LABORATOIRE DE GENETIQUE MICROBIENNEtheses.univ-oran1.dz/document/TH4138.pdf · LABORATOIRE DE GENETIQUE MICROBIENNE Mémoire de fin d ... 34 souches ont été apparentées au genre

الجمھوریة الجزائریة الدیمقراطیة الشعبیة

وزارة التعلیم العالي و البحث العلمي

REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE

MINISTAIRE DE L4ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE

UNIVERSITE D’ORAN

FACULTE DES SCIENCES

DEPARTEMENT DE BIOLOGIE

LABORATOIRE DE GENETIQUE MICROBIENNE

Mémoire de fin d’étude

En vue de l’obtention du Diplôme de Magister

En Biologie

OPTION : Biologie moléculaire et génétique des microorganismes

Thème

Mme Mesli-Taleb Farida Président Professeur Université d’ORAN

Mme Matallah-Boutiba Amaria Examinateur MCA Université d’ORAN

Mr Saidi Noureddine Examinateur MCA Université d’ORAN

Mr Bensalah Farid Encadreur Professeur Université d’ORAN

Mme Merassi-Guermouche Amel Invitée MAA Université d’ORAN

2012-2013

Caractérisation des différentes aptitudes des souches de la flore tellurique et marine du genre Rhodococcus isolées de

sites contaminés

Présenté par : DJOUAD MOKHTAR EDDINE soutenue le 20/10/2013

Dédicace

Je dédie ce mémoire : A mes parents qui n’ont jamais cessé de ménager leurs

efforts Pour atteindre ce niveau. Leurs sacrifices, conseils

Et patience, compréhension et encouragements

A toutes et tous, ceux qui étaient la pour moi, avec leur présence et appui

Jamais de simples mots me permettront de vous exprimer mes

Remerciements. A ma grande famille, grands et petits.

A mes amis

Mokhtar-eddine

Remerciements

Je tiens tout d’abord à remercier le bon Dieu tout puisant de m’avoir aidé à réaliser ce modeste travail. Je remercie très chaleureusement mon professeur et encadreur Mr BENSALAH Farid ., pour ça confiance , aide et pour son temps Ce monsieur qui n’a économisé aucun effort pour que ce mémoire puisse voire le jour. Je lui exprime ma gratitude de m’avoir dirigé, encouragé et surtout aidé afin de réaliser ce travail. J’adresse mes remerciements à mon Mme GUERMOUCHE Amel ., pour son aide et son appuie Je remercie les membres du jury, qui ont bien voulu examiner ce travail. Je remercie tous les enseignants de mon cursus universitaire qui ont contribué à ma Formation. Mes vifs remerciements vont, également, à tout le personnel du laboratoire de Générique microbienne « LGM », pour leurs aides et leur présence Sans oublier pas Salim , Rania , Yasmine , Hanane, Mr Maura et Mme Chaib Faiza pour leur aide précieuse dans mon travail et leurs contribution logistique importante Enfin, il me serait difficile d’omettre de remercier tous ceux qui ont contribué de Prés ou de loin à ce travail. Qu’ils trouvent dans ses quelques lignes l’expression de mes Sincères remerciements.

Sommaire

Dédicace et Remerciements

Liste d’abréviation

Liste des figures et tableaux

Résumé

Introduction………………………………………………………………………………….1

Chapitre I : Etudes bibliographique

I – Les Rhodococcus agents de biodégradation dans la nature . ..……………………………4

1- Préambule ……...……………………………………………….……………………….4

2 - Historique du Genre Rhodococcus : Un coque rouge…………….…………………..….5

3- Systématique actuelle …...…….……………………………………….………………...10

3.1- Le genre Rhodococcus...…..………………………………………….………………10

3.2 – Classification des Rhodococcus ………...……………………………...…………...13

3.2.1 – Taxonomie numérique …………..…………….……………………………...…13

3.2.2 - Chemotaxonomie ……………………………….………………………………..13

3.2.3- Taxonomie moléculaire ……………………………….…………………………14

3.3- Espèces actuelles de Rhodococcus ………...………..…….…………………………15

4- Ecologie des Rhodococcus ………...………..…………………………………….…17

5- La Nouvelle identification des Rhodococcus ………..………………………………17

6- Rhodococcus dans la biotechnologie....................................................................…...19

6.1- Bioremediation et Biodégradation……….……………..………………………….19

6.2- Production des Biosurfactants ………………………………………………...20

6.3- Synthèse Industrielle et transformations…………………………...………………20

6.4- Applications Diverse……………………………………….…………………………22

II- Caractérisation génétique des souches ………………………………………………....23

1- PCR…….………………………………………………………………………………...23

2- Méthodologies moléculaires appliquées à l’étude des souches bactériennes telluriques …………………………………………….24

2.1- Analyse des profils de restriction des ADNr 16S amplifiés (ARDRA) ……………..25

2.2- Séquençage des ADNr 16S et Analyse phylogénétique …………...………………...27

III- Intérêt des biosurfactants dans la caractérisation …………………………………29

Les biosurfactants ………………………………………………………………………...29

1- Définitions ………………………………………………………………………...29

2- Structure et classification des biosurfactants ………………………………….………...29

3- Biosynthèse et rôle physiologique ………………………………………………...30

4- Rôle des biosurfactants dans la biodégradation des hydrocarbures ……………….....31

5- Potentiels des biosurfactants ………………………………………………………....32

6- Les différentes applications des biosurfactants ……………………………..…………...32

7 - Biosurfactants des Rhodococcus………………………...………………………………34

Chapitre II : Matériel et Méthodes

II- Méthodologie de travail ……………………………………………………….……35

II.1 - Echantillonnage et prélèvement ……………….………………………………….…35

II.2- Isolement……..…………………………………………………………………….…..36

II.2.1- Méthode classique sans enrichissement …………………………………………...36

II.2.2- Méthode avec pré-enrichissement ……………………………………………… ..36

II.3- Purification ………………………………………………………………………...37

II.4- Conservation des souches purifiées……………………..……………………………..37

III- Identification des souches purifiées …………………………………………………39

III.1 - Etudes Morphologique : ………………………………..……………………………39

a- Macroscopique ……………………………………………………………………….39

b- Microscopique ………………………………………………………………………..39

1- L’Etat frais …………………………………………………………………………. ..39

2- Gram ………………………………………………………………………………...40

3- Mobilité ………………………………………………………………………………41

4- Recherche de spores ………………………………………………………………….41

III.2- Etudes biochimique et aptitudes : ……………………………………………………...41

a- Etudes biochimique : ………………………………………………………………....41

1- Etudes des types respiratoires …………………………….…………………………..41

2- Test catalase ………………………………………………………………………...42

3- Test NaCl …………………………………………………………………………….42

4- Test Urease ………………………………………………………………………...42

5- Digestion du Tween 80 ..……...……………………………………………………...42

b- Etudes des aptitudes et propriétés…………………..……………………………...…43

1- Test de dégradation du pétrole …..…….…..………………………………………...43

2- Test de production de Glycolipides ….…………......…………………………….....44

3- Test de dégradation du cholestérol….....……………………………………………45

4- Détermination de l’index d’émulsion E24………………………...………………….46

5- Interaction souches sélectionnées / pétrole brut …………………………………….46

6- Test de l’INT ………………………………………………..…………………….…47

7- Test d’hémolyse……………………………………………………………………...49

8- Culture sur gélose au sang (colonies)……………………………………………….49

IV- Identification par méthodes de biologie moléculaire ………………..……………….50

1- Amplification de l’ADNr 16S...…………………………………………………...50

a- Extraction d’ADN ………………………………………………………………....50

b- Amplification de L’ADNr 16S par PCR ………………………………………....51

b.1- Principe …………………………………………………………………….....51

b.2- Amplification …………….…………………………………………………..51

b.3- Electrophorèse de l’ADN …………….…………………………………...52

2- La recherche du gène Cholestérol Oxydase « CHO »……………………....53

a- Extraction d’ADN génomique ………………………….…………………………........53

b- Vérification qualitatif de l’ADN extrait …………….…………………………………...54

c- Préparation de la solution mixte …………….…………………………………………...54

d- Amplification du gène CHO ……….…………………………………………………....55

e- Electrophorèse de l’ADN………………………………………………………………...56

Chapitre III: Résultats et discussion

I- Isolement …………………………………………………………………………….58

1- Caractéristique des Echantillons ………………………………………………....58

2- Sélection des souches ……….…...……...…………………….……………………59

II- Identification des souches …………………………………………………………....59

II.1- Etudes Morphologique ………...……………………………………………………59

1- Etudes macroscopique ……………………………………………………………….59

2- Etudes microscopique ……………………………………………………………….63

II.2 - Etudes biochimique et aptitudes …………………………...………………………..71

a- Etudes biochimique …………………………………………………………………71

b- Etudes des aptitudes …………………………………………………………………75

III- Identification par méthodes de biologie moléculaire ………………………………....82

A – ARN S16 ………………….………..………………………………………….…….83

B – Gene CHO ………………………...……………………………………….…………84

Conclusion et perspective …………..………………………………………………………87

Référence bibliographique ………..…………………………………………………..........90

Annexes

Liste des Tableaux

Tableau 1 : exemple de la reclassification de quelque souche du genre Rhodococcus

Tableau 2 : les majeurs différences en chemotaxonomie entre les genre de la famille

Corynebacteriniae

Tableau 3a : les espèces appartenant au genre Rhodococcus et leurs écosystèmes d’isolement

Tableau 3b (suite) les espèces appartenant au genre Rhodococcus et leurs écosystèmes

d’isolement

Tableau 4 : gènes de quelques espèces de Rhodococcus codants pour des enzymes qui rentre

dans les voies catabolique des polluants

Tableau 5 : source microbienne et principaux type de biosurfactants (Desai et al.,1997)

Tableau 6 : composés chimique éliminés par biodégradation bactérienne ( Mulligan,2009)

Tableau 7 : Paramètres utilisés dans le test INT

Tableau 8 : caractères des échantillons et leurs sites de prélèvement

Tableau 9 : critères macroscopiques des isolats

Tableau 10 : aspect microscopique des souches isolées

Tableau 11 : tolérance de forte concentration au NaCl

Tableau 12 : indices d’émulsion E24 pour les souches testées

Liste des Figures

Figure 1 : arbre phylogénique des espèces appartenant au genre Rhodococcus

Figure 2 : Principe de la PCR « Polymérase Chain Reaction »

Figure 3a : Agrandissement d’un ribosome chez une bactérie.

Figure 3b : Modélisation tridimentionnelle du ribosome 70S composé de la grande sous-unité

50S (ARNr 5S ARNr 23S + 31 protéines) et la petite sous-unité 30S (ARNr 16S + 21

protéines).

Figure 3c : Exemple de repliement dans l’espace de l’ARNr 16S provenant de la petite sous-

unité 30S du ribosome (Stern et al., 1988b).

Figure 3d : Structure secondaire de l’ARNr 16S de Vibrio. Parahaemolyticus X56580

présentant les quatre principales séquences provenant de différents isolats de Vibrio

parahaemolyticus (Harth et al., 2007).

Figure 4 : Schéma général d’isolement et de purification des souches bactériennes contenues

dans les prélèvements de sol

Figure 5 : différentes Formes bactériennes sous microscope optique

Figure 6 : Production de biosurfactants et dégradation du pétrole brut en milieu liquide

Figure 7 : Flore tellurique sur GN apres 48 heures d’incubation

Figure 8 : Profil macroscopique de Rhodococcus erythropolis ( Ghent university, 2009)

Figure 9 : Test catalase

Figure 10 : croissance des isolat sur un milieu GN a forte concentration en NaCl ( 5 et 7 %)

Figure 11 : les isolats ayant montré une digestion sur milieu Tween80

Figure 12 : exemple de test des isolats sur milieu MSM-Pétrole

Figure 13: mettre en evidance la production de glycolipides sur milieu solide

Figure 14 : exemple de test des isolats sur milieu MSM-choléstérol

Figure 15 : calcule de l’indice d’émulsion E24

Figure 16 : Dégradation de pétrole brut et production de biosurfactant

Figure 17 : Test INT après interaction bactérie/ polluant

Figure 18 : culture sur gélose au sang

Figure 19: Amplification du fragment de l’ADNr 16S (1500 pb) par électrophorèse sur gel d'agarose

chez les isolats Figure 20 : Amplification Gène CHO (1600 pb) par électrophorèse sur gel d'agarose chez les isolats

Liste des Abréviation

ADN : Acide désoxyribonucléique

ADNr S16: ADN codant pour la sous unité 16S de l’ARN ribosomal

BET: Bromure d’Ethidium

BLAST : Basic Local Alignment Search Tool

C°: Celsius

CHO: cholesterol oxydase

dNTP :désoxycléoside triphosphate

E24: Index d’émulsion

EDTA: Ethylenediaminetetraacetic acid

GN : gélose nutritive

INT: chlorure de 2-(p-iodophényl)-3(p-nitrophényl)-5-phényI tétrazolium.

LB : milieu Luria Bertani

LGM : laboratoire de génétique microbienne

MSM : Mineral salt medium

NCBI : National Center for Biotechnology Information

Pb : paire de base

PCR : Polymérase chain reaction

pH : potontiel hydrogen

R. : Rhodococcus

Rpm : Rotation par minute

SDS : sodium dodécyl sulfate

TBE : Tris borate EDTA

TE : Tris EDTA

UV : ultraviolet

Résumé Dans notre travail on s’est intéressé au genre Rhodococcus qui se distingue par son aptitude à

dégrader plusieurs polluants ou même faire la bioconversion et la biosynthèse d’une multitude

de produits intéressants qui ont une valeur appréciée dans plusieurs domaines notamment les

secteurs de l’environnement, industries et sciences médicales.

Une soixantaine de souches ont été isolées à partir de différents sites en particulier des terres

agricoles dans des régions variées, sites pollués (essence, gasoil, goudron, huile résiduelle),

patte graisseuse et eau de mer polluée par des hydrocarbures.

34 souches ont été apparentées au genre Rhodococcus après criblage primaire selon les

propriétés physico-chimiques, biochimique et une pré-identification macroscopique et

microscopique, et selon des aptitudes biologique notamment l’activité lipolytique qui a été

mise en évidence grâce au test patch sur milieu Tween 80-Agar, une vingtaine de souches ont

présentés une activité lipolytique traduite par des halos opaque autour des patchs.

25 souches ont présenté une activité catabolique vis-à-vis du pétrole brut mis en évidence par

des halos claires sur milieu MSM vaporisées par le polluant (pétrole) et ensemencées par les

différents isolats, ces derniers peuvent donner des biosurfactants actifs comme produits de

synthèse, cette étude est réalisé en faisant une culture sur MSM liquide avec le pétrole brut

comme seule source de carbone, neuf souches sur douze testées ont présenté un pouvoir de

dégradation et ont pu donné un biofilm qualifiée de biosurfactant, le niveau de biodégradation

a été estimé par le test INT. Le calcul de l’indice d’émulsion à montré des souches ayant un

E24 égal à 54.54, 31.81, 27. 27 ce qui représente des valeurs remarquables nécéssitant une

investigation plus approfondie vis-à-vis de leur interêt en biotechnologie.

D’autre part, 19 souches ont présenté une activité catabolique sur le cholestérol, cette activité

est vraisemblablement due à la Cholestérol oxydase, une enzyme contrôlé par le gène CHO

dont l’amplification par des amorces spécifiques utilisées dans les techniques de biologie

moléculaire à base de PCR a abouti à un amplifiat pour deux souches témoin du laboratoire

(Pseudomonas) et pour une souche apparentée au genre Rhodococcus (LBTP2).

L’optimisation d’une méthode d’extraction d’ADN de souches apparentés au genre

Rhodococcus et une approche de diagnostique à base de PCR a été réalisée afin d’amplifier le

gène de l’ADNr 16S de 1500 pb par l’utilisation d’un couple d’amorces universelles et un

programme d’amplification approprié.

Mots clé : Rhodoccocus, biosurfactants , INT, E24, cholestérol oxydase , PCR , ADNr 16S.

Résumé Summary:

In this work we are more interested in the genus Rhodococcus, which is distinguished by its

ability to degrade several pollutants or even make the bioconversion and the biosynthesis of a

variety of interesting products that have appreciated in value several areas including areas of

environmental, industrial and medical sciences.

Sixty strains were isolated from different sites in particular agricultural land in various areas

polluted sites (gasoline, diesel, tar, and residual oils), fat legs and water polluted by

hydrocarbons Sea.

34 strains were related to the genus Rhodococcus after primary screening according to the

physico-chemical properties, biochemical and pre-macroscopic and microscopic

identification, and on biological skills including lipolytic activity is highlighted by the patch

test middle-Tween80 Agar, twenty strains presented lipolytic activity resulted in opaque halos

around patches.

25 strains showed a catabolic activity vis-à-vis crude oil highlighted by clear halos on MSM

medium sprayed by the pollutant (oil) and seeded by the different isolates, they may pledge

assets as biosurfactants synthesis products this study is carried out by a culture liquid MSM

with crude oil as the sole carbon source, nine out of twelve strains tested showed a power

degradation and have given a qualified biosurfactant biofilm, the level of biodegradation was

estimated INT by the test. The calculation of the index emulsion showed strains with E24

equal to 54.54, 31.81, 27.27, which represents outstanding value requiring further

investigation toward their interest in biotechnology.

On the other side, 19 strains showed a catabolic activity on cholesterol, this activity is

probably due to the cholesterol oxidase, controlled by the CHO gene. Amplification with

specific primers used in molecular biology techniques based on PCR, amplification product

resulted in a witness for two laboratory strains (Pseudomonas) and a strain related to the

genus Rhodococcus (LBTP2).

The optimization of a DNA extraction method related to the genus Rhodococcus strains and a

diagnostic approach based on PCR was performed to amplify the 16S rDNA gene of 1500 bp

by using a pair of universal primers and appropriate program amplification.

