sg6) 1

EHNV/

ECV

4 Ohlemeyer et al., 2011 MCP 4

SVCV 11 OIE 2009;

Stone et al., 2003

G 2 Liu et al., 2007 M 4

Koutná et al., 2003 G 3

Miller et al., 1998 G 2

laborspezifisch N 1

Tab. 3: Übersicht angewandter diagnostischer Amplifizierungsverfahren zum Nachweis von fischpathogenen viralen Erregern im Rahmen des nationalen Ringtests 2014∑ n: Gesamtanzahl der Labore mit etablierten Amplifizierungsverfahren, n: Anzahl der Labore entsprechend dem angegebenen Amplifi-zierungsverfahren, ORF: o�ener Leserahmen, *: KHV-U (GenBank DQ657948)

Erreger EU-Empfehlung Deutschland FLI-Zulassung Charge GültigkeitIHNV 136-3 BIO 285 (136/3) FLI-B 647 aIHN14C04 08.04.14-31.03.16

VHSV IP5B11 BIO 282 (IP5B11) FLI-B 646 aVHS14C04 08.04.14-31.03.16

ISAV 3H6F8/ BIO 337 FLI-B 422 aISA14B24 10.03.14-28.02.16

10C9F5

Tab. 4: In Deutschland zugelassene mAK und geprüfte Chargen zur Diagnostik der anzeigepflichtigen Erreger der IHN, VHS und ISA

Verwendete in vitro DiagnostikaUm eine einheitliche und vergleichbare Diagnostik sicherzustellen, sind sowohl standardisierte Methoden als auch geprüfte Reagenzien (z. B. Antikörper) essentiell. Nicht zugelassene in vitro Diagnostika können zu starken unspezifischen Reaktionen führen, die eine eindeutige Diagnostik erschweren oder gar verhindern. Für in vitro Diagnostika zum Nachweis von Erregern anzeigepflichtiger Tierseuchen besteht die Zulassungspflicht (Anon. 1). Listen der in Deutschland zugelassenen Mittel und freigegebenen Chargen sind auf der Homepage des FLI verfügbar. Eine Übersicht derzeit zugelassener und geprüfter Chargen von mAK zum Nachweis von IHNV, VHSV und ISAV sind in der Tab. 4 dargestellt.


FazitDer nationale Ringtest verlief insgesamt zufriedenstellend. Alle Labore haben entsprechend ihrer Beteiligung zum Nachweis der unterschiedlichen Erreger korrekte Befunde erhoben. Die Nukleinsäure-Isolierung und der anschließende Genomnachweis erfolgten unter Verwendung verschiedener Kits unterschiedlicher Hersteller, was bei gleicher Eignung und entsprechender Validierung möglich ist. Kritisch anzumerken ist, dass nur zugelassene Chargen von in vitro Diagnostika verwendet werden dürfen, damit diagnostische Ergebnisse in der Praxis einer seuchenrechtlichen Überprüfung standhalten. Weiterhin ist eine regelmäßige Validierung der für die Virusanzucht verwendeten Zellkulturen zu empfehlen. Die Ergebnisse des Ringtests bestätigen die Fachkompetenz der Labore.

ReferenzenAmtliche Methodensammlung / Hrsg.: Friedrich-Loe�er Institut, Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit. www.fli.bund.de/de/startseite/veroe�entlichungen.

Anon. 1. Gesetz zur Vorbeugung und Bekämpfung von Tierseuchen (Tiergesundheitsgesetz – TierGesG) vom 22. Mai 2013 (BGBl. I S. 1324 (Nr. 25).

Tagungsankündigung 7. Riemser Diagnostiktage am 26. und 27. November 2015 in Greifswald


wir laden Sie zu den 7. Riemser Diagnostiktagen ein, die Ende November vom Institut für Virusdiagnostik (IVD) in Zusammenarbeit mit dem Arbeitskreis für veterinärmedizinische Infektionsdiagnostik (AVID) ausgerichtet werden. Mit dieser Tagung wenden wir uns mittlerweile schon „traditionsgemäß“ an Sie als die Praktiker des Laboralltags in staatlichen und privaten Untersuchungseinrichtungen.

Die Anmeldung für die 7. Riemser Diagnostiktage ist ab August online über die Homepage des FLI möglich.

Wir freuen uns auf spannende Themen und einen regen Erfahrungsaustausch mit Ihnen und verbleiben

mit kollegialen Grüßen

Prof. Dr. Martin Beer, Dr. Bernd Ho�mann

Datum: 26.11.2015 ab 9:00 bis 27.11.2015 bis 14:00 UhrOrt: Alfried-Krupp-Kolleg, Martin-Luther-Str. 14, 17489 GreifswaldKontakt: Prof. Dr. Martin Beer ([email protected]), Ines Jakobi ([email protected]) Tel. 038351 7-1381

Vorläufige Themenschwerpunkte:

• Verordnungen und Gesetze – relevante Neuerungen und Änderungen• Berichte aus den Referenzlaboratorien• Berichte aus der Laborpraxis und der Industrie• Moderne Diagnostikmethoden• Vektorübertragene Tierkrankheiten und Zoonosen• Klassische Tierseuchen• Eradikationsprogramme

Anon. 2. Aquakultur-Richtlinie 2006/88/EG des Rates vom 24. Oktober 2006 mit Gesundheits- und Hygienevorschriften für Tiere in Aquakultur und Aquakulturerzeugnissen und zur Verhütung und Bekämpfung bestimmter Wassertierkrank-heiten (ABl. L 328 vom 24.11.2006, S. 14).