Keywords: Rhodoccocus, biosurfactants, INT, E24, cholesterol oxidase, PCR, DNAr 16S

Résumé

:الملخص

یل التحویل عیل عدة ملوثات أو حتى تفتحلذي یتمیز بقدرتھ على ، ال جنس رودوكوكوس في عملنا ھذا كنا أكثر اھتماما في

تقدر قیمة في العدید لوثات والنفایات الصناعیة ھذه المیزة مثیرة لالھتمام ومجموعة متنوعة من المالبیولوجي والحیوي ل

.مجاالت البیئیة والصناعیة و العلوم الطبیةالمن المجاالت بما في ذلك

من مواقع مختلفة على وجھ الخصوص األراضي الزراعیة في مختلف المناطق المواقع الملوثة ةتم عزل ستین سالل

.وثة بالھیدروكربوناتالملالبحر ، الدھون ومیاه )البنزین والدیزل والقطران والزیوت المتبقیة(

بعد الفرز االبتدائي وفقا لخصائص الفیزیائیة والكیمیائیة، جنس رودوكوكوس إلى ساللة انھا تنتمي 34یمكن اعتبار و

التحلیلي البیولوجیة بما في ذلك التحدید المجھري، وانطلقا من الخصائص و العینیةوالكیمیاء الحیویة ومعالجات ما قبل

.حول السالالت في بقع ساللة نشیطة حیث تمثل النشاط عشرین الذي ابرز ، Tween80والتي أبرزھا اختبار للدھون

وش قبال رشالم MSM على الوسط واضحة ھاالت أبرزھا التي الخام النفط اتجاه تقویضي النشاط سالالت 25 وأظھرت

عوامل فعالیة سطحیة بیولوجیة ھذه العزالت قد تعطي أن كما المختلفة، االختبار عزالتنمي لوالم) النفط( الملوثاتب

اثني أصل من تسعة ,للكربون وحید كمصدر الخام النفط مع السائل MSM في وسط الدراسة ھذه تتم ، التولیف منتجاتك

البیولوجي التحلل مستوى وقدر ،ھامة عوامل فعالیة سطحیة بیولوجیة وأعطتقوة التحلل أظھرت اختبار ةسالل عشر

قیمة یمثل الذي 27. 27 ،31.81 ،54.54 یساوي E24 أن سالالتاالستحالب لل مؤشر حساب وأظھر. INTختباربا

.الحیویة التكنولوجیا مجال في الذي تمثلھ ھتماماال نظرا لحیز التحقیق من مزیدا تتطلب ھامة

یكون ھذا النشاط نظرا ألوكسیدیز سالالت نشاط تقویضي على الكولیسترول، قد 19من ناحیة أخرى، أظھرت

تقنیات البیولوجیا الجزیئیة على حیث حولنا ابراز ھذا الجین عز طریق، CHOالكولسترول، والتي تسیطر علیھا الجینات

جنس المتصلة وساللة) (Pseduomonas مختبر سالالت من الثنینواھد االش في جزالمن التضخیم أدى، PCR أساس

إلى الحصول على ناتج إیجابي للتضخیم LBTP2)(الرودوكوكس

تشخیص یعتمد على البیولوجیا نا ھجتناو الرودوكوكوس جنسلتم إجراء التحسین من طریقة استخراج الحمض النووي

عن طریق استخدام زوج من زوج قاعدة 1500الذي یبلغ الجینوتحدید S 16 rDNAلتضخیم PCRالجزیئیة بواسطة

تضخیم لل مناسبو برنامج عالمي ال تضخیملمبتدئات ا

PCR ،16Sأوكسیدیز الكولسترول، ،INT ،E24، عوامل فعالیة سطحیة بیولوجیة، الرودوكوكوس :المفتاحیة كلمات

DNA

INTRODUCTION

Introduction

1

Depuis le siècle dernier et jusqu’à nos jours, l’importance de l’industrie pétrolière n’a cessé de

croître et ceci grâce au rôle stratégique et politique que le pétrole joue sur la scène mondiale

En effet, rien que pour l’année 2000, la production mondiale a atteint 11 millions de tonnes

par jour de produits pétroliers (Soltani, 2004).

Cependant, les effets dévastateurs de cette industrialisation et leur impact ont été évalué sur

l’environnement. En effet, de nombreux dégâts réels ont été constatés lors d’accidents (par

exemple fuite de pétrole), de rejets ou de déversements volontaires, pouvant entraîner des

catastrophes écologiques irréversibles. Les conséquences de ces pollutions écologiques,

peuvent avoir un impact soit direct ou indirect, sur la santé humaine et sur l’équilibre des

écosystèmes aussi bien marins que continentaux. La qualité des sols peut également en être

altérée (Gabet, 2004).

Par ailleurs, le problème majeur rencontré dans les sols pollués par les produits pétroliers est

l’atteinte de la nappe phréatique affectant ainsi la qualité des eaux, d’où la nécessité de leur

traitement (Perfumo et al., 2010).

Les techniques de remédiation des sols reposent sur des processus physicochimiques ou

biologiques. Il existe des techniques modifiant totalement l'intégrité des sols qui sont le plus

souvent très coûteuses et très complexes (Ballerini et Vandescateele,1999), seul la

bioremédiation reste la solution la plus efficace, la plus demandée car elle est moins coûteuse,

il s’agit d’une technique douce dont le principe repose sur la minéralisation complète des

produits pétroliers qui ne génèrent aucun sous produit toxique; contrairement aux procédés

physicochimiques qui consistent souvent en un transfert de la pollution d’un milieu à un autre

ou encore à son confinement, ces dernières années une tendance s’est distinguée dans

l’univers scientifique, des petites usines à l’échelle microscopique ont été découvertes.

Les bactéries sont des catalyseurs fondamentaux dans de nombreux procédés industriels dans

divers domaines d'application. Exemples d'activités qui font couramment usage de processus

bactériens sont les industries de l'environnement, de la pharmacie, de la biotechnologie et

alimentaires. Dans l'industrie, les procédés catalytiques chimiques nécessitent des pH

extrêmes et des conditions de température et de pression. Les bactéries sont utilisées pour

atteindre les mêmes processus dans des conditions plus modérées concernant ces variables.

Introduction

2

Cependant, les mécanismes d'adaptation et le métabolisme polyvalent de bactéries peuvent

être exploités pour accroître encore leur applicabilité.

Les bactéries Rhodococcus omniprésents affichent un large éventail de capacités

enzymatiques et ils peuvent être trouvés dans l’environnement d’une façon très répandue. Le

métabolisme polyvalent conférée par leur gamme élargie d'enzymes et de leur résistance

affichée fait que les souches de ce genre sont des candidats potentiels à être utiliser dans la

biotechnologie environnementale et industrielle (Bell et al.,1998). Les bactéries ont la

capacité d'utiliser différents mécanismes de défense et d'adaptation contre les environnements

hostiles. À ce jour, les mécanismes d'adaptation connus de Rhodococcus sont ceux associés à

la composition de la paroi cellulaire et de morphologie de la membrane cellulaire, et les voies

métaboliques / catabolique (Warhurst et Fewson 1994 , Bell, et al.,1998 de Carvalho et da

Fonseca, 2005b).

Dans ce travail on s’est intéressé plus au genre Rhodococcus qui se distingue par son aptitude

à dégrader plusieurs polluants notamment les hydrocarbures. Il est une véritable industrie qui

prend tendance à servir dans l’application dans la dépollution et la décontamination des sites

pollués par les différents types de contaminants. L’emploit du CTC (5-cyano-2,3-dotolyl

tetrazolium chloride) ou de l’INT (2(p-iodo-phenyl)-3-(p-nitrophenyl)-5-phenyl tetrazolium

chloride) permet de suivre l’activité respiratoire par l’apparition d’un cristal fluorescent (CTC

ou INT-Fromazan), Garland (1997) et Smalla et al. (1998). Le métabolisme du carbone (ayant

le polluant comme source) dans l’échantillon peut être ainsi appréhendé et du coup montrer la

biodégradation de ce polluant.

Les Rhodococcus rentrent aussi dans d’autres applications suite à leur pouvoir émulsifiant qui

aide à produire des émulsions oléophiles et des bases pour les crèmes, les films huileux et des

pâtes graisseuses. Leur application comme bioflocculants est très utilisée dans de nombreux

procédés industriels, y compris le traitement des eaux usées, le traitement en aval, la

nourriture et les technologies de fermentation. Ce genre peut effectuer la bioconversion et la

biosynthèse d’une multitude de produits intéressants qui ont une valeur appréciée dans

plusieurs domaines notamment les secteurs environnement, industries et sciences médicales.

Les cholestérol oxydases de Rhodococcus par exemple ont été étudiées et pourraient avoir des

applications dans l'industrie alimentaire ou dans la production de stéroïdes (Finnerty 1992;

Christodoulou et al.,1994. Kreit et al., 1994).

Introduction

3

D’autre part, les tréhaloses lipides et les glycolipides tensioactifs sont des biosurfactants

produits par les Rhodococcus et bactéries apparentées présentent des activités biologiques très

recherchées. Ce genre reste inconnu pour le large public des scientifiques par rapport aux

autres souches liées à l’environnement, dans ces caractéristiques biologiques ou encore moins

dans ces applications biotechnologiques.

Beaucoup de travaux ont porté sur l’optimisation de conditions de culture de ces bactéries in

vitro, l’évaluation de leur capacité d’émulsification, la production des biosurfactants et leurs

différentes applications. Cependant, aucune recherche n’a porté sur l’isolement et la

caractérisation de ces souches bactériennes indigènes des zones littorales ou désertiques de

l’Algérie, à l’exception des travaux de (Benmalek et al.,2001).

Dans un premier temps on envisage de faire un isolement de souches appartenant au genre

Rhodococcus à partir d’échantillons diverses (terre agricole, sol contaminé par le pétrole, eau

résiduelle, eau pollué par les hydrocarbures). Cet isolement sera suivi d’une purification, puis

une caractérisation des souches par approche phénotypique comme méthode classique d’une

pré-identification notamment une étude macroscopique et microscopique, colorations

spécifiques, mobilité et formation de spores aussi une caractérisation biochimique en se

basant sur les type respiratoires, catalase, estérase et tolérance au NaCl.

Dans un autre volet une caractérisation sera faite aussi par rapport à quelques aptitudes

biologiques dont la dégradation des hydrocarbures sur milieu solide MSM avec du pétrole

brut additionné par vaporisation et sur milieu liquide qui sera évalué par le test INT (sels de

tétrazolium). La production de biosurfactants actifs, dégradation de cholestérol ainsi que la

culture sur gélose au sang pour distinguer l’aspect mucoïdes des souches sera éléborée.

En dernier lieu, deux techniques d’extraction d’ADN seront réalisées, deux amplifications

seront effectuées par l’utilisation de deux programmes PCR. L’ADNr 16S va nous orienter

sur la taxonomie des souches isolées par un amplifiat de 1500 pb qui sera recherché et aussi

un dépistage de gène CHO (Cholestérol oxydase) sera accompli et un fragment de 1600 Pb

sera préconisé.

RECHERCHE

BIBLIOGRAPHIQUE

Recherche bibliographique

4

I – Les Rhodococcus agents de biodégradation dans la nature 1- Préambule

Le genre Rhodococcus dans le sous-ordre Corynebacteriniae a eu une histoire taxonomique

quadrillée, mais plusieurs incertitudes et confusions ont été résolues très tôt d'une manière

satisfaisante par l'application de chemotaxonomique à caractères phylogénétiques. Une telle

information a permis la création et la reconnaissance formelle d’isolats étroitement liés aux

genres Gordonia, de Tsukamurella et de Dietzia une fois placés d'une manière peu

convaincante dans le genre Rhodococcus, Nocardia et de Tsukamurella. Cependant, quelques

espèces nouvelles de représentation, n'ont été jamais formellement décrites.

Il est maintenant clair, que les rhodococci sont des organismes très importants,

particulièrement par leurs remarquables puissances métaboliques. Cela est souvent dû à leurs

plasmides mobiles, grands et habituellement linéaires de possession, portant des gènes codant

à des enzymes capables de dégrader une gamme impressionnante de composés organiques :

xenobiotiques et naturels dont certains sont susceptibles de poser des risques

environnementaux à long terme (Bell et autres 1998 ; Larkin et al.2006). Ainsi, leur potentiel

dans la bioremédiation est immense (Vander Geize et Dijkhuizen 2004).

Ils sont également connus pour produire des métabolites de potentiel industriel comprenant

des carotenoïdes, des bio-agents tensio-actifs et le bio-flocculation, acrylamide (Jones et

Goodfellow 2010). Ces seuls attributs soulignent l'importance de pouvoir identifier de telles

populations rapidement et sans équivoque, ce qui exige une classification convenable.

Comme la plupart des autres bactéries (Goodfellow et al., 1998 ; Jones et Goodfellow 2010).

Maintenant avec des techniques moléculaires, particulièrement les analyses d'ordre du gène

16S rRNA, cette confusion peut être résolue, et la taxonomie de Rhodococcus devient plus

stable. Pourtant plusieurs problèmes importants non résolus demeurent. En outre, comme

Goodfellow et autres l’ont discuté en 1998, plusieurs des nouveaux isolats environnementaux

montrant des activités métaboliques nouvelles n'ont été jamais caractérisés en juste

proportion, après l'isolement original pour permettre la validité de leur spéciation. En

conséquence, il est impossible de savoir si chaque isolat environnemental de Rhodococcus

représente la population d'anovel, ou est identique, et/ou étroitement lié à ceux utilisés déjà

dans des études précédentes. C'est une situation insatisfaisante qui compromet la

communication efficace entre les personnes travaillant avec des membres de ce genre. En fait,


5

en dépit des avancées considérables dans notre compréhension de leur systématique pendant

les dernières deux décennies, la même réticence de répondre à cette exigence essentielle

persiste. Le but dans cette recherche bibliographique est de présenter l'état actuel de la

taxonomie des membres du genre Rhodococcus et son caractérisation par des techniques

moléculaires plus puissantes maintenant disponibles et par l'application d'un éventail de

marqueurs phylogénétiques (Gürtler et al., 2004).

2 – Historique du Genre Rhodococcus : Un coque rouge

L’observation de Goodfellow et al. (1998) et Jones et Goodfellow (2010) fournit des vérités

accablantes sur l'histoire de ce genre difficile à identifier. L’impact chemo-taxonomique et

les approches moléculaires ont pu permettre de définir plus précisément ce genre.

Zopf (1891) a d'abord proposé de créer le genre Rhodococcus pour inclure deux bactéries

rouges nommés ensuite par Overbeck (1891) : Micrococcus erythromyxa et M. rhodochrous.

Ce nom de genre, également suggéré par Winslow et Rogers (1906) et Molisch (1907) pour

d'autres coques rouges, et avec R. rhodochrous comme souche type, a été maintenu au cours

des quatre premières éditions du Manuel de bactériologie Déterminative de Bergey.

Ceux-ci et plusieurs autres souches ont ensuite été « ré assimilés » dans le genre Micrococcus

pour la cinquième édition du Manuel de Bergey, un arrangement qui a persisté dans la

sixième, et qui reflète le manque actuel de caractères adaptés à leur description.

Gordon (Gordon et Mihm 1957, 1959) a été la première à réaliser pleinement les insuffisances

de s'appuyer totalement sur la morphologie des cellules et des réponses de coloration pour

trier la taxonomie d'un grand nombre de souches disponibles qui avaient été placés, souvent à

contrecœur, dans plusieurs genres différents, notamment Rhodococcus. En conséquence, elle

a entrepris une série d'études définissant l'application d'une approche plus polyphasique (par

exemple Gordon et Mihm 1961). Au départ, elle a placé tous ces éléments dans le genre

Mycobacterium comme M. rhodochrous, basée principalement sur des similitudes dans leur

morphologie des colonies et la solidité de l'acide de certaines cultures (Gordon, 1966). Il a

fallu une taxonomie numérique pour révéler le véritable rang taxonomique des

M. rhodochrous, qui a émergé à partir de ces études comme un regroupement digne d'un


6

statut de genre distinct, et une claire distinction des autres membres du genre Mycobacterium

ainsi que Nocardia et Corynebacterium (Goodfellow et al.,1998)

Cependant, il a fallu attendre la septième édition du Manuel de bactériologie Déterminative de

Bergey pour prendre une mesure officielle. Ces souches ont été retirées du genre

Mycobacterium et réaffectées provisoirement à un certain nombre des espèces Nocardia

(McClung 1974). Le genre Gordona (plus tard Gordonia) proposé par Tsukamura (1971),

dont les membres de certaines souches M. rhodochrous étaient très semblables

phénotypiques, était à l'époque considéré comme un genre de statut incertain (incertaesedis),

et n'a pas été mentionné dans la présente édition du Manuel. Sa formation et la reconnaissance

formelle éventuelle jouent un rôle important dans l'histoire Rhodococcus. Parmi les destins

taxonomiques possibles envisagés par Bousefield et Goodfellow (1976) pour ces souches de

M. Rhodococcus c'est de les laisser là où ils étaient, en les plaçant dans un autre genre

pré-existant ou élaborer un nouveau genre pour les intégrer. Le genre Rhodococcus existait

déjà, mais était tombé dans l’oubli.

Il avait été ressuscité par Tsukamura (1974) pour contenir six espèces qui avaient été placées

en tant que membres du genre Gordona, à savoir : R. aurantiacus, R. bronchialis, R.

rhodochrous, R. roseus, R. et R. rubropertinctus terrae. Cette liste des espèces a été modifiée

par Goodfellow et Alderson (1977) après leur vaste étude taxonomique numérique, qui a

conduit à l'ajout de quatre autres espèces : R. coprophilus, R. corallinus, R. equi et R. ruber.

L'ADN: les données d'hybridation de l'ADN étaient généralement favorables à ces stages

(Mordarski et al 1976, 1977). Le genre Rhodococcus a été reconnu dans la liste approuvée des

noms bactériens (Skerman et al.,1980) ainsi que dans la première édition du Manuel de

Bergey de Bactériologie systématique (Goodfellow, 1989), où 14 espèces (dont certaines

aujourd'hui ne sont plus reconnues comme l’espèce Rhodococcus - voir ci-dessous) ont été

répertoriées. Encore une fois, le genre Gordona n'a pas été jugé digne d'une mention dans le

manuel.

Maintenant, dans la deuxième édition du Manuel de bactériologie systématique de Bergey, 30

espèces Rhodococcus sont reconnues et décrites (Jones et Goodfellow 2010).