Anon. 3. Durchführungsrichtlinie 2014/22/EU vom 13.02.2014

Anon. 4. Entscheidung der Kommission 2001/183/EG vom 22. Februar 2001 zur Festlegung der Probenahmepläne und Diag-noseverfahren zur Erkennung und zum Nachweis bestimmter Fischseuchen und zur Aufhebung der Entscheidung 92/532/EWG. (ABl. EU Nr. L 56 S. 65).

Anon. 5. Fischseuchenverordnung und Verordnung zur Änderung der Verordnung über anzeigepflichtige Tierseuchen vom 24. November 2008 (FischSeuchV 2008, BGBl. I S. 2315), zuletzt geändert durch Artikel 30 der Verordnung vom 17. April 2014 (BGBl. I S. 388).

Anon. 6. "Diagnostic Manual for Aquatic Animal Diseases" des O�ce International des Epizooties (O.I.E.) in der jeweils aktuellen Ausgabe.

Weitere Literatur bei den Verfassern


Laborvergleichsuntersuchung zur serologischen Diagnostik der Beschälseuche 2015

Björn Bassarak und Irmgard Moser

Friedrich-Loe�er-Institut, Institut für molekulare Pathogenese, Nationales Referenzlabor für Beschälseuche, Jena

Beschälseuche der Pferde und anderer Equiden wird durch Trypanosoma (T.) equiperdum, einen einzelligen Parasiten (Abb. 1a), hervorgerufen, der ausschließlich beim Deckakt übertragen wird. Der Erreger ist in Asien, Afrika, Russland und Teilen des Mittleren Ostens verbreitet, kommt aber auch in südlichen Regionen Europas sporadisch immer wieder vor (Abb. 1b). Deutschland ist seit vielen Jahrzehnten frei von Beschälseuche, die in Europa zu den anzeigepflichtigen Tier-seuchen zählt.

Abb. 1a : TEM Bild Trypanosoma equiperdum

Abb. 2b: Vorkommen von Beschälseuche von Januar bis Juni 2012Karte: Disease distribution map WAHID OIE

Um beim Import von Pferden aus Risikoregionen die Gefahr der Einschleppung der Seuche zu mindern, sind die Landes-untersuchungsämter gehalten, im Rahmen der amtlichen Diagnostik, serologische Untersuchungen, vorzugsweise die Komplement-Bindungsreaktion (Diagnostikmethode der Wahl auf Empfehlung der OIE), zum Nachweis spezifischer Antikörper im Blutserum bei den Tieren durchzuführen. Das hierfür benötigte Antigen wird vom nationalen Referenz-labor für Beschälseuche für die deutschen Untersuchungs-ämter bereitgestellt.

Bei der Produktion von Antigen nach der von der OIE empfohlenen Methode ist das Setzen einer Infektion bei Labornagern, vorzugsweise Ratten, zur Vermehrung und die Gewinnung der Parasiten im präparativen Maßstab durch maximalen Blutentzug, der zum Exitus der Tiere führt, notwendig. Als Alternative wurde in den vergangenen drei Jahren im Rahmen eines vom BMBF geförderten Projektes („3R-Methoden zum Ersatz und zur Verbesserung gesetzlich geforderter Tierversuche bei der Prüfung von immunologi-schen Arzneimitteln: In vitro-Vermehrung von Trypanosoma equiperdum zur Gewinnung von Antigen zu Diagnosezwe-cken“, Förderkennzeichen 0316009C) eine Methode zur Kultivierung von T. equiperdum in vitro entwickelt.

Die Laborvergleichsstudie, über die hier berichtet wird, verfolgte zwei Ziele. Zum Ersten sollte die Qualität der sero-logischen Beschälseuche-Diagnostik in den amtlichen Unter-suchungseinrichtungen überprüft werden.

Zum Zweiten sollte ein auf alternative Weise (in vitro) produ-ziertes Beschälseuche-Antigen im Vergleich zum amtlich zugelassenen Antigen evaluiert werden.

Die Landesuntersuchungsämter folgender Bundesländer sowie das Nationale Referenzlabor für Beschälseuche des FLI nahmen an der Studie teil:

Baden-Württemberg

Bayern-1

Bayern-2

Berlin / Brandenburg

Hessen

Niedersachsen

Nordrhein-Westfalen

Rheinland-Pfalz

Sachsen

Schleswig-Holstein

Aus dem europäischen Ausland nahmen das EU-Referenz-labor und die Referenzlabors aus Italien, den Niederlanden und Polen an der Laborvergleichsstudie teil. In dem hier vorgelegten Bericht wurden die Ergebnisse der letztge-nannten Labors jedoch nicht berücksichtigt.

MethodenDie Komplement-Bindungsreaktion sollte nach dem jeweils bei den teilnehmenden Labors etablierten Protokoll durch-geführt werden.

Vom FLI wurden jedem Teilnehmer lyophilisiertes Beschälseu-che-Antigen (T. equiperdum) aus konventioneller Herstellung (amtlich zugelassen; Antigen A) und lyophilisiertes Antigen, hergestellt aus in vitro vermehrten Trypanosomen (alternativ; Antigen B), mit entsprechenden Anwendungshinweisen zur Verfügung gestellt.