Cependant, comme mentionné ci-dessus, quelques-unes des espèces de Rhodococcus

originales de Tsukamura (1974) ont survécu (Tableau 1). Les décisions pour les enlever à


7

d'autres genres ont été fondées en grande partie sur des comparaisons de leurs caractères

chimiotaxonomiques. Il s'agit notamment (Tableau 2) de leur structure de peptidoglycane,

Composition chimique en sucre des parois, longueurs de chaîne d'acides mycoliques, lipides

polaires, les compositions d'acides gras et de la chimie de menaquinone (Goodfellow et al.,

1998), soutenu par l'ARNr 16S des comparaisons de séquences de gènes. Ces données ont

confirmé que les membres des genres Nocardia et Rhodococcus appartenaient à deux groupes

phylogénétiquement hétérogènes.

Par conséquent, un changement considérable de groupe de genre a eu lieu et un transfert de

plusieurs membres de Rhodococcus à Gordona / Gordonia a été établi (un genre rétabli par

Stackebrandt et al.(1988) à accueillir ces souches), Corynebacterium et Nocardia et de

Nocardia et Tsukamurella à Rhodococcus (voir ci-dessous).

En outre, une partie de la reclassification rhodococci a servi de base à l'établissement de

nouveaux genres producteurs d'acide mycolique, à savoir Dietzia (Rainey et al.,1995b) et

Tsukamurella (Collins et al.,1988). Depuis, de nombreuses nouvelles espèces ont été décrites

pour inclure les isolats de très différents habitats (Tableaux 3a,3b), et de nouvelles espèces qui

attendent des études approfondies.


8

Tableau 1 : exemples de la reclassification de quelques souches du genre Rhodococcus

(Jones et Goodfellow al., 2010).


9

Tableau 2 : les différences majeures en chemotaxonomie entre les genres de la famille

Corynebacteriniae (Goodfellow et al.,1998)


10

3- La systématique actuelle

3.1- Le genre Rhodococcus

Rho.do.coc’cus : Gr.n. rhodon, la rose ; Gr.n. coccus, un grain,

Sur la base de vastes données taxonomiques poly phasiques, les membres du genre

Rhodococcus sont actuellement placés dans les producteurs d’acides mycoliques Sous-ordre

des Corynebacterineae dans la famille des Nocardiaceae au sein du phylum Actinobacteria,

qui contient des bactéries Gram-positives, des pourcentages élevés en G+ C. Il a été suggéré

que le Nocardiaceae devrait être émendé sur la base de l'ARNr 16S nucléotides de signature

(2009 Zhi et al.) pour intégrer tous les genres précédemment placés dans la famille des

Gordoniaceae

Par conséquent, en plus de Rhodococcus (Goodfellow et al.,1998; Zopf 1891), Nocardia

(Trevisan 1889) et Smaragdicoccus (Adachi et al., 2007), cette famille aurait désormais inclu

Gordonia (Stackebrandt et al.,1988. Tsukamura 1971), Skermania (Chun et al., 1997),

Williamsia (Kampfer et al., 1999) et Millisia (Soddell et al.,2006).

Les principales caractéristiques chimio taxonomiques de ces derniers et les autres genres des

Corynebacterineae sont donnés dans la Tableau 2.

Le genre Rhodococcus embrasse des organismes ayant les caractéristiques suivantes

(Goodfellow et al.,1998; Goodfellow et Maldanado 2006; Jones et Goodfellow 2010): Les

membres sont Gram positif à Gram variable, non-mobile, aérobie organismes chemo-

organotrophiques avec un métabolisme oxydatif, capables généralement d'utiliser un large

éventail de composés organiques comme source d'énergie (source de carbone). Ils démontrent

un cycle de vie dont la complexité varie entre les différents membres. Selon la souche, des

tiges et des cocci peuvent subir une série de transformations morphologiques, et prendre des

formes de coques dans une conversion de tiges et de filaments. Certains d'entre eux forment

des branches et évoluent vers des filaments ou hyphes abondamment ramifiés, qui peuvent

devenir « aériennement » organisés. Ces différentes formes morphologiques se fragmentent,

éventuellement et réapparaissent à nouveau pour prendre des formes de coques et de

coccobacilles courtes. Tous ne possèdent pas une pigmentation rouge, et la couleur de la

colonie peut varier avec la souche : de l'incolore au chamois, crème, jaune, orange et rouge.


11

Le Rhodococcus peptidoglycane contient des résidus d'acide muramique glycolée dans la

chaîne glycane et méso-2,6-diaminopimélique. Ainsi, le peptidoglycane est du type A1g.

Arabinose et galactose sont les principaux sucres de la paroi. Les acides mycoliques sont de

30-54 atomes de carbone de longueur et contiennent jusqu'à quatre doubles liaisons. La

chromatographie en phase gazeuse et la pyrolyse de leurs esters d'acides mycoliques libèrent

des acides gras contenant 12 à 16 atomes de carbone.

L’isoprenologue prédominant se compose de menaquinones déshydrogénés contenant huit

unités d'isoprène, soit MK 8 (H). Les principaux phospholipides sont diphosphatidylglycérol,

phosphoéthanolamine et mannosides phosphatidyly inositol. Les acides gras sont saturés à

chaîne linéaire. Les acides gras monoinsaturés et les acides gras sont ramifiés à 10

methyloctadecanoic (acide tuberculostéarique). Le pourcentage de G+ C de l'ADN est de 63 à

73%.


12

Tableau 3a : les espèces du genre Rhodococcus et leurs écosystèmes d’isolement



13

Tableau 3b (suite) les espèces du genre Rhodococcus et leurs écosystèmes d’isolement


3.2- La classification des Rhodococcus

3.2.1 – La taxonomie numérique

Le Rhodococcus de genre ravivé a été initialement proposé sur la base d'une étude des

actinomycètes qui a examiné des souches de test pour les 92 caractères unitaires et les a

regroupés selon le pourcentage de similarité (Goodfellow et Alderson, 1977).

Les caractéristiques examinées étaient les suivantes: la coloration et la morphologie, les tests

nutritionnels, la tolérance aux composés inhibiteurs, la résistance à divers antibiotiques; la

capacité de croître dans diverses conditions de température et de pH, et des analyses

chimiques.

Plus tard, des études taxonomiques numériques similaires comprenaient des tests

supplémentaires, en particulier l'utilisation de substrats fluorogènes pour détecter les activités

enzymatiques spécifiques (Goodfellow et al., 1990).

3.2.2 – La Chemotaxonomie

Les caractéristiques chimiques qui définissent le Rhodococcus ont été décrites par Goodfellow

(1989a) et mises à jour par Finnerty (1992). Ils ont des parois cellulaires de chémotype IV, ce

qui signifie que l'acide diamino dans le peptidoglycane est l'acide méso-diaminopimélique et

que les principaux sucres sont l'arabinose et du galactose.

Bien que les autres genres dans le groupe CMN ont également une paroi cellulaire chemotype

IV (Goodfellow 1989b), Rhodococcus peut être séparé d'eux sur la base de la combinaison

des caractéristiques chimiotaxonomiques décrits par Rainey et al. (1995a). Caractéristiques

diagnostiques clés pour ce genre sont: la possession de l'acide tuberculostéarique, les acides


14

mycoliques ayant des longueurs comprises entre 34 et 64 atomes de carbone, le type principal

de ménaquinone est dihydrogéné menaquinones ayant huit unités isoprénoïdes, mais ils n'ont

pas l'élément cyclique qui est une caractéristique de motif de Nocardia. Les proportions

relatives des différents lipides (acides gras mycolate et autres) peut être utile pour différencier

les espèces dans le genre (Klatte et al., 1994c).

3.2.3- La taxonomie moléculaire

L'outil le plus puissant dans l'analyse et la réorganisation de la taxonomie de Rhodococcus au

cours des dernières années a été l'analyse de la séquence du gène de l'ARNr 16S.

Le degré de variation dans la séquence entre deux organismes donnés peut être considéré

comme une mesure de la façon dont les organismes sont étroitement liés

Les Bactéries avec ADNr 16S : 97% de similitudes ou plus, peuvent être les mêmes espèces

(Stackebrandt et Goebel, 1994).

En cas de doute, les valeurs de réassociation ADN-ADN peuvent être obtenues; une valeur

d'homologie de 70% est considérée comme le minimum pour l'identité de l'espèce (Wayne et

al., 1987). Les séquences d'ADNr 16S sont maintenant disponibles pour toutes les espèces de

Rhodococcus décrites valablement et les expériences de réassociation ADN-ADN ont été

effectuées si nécessaire (Rainey et al., 1995c; Briglia et al., 1996).

Par conséquent, il est probable que toutes les espèces actuelles sont stables mais il peut y

avoir un doute sur l'état de R. percolatus qui a 99,3% 16S d'identité de séquence d'ADNr et

71% d'homologie ADN-ADN avec R. opacus. Mais les deux espèces peuvent être séparées

sur la base du phénotype nutritionnel et la composition en acides gras (Briglia et al., 1996).

L'étude de Rainey et al. (1995c) a montré que Rhodococcus est un genre relativement

divergent tombant dans cinq groupes distincts. Un groupe contient R. erythropolis avec R.

globerulus, R. marinonascens et R. opacus, un second contient R. rhodochrous avec R. ruber

et R. coprophilus, tandis que R. rhodnii, R. fascians et R. equi

Ces travaux ont également conclu que le genre Nocardia a évolué au sein de Rhodococcus

plutôt qu’à ses côtés. Plus tard, Briglia et al. (1996) ont montré que R. zopfii réside dans le

groupe R. rhodochrous tandis que R. percolatus réside dans le groupe R. erythropolis. Les

Phylogénies peuvent également être déduites à partir d'autres séquences moléculaires.

Ochi (1995) a analysé la séquence ribosomique AT-L30 protéines et il a trouvé généralement

un bon accord avec les résultats de phylogénies obtenues à partir des analyses d'ADNr 16S


15

3.3- Les espèces actuelles de Rhodococcus

Au moment de la rédaction de ce mémoire, 31 espèces Rhodococcus avaient été valablement

désignées et reconnues (Jones et Goodfellow al., 2010).

Ils sont énumérés dans le tableau 3, ainsi que leurs sites d'origine de l'isolement. Comme

mentionné précédemment et figurant au tableau 1a, b, un brassage considérable parmi les

membres de ce genre et d'autres de la Corynebacterineae a eu lieu, et ensuite les caractères

additionnels ont clarifié leur phylogénie. Par exemple, certaines espèces initialement incluses

dans le genre Rhodococcus ont été « ré-attribuées » par la suite dans plusieurs genres

différents (tableau 1a) [par exemple Rhodococcus Maris est maintenant Dietzia maris (Rainey

et al. 1995b)], tandis que d'autres à l'origine placées ailleurs sont reconnues aujourd'hui

comme Rhodococcus spp. (Tableau 1b) [Par exemple Corynebacteroides Rhodococcus était

auparavant Nocardia corynebacteroides (Yassin et Schaal 2005)]. Dans quelques cas, ils

apparaissent comme synonymes tardifs d'espèces décrites précédemment [par exemple R.

roseus est synonyme de R. rhodochrous (Rainey et al., 1995a)].

Leurs relations phylogénétiques, basées sur les données de séquence 16S ARNr, sont

illustrées dans la Figure 1.


16

Figure 1 : arbre phylogénique des espèces du genre Rhodococcus



17

4- L’écologie des Rhodococcus

Les Rhodococcus ont été isolés à partir de nombreux habitats différents, bien qu'ils se posent

surtout initialement à partir du sol dans les matières fécales et les sédiments aquatiques (Jones

et Goodfellow 2010), où souvent ils s'enrichissent d'une contamination persistante avec des

composés organiques souvent complexes xénobiotiques et d'autres qui peuvent être utilisés

comme source d'énergie unique de carbone pour ce genre.

Il semble peu probable que notre compréhension actuelle de leur distribution mondiale soit

terminée, car ils ont aussi été isolés fréquemment de mousse de réacteurs de boues activées

(De los Reyes 2009), à partir de restes de squelettes dans des fosses (R. jostii) et de

l'atmosphère d'un laboratoire spatial russe (R. baikonurensis), comme indiqué dans le Tableau

3.

5- La Nouvelle identification des Rhodococcus

Des problèmes ont été rencontrés en essayant de classer et d'identifier les souches de

Rhodococcus lorsqu’au début seules les données sur la morphologie des cellules étaient

disponibles.

Seule une combinaison des caractères morphologiques, chimiotaxonomiques (Tableau 2) et

phylogénétiques peuvent classer les souches dans ce genre, maintenant identifié plus

fiablement (Goodfellow et al., 1998;. Goodfellow et Maldanado 2006; Jones et Goodfellow

2010).


18

Tableau 4 : gènes de quelques espèces de Rhodococcus codants pour des enzymes qui entrent

dans les voies cataboliques des polluants (Jones et Goodfellow al., 2010).


19

6- Rhodococcus dans la biotechnologie

Comme le tableau 4 montre, les bactéries appartenant au genre Rhodococcus ont un grand

nombre d'enzymes qui leur permettent d'effectuer plusieurs biocatalyses et les réactions de

dégradation ayant une pertinence industrielle (Bell et al., 1998 de Carvalho da Fonseca et

2005b, Larkin, Kulakov et Allen 2006). Les Rhodococcus ont révélé être capables de

dégrader une large gamme de composés naturels et des xénobiotiques hydrophobes: à chaîne

courte, longue chaîne ainsi que des hydrocarbures et des composés aromatiques halogénés,

comme les hydrocarbures aromatiques polycycliques, des biphényles polychlorés et

dibenzothiophènes référence (MR). La résistance cellulaire démontrée et la dégradation de

tous ces composés sont liées au génome des cellules (Larkin, Kulakov et Allen 2005). La

mobilisation des grands plasmides linéaires et la présence de plusieurs homologues d'enzymes

dans les voies cataboliques (Van der Geize et Dijkhuizen 2004 Larkin, Kulakov et Allen

2006).

6.1- Bioremediation et Biodégradation

La capacité de dégrader un grand nombre de composés organiques et leur tolérance associée

font des bactéries Rhodococcus, une étude de cas appropriée en vue d’une utilisation dans la

biorestauration et la biodégradation des polluants (Bell et al., 1998 Larkin, Kulakov et Allen

2006 de Carvalho 2009).

Les déchets produits par les industries sont grandes en quantité et très variés. La

contamination des sols et de l'eau devient un problème difficile à résoudre. Les Rhodococcus

ont montré leur capacité à dégrader les polluants biodisponibles faibles, allant de simples

hydrocarbures, aux hydrocarbures chlorés, les hydrocarbures aromatiques, les

nitroaromatiques et aromates polycycliques chlorés (Bell et al., 1998). Les rapports établis au

sujet des espèces Rhodococcus démontrent que R. rhodochrous peut dégrader les

polychlorobiphényles (PCB) (Boyle et al 1992.) Il est aussi une bactérie de désulfuration

(Bozdemir et al.,1996). R. globerulus P6 peut dégrader les polluants chimiques de

polychlorobiphényles (PCB) (Asturias et Timmis 1993). L’assainissement biologique des

déchets contenant de l'atrazine et de s-triazine peuvent être effectués par R. corallinus

(Arnold et al., 1996). R. ruber et R. erythropolis ont été décrits comme capables d'assainir les

environnements contaminés par le pétrole brut (Bell et al., 1998). La souche R. erythropolis

DCL14 a été décrit pour être capable de dégrader une large gamme de composés toxiques,

comme les n-alcanes et des composés aromatiques, du mazout et de l'huile (de Carvalho da

Fonseca et 2005b)


20

6.2- La production des Biosurfactants

En réponse à la présence de composés hydrophobes, tels que les hydrocarbures liquides, les

bactéries appartenant au genre Rhodococcus produisent des biosurfactants, Les tensioactifs

cellulaires produits par ce genre sont principalement des glycolipides (Lang et Philp, 1998)

ils favorisent l'adhérence des cellules bactérienne des phases hydrophobes dans deux

systèmes de phase. Ce fait réduit la tension interfaciale entre les phases, ce qui permet une

entrée plus facile de composés hydrophobes dans des cellules. La dispersion des composés

hydrophobes causée par les agents tensio-actifs augmente l'aire de surface pour l'action

microbienne (Bell et al., 1998). L'utilisation de biosurfactants présente plusieurs avantages et

complète le traitement des déchets chimiques par bioremédiation (Kosaric 1992). La souche

de R. erythropolis DCL14 a une production de tensioactif glycolipide-base en présence

d'alcanes à longue chaîne (de Carvalho, Wick et Heipieper 2009). Les biosurfactants produits

par R. erythropolis, R. opacus, et R. ruber peuvent être appliqués dans le pétrole brut, par

exemple pour le nettoyage des réservoirs d'huile ou l'enlèvement du pétrole à partir de sables

contaminés (Ivshina et al., 1998).

6.3- Synthèse Industrielle et transformations

Les Espèce Rhodococcus ont été définies pour produire un certain nombre de produits

commercialement intéressants et potentiellement utiles. Rhodococcus rhodochrous J1 est

utilisé par l'industrie de la chimie Nitto Company Ltd (Japon) pour produire plus de 30 000

tonnes d'acrylamide par an (Yamada et Kobayashi, 1996). C’est le premier exemple de

production industrielle réussie d'un produit chimique de base en utilisant un microbe. Une

nitrilase surproduction est utilisée. Les recherches ont continué dans l'application de nitrilases

(surtout à partir de Rhodococcus) pour produire une gamme d'autres produits tels que l'acide

acrylique et divers amides, y compris les vitamines nicotinamide , l'acide paminobenzoique et

les antimycobactériens hydrazides de l'acide isonicotinique et pyrazinamide (Kobayashi et

Shimizu, 1994; Yamada et Kobayashi, 1996). Ces conversions montrent des rendements

élevés et une forte spécificité avec un potentiel considérable pour une application industrielle.

Les nitrilases dans R. rhodochrous J1 sont génétiquement couplés avec des amidases qui

pourraient être utilisés pour d'autres transformations (Kobayashi et al.,1993).

Des gènes nitrilase spécifique au genre Rhodococcus ont été clonés et exprimés dans E. coli

(Kobayashi et al., 1993). Des sondes génétiques ont été développées pour dépister les gènes

nitrilase dans d'autres souches (Duran et al., 1993).


21

La production de poly (3-hydroxyalcanoïque) aminés par R. ruber a été étudiée (Pieper et

Steinbüchel 1992). Un tel composé, un copolyester de 3-hydroxybutyrate et de 3 -

hydroxyvalerate (3HB-co3HV), est produit commercialement comme un plastique

biodégradable -'' BIOPOL'' - par Zeneca Bio. Les produits utilisent la bactérie Alcaligenes

eutrophus (Lee, 1996). Rhodococcus ruber peut produire aussi le 3HB-co3HV avec une

proportion différente de monomères tout en poussant sur des substrats moins coûteux que

ceux utilisés pour la production BIOPOL.