Weiterhin wurden 14 Serumproben vom Pferd (A1 - A14) für die KBR mit Antigen A und für die KBR mit Antigen B (B1 - 14) sowie positives und negatives Kontrollserum vom Pferd an die Teilnehmer versandt.

Bei den Seren handelte es sich um sechs positive Feldseren mit geringem, mittlerem und hohem Titer gegen konventio-nell hergestelltes Beschälseuche-Antigen von immunisierten bzw. erkrankten Pferden, die uns vom Europäischen Referenz-labor für Beschälseuche in Frankreich und von italienischen Kollegen zur Verfügung gestellt worden waren. Sieben nega-tive Feldseren entstammten dem Referenzlabor des FLI. Bei den positiven und negativen Kontrollseren handelte es sich um die für die amtliche Diagnostik vom FLI üblicherweise zur Verfügung gestellten Kontrollseren. Die Titer aller versandten Seren waren vorab am NRL bestimmt bzw. bestätigt worden. Die Serumtiter wurden gemäß OIE Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2013 ab einem Titer von 1:5++ als positiv bewertet. Bei antikomplemen-tärer Aktivität eines Serums sollte, gemäß der Empfehlung der OIE, das Ergebnis als positiv bewertet werden, wenn der spezifische Serumtiter mindestens drei Verdünnungsstufen größer war als der antikomplementäre Titer des fraglichen Serums. Bei der Vorauswahl der Seren war bei keinem Serum antikomplementäre Aktivität festgestellt worden.

Zusammenfassende Bewertung und AusblickDie überwiegende Anzahl der Teilnehmer erzielte die erwar-teten positiven bzw. negativen Ergebnisse. Die Variations-breite der mit den positiven Seren erzielten Werte entspricht der Variationsbreite der Ergebnisse, die auch in anderen Laborvergleichsstudien mit der Beschälseuche-KBR erreicht werden, wenn bei Verwendung des gleichen Antigens Reagenzien unterschiedlicher Hersteller und unterschied-liche Durchführungsbedingungen verwendet werden.

Mit vier negativen Seren und Antigen A (zugelassenes Antigen) wurden bei zwei von elf Teilnehmern schwach posi-tive Ergebnisse erzielt.

Mit vier positiven Seren und Antigen A wurden bei zwei von elf Teilnehmern negative Ergebnisse erzielt.

Die Analyse der Di�erenzen zwischen den Serumtiter-Werten für die Antigene A (zugelassen) und B (alternativ) zeigt, dass das alternativ produzierte und das zugelassene Antigen im wesentlichen vergleichbare Ergebnisse hervorbringen. Zur

ErgebnisseDie mit „S“ gekennzeichneten Serumtiterwerte (siehe Säulendiagramme) stellen die „Sollwerte“ dar, die mit den entsprechenden Seren am FLI in Vorversuchen erzielt oder von den Herkunftslabors in Frankreich oder Italien mitgeteilt worden waren. Bei den Seren 7, 9 und 11 wurde der Solltiter nur mit Antigen A überprüft.Der Serumtiterwert bei einer Serumverdünnung von < 1:5++ wurde auf der Y-Achse der Diagramme mit dem Zahlenwert 2,5 belegt.Feinabstufungen der Serumtiter innerhalb einer Titerstufe (+ - ++++) sind in den Abbildungen nicht dargestellt.Negative Seren (Abbildungen 2a – 2g)Bei den Seren 1, 3, 4, 6, 8, 12 und 13 waren Serumtiter von < 1:5++ zu erwarten.

Tab. 1: Qualitativer Vergleich der KBR-Ergebnisse für Antigen A und Antigen B

Di�erenz der Titerstufen zwischen

Antigen A und Antigen B

Anzahl der Ergebnisse

Keine 391 322 43 17 1

Quantitative Analyse der Di�erenzen zwischen Serumti-ter-Ergebnissen für die Antigene A und B Der Vergleich der mit den Antigenen A und B erzielten Ergebnisse zeigte, dass in 92,2 % der Fälle die Di�erenz nicht mehr als eine Titerstufe betrug (Tab. 1).

Validierung des alternativ produzierten Antigens sind jedoch noch weitere Untersuchungen erforderlich.


Abb.: 2c Abb.: 2d

Abb.: 2e Abb.: 2f

Abb.: 2g

Abb.: 3a Abb.: 3b

Positive Seren (Abbildungen 3a – 3c) -Bei den Seren 5, 7 und 11 wurde ein geringer positiver Titer erwartet.

Abb.: 3c

Abb.: 4a Abb.: 4b

Abb.: 5a Abb.: 5b

Bei den Seren 2 und 10 (Abbildungen 5a und 5b) wurde ein hoher bzw. sehr hoher positiver Titer erwartet.

Bei den Seren 9 und 14 (Abbildungen 4a und 4b) wurde ein mittlerer positiver Titer erwartet.

Abb.: 2a Abb.: 2b

Negative Seren (Abbildungen 2a – 2g) -Bei den Seren 1, 3, 4, 6, 8, 12 und 13 waren Serumtiter von < 1:5++ zu erwarten.