Une gamme d'autres transformations potentiellement utiles en utilisant des cellules de

Rhodococcus ou des enzymes a été décrite. Woods et Murrell (1990) signalent la

transformation des alcènes gazeux en époxydes par une culture. Les époxydes sont utilisés

dans les Ferro-cristaux liquides électriques (Kieslich 1991).

La biotransformation produit le sec-cedrenol, un composé ayant une valeur médicale

potentielle, a été décrit (Takigawa et al., 1993). Ludwig et al. (1995) ont identifié une

déshydrogénase d'alcool secondaire avec une spécificité rare pour les alcools à longue chaîne,

et cela pourrait être utilisé pour produire des stéréo-isomères spécifiques d'alcools

secondaires. Peters et al. (1993) rapportent des utilisations possibles de synthèse reductases

carbonylés à partir de Rhodococcus pour donner une série de composés qui peuvent être

utilisés pour la synthèse de produits pharmaceutiques et agrochimiques. Les acides

muconiques peuvent être produits par une souche de R. rhodochrous (Warhurst et al., 1994).

Les oxydases cholestérol de Rhodococcus ont été étudiées et pourraient avoir des applications

dans l'industrie alimentaire ou dans la production de stéroïdes (Finnerty 1992; Christodoulou

et al.,1994. Kreit et al., 1994). L’efficacité de la production des acides aminés L-leucine et la

L-phénylalanine en utilisant des enzymes de Rhodococcus a été rapportée (Hummel et al.,

1987;. Bhalla et al.,1992).


22

6.4- Applications Diverses.

Des suggestions ont été faites pour l'utilisation des Rhodococcus dans l'industrie alimentaire.

En plus de son cholestérol oxydases (voir ci-dessus), R. fascians a été étudiée pour sa capacité

à dégrader la limonine, un composé au goût amer trouvé dans les jus de fruits. La possibilité

d'améliorer la saveur du jus de fruit amer en utilisant R. fascians dans des bioréacteurs a été

étudiée (Iborra et al., 1994;. Marwaha et al., 1994).

La forte coloration de nombreuses colonies de Rhodococcus a conduit à s'intéresser aux

pigments. Un gène de pigment petite Rhodococcus a été exprimé dans E. coli et il a été

proposé que le gène pourrait être utilisé comme un gène rapporteur pour permettre une

identification rapide des colonies de bactéries transformées (Hart et al., 1990).


23

II- caractérisation génétique des souches Grâce au développement des méthodes de biologie moléculaire et en particulier des

techniques basées sur les molécules d’ARN ribosomaux, les cultures ne constituent plus un

préalable incontournable aux études de diversité (Alain et al., 2003).

Nous devons admettre que cette approche basée sur le principe évolutif est vitale et

fascinante. En effet, pour comprendre les caractéristiques d’un organisme, on doit considérer

sa position actuelle dans l’environnement ainsi que le processus évolutif par lequel il est passé

(Vandecasteele et al., 2008). Cette étude permet d’ordonner les espèces bactériennes dans

l’arbre phylogénétique du monde vivant (Grimont et al., 2002).

1- PCR

Figure 2 : Principe de la PCR « Polymérase Chain Reaction »


24

La PCR (polymerase chain reaction) permet d’amplifier spécifiquement une région de DNA

double brin de quelques centaines de paires de bases. Ce DNA doit d’abord être séparé en

simples brins (dénaturation à 95°C).

• On ajoute au DNA de départ une large quantité d’amorces (oligonucléotides synthétiques

complémentaires des deux extrémités de la région à amplifier) qui vont s’hybrider à 50-60°C

environ avec la séquence complémentaire sur chacun des brins de DNA, et les quatre d’NTP

qui serviront de substrats.

• On soumet le tout à l’activité d’une DNA polymérase (Taq polymerase) qui synthétise à

72°C un brin complémentaire à partir du 3’OH de l’amorce hybridée. On obtient quatre brins

de DNA.

• On recommence à dénaturer ces 4 brins, puis on les laisse s’hybrider avec les amorces

(toujours en excès) et la polymérase entre en action pour aboutir à 8 brins de DNA.

• On recommence à dénaturer ces 8 brins, puis on les laisse s’hybrider avec les amorces

(toujours en excès) et la polymérase entre en action pour aboutir à 16 brins de DNA.

• Et ainsi de suite 35 fois, ce qui aboutit à 34359738368 brins de DNA (34 milliards), ce qui

représente une quantité suffisante pour étudier le fragment de DNA amplifié.( Housset et al ;)

2- Méthodologies moléculaires appliquées à l’étude des souches bactériennes

telluriques

Les techniques moléculaires impliquent généralement l'extraction des acides nucléiques

(ADN ou ARN) issus des populations microbiennes de façon directe ou indirecte à partir du

sol. Elles sont indépendantes des méthodes cultivables et ont un pouvoir de résolution

variable qui peut généralement être ajusté en fonction des objectifs, de l’analyse des grands

groupes taxonomiques jusqu’à la mise en évidence d’espèces au sein d’échantillons de sols.

Nous nous limiterons à décrire les techniques utilisées dans le cadre de notre étude.


25

2.1- Analyse des profils de restriction des ADNr 16S amplifiés (ARDRA)

Les travaux de Carl Woese (1987) ont véritablement révolutionné l’approche taxonomique en

microbiologie. Ils ont démontré que les séquences d’ADN ribosomaux (ADNr) présentes

sous forme d’opérons chez tous les microorganismes (leur nombre variant environ de 1 à 15

copies par génome bactérien (Rainey et al., 1996) étaient des marqueurs évolutifs

relativement robustes, semblables à des « chronomètres », très utiles pour déchiffrer la

phylogénie et l’évolution des populations microbiennes au cours du temps (Woese, 1987).

Les ribosomes (cf figure I-3-1) sont formés de deux sous-unités (une grande sous-unité 50S et

une petite sous-unité 30S) comportant chacune des protéines ribosomales (31 et 21 protéines

respectivement) assemblées sur une matrice d'acides ribonucléiques (ARNr). Les ARN

ribosomiques (petite sous unité = ARNr 16S, grande sous-unité = ARNr 23S) se sont imposés

comme référence de taxonomie moléculaire car ils réunissent l'ensemble des qualités requises.

En premier lieu, ils sont un élément clé de la synthèse protéique, fonction très conservée car

indispensable à la vie de la cellule. Ensuite, ils ont une structure particulière faite d'une

succession de domaines dont les vitesses d'évolution sont très variables, de relativement

élevée à presque nulle et chacun de ces domaines a son importance pour l'identification

moléculaire des micro-organismes. Certaines parties sont identiques chez toutes les bactéries

et donc utilisables comme sites de complémentarité pour des amorces universelles de

séquences ou d'amplification (PCR). La comparaison des domaines conservés permet de

retracer les liens de parenté qui unissent des bactéries éloignées, tandis que les domaines à

vitesse d'évolution plus rapide permettent l'étude des relations phylogénétiques d'espèces plus

proches. D'autres parties de séquences sont propres à un groupe et permettent ainsi

l'identification de séquences dites signatures caractéristiques d'ordres taxonomiques différents

(espèce, genre, famille ou royaume). A titre d’exemple, Heuer et al. (1999) ont indiqué que

les régions différentes de l'ADNr 16S (A, B, C, D, E, F, V1–V3 et V5–V9) ont pu être

utilisées pour générer des empreintes des communautés bactériennes.

L’ARDRA consiste, après amplification par PCR d’une partie de la séquence du gène de

l’ADNr 16S, à analyser, après digestion enzymatique, les profils de restriction obtenus entre

différents échantillons d’ADNr 16S. Cette méthodologie est, d’une façon générale et quel que

soit le gène auquel elle est appliquée, appelée analyse du polymorphisme de longueur des

fragments de restriction ou RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism). En revanche,

lorsqu’elle est appliquée à des ADN ribosomaux (ADNr), on parle plutôt d’analyse de


26

restriction d’ADN ribosomaux amplifiés ou d’ARDRA. Cette technique a été reconnue

comme étant un outil d’analyse phylogénétique fiable et a donc été largement utilisée dans de

nombreuses études taxonomiques sur divers microorganismes cultivables ou non cultivables,

issus de différents échantillons environnementaux (Vaneechoutte et al., 1992, 1993;

Martinez-Murcia et al., 1995). Les travaux de Moyer et al. (1994) ont démontré que

l’utilisation de 2 endonucléases reconnaissant des sites de restriction à 4 nucléotides

permettait de discriminer la majeure partie des ADNr 16S présents au sein d’un mélange

complexe, en révélant le polymorphisme de séquence de l’opéron ribosomique bactérien

(Massol-Deya et al., 1995). Il est communément admis que l’ARDRA permet de différencier

des échantillons jusqu’au niveau du genre bactérien (Martin-Laurent et al., 2001). Toutefois,

il est faut être très prudent dans l'interprétation de la composition des communautés

microbiennes car la méthode d'extraction des ADN peut influencer les résultats obtenus

(Martin-Laurent et al., 2001).

Figure 3 : (a) Agrandissement d’un ribosome chez une bactérie. (b) Modélisation tridimentionnelle du

ribosome 70S composé de la grande sous-unité 50S (ARNr 5S ARNr 23S + 31 protéines) et la petite sous-

unité 30S (ARNr 16S + 21 protéines). (c) Exemple de repliement dans l’espace de l’ARNr 16S provenant

de la petite sous-unité 30S du ribosome (Stern et al., 1988b). (d) Structure secondaire de l’ARNr 16S de

Vibrio. Parahaemolyticus X56580 présentant les quatre principales séquences provenant de différents

isolats de Vibrio parahaemolyticus (Harth et al., 2007).


27

2.2- Séquençage des ADNr 16S et Analyse phylogénétique

Principe général

La systématique peut être définie comme une nomenclature hiérarchisée des organismes

vivants, lié à la théorie de l’évolution, et dont l’objectif principal est d’assurer une

classification des espèces s’appuyant sur les relations phylogénétiques (Harayama et Kasai,

2006). L’espèce constitue l’unité taxonomique fondamentale. Wayne et al. (1987) ont proposé

une définition de l’espèce microbienne s’appuyant sur les propriétés de dénaturation et de

renaturation de l’ADN génomique. Ainsi, les valeurs d’hybridation ADN-ADN entre deux

souches supérieures ou égales à 70 %, accompagnées de valeurs de ΔTm inférieures ou égales

à 5°C, constituent des bornes raisonnables et acceptables de définition de l’espèce

microbienne. Néanmoins, certains auteurs ont pu mettre en évidence que cette méthodologie

présentait certains biais (Stackebrandt et Goebel, 1994 ; Vandamme et al., 1996). En outre,

Rossello-Mora et Amann (2001) ont montré que pour décrire de nouvelles espèces

microbiennes, une approche polyphasique intégrant des données à la fois génotypiques et

phénotypiques s’avérait nécessaire. Les spécialistes de la systématique bactérienne n’ont donc

pas encore totalement trouvé de consensus satisfaisant pour définir sensu stricto le terme

d’espèce (Cohan, 2002). En effet, donner une définition de l’espèce bactérienne applicable à

tous les microorganismes semble difficile, aucun critère de classification phylogénétique

n’étant suffisamment discriminant, stable et universel (Stackebrandt, 2003).

Malgré les biais inhérents à chaque méthode, l’étude de l’hybridation ADN-ADN associée à

l’analyse des séquences d’ADNr 16S constitue une méthodologie très largement admise par

les microbiologistes pour discerner les souches microbiennes étroitement apparentées.

Historiquement, le début des phylogénies moléculaires basées sur l’analyse comparée de

séquences remonte aux années 60, avec les travaux de Zucklerkandl et Pauling (1965) et

Fitch et Margoliash (1967) sur les séquences protéiques de cytochrome c et de globines.

Dans le cadre de notre étude, l’analyse phylogénétique s’est appuyée sur le séquençage des

ADNr 16S (Woese et al., 1990).


28

Cette procédure s’est déroulée en plusieurs étapes consécutives : (i) amplification des

séquences d’ADNr 16S (environ 1500 paires de bases) à partir d’amorces universelles de la

division Bacteria, (ii) séquençage, (iii) édition et alignement des séquences obtenues par

comparaison avec des séquences de références présentes dans les bases de données

internationales, (iiii) estimation des distances évolutives entre les séquences concernées par

application de modèles évolutifs et enfin, (iiiii) construction d’un arbre phylogénétique à

partir des distances évaluées précédemment par l’application d’un algorithme associé à une

analyse statistique afin de tester la robustesse de l’arbre retenu.


29

III- Intérêt des biosurfactants dans la caractérisation des souches L’étude des biomolécules bactériennes, qu’elles soient intracellulaires ou extracellulaires est

considérée comme méthode phénotypique mais qui rapportent des informations relatives aux

gènes bactériens. De cette manière, elles peuvent être proposées comme un lien entre

l’approche phénotypique et l’approche génotypique dans la taxonomie bactérienne,

participant au criblage des souches sauvages, et leur attribution aux taxons. C’est le cas

notamment des biosurfactants qui présentent l’intérêt d’être synthétisés par un nombre

restreins de microorganismes, à différents taux, avec différentes natures chimiques, et

appartenant à des classes variées.

Les biosurfactants

1- Définitions

Les surfactants (SURFace ACTive AgeNTS) sont des agents à activité de surface

(tensioactifs), synthétisés chimiquement ou par voie biologique (biosurfactants) (Al-Araji et

al, 2007).

Ces molécules de haute énergie se répartissent à l’interface entre liquides non miscibles

réduisant ainsi l’énergie libre du système (Mulligan, 2009) et formant des microémulsions des

solutions aqueuses ou des mélanges d’hydrocarbures (Prommachan, 2002).

La tension superficielle de l’eau peut être réduite de 72 mN/m jusqu’à 27 mN/m en présence

d’un surfactant, synthétique ou naturel (Christofi et al., 2002) mais cette capacité reste

relative et varie d’un surfactant à un autre.

2- Structure et classification des biosurfactants

Il s’agit de molécules amphiphiles (Prommachan, 2002), constituées de deux pôles: un pôle

hydrophile, qui peut être un ester, un hydroxyle, un phosphate, un carboxyle, ou encore un

groupe d’hydrates de carbone et peut avoir une charge neutre ou négative, et un pôle

hydrophobe qui est un acide gras (Maier, 2003, Marqués et al., 2009) hydroxylé, saturé ou

insaturé, et peut être aussi un peptide (Banat, 1995).

Selon plusieurs auteurs (Kosaric et al., 1983, Rosenberg et al., 1993, Desai et al., 1997,

Prommachan, 2002, Al-Arajil et al., 2007, Mulligan, 2009) les classes majeures de

biosurfactants sont différenciées essentiellement par leur composition chimique et leur origine

microbienne (Tableau 5).


30

Tableau 5 : source microbienne et principaux type de biosurfactants (Desai et al.,1997)

3- Biosynthèse et rôle physiologique

La production de biosurfactants est un phénomène communément observé lors de la

croissance d’un microorganisme sur des substrats insolubles dans l’eau et la réduction de la

tension superficielle du milieu ainsi que la formation d’une émulsion stable indiquent une

production efficiente (Pruthi et al., 1995). La présence de surfactant est nécessaire pour

obtenir une émulsion stable entre deux liquides purs non miscibles (Krepsky et al., 2007).

Cameotra (2009) explique ce phénomène comme étant l’un des comportements des

microorganismes pour augmenter la biodisponibilité de plusieurs substrats hydrophobes, qui

sont peu utilisés à cause de leur insolubilité dans l’eau.


31

En effet, ces bactéries synthétisent les biosurfactants qui sont soit des molécules

intracellulaires, extracellulaires ou localisées à la surface de la cellule (Prabhu et al., 2003)

pour faciliter la diffusion des hydrocarbures ou leurs dérivés à l’intérieur de la cellule

bactérienne à fin de les dégrader (Al-Arajil et al., 2007). Il est intéressant de savoir aussi que

les produits intermédiaires d’oxydation des hydrocarbures ne persistent pas dans le sol comme

polluants, mais seront potentiellement réabsorbés et métabolisés par les même

microorganismes prédominants, comme l’a révélé l’étude de Dashti et ces collaborateurs en

2008.

Cependant, les biosurfactants peuvent avoir d’autres rôles aussi importants que

l’émulsification, par exemple : l’adhésion aux surfaces solides et la formation de biofilms

(Alasan d’Acinetobacter), la régulation du niveau énergétique cellulaire (sophorose de T.

bombicola), l’activité bactéricide (gramicidine, polymexine, surfactine), la pathogénicité de

certaines bactéries (rhamnolipides de Pseudomonas), ainsi que le piégeage des métaux lourds

(Vandecasteele, 2008).

4- Le rôle des biosurfactants dans la biodégradation des hydrocarbures

Il existe une relation claire entre l’activité d’émulsification, l’adhérence des cellules à

l’hydrocarbure, et le taux de croissance des isolats sur le pétrole brut (Mehdi et al., 2008).

Une étude très récente sur des bactéries (Pseudomonas sp.) capables de dégrader le n

héxadecane en produisant des biosurfactants était faite par Cameotra et ces collaborateurs

(2009) pour élucider ce mécanisme. En présence de n-héxadecane dans le milieu de culture,

les bactéries secrètent des substances qui forment un réseau de projections extracellulaires

reliant les cellules les unes aux autres. Ce réseau est supposé être un complexe de

biosurfactants et d’alcanes qui forme un site d’ancrage des cellules et un moyen de transport

d’hydrocarbures à leur surface cellulaire. Le biosurfactant disperse l’héxadécane en petites

gouttelettes, et forme une couche autours de chacune, augmentant ainsi ça disponibilité aux

organismes dégradants


32

5- Les potentiels des biosurfactants

Les biosurfactants peuvent être aussi efficaces et plus avantageux que les surfactants

synthétiques. Ils sont hautement spécifiques, biodégradables, biocompatibles avec

l’environnement (Mulligan, 2009), moins sensibles aux biotopes de températures, pH et

salinité extrêmes (Suwansukho et al., 2008), moins toxiques et peuvent être synthétisés en

grandes quantités, sur des sources d’énergie coûteuses, comme les produits pétroliers

(Sarubbo et al., 2006), mais aussi sur des ressources renouvelables.