MethodePacifi c Bio

(Single-molecule real-time sequencing)

Ion Torrent (Ion

semiconductor sequencing)

454(Pyrosequencing)

Illumina(Sequencing by

synthesis)

SOLiD(Sequencing by

ligation)

Read Länge 5,000 bp bis ~22,000 bp

Bis zu 400 bp Bis zu 1000 bp 50 bis 300 bp50+35 oder 50+50 bp

Genauigkeit 99.999 % Consensus87 % Einzelread

98 % 99.9 % 98 % 99.9 %

Reads pro Lauf 50,000 pro SMRT cell

Bis zu 80 Millionen

1 Million Bis zu 3 Milliarden1.2 bis 1.4 Milliarden

Zeit pro Lauf 30 Minuten bis 2 Stunden

2-5 Stunden 24 Stunden 1 - 11 Tage 1 - 2 Wochen

Kosten pro 1 Mio. Basen * $0.75 - $1.50 $1 $10 $0.05 - $0.15 $0.13

VorteileLängste Readlänge,

Schnell, Detektion von Modifi kationen

Weniger teures Gerät

Schnell

Lange ReadlängeSchnell

Hoher Durchsatz, geringer Preis pro

Base

Geringer Preis pro Base, hohe

Genauigkeit

Nachteile Moderater Durchsatz Gerät ist sehr teuer

Homopolymer Fehler

Reagenzien sind teuer,

Homopolymer Fehler

Geräte relativ teuer,

Kontaminations-anfällig

Langsam, kurze Readlängen, Probleme mit Palindromen

Tab. 1: Übersicht und Vergleich unterschiedlicher Sequenzierplattformen, * Preis in US$

Next-Generation Sequen-cing und Metagenoma-nalyse - Potential für die Diagnostik

Maria Jenckel

Friedrich-Loe� er-Institut, Institut für Virusdiagnostik, Greifswald-Insel Riems

Bereits 2011 zeigte die Identifi zierung des Schmallenberg Virus als Erreger in Milchkühen das Potential von Next-Ge-neration Sequencing und Metagenomanalyse. Doch nicht nur in der Metagenomanalyse und der Identifi zierung neuer Pathogene hat die Hochdurchsatzsequenzierung an Bedeutung gewonnen. Auch für bereits bekannte Viren bietet diese Methode eine Reihe von Möglichkeiten. Einer-seits kann so das gesamte Genom abgedeckt und sequen-ziert werden, anderseits macht es die Analyse von Varianten möglich, welche durch klassische Sangersequenzierung gar nicht oder nur unzureichend detektiert werden können. Ferner ermöglicht die Sequenzierung ebenfalls Studien wie Transkriptomanalysen. Im Folgenden soll das Verfahren und das Potential für die Diagnostik dargestellt werden.

Sequenzierplattformen für das Next-Generation SequencingAuf dem Markt gibt es mittlerweile eine Handvoll Hoch-durchsatzsequenzierer unterschiedlicher Firmen. So bietet Life Technologies neben dem Ion Torrent außerdem den SOLiD als Sequenzierplattform an, von Roche wird noch bis

2016 der Genome Sequencer FLX verfügbar sein. Ebenso bietet Illumina verschiedene Geräte an. Während die bereits genannten Geräte der zweiten Generation des Sequenzie-rens angehören, bietet Pacifi c BioScience mit dem PacBio ein Gerät der dritten Generation an und auch Oxford Nanopore befi ndet sich mit einem Gerät der dritten Generation bereits in der Testphase. Alle Systeme haben unterschiedliche Vor- und Nachteile (siehe Tab.1), sodass die Wahl des Sequen-zierers von der entsprechenden Fragestellung abhängig ist. Für Metagenomanalysen sind beispielsweise der Ion Torrent und der GS-FLX nutzbar, da hier eine Kontamination am geringsten ist, wohingegen sich die Illumina-Geräte auf Grund ihres hohen Durchsatzes für Amplikon- und Volllän-gensequenzierung eignen.

Probenvorbereitung und SequenzierungFür die Geräte der 2. Generation (Ion Torrent, 454, Illumina, SOLiD) ist das Prinzip der Probenvorbereitung ähnlich. Zunächst wird die doppelsträngige DNA auf eine, von der Sequenzierplattform abhängigen, Länge fragmentiert. Für den Ion Torrent PGM und den Illumina MiSeq werden beispielsweise Fragmentgrößen von 300-500 Basenpaaren (bp), für den 454 GS-FLX von 800-1000 bp verwendet. Anschließend werden an die Enden dieser Fragmente Adapter ligiert um eine DNA-Bibliothek zu generieren. Mit Hilfe dieser Adapter erfolgt im nächsten Schritt eine klonale Amplifi kation der DNA-Bibliothek. Das heißt, jedes DNA-Fragment wird unabhängig voneinander amplifi -ziert um im folgenden Sequenzierprozess für die nötige Signalverstärkung zu sorgen. Diese Amplifi kation kann auf verschiedenen Wegen geschehen. Für den 454, den SOLiD und den Ion Torrent wird eine Emulsions-PCR (emPCR)