Un autre avantage des biosurfactants, est la possibilité de leur modification par

biotransformation à fin de générer de nouveaux produits pour des besoins spécifiques

(Samadi et al., 2007). Avec l’introduction de certains groupements fonctionnels, les

biosurfactants fournissent de nouvelles propriétés, surpassant ainsi les surfactants chimiques

dans beaucoup d’applications (Huang et al., 2010).

Ces biomolécules présentent une large gamme de propriétés fonctionnelles qui permettent leur

exploitation dans divers domaines (Prommachan, 2002). Cependant, il n’est pas facile de

rationaliser la différence entre leurs rôles naturels et nos applications (Cameotra et al., 2004;

Marqués et al., 2009). Leur capacité à modifier les propriétés interfaciales et leur auto-

assemblage en micelles ou autres nanostructures est cruciale pour plusieurs processus

industriels tels que la formation de couches, la diffusion, la formation de mousse, la

détergence, la catalyse micellaire, etc. (Xiaoyang et al., 2009).

Ces biomolécules peuvent aussi induire la formation d’émulsion, la séparation de phases, la

solubilisation, le mouillage, la réduction de viscosité (Ochsner et al., 1995), la floculation,

l’agrégation, la désorption (Karanth et coll., 1999) ainsi que la stabilisation et la

déstabilisation d’émulsions (Huang et al., 2010).

6- Les différentes applications des biosurfactants

Compte tenu de leurs potentialités et de leur innocuité, les biosurfactants sont aujourd'hui

utilisés dans différents domaines d'application tels que :

- la bioremèdiation des sites contaminés par les hydrocarbures, les polluants organiques et les

métaux lourds (Tableau 6), (Raza et al., 2007) et dans le traitement des eaux usées (Samadi et

al., 2007).


33

Tableau 6 : composés chimiques éliminés par biodégradation bactérienne

(Mulligan,2009)

- l’industrie pétrolière, et particulièrement dans l’amélioration de récupération transport dans

les pipelines et dans les opérations de nettoyage des bacs de stockage du pétrole (Banat, 1995,

Meylheuc et al., 2001).

- l’agriculture, jouant le rôle d’antagonistes empêchant la propagation de ces zoospores dans

les systèmes de culture sans sol (l’hydroponique) (Hultberg et al., 2008).

- l’industrie alimentaire, comme additifs alimentaires, et comme améliorants dans la

boulangerie et la charcuterie (Prommachan, 2002).

- l’industrie du cosmétique (Suwansukho et al., 2008) et dans les procédés de teinture du

textile (Savarino et al., 2009).

- l’industrie pharmaceutique, comme agents thérapeutiques présentant des activités

antibactériennes, antifungiques et antivirales pour combattre les différentes maladies

infectieuses (Rodrigues et al., 2006).

- le secteur de haute technologie comme l'impression électronique, l'enregistrement

magnétique, la micro-électronique (Marqués et al., 2009) ainsi que dans les nanotechnologies,

tel que la fabrication des nanoparticules d’argent ou les tiges de NiO, etc. (Mulligan, 2009).


34

7 - Biosurfactants des Rhodococcus

Le genre Rhodococcus synthétise des glycolipides (surtout trehalolipide) c’est un

biosurfactant avec diverses propriétés physico-chimiques et des activités biologiques

comparables avec d'autres tensioactifs microbiens, qui déterminent leurs applications

potentielles dans les biotechnologies industrielles et environnementales.

La seule limitation pour la réussite de la pénétration de biosurfactant sur le marché de la

biotechnologie est leur coût de production élevé, y compris la fermentation bactérienne et les

dépenses de récupération du produit. La production de biotensioactif partir de ressources

renouvelables est une option attrayante actuellement inexploitée pour les tensioactifs de

Rhodococcus. Cependant, plusieurs études récentes ont montré que les Rhodococcus sont

capables de croître sur les huiles végétales formant des émulsions stables en raison de la

production de surfactant intensive (Haba et al., 2000;.. Sadouk et al., 2008).

Il convient de noter que le développement d'une biotechnologie rentable pour la production de

biosurfactant exige des recherches plus fondamentales sur les voies métaboliques impliquées

dans la synthèse des glycolipides à partir de différents substrats hydrophobes et sur les

mécanismes de régulation permettant une surproduction de surfactant. Cette recherche

consisterait à utilisé outils de la biologie moléculaire actuellement disponibles pour

Rhodococcus et développé sur la base de séquences génomiques complètes déterminé pour

plusieurs espèces.

Un autre axe de recherche comprend la modélisation des conditions de croissance de cellules

(par exemple, des composants de milieu organiques autres facteurs physiques inducteurs

chimiques minéraux et, la température, le pH et, b) pour obtenir des biosurfactants avec des

propriétés fonctionnelles cibles. Ainsi, dans nos expériences, un rendement de biosurfactant

élevé a été enregistré pour les cellules R. ruber cultivés sur hexadécane, même si l'activité est

supérieure émulsification a été enregistrée pour la biosurfactant produites en utilisant

dodécane comme un substrat de croissance (Kuyukina et al., 2005). En résumé, le

développement de procédés de fermentation moins chers pour les biosurfactants de

Rhodococcus utilisant des matières premières renouvelables à faible coût et une augmentation

des rendements de produits par superactif, par exemple, des souches génétiquement modifiées

pourrait les rendre économiquement attractifs et hautement compétitifs avec des tensioactifs

synthétiques.

MATERIEL ET METHODES

Matériel et méthodes

35

I- Matériel Biologique

Échantillons de sol prélevés : bourbiers pollués par des rejets de forage ainsi qu’à partir de

zones humides et sols arides, les bactéries sont isolées, purifiés afin d’être identifiées, et afin

de déterminer leurs propriétés et aptitudes biologiques.

Sites de prélèvements :

- Ain Timouchent – Béni saf (Zone humide)

- Batna – Timgad , sidi maansar ( Terre agricoles )

- Biskra – el Kantara ( Oued , Oasis , Eau de sources ) , Biskra ( Oued , Oasis )

- Naama – Ain Safra , ain el warka , Tiout

- Oran, messreguine (Zone humide), Arzew (Port Pétrolier),

- Ourgla – Site pétrolier Hassi messoud Nom de l’entreprise : SONATRACH

Nom du Puit : OMOz S11

Date de prélevement : 18/11/2012

II- Méthodologie de travail

II.1 - Echantillonnage et prélèvement

L’échantillonnage était varié avec une dominance des échantillons récupérés de site pollué par

les hydrocarbures

Sur terrain, les échantillons du sol sont prélevés à partir de 40 cm de profondeur selon la

norme NF ISO 11464-1998 pour les analyses physicochimiques et à une profondeur de 20 cm

selon la norme ISO 10381-1994 pour les analyses microbiologiques.

Les échantillons destinés aux analyses microbiologiques sont conservés dans des flacons à

4°C et acheminés au laboratoire.


36

II.2- Isolement Deux méthodes d’isolement on été utilisées.

II.2.1- Méthode classique sans enrichissement

Préparation de la solution mère

A partir d'un échantillon de sol destiné à l'analyse microbiologique, 1 g de sol est pesé puis

introduit dans un tube à essai contenant 9 ml d'eau physiologique préalablement autoclavée.

Le tube est ensuite agité énergiquement pendant 2 minutes. Le contenu du tube représente la

solution mère.

9 ml d’eau physiologique stérile est ajouté à 1 ml de la solution mère. Le mélange bien agité

représente la dilution à 10-1. 1 ml de cette dilution mélangé à 9 ml d’eau physiologique,

correspondra à la dilution 10-2. On continue ainsi jusqu'à l'obtention d’une dilution adéquate.

Ensemencement par étalement sur gélose nutritive

Le milieu gélosé préalablement fondu est réparti dans des boites de pétri à une hauteur

d'environ 3 à 4 mm qu’on laisse ensuite refroidir. 0.1 ml de la dernière dilution est prélevé à

l’aide d'une pipette Pasteur puis déposé sur la gélose, ensuite étalé sur toute la surface du

milieu.

Après 24h à 48h d'incubation à 30°C, les colonies développées sont observées et isolées

(Figure 4)

II.2.2- Méthode avec pré-enrichissement

À partir d'un échantillon de sol, 1 g est prélevé puis mélangé à 9 ml de milieu MSM (voir

composition en annexe). Le milieu est additionné de pétrole brut à raison de 1 % qui est

considéré ici comme seule source de carbone.

Le mélange est ensuite incubé à 30°C sous agitation à raison de 150 tours/min pendant 24

heures.

Après l’étape de pré enrichissement, des dilutions variant de 10-1 à 10-7 sont réalisées, ensuite,

0.1 ml de chaque dilution est ensemencé sur le milieu GN (voir la composition en annexe).

L'incubation se fait à 30°C pour une durée de 48 a 72 heures (Martinneau et al., 1996).


37

Cette étape d’enrichissement est prise en considération afin de donner toutes les chances aux

bactéries exigeantes de croitre.

L’incubation est réalisée à une température ambiante de 30 °C, favorable pour la croissance

des Rhodococcus spp. qui sont mésophiles et aérobies strictes.

II.3- Purification

Après 24 h d’incubation, l’étape de purification des cultures permet d’obtenir des cultures

pures à partir des différentes souches obtenues.

La purification est faite par les méthodes classiques de dilution et ensemencement par stries

sur les boites contenant de la GN, afin d’avoir des colonies bien distinctes et visibles.

La sélection est basée sur l'aspect macroscopique des colonies : la couleur, la forme, le

diamètre, l’opacité…etc. Un échantillon de chaque type de colonie est prélevé et ensuite

purifié par repiquage successif selon la méthode de stries comme on l’a cité ci-dessus

(Martinneau et al., 1996).

II.4- Conservation des souches purifiées

Les souches isolées sont conservées dans des tubes à essai contenant le milieu gélose nutritive

incliné. Les souches sont ensemencées en stries sur la pente des tubes, puis incubées à 30°C

pendant 24 heures. Les tubes dans lesquels il y a eu une croissance seront bouchés et

conservés à 4°C pour une durée de 4 à 6 semaines. Afin de pouvoir toujours disposer de

souches viables, la réactivation doit se faire tous les mois (Martinneau et al., 1996).

Une démarche plus fiable pourra être faite pour une conservation de longue durée, les

bouillons de culture sont passés à la centrifugeuse pendant quelque minute à 5000 rpm le

culot bactérien est récupéré stérilement et re-suspendu dans du bouillon de culture (LB)

supplémenté en glycérol à 15%, elles sont ensuite conservées à -20ºC. Un repiquage tout les

6 mois est recommandé.


38

Figure 4 : Schéma général d’isolement et de purification des souches bactériennes contenues

dans les prélèvements de sol selon la méthode classique


39

III- Identification des souches purifiées

L'identification des souches isolées est réalisée sur la base d’études morphologiques,

physico-chimique, biochimiques et génétiques

III.1 - Etudes Morphologique

a- Macroscopique

La première étape du diagnostic bactérien et du biotypage d’une souche est la description

macroscopique des colonies isolées; parfois cette seule étude permet de connaître le germe

qu’on a en présence car les colonies sont typiques.

L’observation de l'aspect macroscopique des colonies permet d'effectuer une première

caractérisation, avec une orientation possible des résultats au cours de l'identification.

Selon Singleton (1999), les éléments d’identification macroscopique sont:

- La forme des colonies : rondes, irrégulières

- La taille des colonies par la mesure du diamètre.

- La Chromogénèse: couleur de la colonie.

- L'élévation: convexe, concave, plate.

- L'opacité: opaque, translucide ou transparente.

- La surface: lisse, rugueuse, sèche, dentelée,

b- Microscopique

Une observation microscopique à l’aide d’un microscope optique est faite pour définir

l’aspect unicellulaire des bactéries isolées et purifiées.

1- L’Etat frais

Permet de déterminer la forme, l'arrangement et la mobilité des bactéries. il consiste en

l'observation d'une goutte de suspension bactérienne, préparée avec de l'eau physiologique et

placée entre lame et lamelle. L’observation se fait au microscope photonique à grossissement

X1000 (Singleton et al,. 1999).


40

En plus la coloration au bleu de méthylène apporte des informations concernant la

morphologie des germes.

Cette démarche sert de faire un premier diagnostic et une première pré-identification orientée

vers deux cas de figures qui sont les coccobacilles et les bacilles comme le stipule la

littérature pour les Rhodococcus.

Figure 5 : différentes Formes bactériennes sous microscope optique

2- Gram

Le gram est distingué par une méthode Rapide en utilisant le test KOH qui consiste a traiter

les colonies bactériennes par une solution de KOH à 3.0% (Gregersen et al., 1978).

Le principe de cette technique est relativement simple, une goutte d’une solution aqueuse a

3% de KOH est déposée sur une lame de microscopie, à l’aide d’une anse, faire une

émulsion de culture bactérienne âgée de 24 a 48 heures avec la solution, les résultats sont de

la façon suivante :

- Complexe visqueux et formation de filament en soulevant l’anse après l’émulsion de la

colonie avec la Solution du KOH est synonyme que la bactérie est un gram négatif.


41

- Complexe homogène après l’émulsion de la colonie avec la solution de KOH qui

indique que la bactérie est un gram positif.

3- Mobilité

La mobilité des bactéries a été étudiée par observation microscopique à l’état frais sur cultures

en phase de croissance dans une goutte d’eau distillée stérile entre lame et lamelle.

4- Recherche de spores

La coloration au bleu de méthylène permet l’observation de la morphologie cellulaire et la

présence ou l’absence de la spore, (Delarras et al., 2008).

Sur un frottis bactérien correctement fixé à la chaleur, on fait couler la solution de bleu de

méthylène jusqu'à ce que toute la lame soit couverte, après un temps de réaction d’une

minute, on rince abondamment à l’eau, ensuite le frottis bactérien est séché puis observé au

microscope avec grossissement X1000.

III.2- Etude biochimique et aptitudes des bactéries

a- Etude biochimique

1- Etude des types respiratoires

Après incubation des milieux à 30°C pendant 24 heures, 4 types respiratoires peuvent être

distingués (Marchal et al.,1982),

- Croissance en surface: bactéries aérobies strictes.

- Croissance en profondeur: bactéries anaérobies strictes.

- Croissance le long du tube: bactéries aéro-anaérobies facultatives.

- Croissance dans la partie supérieure proche de la surface: bactéries microaérophiles

Les bactéries aérobies strictes ont étés sélectionnées


42

2- Test catalase

La catalase est une enzyme ayant la propriété de décomposer le peroxyde d'hydrogène (H2O2)

avec dégagement d'oxygène selon la réaction suivante

Sur une lame et à l’aide d’une pipette Pasteur, on dépose une colonie bactérienne à laquelle on

ajoute de l’eau oxygénée H2O2, (à 10 volumes). La présence d’une catalase est révélée par

l’apparition immédiate de bulles de gaz qui correspond à l’oxygène dégagé (Tortora et al.,

2003).

3- Test de tolérance au NaCl

Les souches sont cultivées dans le milieu LB additionné de 5 % et 7 % de NaCl , pour

détecter et mettre en évidence la tolérance des souches isolées à la salinité.

Chez les Rhodococcus cette capacité est nettement remarquée, elle sera utilisée dans nos

travaux comme critère de sélection.

4- Test Urease

On a utilisé un système de lecture de l’uréase qui se compose

- Urée CO(NH2)2 2 g

- Rouge de phénol à 1% 0,25 ml

Après 24 heures d’incubation d’un tube à essai contenant le milieu dans lequel une suspension

de la bactérie étudiée est réalisée. Si elle possède une uréase active la réaction suivante aura

lieu :


43

Le CO2 et le NH3 se combinent ensuite pour donner du carbonate d’ammonium selon la réaction :

Sous l’action d’une uréase il y a donc alcalinisation du milieu (virage de l’indicateur au

rouge).

Les Rhodococcus étant des urease + (producteur d’urease), les souches qui ont présenté un

résultat positif ont été sélectionnées.

5- Digestion du Tween 80

Ce test est fait pour déterminer l’activité estérase présente chez les souches isolées à l’aide du

Tween 80 qui est le nom commercial du détergent : polyoxyethylene sorbitan mono oléate.

Un milieu à base de tween (Voir annexe) est utilisé comme base dans ce test de digestion.

Les souches à tester sont obtenues de cultures bactérienne âgées de 24 à 48 heures ,

l’ensemencement se fait par Patchs sur le milieu approprié ( Tween 80 ) et l’incubation est

faite à 27 °C , en cas de résultat positif ( présence d’une activité tween –estérase ) les acides

gras libérés par les estérases se complexent au ions Ca2+ pour former un précipité autour de

la culture bactérienne, ceci ce traduit par un halo opaque, par contre le résultat est négatif

( absence de tween –estérase) lorsque le milieu reste inchangé ( Schaad et al., 2001)

b- Etude des aptitudes et propriétés

1- Test de dégradation du pétrole

Il a été réalisé sur milieu MSM (Alexander and Lustigman, 1966) et la méthode utilisée est

celle de Kiyohara et al., (1989)

Les boites de gélose contenant du MSM (milieu minéral qui ne contient pas de source de

carbone) ont été préparées. Elles ont ensuite été ensemencées avec des souches à partir des


44

colonies par la méthode des patchs et ceci pas des cure-dents stérile précédemment

autoclavés.

Par la suite, ces boites ont été pulvérisées en utilisant un atomiseur avec du pétrole brut

stérilisé par filtration a l’aide d’un filtre millipore 0,22 µm (MILLEX® -GS . milipore S.A.

67 Molshiem France).

Le milieu est imprégné par le pétrole et les boites ont été incubées à 30°C pendant 3 à 6

jours.

Les souches montrant la dégradation ont été distinguées par des zones claires autour des

colonies sur les plaques opaques.

On a optimisé cette méthode en imprégnant du papier wattman stérile par du pétrole filtré et

puis en le mettant en contact avec la gélose contenant du MSM et ou on a préalablement

réalisé des dépôts de patch des souches à tester.

2- Test de production de Glycolipides

Les glycolipides sont les plus connus parmi les biosurfactans , ils se constituent de mono- , di-

, tri- et tetrasaccharides qui incluent le glucose , mannose , galactose , acide glucuronique ,

rhamnose et le galactose sulphate (Veenanadig et al.,2000 ; Chen et al.,2007).

Dans la littérature le genre Rhodococcus est cité comme producteur de plusieurs types de

biosurfactants notamment les glycolipides (Mulligan et al., 2005).

Nous avons donc effectué un premier test qualitatif qui consiste à faire croître les isolats sur

un milieu de culture solide contenant du bleu de méthylène et du chlorure de calcium.

(Hauser et al., 1957).


45

3- Test de dégradation du cholestérol

La cholestérol oxydase (CHO) est une enzyme qui catalyse l’oxydation du cholestérol en

provoquant la conversion de 5-cholesten-3β-ol en 4-cholesten-3-one ( Murooka et al., 1986) .

Elle a plusieurs applications en médecine (Allain et al., 1974) , agriculture, industrie, et

préparation pharmaceutique (Ahmed et al., 1992) . Actuellement , elle est utilisée pour la

production de kits de diagnostic médical essentiellement pour déterminer le taux de

cholestérol dans le sang (Noma et al.,1976) et aussi comme insecticide biologique (Purcell et

al., 1993) et comme précurseurs de stéroïde (Bell et al., 1998)

Beaucoup de bactéries produisent cet enzyme, les genre Arthrobacter, Brevibacterium,

Pseudomonas, Nocardia, Rhodococcus, Streptomyces, Corynebacterium and Shizophyllum

sont les plus distingués (Yazdi et al., 2008). Cet enzyme peut être produite sous trois formes

intracellulaire, extracellulaire et intra-membranaire, d’où son spectre large d’applications, le

criblage et l’isolement de ces bactéries est demandé suite à l’importance de cet enzyme en

biotechnologie (Yazdi et al., 2001).

Ce test est réalisé sur milieu MSM (Alexander and Lustigman, 1966) par la méthode

Kiyohara, décrite précédemment.

Cette technique a été est optimisée sur du papier wattman imbibé par une solution de

cholestérol (Kit CHRONOLAB SYSTEM, Barcelona, Spain : colorometric method

quantitative determination of cholesterol) dans des boites contenant du MSM et

préalablement ensemencé par les souches à tester, la préparation a été incubée ensuite à 30°C

pendant 3 à 6 jours.

Une vaporisation par le réactif du kit de dosage et faite pour distinguer les souches montrant

un pouvoir catabolique du cholestérol.

La lecture du principe de la technique est interprétée comme suit :

Le cholestérol présent dans le milieu forme un complexe coloré avec le réactif du kit (Voir

Annexe) une couleur rosâtre signifie la présence de cholestérol.

La présence d’un halo clair autour des colonies formées est synonyme de dégradation du

cholestérol.


46

4- Détermination de l’index d’émulsion E24

L’index d’émulsion permet de vérifier la capacité des souches à émulsionner une phase

hydrophobe (le pétrole brut) dans une phase hydrophile (le milieu de culture).

Le test consiste à mélanger 3 ml du milieu de culture (de fermentation) avec 3 ml de pétrole

brute dans des tubes stériles. Les tubes sont agités au vortex pendant 3min.

Après homogénéisation des deux phases, on procède au calcul de l’index d’émulsion (E24)

selon la relation suivante :

E24 = (he / ht) x 100

he : hauteur de l’émulsion.

ht : hauteur totale du mélange.

Les tubes sont laissés au repos pendant 24 heures à température ambiante.

Puis le calcul de E24 est refait une deuxième fois pour vérifier la stabilité de l’émulsion

(Bodour et al., 2004).

5- Interaction souches sélectionnées / pétrole brut

Douze souches isolées et sélectionnées ont fait l’objet d’une recherche dans ce travail

a. Préparation de la préculture Les souches à tester sont inoculées dans des tubes contenant du LB comme milieu de culture

et l’incubation se fait à 30°C pendant 72 heures

Le culot bactérien est récupéré par centrifugation à 3000 rpm et puis laver 2 fois par l’eau

physiologique stérile.

b. dégradation du pétrole brut en milieu liquide et production de biosurfactants

La production de biosurfactant s’effectue dans un Erlenmeyer de 200 ml contenant 100 ml de

milieu MSM (voir annexe) préalablement autoclavé et additionné de 2 % de pétrole brut

comme seule source de carbone. Ce milieu est inoculé par 1 % de la préculture précédente et

l’incubation s’effectue à température ambiante dans un système à agitation (Figure 5)

réglable pendant 5 jours (Sifour et al., 2007).


47

Figure 6 : Production de biosurfactants et dégradation du pétrole brut en milieu

liquide sous agitation


48

6- Test de l’INT

Ce test consiste à démontrer l’activité biologique des souches isolées et ceci vis-à-vis du

pétrole brut, la dégradation de ce dernier par l’isolat est mise en évidence à l’aide de l’INT

chlorure de 2-(p-iodophényl)-3(p-nitrophényl)-5-phényI tétrazolium.

La technique proposée est fondée sur l'utilisation d'un sel de tétrazolium : le chlorure de 2-(p-

iodophényl)-3(p-nitrophényl)-5-phényI tétrazolium (INT). Au cours de la respiration, les

cellules vivantes réduisent I'INT soluble et incolore à l'état oxydé en cristaux d'INT-

Formazan (INTF), de couleur rouge-violette. Cette transformation de I'INT en INTF reflète

l'activité respiratoire des cellules et peut être interprétée comme une indication de la viabilité

du microorganisme (Biiton et Koopman., 1982) et dans notre cas elle sera synonyme de

dégradation de pétrole brut vu qu’il est utilisé comme seule source de carbone.

Les concentrations utilisées dans le milieu réactionnel est de (25mg/ml) pour le Glucose et

de (3g/l) pour l’INT.

Le protocole et les quantités utilisées dans ce test sont décrits dans le tableau 7.

Témoin Positif Témoin négatif Test des isolats

- MSM (800µl)

- Glucose (8µl)

- Culture (200µl)

- INT (50µl)

- MSM (800µl)

- Culture (200µl)

- INT (50µl)

- MSM (800µl)

- Pétrole brut (16µl)

- Culture (200µl)

- INT (50µl)

Tableau 7 : Paramètres utilisés dans le test INT


49

7- Test d’hémolyse

Ce test a été réalisé pour montrer l’importance du dispositif enzymatique chez les bactéries

isolées. Le milieu gélose au sang est un milieu riche qui permet la culture et l’isolement des

bactéries exigeantes (sans besoin de facteurs particuliers).

La lecture de l’hémolyse est un critère d’orientation, en particulier pour les streptocoques.

La lecture se fait après 24 à 48 heures à 37°C, en aérobiose (éventuellement atmosphère

enrichie en CO2) l’examen macroscopique des colonies est réalisé et l’halo d’hémolyse est

recherché

Mise en évidence de l’hémolyse

o Absence d'halo d'éclaircissement autour de la colonie: absence d'hémolyse

o Halo d'éclaircissement complet, à bords nets: hémolyse ß (lyse des hématies et

digestion totale de l’hémoglobine libérée)

o Halo flou d'éclaircissement (sans verdissement): hémolyse ß' ou hémolyse "ß

floue"

o Halo verdâtre, à bords flous : hémolyse α (lyse des hématies et digestion

incomplète de l’hémoglobine libérée à méthémoglobine).

8- Culture sur gélose au sang (colonies)

En sachant que les Rhodococcus se distingue en colonies mucoides sur gélose au sans on a

ensemencé les souches isolées et purifiées sur gélose au sang et on les a incubée à 30 °C

pendant 48 heures (Lashkarian et al.,2010).


50

IV- Caractérisation des souches par les méthodes de biologie moléculaire

1- Amplification de l’ADNr 16S

Afin d’uniformiser cette méthode à l’ensemble des souches du laboratoire, des amorces

universelles ont été utilisées (8UA ,1492R) dans cette approche pour cinq genres au total

dont un pré-identifiée et apparenté au Rhodococcus.

a- Extraction d’ADN

La méthode de Gevers et al.,(2001) a été utilisée

- Les cellules à partir d’une colonie sont resuspendues dans 1ml d’eau distillée stérile et

centrifuger à 3000 tours/min pendant 10, le culot est mis à -20°C pendant 1h.

- Le culot est ensuite lavé dans 1ml de tampon TES (6.7% sucrose, 50 mM Tris-Hcl pH 8,

1mM EDTA) et resuspendu dans 300 µl de tampon STET (8% sucrose, 5% Triton X-100,

50mM Tris-Hcl pH 8, 50mM EDTA).

- 75 µl de tampon de lyse (TES contenant 1330U/ml mutanolysine et 40 mg/ml lysosyme)

sont ajoutés à la suspension et incubés à 37°C pendant 1h.

- Ajouter par la suite 40 µl de SDS préchauffé (37°C) dans un tampon TE (10 mM Tris-

Hcl, 1mM EDTA, pH 8), les cellules sont vortexées pendant 60 secondes et incubées à

37°C pendant 10 min suivi d’une incubation à 65°C pendant 10 min.

- 100 µl de tampon TE sont ajoutés et le lysat est extrait avec 1 volume de

(phénol/chloroforme/isoamylalcool).

- Les phases sont séparées par centrifugation à 3000 tour/min pendant 20 min. La phase

aqueuse est mixée avec 70 µl de NaCl 5M et 1 ml d’isopropanol, l’ADN est précipité

dans la glace pendant 15 min.

- L’extrait ADN est collecté par centrifugation 3000 tours/min pendant 20 min et le culot

est lavé dans de l’éthanol froid à 70%.

- Le culot ADN est resuspendu dans 50 µl d’eau distillée stérile pour des fins analytiques.


51

b- Amplification de L’ADNr 16S par PCR

b.1- Principe

C’est une méthode qui nécessite quelques variations thermiques cycliques réalisées sur un

même échantillon. L’emploi d’une ADN polymérase thermorésistante, la Taq Polymérase

(issue de Thermophillus aquavarum) évite d’ajouter l’enzyme à chaque cycle. Elle se base

principalement sur trois étapes : dénaturation, hybridation et polymérisation.

Connaissant la structure primaire de la séquence cible (ou de ses extrémités éventuelles),

celle-ci peut être amplifiée in vitro par une extension convergente simultanée en utilisant des

amorces spécifiques encadrant la cible à amplifier.

Les deux amorces sont additionnées à l’ADN (dans notre cas l’ADNr 16S) génomique dans

des conditions d’hybridation avec la cible après sa dénaturation (séparation des deux brins

sous l’effet de la température). Les deux amorces se placent en face de leurs séquences

complémentaires situées sur les deux extrémités 3’ des deux brins à amplifier. Leur

élongation dans le sens 5’ → 3’ par l’ADN polymérase permet à chaque brin de la cible d’être

recopié uniquement sur la zone encadrée par les deux amorces.

L’opération est reprise en plusieurs cycles. Chacun de ces cycles comprendra :

− un temps de dénaturation de l’ADN cible à amplifier,

− un temps pour l’hybridation des amorces avec les extrémités 3’ de l’ADN cible

(généralement > 40 °C),

− un temps nécessaire à l’extension des deux amorces

b.2- Amplification

Les couples d’amorces utilisés (Turner et al.,1999) :

8UA: 5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3’

1492R : 3’-TACGGGTACCTTGTTACGAC TT-5’


52

L'amplification d'ADN a été effectuée avec un thermo cycler d’amplification de type PCR

TECHNE TC-312 (Barloworld Scientific Ltd, stone ST 15 OSA, UK) et ceci en suivant un

programme d’amplification comme décrit ci-dessous

- Pré-dénaturation à 95°C pendant 15min,

- Dénaturation à 94°C pendant 1min,

- Hybridation à 60°C pendant 1min 35 Cycles

- Elongation à 72°C pendant 1.5min

Enfin une étape d’élongation finale à 72°C pendant 10min.

Les mélanges réactionnels sont réalisés à un volume final de 25 µl contenant :

- 2.5 µl 10X tampon PCR (Takara),

- 2µl dNTP (takara),

- 0.5 µl de chaque amorce,

- 0.25 µl de taq ADN polymerase (Takara)

- H2O stérile en qsp.

Le produit amplifié par PCR est une bande ADN préconisé à 1500 pb

b.3- Electrophorèse de l’ADN

5 µl des produits PCR ont été analysés par électrophorèse sur gel d’agarose à 1.3% à 80 V

pendant 40 minutes.

La présence des produits amplifiés par PCR est révélée en électrophorèse sur ce gel en

utilisant un marqueur de taille Smart Ladder 200 pb.

La lecture du gel se fait sur une plaque à ultra-violet (UVITEC SXT-F6 ® 180W ,312nm ),

Le gel est visualisé dans l’obscurité, il sera photographié avec un appareil numérique ou

scanner.


53

2- La recherche du gène Cholestérol Oxydase « CHO »

Les souches possédant ce gène représentent une importance considérable, au total six souches

ont été testées, quatre d’entre elles sont apparentées au genre Rhodococcus et deux autres sont

identifiées à des Pseudomonas appartenant à la collection LGM du laboratoire de l’université

d’Oran.

a- Extraction d’ADN génomique

L’ADN génomique est extrait par les méthodes standard en utilisant un kit ADN (Ultra Clean

Microbial DNA isolation Kit , Carlsaad.Ca )

1- Mettre 1.8 ml de culture microbienne dans un tube de la collection contenant 2 ml, le

faire centrifugé à 10.000 tours/min pendant 30 secondes à température ambiante.

Eliminer le surnagent.

2- Re-suspendre le culot dans 300 µl de la solution MicroBead et vortexer. Transférer

les cellules re-suspendues dans le tube MicroBead.

3- Ajouter 50 µl de la solution MD1 au tube MicroBead. Vortexer à la vitesse maximale

pendant 10 minutes.

4- S’assurer que les tubes de MicroBead de 2 ml tournent librement dans la

centrifugeuse sans frottage. Laisser centrifuger à 10.000 tours/min pendant 30

secondes à température ambiante et s’assurer que ça ne dépasse pas les 10.000

tours/min pour que les tubes ne se brise pas.

5- Transférer les surnagent dans de nouveaux tubes propres de 2 ml. Prévoir 300 µl ou

350 µl de surnagent.

6- Ajouter 100 µl de la solution MD2 au surnagent, vortexer pendant 5 secondes et

incuber à 4°C pendant 5 minutes.

7- Centrifuger les tubes à 10.000 tours/min pendant 1 minute.

8- En évitant le culot, transférer le volume entier du surnagent dans des tubes propres de

2 ml. Prévoir 450 ml en volume.

9- Secouer la solution MD3 avant emploi. Ajouter 900 µl de cette solution au surnagent

et vortexer pendant 5 secondes.

10- Charger environ 700 µl dans le spin-filter et centrifugé à 10.000 tours/min pendant 30

secondes à température ambiante. Jeter le surplus, ajouter le surnagent restant au spin-

filtre, centrifugé à 10.000 tours/min pendant 30 secondes. Un totale de 2 ou 3


54

chargements sont nécessaires pour chaque échantillon pour avoir le maximum d’ADN

concentré.

11- Ajouter 300 µl de la solution MD4 et centrifugé à 10.000 tours/min pendant 30

secondes. Puis jetter le surplus.

12- Centrifuger à température ambiante à 10.000 tours/min pendant 1minute

13- Faire attention à ne pas éclabousser le liquide sur le support du spin-filter, puis le

placer dans un nouveau tube de 2 ml.

14- Ajouter 50 µl de la solution MD5 au centre de la membrane blanche du filtre.

15- Centrifuger à température ambiante à 10.000 tours/min pendant 30 secondes.

16- jetter le filtre de rotation, l’ADN dans le tube est enfin prêt pour n’importe quel autre

application.

17- L’ADN doit être conservé à – 20°C

b- Vérification qualitatif de l’ADN extrait

Afin de vérifier la qualité de l’ADN après extraction, la technique la plus commune est la

migration de l’échantillon sur gel d’agarose 1 % suivie d’une visualisation sous lumière UV.

Si les ADN migrent sous la forme d’une trainée (smear) l’échantillon d’ADN a sans doute

subi une dégradation majeure.la quantité de l’ADN peut aussi s’estimer par DO.

c- Préparation de la solution mixte

Pour diminuer les risques d’erreurs et de contamination nous avons préparé une solution

mixte contenant tous les composants de la PCR.

Les amorces utilisées sont (Lashkarian et al.,2010) :

- CHO Forward :

5’-ATACTGCAGATGACCGATAGCCGGGCGAACA-3’

- CHO Reverse :

5’-ATAAAGCTTTCACTGGATGTCGGACGAGATG-3’


55

Il faut noter que :

- Les composants de la PCR (tampon Taq, dNTP, Mg Cl2, Primers, Taq polymerase) ainsi

que l’ADN génomique à amplifier sont gardés séparés dans leurs tubes respectifs dans de la

glace jusqu’ à la fin de la manipulation.

- A chaque fois qu’un composant de la PCR est ajouté au volume réactionnel, nous effectuons

un rinçage (l’eau est le premier composant ajouté).

- Il faut à chaque fois changer d’embout.

- L’enzyme Taq polymérase est le dernier composant ajouté à la solution mixte avant la mise

en contact avec l’ADN génomique à amplifier (car il constitue le substrat enzymatique).

La mixture réactionnelle pour l’amplification PCR est comme suit :

• 5 µl de l’ADN

• 1 U de la taq ADN polymérase

• 1.5 mM de MgCl2

• 2.5µl du tampon PCR X10

• 0.5 µl, des Primers

• 0.4mM de dNTP mix

• 15µl eau bi-distillée

d- Amplification du gène CHO

Après avoir placé les tubes contenant l’ADN bactérien dans le Thermocycleur (TECHNE TC-

312 - Barloworld Scientific Ltd, stone ST 15 OSA, UK), une pré-dénaturation à 95°C pendant

5 minutes est entamée. Ensuite, le programme d’amplification est exécuté selon trois étapes

répétées en 30 cycles :

- Dénaturation à 94 °C pendant 45 secondes.

- Hybridation des amorces à 58 °C pendant 45 secondes.

- Elongation (polymérisation) à 72 °C pendant 90 secondes.

Enfin, une étape d’élongation finale est réalisée à 72°C pour 5 minutes.

4µl du produit résultant de la PCR est analysé sur électrophorèse, la taille de l’amplimère

préconisé est de 1600 pb pour tous les échantillons amplifiés comparativement aux marqueurs

de taille utilisé,( Lashkarian et al.,2010).


56

e- Electrophorèse de l’ADN

Une Electrophorèse, sur gel d’agarose à 1,3%, des produits de PCR a été réalisée pour

confirmer la réussite de l’amplification.