genutzt. Dabei wird eine Wasser-in-Öl-Emulsion hergestellt, wobei jedes Wassertröpfchen einen Mikroreaktor darstellt, in dem sich jeweils ein DNA-Fragment der Bibliothek, ein DNA-Bead und die benötigten Primer, Nukleotide und die Polymerase befi nden. Durch das Verhältnis von DNA-Beads zu DNA-Fragmenten der Bibliothek wird gewährleistet, dass statistisch nur jeweils ein DNA-Fragment an ein DNA-Bead bindet und entsprechend klonal amplifi ziert wird. Illumina nutzt für die klonale Amplifi zierung das Prinzip der Brücken-Amplifi kation. Hier binden DNA-Fragmente an eine mit Adaptern besetzte Oberfl äche. Da beide Enden des DNA-Fragments mit Adaptersequenzen versehen sind, bindet das zweite Ende des DNA-Fragments ebenfalls an die Ober-fl ächen-Adapter und es entsteht eine „Brücke“, wobei die Oberfl ächenadapter als Primer für die Amplifi kation dienen. Es entstehen sogenannte „Cluster“. Hierbei ist die statistische Verteilung von DNA-Fragment zur Fläche der entscheidende Faktor. Während der Sequenzierung erfolgt die Detektion der eingebauten Nukleotide in der Regel über optische Signale, welche von einer Kamera detektiert, übereinandergelegt und anschließend von einer Software in eine Nukleotidsequenz übersetzt werden. Lediglich der Ion Torrent bedient sich keiner optischen Detektionsmethode. Hier wird die Konzen-tration der frei werdenden Protonen bzw. die pH-Wertände-rung während des Einbaus eines Nukleotids gemessen.

Was ist eine „Metagenomanalyse“?Die Metagenomanalyse ist die Untersuchung der Zusammen-setzung einer Population auf genomischer Ebene und die Identifi zierung der in ihr enthaltenen Organismen und Viren. Abb.1 zeigt schematisch den Ablauf einer Metagenomun-tersuchung. Dabei ist gerade der bioinformatische Anspruch dieser Analysen sehr hoch, um möglichst viele Organismen und Viren innerhalb der untersuchten Population in einer angemessenen Zeit zu identifi zieren. Hierfür stehen verschie-dene Software-Anwendungen zur Verfügung, unter anderem der automatisierte Workfl ow RIEMS (Reliable Information Extraction for Metagenomic Sequence datasets)1, welcher jede Read-Sequenz eines Datensatzes in einer kaskaden-ar-tigen Abfolge taxonomisch zuordnet. Damit ist es möglich,

Abb. 1: Schematische Darstellung der Metagenomunter-suchung (A, B) Probenentnahme, Nukleinsäureextraktion und Herstellung einer DNA-Bibliothek (C) Sequenzierung der DNA-Bibliothek (D) Bioinformatische Auswertung der erhaltenen Sequenzdaten (E) Taxonomische Zuordnung der Sequenzdaten2

ein umfassendes Bild über die Zusammensetzung einer Probe zu erhalten.

Der Erfolg der Metagenomanalyse hängt jedoch nicht nur von der Probenvorbereitung, dem jeweiligem Sequenzier-system und der Datenauswertung ab, sondern wird auch entscheidend durch das Probenmaterial bestimmt. Da für Metagenomanalysen fast ausschließlich Organmaterial zur Verfügung steht, bildet hier das Wirtsgenom das größte Problem. Dieses wird ebenfalls sequenziert und macht in der anschließenden Datenanalyse den Großteil der Sequenzen aus. Da im Vorfeld nicht bekannt ist, ob es sich um ein DNA- oder RNA-Virus handelt, bietet es sich im Allgemeinen an, RNA zu extrahieren und diese für die Sequenzierung zu nutzen, da replizierende DNA-Viren auf mRNA-Ebene detektiert werden können. Hier sind sto� wechselaktive Organe wie z.B. die Leber sehr problematisch, da der Anteil an wirtseigener mRNA entsprechend groß ist. Zu beachten ist ebenfalls der Zeitpunkt der Probennahme und die Art der Probe (Organsystem, Serum, Blut, Nasentupfer etc.). Ist das Tier nicht mehr virämisch bzw. kommt das entsprechende Pathogen nicht oder nicht in ausreichender Menge in der gewählten Probenmatrix vor, ist auch hier die Virusdetek-tion unwahrscheinlich. Manchmal kann jedoch auch schon die Detektion von einer Handvoll oder selbst einer einzigen virusspezifi schen Sequenz ausreichend sein, um das entspre-chende Pathogen zu identifi zieren und anschließend mittels klassischer Diagnostik den Befund zu bestätigen. Dabei stellt die Metagenomanalyse immer nur einen Startpunkt dar, der dann mit anderen Methoden weiter verfolgt werden kann.

1 Scheuch M, Höper D, Beer M. 2015. RIEMS: a software pipeline for sensitive and comprehensive taxonomic classi-fi cation of reads from metagenomics datasets. BMC Bioin-formatics 16:69

2 Höper D. 2014. Ein Virus wird entdeckt: Forschung und Diag-nostik mit dem Next Generation Sequencing. Forschungsre-port 2:20-23


Suvaxyn®CSF Marker – der KSP-Markerimpfsto� „CP7_E2alf“ wurde nach über 10 Jahren Entwicklungsarbeit durch die Europäische Arzneimittelagentur zugelassen

Sandra Blome und Martin Beer

Friedrich-Loe� er-Institut (FLI), Institut für Virusdiagnostik, Greifswald – Insel Riems

Die Klassische Schweinepest (KSP) gehört zu den wichtigsten Infektionskrankheiten der Schweine und ist aufgrund ihrer Konsequenzen für die Schweineindustrie weltweit gefürchtet. In der Europäischen Union wird seit 1990 eine strikte, auf die Tilgung der Seuche ausgerichtete Bekämpfungsstrategie ohne prophylaktische Impfung umgesetzt. Daher trafen Einträge des KSP Virus (KSPV) seither auf eine voll empfäng-liche Schweinepopulation. Insbesondere in schweinedichten Gebieten bedeutet dies hohe ökonomische Verluste und eine immense Anzahl zu tötender, häufi g gesunder Tiere. Dies ist sowohl aus ethischen sowie ökonomischen Gesichtspunkten fragwürdig und dem Verbraucher, vor allem vor dem Hinter-grund der Existenz leistungsfähiger Impfsto� e, nur schwer zu vermitteln.

Die entsprechenden Rechtsvorschriften sehen allerdings durchaus die Möglichkeit einer Notimpfung im Krisen-fall vor und beschränken dies nicht auf eine Impfsto� art. Aufgrund von Handelsrestriktionen, denen konventionell geimpfte Tiere und ihre Produkte unterliegen, ist jedoch nur der Einsatz von Impfsto� en diskutabel, die eine Di� eren-zierung von geimpften und infi zierten Tieren ermöglichen (Markerkonzept; DIVA). Leider waren die bislang verfügbaren DIVA KSP-Impfsto� e mit deutlichen Schwächen behaftet (mehrfache Impfung, keine orale Vakzinierung), so dass von der Notimpfmöglichkeit im Hausschweinebereich nicht bzw. kaum Gebrauch gemacht wurde. Auch bei der Notimpfung von Schwarzwildpopulationen würde der Einsatz eines DIVA-Impfsto� es deutliche Vorteile bringen, da die Seuchen-situation durch die Testmöglichkeiten besser nachvollzogen werden kann.

In den letzten 10 Jahren wurde, im Rahmen von zwei aufein-anderfolgenden EU-geförderten Forschungsprojekten, einer der erfolgversprechendsten Lebendimpfsto� kandidaten für die Impfung von Haus- und Wildschweinen, „CP7_E2alf“, unter maßgeblicher Beteiligung des FLI, konstruiert, getestet und zur Marktreife geführt. Bei der Entwicklung machte man sich die Möglichkeit zunutze, chimäre Pestiviren auf der Basis sogenannter infektiöser Klone herzustellen. Das Virus

„CP7_E2alf“ beruht auf dem infektiösen Klon des zytopatho-genen Bovinen Virusdiarrhöevirus (BVDV) „CP7“. Die für das Hauptimmunogen der Pestiviren, das Hüllglykoprotein E2, kodierende Region wurde durch das entsprechende Teilstück des KSPV-Stammes “Alfort 187” ersetzt. So ließen sich die Vorzüge eines Lebendimpfsto� es mit einem tragfähigen Markerkonzept vereinen. Die serologische Di� erenzierung erfolgt anhand der Detektion von KSPV-spezifi schen Erns-An-tikörpern, die nur nach Feldvirusinfektion nachweisbar sind. Darüber hinaus wurde eine impfvirusspezifi sche Real-Time RT-PCR entwickelt, die auch ein genetisches DIVA-Konzept möglich gemacht hat.

Im Rahmen der Impfsto� testungen, die durch Arbeitsgruppen des FLI und internationale Partner durchgeführt wurden, konnte gezeigt werden, dass der chimäre Impfsto� genetisch stabil und unschädlich für die Zieltierart (Haus- und Wild-schwein) ist. Des Weiteren überschreitet der Impfsto� nicht die Plazenta und kann keine persistierenden Infektionen induzieren. Es konnte zudem gezeigt werden, dass in anderen relevanten Spezies (kleine Wiederkäuer, Rinder, Kaninchen) nach Inokulation keine produktive Infektion entsteht.

In Wirksamkeitsprüfungen wurde belegt, dass ein sehr früher, langanhaltender und belastbarer Schutz gegen hoch-virul-ente KSPV-Stämme und relevante, moderat-virulente Feld-stämme der letzten Jahre (inklusive KSPV „Rösrath“) nach einmaliger Impfung mit „CP7_E2alf“ besteht. Maternale Antikörper können, wie bei anderen Lebendimpfsto� en, die Schutzwirkung beeinfl ussen und der vertikale Schutz kann bei sehr früher Belastungsinfektion mit sehr hoch virulenten KSPV-Stämmen variieren. Diese Punkte sind bei der Planung einer Impfstrategie zu bedenken und in die Risikoabwägung einzubeziehen.

Für die serologische Markerdiagnostik steht derzeit ein zuge-lassenes kommerzielles System zur Verfügung (ehemals Fa. Prionics) und weitere Tests befi nden sich in der fi nalen Phase der Entwicklung.

Basierend auf den vorgelegten Daten wurde der Impf-sto� kandidat „CP7_E2alf“ unter dem Handelsnamen „Suvaxyn®CSF Marker“ (Fa. Zoetis) im Februar 2015 durch die Europäische Arzneimittelagentur (EMA) zugelassen und steht nun für den Einsatz als Lebendmarkerimpfsto� für Hausschweine zur Verfügung.