Préparation du gel :

- Peser 1 g d’agarose dans un Erlenmeyer de capacité suffisante.

- Ajouter l’agarose à 100 ml de TBE.

- Chauffer avec agitation jusqu’à ébullition et disparition du trouble.

- Laisser refroidir jusqu'à ce qu’il devienne possible de saisir le flacon à main nue

(température environ 45-50 °C).

- Ajouter 2μl de BET dans 50ml TBE.

- Agiter (sans chauffer) doucement pour éviter la formation de bulles d’air.

- Préparer le moule pour le coulage du gel.

- Placer le moule sur une surface bien horizontale.

- Couler lentement le gel sur 3 à 5 mm d'épaisseur et laisser gélifier dans la cuve, le

peigne mis au préalable crée des espaces pour les puits.

- Laisser refroidir 30 minutes environ avant d’enlever délicatement le peigne.

- Les puits sont placés du côté de la cathode.

- Le gel est enfin prêt pour le dépôt des échantillons.

Dépôt des échantillons (produits d’amplification)

- Mélanger la solution de charge (bleu de bromophénol et glycérol) avec l’ADN sur un

morceau de parafilm (4 μl d’ADN et 2 μl de la solution de charge) avec une

micropipette.

- Pipeter 2 μl de ce mélange en fixant fermement la pipette avec l’autre main.

- Mélanger sur support de parafilm un volume de la solution de charge (contenant

l’ADN amplifié par PCR) avec un volume donné de la solution mixte.

- Remplir les puits avec ce mélange en faisant attention à ne pas déchirer le fond du gel avec la pointe de l’embout.


57

- Migration

- Fermer la cuve, brancher les fils et exercez un voltage de 70 v jusqu’à 80 v pendant 5

minutes pour permettre la sortie de l’ADN des puits.

- Ensuite, descendre à 50 v le reste de l’électrophorèse.

- Laisser migrer jusqu’à ce que le colorant de charge arrive à proximité du bord du gel

(environ 40 minutes).

- Quand le témoin de migration (colorant bleu) atteint l’extrémité du gel, le courant est

coupé.

- Visualisation La visualisation de l’ADN sur le gel d’agarose est réalisée grâce à un colorant fluorescent le

bromure d’Ethidium (BET). Ce composé possède la propriété de s’intercaler entre les paires

de bases des acides nucléiques. Le gel est visualisé dans l’obscurité à l’aide d’un

Transilluminateur à UV puis photographié avec un appareil numérique ou scanner.

RESULTATS ET DISCUSSIONS

Résultats et discussion

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I- Isolement

1- Caractéristique des Echantillons

échantillons Site de prélèvement Description

01 Terre Missreguine Couleur marron foncée,

homogène, humide

02 Terre Beni-Saf Couleur marron foncée,

homogène, humide

03 Terre polluée par le goudron

(Oran)

Couleur marron foncée,

homogène, humide + odeur

du polluant

04 Terre polluée par l’essence

(Oran)



du polluant

05 Terre polluée par le Gasoil

(Oran)



du polluant

06 Pate graisseuse ( Afia Algérie

- Hassi ameur- Oran ) Odeur spéciale,

07 Station d’épuration ( Afia Algérie

- Hassi ameur- Oran ) Odeur spéciale,

08 Eau de mer polluée – Port Aval Arzew -

Oran

Eau pollée par des

hydrocarbures (deux phases

aqueuses)

09 Bourbier Hassi Messaoud Sèche, sableuse

10 Terre Oued Biskra – El Kantara Sèche, sableuse

11 Terre Sidi Maanser – Batna Couleur violette

12 Terre Ain Ourka - Nâama Couleur noirâtre, odeur

spéciale, humide

13 Terre oasis - Ain Safra – Nâama Sèche, sableuse

14 Lac Ain Ourka – Nâama Eau douce, odeur spéciale

Tableau 8 : caractères des échantillons et leurs sites de prélèvement


59

2- Sélection des souches

L’isolement des souches est fait sur GN, l’incubation varie entre 24, 48 et 72 heures

L’étape des pré-enrichissements dans du milieu LB été indispensable pour favoriser la

croissance des souches à caractères recherchés (Martinneau et al., 1996).

II- Identification des souches

II.1- Etude Morphologique

1- Etude macroscopique

La sélection des Rhodococcus se fait sur la base de la couleur Orange, jaune et orangée de la

colonie et aussi en fonction de son aspect et de sa taille.

L'ensemencement sur milieu GN a permis d'isoler une soixantaine de colonies distinctes selon

les critères recherchées et ceci à partir de 14 sites de prélèvement au total.

Les colonies sont généralement lisses et ont un diamètre de plus de 1mm, de tous les

microorganismes du sol, les bactéries sont les plus nombreuses et les plus petites : la taille de

leurs colonies ne dépasse pas en général, 0.5 à 2 mm de diamètre (Roget et al,.2001).

D’un autre coté on a remarqué une richesse forte intéressante dans la composition de la flore

tellurique (Figure 7).

Dans le contexte de ce travail on est plus captivé par les colonies mucoïdes et aussi celles qui

présente une forte pigmentation rouge, rosâtre ou orangée typique au genre recherché comme

le montre les illustrations suivantes (Tableau 8).

L’observation de Goodfellow et al. (1998) et Jones et Goodfellow (2010) fournit des

informations sur les caractères macroscopiques du genre Rhodococcus qui semblent similaires

a ceux qu’on a trouvés.

Un exemple du genre Rhodococcus est présenté dans la figure (Figure 8) (VIB Department of

Plant Systems Biology, Ghent University).


60

Figure 7: Flore tellurique sur GN après 48 heures d’incubation

Figure 8 : Profil macroscopique de Rhodococcus erythropolis ( Ghent university, 2009)


61

La souche LBTP2 : couleur orange foncée,

colonie mucoïde

La souche A3 : couleur beige foncée, colonie

mucoïde

La Souche R3 : couleur Rougeâtre , cercle

central , visqueuse à J2 et compacte à J4

La souche 6TMM : couleur orange, colonie

circulaire visqueuse


62

Tableau 9 : exemple sur la morphologie l’aspect macroscopique des souches isolées

La souche LBTP1: couleur beige foncée,

colonie mucoïde

La souche TASG2 : couleur moutarde, colonie

bombée

La Souche LAWG3 : couleur orange foncée,

colonie mucoïde

La souche R2 : couleur Rose, colonie circulaire

visqueuse


63

2- Etude microscopique

L'observation microscopique a été réalisée suivant deux étapes : une observation à l'état frais

et la coloration au bleu de méthylène. Les résultats obtenus se résument dans le tableau 10.

Les résultats consignés dans ce tableau, montrent une variété de types bactériens. Les

bactéries isolées sont non mobiles. Elles présentent différentes formes bacillaires, du groupe

des coccobacilles ou coques. Elles sont assemblées en différents arrangements soit en paire,

en amas, en chainettes ou même isolées. Elles présentent aussi une paroi de Gram positive ou

négative. La coloration au bleu de méthylène a révélé la présence de spore uniquement chez

quelques bacilles, les coques et les colibacilles en sont dépourvus.

Les bactéries du sol ont une grande variété de formes. Elles peuvent être mobiles ou

immobiles, et posséder ou non des formes de résistance (spores, kystes) (Dommergues et

al.,1977).

A cause de la structure solide du sol et de l'absence d'eau en quantité suffisante, les bactéries

de sol sont peu mobiles et se fixent plutôt sur toutes sortes de supports où elles se développent

en micro-colonies de manière à rester en contact avec leurs ressources en eau et en nutriments

(Boussboua, 2002).

Le caractère mobile des bactéries isolées peut être expliqué par le phénomène de

chimiotactisme, il est important dans la dégradation de nombreuses classes d’hydrocarbures.

Il donne en effet aux bactéries mobiles l'avantage de pouvoir localiser des composés comme

le toluène (Vandecasteel et al., 2005).

Les souches les plus fréquemment décrites dans la biodégradation des hydrocarbures

appartiennent aux genres de Gram positif. D’autres souches à Gram négatif ont la capacité de

dégradation des hydrocarbures assez large (Vandecasteel et al., 2005).

Dans notre cas, les souches Gram positif, non mobile et ayant une forme bacillaire ou cocoïde

ont été criblées et présélectionnées, ceci peut nous orienter vers le genre Rhodococcus.


64

- Mobilité

Les souches isolées étaient non mobiles pour la totalité , or les espèces apartenant au genre

Rhodococcus recherché possèdent cette proprieté

- Spores

Apres coloration avec le bleu de méthylène on a pu selectionné, les islolats qui peuvent être

interessants.

La démarche expérimentale nous a permis de montrer que les souches isolées et selectionées

sont non mobiles et asporulées

Souche Gram Origine Observation microscopique Aspect

microscopique

PT+

(LGM-R1) -

Bourbier

Hassi

messaoud

cocobacille

LBTP1*

(LGM-

R11)

+

Bourbier

Hassi

messaoud

cocobacille


65

TPA3

(LGM-R3) +

Terre

pollué par

des gasoil

cocobacille

Bios2

(LGM-

R36)

-

Bourbier

Hassi

messaoud

cocobacille

D4

(LGM-

R41)

-

Pate

huileuse

( Afia)

coques


66

LBTP1

(LGM-

R10)

+

Bourbier

Hassi

messaoud

cocobacille

R3

(LGM-R6) +

Eau de

mer

polluée –

Port Aval

Arzew –

Oran

coques

6TMM

(LGM-

R16)

+

Terre

pollué par

l’essence

coques


67

TMD

(LGM-

R15)

+

Terre

pollué par

l’essence

coques

SH

(LGM-R9) +

Terre

Oued

Biskra –

El Kantara

coques

PT1

(LGM-

R31)

-

Bourbier

Hassi

messaoud

Coques

grande taille


68

LBTP2

(LGM-

R13)

+

Bourbier

Hassi

messaoud

Bacille en V

LAWG3

(LGM-

R19)

+

Lac Ain

ouarka

( Wilaya

de Nâama)

cocobacille

A3

(LGM-

R18)

+

Terre

Oued

Biskra –

El Kantara

Bacille en V


69

TP1

(LGM-R8) +

Bourbier

Hassi

messaoud

cocobacille

HM2

(LGM-

R39)

+

Terre

pollué par

le goudron

cocobacille

TASG2

(LGM-

R33)

+ Terre Ain

Sefra

Coques


70

Tableau 10 : Exemple de l’aspect microscopique et autres caractères des souches

isolées ( flore tellurique et aquatique )

TASG3

(LGM-

R34)

+ Terre Ain

sefra

cocobacille

ATG3

(LGM-R7) +

Terre

pollué par

le goudron

Petit bacille

en V

LBTP3

(LGM-

R14)

+

Bourbier

Hassi

messaoud

Bacille en V


71

III.2 – Etude biochimique et autres aptitudes

a- Etude biochimique

1- Type respiratoire

le type respiratoire des Rhodococcus et celui des actinobactéries est connu comme aerobie

stricte (Marchal et al.,1982). Selon Goodfellow et al. (1998), l’incubation et croissance des

souches sont realisées dans des condition d’aerobiose.

2- Test Catalase

Figure 9 : Test de la Catalase

Selon l’illustration on note clairement que la catalase se manifeste par une effervéscance lors

du contact de la souche à tester ( possèdant une catalase) avec l’eau oxygèné (H2O2)

Les souches testées sont des isolats à catalase positive et ceci comme le démontre Tortora et

al.,(2003).

3- Test de tolérance au NaCl

Etant donné le pouvoir de tolérance aux fortes concentrations de NaCl du genre Rhodococcus,

ce test est considéré comme un critère de criblage.

18 souches ont pu croitre dans un milieu où la concentration de NaCl est de 7 %, 20 souches

ont pu croitre dans un milieu où la concentration de NaCl est de 5 % (tableau 11).

Nos résultats se rapprochent de ceux de (Zopf 1891 ; Tsukamura 1974 : Rainey et al. 1995)

qui on décrit le genre Rhodococcus comme tolérant au NaCl. D’autre part Goodfellow, M.

and Alderson, G. 1977 sur leurs travaux sur Rhodococcus roseus et sur Rhodococcus

rhodochrous ont montré que ces deux espèces tolèrent de fortes concentrations au NaCl

allants jusqu'à 7%


72

LBTP1 HM1 ATM6

ATM6* LBTP1* TPA3

6TMM TMD /

ATG3 LBTP3 WSG6

D4 HM2 BIO C

HM1 BIO S2 /

- absence de croissance

- croissance à 5% NaCl - croissance à 5 et à 7 %

Tableau 11 : tolérance des souches à la salinité

Les figures suivantes illustrent la croissance des bacteries en présence de NaCl

Figure 6.1 (Boite 1) : 6TM4(A) , TME(B)

b

Figure 6.2 (Boite 2) : LBTP1(C), HM1(D), TMD(E), 6TMM(F)

6 TM4 TME R3

R2 TASG3 TASG2

SH PT1 /

TP2 D4+ PT3+

LAWC1 LAWG3 LBTP2

/ / /

NaCl 7% NaCl 5%

NaCl 7% NaCl 5%

A B A B

C D

E F

C D

E F


73

Figure 6.3 ( Boite 3) : croissance faible LBTP3(G), HM2(H), BIO S2(I)

Figure 6.4 (Boite 4) : TP2(J), LAWG3 (K), LBTP2(L)

Figure 10 : croissance des isolats sur un milieu GN à forte concentration en NaCl ( 5 et 7 %)

4- Test urease

Un halo Rougâtre autour de la colonie est synonyme d’alcanisation du milieu et la

dégradation de l’urée , ceci nous amène à détecter l’uréase chez les isolats

les huit souches qui ont présenté cette activité sont les suivantes : LBTP2, A3, LBTP1 ,TP1,

ATM6. TMD, TME, 6TM4

NaCl 7%

NaCl 7%

NaCl 5%

NaCl 5%

G

H

I

G

H

I

J

K L

J

K L


74

5- Test tween 80

des halos opaques se distinguent autour des patchs ensemencés dans le milieu tween 80-agar,

les acides gras libérés par les estérase se complexent aux ions Ca2+ pour former un précipité

autour de la culture bactérienne, les souches ayant obtenu un résultat positif dans ce test

possèdent vraissemblablement l’enzyme estérase (Schaad et al.,2001).

Ces résultats se raprochent de ceux de David et al. (1977) il était parmi les premiers qui a

démontrer l’activité estérase chez quleques souches essentiellement Serratia marcescens.

Figure 11 : les isolats ayant montré une digestion sur milieu Tween80

A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8 : présence d’une digestion « halo opaque » ( résultat positif)

B1, B2, B3, B4, B5 : absence de digestion (résultat négatif)

A1

A7

A6

A2

A4

A5

A3

A8

B1

B2

B4

B5

B3


75

Les souches qui ont présenté une activité estérase sont :

PT1 (A1), TASG3 (A2), TP2 (A6), BIOC (A5), LAWC1 (A8), HM2 (A7), TME, 6TM4, WSG6,

6TMM , TMD , ATG3, R3, R2, LBTP1, A3, LAWG3, LBTP3 ,SH,

b- Etudes des aptitudes

1- Test de biodegradation de pétrole en milieu solide

Le test est positif lors de la formation d’un halo clair autour des colonies des souches testées

ont été isolées des sites contaminés etentielement, elles possèderaient certainement un

potontiel catabolique vis-à-vis des polluants comme le pétrole brut.

Ces résultats ce concordent avec les travaux de Kiyohara et al. (1982) vue qu’il était le

premier à avoir ces résulats et cela éssentiellement avec des isolats de Pseudomonas , ces

constats aussi corroborent avec ceux de (Kreit, 1999), puisque il a décrit que le genre

Rhodococcus englobe des espèces qui possèdent des capacités métaboliques multiples,

comprenant la dégradation d’hydrocarbures variés.

Figure 12 : exemple de test des isolats sur milieu MSM-Pétrole

1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 : souches ayant montré une dégradation du pétrole brut sur milieu solide

8

1

5 6

3

7

4

2


76

25 souches au total ont présenté une activité catabolique sur le pétrole brut : TPA, TME, ATG3,

TP1, ATM6, SH, BIOC, LAWG3, LBTP2, HM1, R2, 6TMM, LBTP3, ATM6*, LBTP1, TP2,

LAWC1, A3, PT1, TASG3, TMD, 6TM4, ATG3, HM2, WSG6. Ces souche s’avèrent être

intéressantes en dépollution marine ou pour les stations d’épuration des hydrocarbures et ceci vis-

à-vis une large gamme de polluants.

2- Test de production de Glycolipides

Les glycolipides se complexent avec le bleu de méthylène et forment un halo autour de la

colonie. Cette technique est basée sur la formation d’un complexe insoluble entre un tenseur

anionique et une substance cationique. Après une nuit à 37°C, les colonies qui ont donné un

résultat positif présentent des halos bleus successifs (Figure 13). La localisation des cercles

bleus vis-à-vis de la colonie traduisent que les glycolipides sont synthétisés au moment des

phases de consolidation juste avant le début de la migration, (A.Abdel-Megeed et al.,2011)

12 souches ont représenté ce cas de figure : HM2, BIOS2, BIOC, D4+, TP2, HM1, 6TMM,

TPA3, TME, 6TM4, LBTP1, ATG3.

Figure 13: mise en évidence la production de glycolipides sur milieu solide


77

3- Test de dégradation du cholestérol

On a pu mettre en évidence l’activité de l’enzyme cholesterol oxydase des isolat vis-à-vis du

cholestérol grâce à la manifestation d’un halo clair qui se forme lors du catabolisme de cette

substance. Ces meme résultats ont été trouvé dans des traveux anterieures particulièrement

par Lashkarian et al. (2010) qui a travaillé sur des souches Rhodococcus spp. et d’autre

espèces qui produisent la cholestérol oxydase.

L’utilisation de cholestérol comme seule source de carbone par des Rhodococci fut observée

par Turfitt en 1948 (MacLachlan et al., 2000). Depuis, de nombreux travaux sont effectués sur

le devenir du cholestérol consommé par ces bactéries et l’activité de dégradation des stérols

par les Rhodococci qui a été divisée en deux parties qui se font indépendamment, mais

simultanément (Kreit, 1999) : la coupure de la chaîne latérale d’une part et la dégradation du

squelette polycyclique d’autre part. Cette dernière fait intervenir des réactions d’oxydation,

d’hydroxylation, d’aromatisation, d’hydrolyse et d’estérification (Zianveni, 1982).