Workshop „Molekulare Infektionsdiagnostik in der Veterinärmedizin“ erfolgreich durchgeführt

Dr. Bernd Ho� mann

Friedrich-Loe� er-Institut (FLI), Institut für Virusdiagnostik, Nationales Refe-renzlabor für Blauzungenkrankheit Institut für Virusdiagnostik, Greifswald – Insel Riems

Die Fachgruppe AVID der DVG hat, in Zusammenarbeit mit dem Institut für Virusdiagnostik am Friedrich-Loe� er-Insti-tut, sehr erfolgreich einen Workshop zur molekularen Diag-nostik von Infektionserregern durchgeführt. In zwei Durch-gängen von jeweils 10 Personen trafen sich vom 10.-12. März und 17.-19. März 2015 insgesamt 20 interessierte Kollegin-nen und Kollegen, um in den Laboren des FLI-Standorts Insel Riems verschiedenste Aspekte der modernen molekularen Infektionsdiagnostik in der Veterinärmedizin zu diskutieren und entsprechende Erfahrungen durch theoretische Un-terweisungen sowie praktisches Arbeiten zu gewinnen und auszubauen. Der Workshop wurde von Dr. Bernd Ho� mann, Leiter des Nationalen Referenzlabors für Blauzungenkrank-heit und AVID-Vorsitzender, organisiert und richtete sich besonders an technische Kräfte und Jungwissenschaftler/Neueinsteiger im Bereich der veterinärmedizinischen Mole-kulardiagnostik. Somit war es nicht verwunderlich, dass mit 13 technischen Kräften diese Gruppe von Teilnehmern be-sonders stark vertreten war.

Die Schwerpunkte des praktischen Teils des Workshops wa-ren die manuelle und automatisierte Nukleinsäure-Extrak-tion mittels Silikamembran- und magnetic bead-basierten Verfahren sowie die Durchführung und Auswertung von Re-al-Time PCR-Analysen an den verschiedensten PCR-Cyclern. Dazu konnten die Teilnehmer auf insgesamt 9 unterschied-liche Real-Time PCR-Cycler von 7 Firmen zurückgreifen. Ne-ben der Möglichkeit der praktischen Testung dieser Cycler sowie der entsprechenden Software wurden Stärken und Schwächen der einzelnen Geräte besprochen und diskutiert. Die praktische Arbeit wurde in Teams von 2 Teilnehmern so-wie einer betreuenden Technischen Assistentin durchgeführt und ermöglichte so einen intensiven Erfahrungsaustausch. Neben der praktischen Arbeit wurden theoretische Grundla-gen zur Nukleinsäure-Extraktion und Real-Time PCR vermit-telt. Hierbei wurden besonders eigene Erfahrungen aus dem Referenzlabor mitgeteilt sowie Kit-Validierungen und neue Entwicklungen auf dem Gebiet der molekularen Diagnostik vorgestellt. Insbesondere die Schnell-Extraktion und high-speed Real-Time PCR, aber auch die Vorstellung der digitalen PCR als besondere Anwendung der Real-Time PCR wurden besprochen. Den Abschluss des theoretischen Teils des Work-shops bildete ein Vortrag zur Funktionsweise und Anwen-dungsmöglichkeiten von klassischer Sanger-Sequenzierung und des Next-Generation Sequencing. Die FG AVID dankt allen Kolleginnen und Kollegen des FLI, ohne deren Zuspruch und Einsatz diese Veranstaltung nicht möglich gewesen wäre. Hierbei seien insbesondere die tech-nischen Kräfte der Nationalen Referenzlabore für Blauzun-genkrankheit, klassische Schweinepest und Maul- und Klau-enseuche genannt, die den praktischen Teil des Workshops intensiv geplant und begleitet haben. Die sehr positive Resonanz der Teilnehmer auf den Inhalt und die Durchführung des Workshops soll Grundlage für die Planung weiterer entsprechender Angebote sein. Die FG AVID und das Friedrich-Loe� er-Institut streben damit eine Optimierung der veterinärmedizinischen Infektionsdiagnos-tik an und bauen die vorhandenen engen Kontakte mit den staatlichen und privaten Untersuchungseinrichtungen durch Workshop-Angebote weiter aus.


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wir können Ihnen im ersten „LABLOEFFLER“ für 2015 wieder ein breites Themenspek-trum aus der Arbeit des FLI vorstellen. Mit drei Beiträgen sind die Ringversuche diesmal stark vertreten. Außerdem informieren wir Sie über den aktuellen Stand zu alten und schon fast vergessenen Infektionskrankheiten wie Rotz und Besnoitiose. Ebenfalls beleuchtet werden die porcine epidemische Diarrhö, die im letzten Jahr besonders in den USA zu sehr hohen Verlusten in den Schweinebeständen führte, und RHDV-2, zu dem in der letzten Zeit vermehrt Anfragen hinsichtlich der Impfung von Kaninchen am FLI eingingen. Vorstellen möchten wir aber auch die Möglichkeiten des Next-Generation Sequencing für die Diagnostik. Diese Methode hat sich in den letzten Jahren enorm weiterentwickelt und wird in absehbarer Zeit zu weiteren Veränderungen in der Tierseuchendiagnostik führen.Wie gewohnt, fi nden Sie zudem die aktuellen Übersichten der Nationalen Refe-renzlaboratorien und der seit der letzten Ausgabe zugelassenen Diagnostika.Besonders hinweisen möchten wir auf die Ankündigung der 7. Riemser Diagnos-tiktage, und ich ho� e sehr, viele von Ihnen im November in Greifswald begrüßen zu dürfen.Wie immer bitten wir an dieser Stelle um Rückmeldungen zum LABLOEFFLER – was fehlt, was können wir noch optimieren? Oder was gefällt Ihnen besonders?Zuerst einmal wünschen wir Ihnen aber viel Freude beim Lesen!

Mit kollegialen Grüßen,Martin Beer und das Redaktionsteam

Erteilung einer Zulassung gemäß § 23 der Tierimpfsto� -Verordnung (10.2014 bis 04.2015)

Bezeichnung des Mittels Art der Anwendung

Zul.-Nr. Datum der Zulassung

Pharmazeutischer Unternehmer

Anti-Borrelia-ELISA Hund in den Handelsformen:1. Anti-Borrelia-ELISA Hund (IgG) Kurzform: Anti-Borrelia Hund/Dog IgG

2. Anti-Borrelia-ELISA Hund (IgM) Kurzform: Anti-Borrelia Hund/Dog IgM

ELISA FLI-B 657 10.10.2014 EUROIMMUND-23560 Lübeck

cattletype BHV1 gE Ab ELISA FLI-B 664 19.11.2014 QIAGEN Leipzig GmbHD-04103 Leipzig

Kylt MGS Triplex – DNA Extraktions- und Real-Time PCR Detektionskit für Mycoplasma gallisepticum und Mycoplasma synoviaeKurzform: Kylt MGS Triplex

DNA-Extraktion und Real-Time PCR

FLI-B 663 24.11.2014 AniCon Labor GmbHD-49685 Höltinghausen

Kylt Infl uenza A Real-Time RT-PCR Detektionskit zum Nachweis von Infl uenzavirus Typ AKurzform: Kylt Infl uenza A

Real-Time RT- PCR FLI-B 672 09.12.2014 AniCon Labor GmbHD-49685 Höltinghausen

Anaplasma-ELISA DOGKurzform: Anaplasma-ELISA

ELISA FLI-B 678 16.12.2014 AFOSA GmbHD-15827 Blankenfelde-Mahlow

RealPCR BVDV RNA Test Real-Time PCR System

FLI-B 671 18.12.2014 IDEXX Europe B.V.NL-2132 LR Hoofddorp

ADIAVET PARATB REAL TIME Real-Time PCR FLI-B 650 19.12.2014 bioMérieux Deutschland GmbHD-72622 Nürtingen

virotype ASFV PCR KitKurzform: virotype ASFV

Real-Time PCR FLI-B 670 20.02.2015 QIAGEN Leipzig GmbHD-04103 Leipzig

ID Screen IBR gB CompetitionKurzform: IBRGBC

ELISA FLI-B 614 17.03.2015 ID VET SARLF-34790 Grabels

LSI VetMAX Coxiella burnetii-Absolute Quantifi cationKurzform: LSI VetMAX Q Fever

Real-Time PCR FLI-C 004 13.04.2015 Life Technologies LyonF-69380 Lissieu

INgene q PPA q PCR FLI-B 669 15.04.2015 INGENASAES-28037 Madrid

bactotype MAP PCR KitKurzform: bactotype MAP

Real-Time PCR FLI-B 651 21.04.2015 QIAGEN Leipzig GmbHD-04103 Leipzig

Eradikit EIAV ELISA ELISA FLI-B 676 21.04.2015 In3diagnostic s.r.l.I-10095 Grugliasco (TO)

Alle Informationen der Zulassungsstelle fi nden Sie auch auf der Internetseite des FLI unter www.fl i.bund.de in der Rubrik Service, Zulassungsstelle.

Bei Fragen wenden Sie sich bitte an Dr. Jana Heidrich (jana.heidrich@fl i.bund.de).

Institut für molekulare PathogeneseInstitut für bakterielle Infektionenund ZoonosenNaumburger Straße 96 a D - 07743 JenaTel.: +49 3641 804 - 0

Institut für Tierernährung Bundesallee 50 D - 38116 BraunschweigTel.: +49 531 596 3102

Institut für Nutztiergenetik Höltystraße 10 D - 31535 NeustadtTel.: +49 75034 871 - 0

Institut für Tierschutz und Tierhaltung Dörnbergstraße 25 + 27 D - 29223 CelleTel.: +49 5141 3846 - 0

Friedrich-Loe�er-Institut, Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit

Institut für molekulare Virologie und ZellbiologieInstitut für InfektionsmedizinInstitut für VirusdiagnostikInstitut für Neue und Neuartige TierseuchenerregerInstitut für ImmunologieInstitut für Epidemiologie

Südufer 10D - 17493 Greifswald - Insel RiemsTel.: +49 38351 7 - 0

Documents

LabLoeffler Ausgabe 10/2015 - openagrar.de · Workshop „Molekulare Infektionsdiagnostik in der Veterinärmedizin“ erfolgreich durchgeführt Seiten 26-29 Nationale Referenzlaboratorien