Les 19 souches ayant présenté une activité catabolique vis-à-vis du cholestérol sont

recensées :

ATM6, ATM6*, 6TMM, TMD, LBTP1, ATG3, R3, R2, 6TM4, TME, LBTP1, A3, TP2, TP1,

LAWG3, LBTP3, LBTP2, HM1, LAWC (Figure 14)

Cette activité catabolique est certainement due au Cholestérol oxydase, une enzyme contrôlé

par le gène CHO dont l’amplification par des amorces spécifiques est prévue ultérieurement

dans ce travail.


78

Figure 14 : exemple de test des isolats ayant montré une activite cholesterol oxydase sur

milieu MSM-choléstérol

A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9, A10 : présence d’une digestion « halo opaque »

( résultat positif)

B1, B2, B3, B4, B5 : absence de digestion (résultat négatif)

A1 A2

A3

A4 A5 A6

B1

A7

B2 A8

B3

B4 B5

A9 A10


79

4- Détermination de l’index d’émulsion E24 Figure 15 : calcul de l’indice d’émulsion E24

Afin d’estimer la production des biosurfactants par les souches isolées, nous avons réalisé le

test d’émulsification (E24) qui consiste à homogénéiser 3ml de milieu de culture avec 3 ml de

pétrole brut. Ceci est reporté dans le protocole de Cooper et Goldenberg (1987)

Les résultats obtenus sont restituées dans le tableau ci-dessous, ces résultats montrent que les

isolats présentant cette aptitude ont un intérêt industriel important grâce à leur production de

ces composés à activité émulsifiante.

Souches Equation L’indice E24

TPA3 (0.6/2.2) *100 27. 27

TME (0.1/2.2)*100 4.45

ATG3 (0.3/2.2)*100 13.63

TP1 (1.2/2.2)*100 54.54

ATM6 (0.35/2.2)*100 15.90

SH (0.4/2.2)*100 18.18

BIOC (0.4/2.2)*100 18.18

LAWG3 (0.3/2.2)*100 13.63

LBTP2 (0.45/2.2)*100 20.45


80

HM1 (0.2/2.2)*100 9.09

R2 (0.3/2.2)*100 13.63

6TMM (0.2/2.2)*100 9.09

LBTP3 (0.7/2.2)*100 31.81

R3 (0.6/2.2)*100 27. 27

ATM6* (0.1/2.2)*100 4.45

Tableau 12 : indices d’émulsion E24 pour les souches testées

On a pu remarque que les souches TP1, LBTP3, TPA3, R3 présentent un indice

d’émulsifiance remarquable elles nécéssitent une investigation plus approfondie vis-à-vis

leurs proprietés biotechnologiques

Nos résultats se rapporochent de ceux de Bodour et al., 2004.

5- Interaction souches sélectionnées / pétrole brut

Apres incubation à tempétature ambiante et sous agitation (180rpm) pendant 15 jours ,

quelques isolats se sont distingués par leur pouvoir de dégradation comme le montre la figure

16. Les anneaux noiratres ont disparu chez certains souches par rapport à d’autres et par

rapport au témoin.

Les souches : ATG3, SH, TP1, R2, LAWG3, LBTP2 ont présenté une formation d’un biofilm

suignifiant la production de biosurfactant et ceci en ayant un pouvoir de dégradation des

hydrocarbures

En réponse à la présence de composés hydrophobes, les bactéries appartenant au genre

Rhodococcus produisent des biosurfactants, Les tensioactifs cellulaires produits par ce genre

sont principalement des glycolipides (Lang et Philp, 1998)

Pour consommer les substrats hydrophobes dans un milieu aqueux, les Rhodococci

synthétisent des lipopolysaccaharides et des surfactants non ioniques dans leur paroi

(tréhalose non ionique) (Al-Araji et al., 2007). Cette capacité à changer la composition de leur

membrane, leur confère une remarquable capacité d’adaptation à des conditions de stress

comme la présence de solvants toxiques ; c’est en modifiant la composition de leur membrane


81

et en formant des agrégats cellulaires qu’elles peuvent ainsi résister aux conditions de stress

(Carvalho et Fonseca, 2005; Ivshina et al.,1998).

Figure 16 : Dégradation de pétrole brut et production de biosurfactant

6- Test de l’INT

Figure 17 : Test INT après interaction bactérie/ polluant


82

Selon Biiton et Koopman (1982), au cours de la respiration, les cellules vivantes réduisent

I'INT soluble et incolore à l'état oxydé en cristaux d'INT-Formazan (INTF), de couleur ouge-

violette.

Ceci peut montrer l’activité biologique des souches isolées et ceci vis-à-vis du pétrole brut, la

dégradation de ce dernier par les isolats est mise en évidence par cette technique.

Comme montre la Figure 17, douze souches ont été testées, parmi elles, dix isolats ont montré

des résultats positifs :

SH, TP1, ATM6, LBTP3, LBTP2, 6TMM, LAWG3, BIOC, R2, R3

Ceci se traduit par une coloration violette, cette dernière peut changer d’intensité d’une

souche à l’autre et cela est proportionnel à l’activité de dégradation de la souche vis-à-vis du

pétrole. Les souches les plus intéressantes : LBTP3, LBTP2, 6TMM, R3 mérite une

investigation plus approfondie.

Nos résultats rejoignent celle de Jonsen et al. 2002 qui ont développé une méthode de

microplaques pour cribler un grand nombre d'isolats bactériens pour la capacité de se

développer sur les différents hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP).

Ils ont utilisé un nouvel indicateur soluble dans l'eau respiration, WST-1 {4 - [3 - (4-iodo-

phényl) -2 - (4-nitrophényl)-2H-5-tetrazolio] -1,3-benzène disulfonate} , en association avec

des sources de carbone facilement dégradable. Les Souches Pseudomonas et Rhodococcus

essentiellement ont été cultivées sur les HAP en microplaques pendant 7 à 10 jours. Le

colorant tétrazolium WST-1 a été ajouté après incubation. Les déshydrogénases dans des

cellules en croissance réduite WST-1 à un formazan coloré soluble dans l'eau, et l'intensité de

la couleur est une mesure du rythme respiratoire.


83

7- Test d’hémolyse

j h

Figure (A) Figure (B)

Figure 18 : culture sur gélose au sang (a) présence d’hemolyse « Souche TP2 » ,

(b) absence d’hémolyse

Quatre souches on présenté une activité hémolytique sur le milieu gélose au sang

- la Bio C apres 72 heures un halos verdatre à hémolyse a

- TP2 apres 48 heures un halos grand claire à hémolyse ß (Figure 15 « A »)

- LBTP2 et A3 six jour apres l’ensemencement Halo flou d'éclaircissement à

hémolyse ß’

8- culture sur gélose au sang

en plus de l’activité hémolyse , les espèces du genre recherché prennent une forme

macroscopique particulière sur le milieu gélose au sang parce qu’elles se distinguent par des

colonies mucoïdes (Lashkarian et al.,2010).

Au total 19 souches ont présenté des colonies avec aspect mucoïde sur gélose au sang

LBTP1 , D4+, D4, TP2, HM2, HM1,BIOS2, PT+3,PT3,BIOC, LAWC1, LBTP2, LAWG3,

TASG3, PT1,A3,LBTP1*


84

III - Identification par les méthodes de biologie moléculaire

A – ADNr 16 S:

Figure 19 : Amplification du fragment de l’ADNr 16S (1500 pb) par électrophorèse sur gel d'agarose chez les isolats du laboratoire (Photo réalisée au Laboratoire de génétique Microbienne, Oran, 2012).

M : marqueur de taille 200 pb ( Smart Leader), piste 1,2 : S1,S2 (Streptomyces), piste 3 : N1(Lactobacille), piste 4 :R1(Rhodococcus), piste 5 : V1 (Leuconostoc) , piste 6 :L2 (Pediococcus ), piste 7 : S3 ( Streptomyces), piste 8,9 : R2,R3 (Rhodococcus), piste 10 : L3 (Leuconostoc), piste 11 : L4 (Lactobacille )

Au total onze souches du laboratoire ont fait l’objet d’une extraction ADN (Gevers et

al,.2007) et une amplification PCR par l’usage d’amorces universelles (8UA/1492R) de

l’ADNr 16S a été réalisée, ce dernier reste un taxon de choix en matière de systématique en

bactériologie et l’amplifiat est estimé à 1500 pb

On note la présence de bandes d’ADN de poids moléculaire à 1500 pb comparativement aux

bandes du marqueur de taille Smart ladder 200 pb (Figure 18).

Au total quatre souches apparentées à des genres différents ont montré des amplifiats à

1500pb. La méthode d’extraction ADN peut être optimisé pour les souches n’ayant pas

présenté un résultat positif

L’amplifiât chez ces quatre souches a une taille de 1500 Pb, ces résultats corroborent avec

ceux de la littérature (Turner et al.,1999).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 M

1500 pb 1000 pb 800 pb 600 pb 400 pb


85

Il serait intéressant de séquencer ces bandes ADN et de confirmer d’une manière résolutive la

taxonomie de ces souches.

B – La recherche du gène Cholestérol Oxydase « CHO »

Figure 20 : Amplification Gène CHO (1600 pb) par électrophorèse sur gel d'agarose chez les isolats

(Photo réalisée au Laboratoire de génétique Microbienne, Oran, 2012).

M : Marqueur de taille

S1, S2, S3, S4 : souches apparenté et genre Rhodococcus (R3. R2. LBTP2, LBTP3)

S5 , S6 : Pseudomonas spp. appartenant à la collection du laboratoire LGM

Nous notons chez la souche S3 une amplification qui doit être optimisée (problème de

stringence) et ceci par l’amélioration de la température d’hybridation des amorces utilisées

(initialement 58°C pendant 45 secondes par cycle d’amplification). Cette souche mérite un

suivi et une investigation approfondie.

En revanche les deux souches Pseudomonas du laboratoire utilisées dans ce travail montrent

un résultat fort intéressant.

Effectivement chez les deux souches S5 et S6, on note la présence d’une bande ADN

approximativement à 1200 pb. Ce résultat ce joint aux travaux de Aono et al., (1994) sur la

2000 pb

1500 pb

1000 pb 800 pb 600 pb 400 pb

M S1 S2 S3 S4 S5 S6


86

une souche Pseudomonas sp. ST-200. Là aussi, il serait judicieux de séquencer ces amplifiats

et de les analyser par apport à la banque de données du NCBI par le BLAST.

En conclusion, ces deux souches restent très intéressantes utiles a promouvoir, vu l’intérêt et

l’impact des applications du cholestérol oxydase dans le domaine clinique et

biotechnologique.

CONCLUSION ET PERSPECTIVES

Conclusion et Perspectives

87

Les objectifs de cette étude étaient de caractériser les différentes aptitudes des souches de la

flore tellurique et marine apparentée au genre Rhodococcus isolées de sites contaminés,

notamment le pouvoir de dégradation du pétrole, du cholestérol et la capacité de produire des

biosurfactants.

Ce travail nous a permis d’élaborer une collection de souche indigène dont le nombre est de

60 isolats, ces derniers ont été isolés à partir de différents sites en particulier des terres

agricoles dans des régions diverses (Oran, Biskra, Batna, Naama) et sites pollués (essence,

gasoil, goudron, huiles résiduelles), patte graisseuse et eau de mer polluées par des

hydrocarbures.

Au total une soixantaine de souches ont été ressencées dont 34 parmi elles ont été apparentées

au genre Rhodococcus après criblage primaire selon les propriétés physico-chimiques ( Gram

+ , non mobiles , non Sporulées ),(Singleton et al.,1999 ; Gregersen et al., 1978 ; Delarras et

al., 2008), biochimique : Catalase + , Aérobie stricte, tolérant au Nacl 5% ( (Marchal et

al.,1982 ; Tortora et al., 2003 ), et une pré-identification microscopique et macroscopique : de

forme bacillaire en V ou cocoïde et colonie mucoïde de couleur Rosâtre à orangée

(Goodfellow et al.,1998), et aussi selon des aptitudes biologiques notamment l’activité

estérase est mise en évidence grâce au test patch sur milieu Tween 80-Agar ( Schaad et al.,

2001). Une vingtaine de souches ont présentés une activité estérase traduite par des halos

opaques autour des patchs.

D’autres part, 25 souches ont présenté une activité catabolique en interaction avec le pétrole

brut par la mise en évidence des halos claires sur boite MSM vaporisées par le polluant

(pétrole) et ensemencées par les différents isolats selon la méthode de Kiyohara (1982), ces

derniers ont donné des biosurfactants actifs comme produits de synthèse déterminés par un

test à base de bleu de méthylène.

Le test INT a pu confirmé l’activité catabolique vis-à-vis du polluant utilisé (le pétrole) chez

dix souches (Biiton et Koopman., 1982). Le calcul de l’indice d’émulsion à montré que

certaines souches ont un E24 égal a 54.54, 31.81, 27.27 cela respectivement chez TP1, LBTP3,

R3, ce qui représente des valeurs intéressantes qui nécéssitent une investigation plus

approfondie, vu leurs proprietés biotechnologiques, ces résultats concordent avec ceux de

Bodour et al.,(2004).


88

Une autre étude a pu montrer que 19 souches ont présenté une activité catabolique vis-à-vis

du cholestérol grâce à un test coloré sur milieu MSM par l’utilisation du Kit d’analyse de

dosage du Cholestérol, cette activité est due à la Cholestérol oxydase, une enzyme contrôlé

par le gène CHO, dont des amplifications PCR ont été élaborées. Ainsi deux souches de

pseudomonas ont révelé des amplifiats de 1200 pb, ces résultats ce joignent aux travaux de

Aono et al., (1994) sur la une souche Pseudomonas sp. ST-200. La souche S3 a montré une

amplification qui doit être optimisée (problème de stringence) et ceci par l’amélioration de la

température d’hybridation des amorces utilisées (initialement 58°C pendant 45 secondes par

cycle d’amplification). Cette souche mérite un suivi et une investigation approfondie.

D’autre part, on a pu optimiser deux méthodes d’extraction d’ADN de souches apparentées au

genre Rhodococcus (méthode de Gevers et al.,(2001) et méthode standard en utilisant un kit

ADN : Ultra Clean Microbial DNA isolation Kit , Carlsaad.Ca ), une approche de

diagnostique à base de biologie moléculaire reliée par PCR a été réalisée afin d’amplifier le


programme d’amplification approprié. A ce titre, un amplifiat de 1500 pb a été obtenu chez

une souche apparenté au genre Rhodococcus.

En matière de Perspectives, nous préconisons plusieurs volets à l’avenir

• Les souches présentant une activitée lypolitique peuvent être exploités pleinement

comme une solution prometteuse pour la dépollution et le nettoiement des sites

submergés par des produits résiduelles spécialement les rejets des huiles dans les

complexes et les raffineries ou encore la valorisation des huiles usagées, tout cela en

minimisant le cout, la complexité du processus du traitement, en augmentant la

rentabilité et aussi en générant des sous-produits de choix.

• Les souches qui ont pu dégrader le pétrole et qui ont donné des biosurfactants comme

produit peuvent être utilisées comme agents de dépollution, une fois mieux

caractérisées.

• Tester les souches et leurs pouvoirs dégradant sur les hydrocarbures, les polluants et

autres rejet industriels

• Tester le pouvoir inhibiteur sur une gamme élargie de pathogène et purifier les

biomolécules responsable de ce pouvoir antimicrobien et potentiellement anti

fungique.


89

• Production, extraction et étude de propriété biologique des biosurfactants issus de

l’activité métabolique de différentes souches et ceci vis à vis de plusieurs substrats tel

que toluène, HAP etc.…

L’intérêt à introduire des nouvelles techniques de dépistage est grandissant, notamment les

techniques TTGE, DGGE pour déterminer la flore microbienne qui se présente dans les

échantillons et prélèvements avant de passer à l’isolement.

Une étape de séquençage après amplification de l’ADN16s dans un but de taxonomie

moléculaire ou du gène CHO sera caractérisée, l’impact du cholestérol oxydase dans les

applications médicales et agroalimentaires n’est à démontrer.

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• Zianveni, Y. (1982). Bioconversion des stéroïdes par les actinomycètes. Institut National Polytechnique de Lorraine, Nancy.

• Zopf.W(1891) Ueber ausscheidung von fettfarbsoffen (Lipochromen) seitens gewisser spaltpilzes.Ber Deut Bot Gesell 9:22–28

• Zuckerkandl, E. et Pauling, L. (1965). Molecules as documents of evolutionary history. Journal of Theoretical Biology, 8, 357-366.

ANNEXE

Annexe Milieu Tween 80:

Peptone ……….. 10.0 g

NaCl …………… 5.0 g

CaCl2…………… 0.1 g

Agar ……………. 15.0 g

H2O …………… 1.0 L

• Stériliser a 121 C pendant 15 minutes. La gélose (sans tween 80)

• Stériliser le Tween 80 par autoclavage a 121 C pendant 20 minutes.

• Ajouter le Tween 80 stérile au milieu to a une concentration finale de 1% (v/v). et

homogénéiser.

Gélose Nutritive (GN) :

Peptone ………………. 10 g

NaCl ........................…...5 g

Extrait de Levure ………5 g

Agar …………………. 15 g

H2O…………………… 1 L

Annexe Gélose au sang frais :

En grammes par litre d'eau distillée

Mélange spécial de peptones.........23g

Amidon……………………………1g

NaCl……........................................5 g

Agar……........................................10g

Sang de mouton…………………50 mL

pH final = 7,3

NB: base Columbia dans cette composition, mais possibilité d’utiliser aussi une GTS ou un

MH ou une base sang (milieux non glucosés, isotoniques).

PREPARATION

1. Liquéfier la base au bain-marie bouillant.

2. Attendre son refroidissement à 45°C (milieu en surfusion).

3. Y ajouter stérilement, à l'aide d'une pipette Pasteur (1 goutte = 0,05 mL), la quantité de

sang nécessaire pour obtenir une concentration finale en sang de 5%, soit:

• Pour 7 mL de milieu de base (petit culot): (7 x 0,05) / 0,05 = 7 gouttes

• Pour 18 mL de milieu de base (grand culot): (18 x 0,05) / 0,05 = 18 gouttes

Le sang ne doit pas être sorti au dernier moment du réfrigérateur, sinon il y a prise en

masse du milieu au moment de l'addition du sang.

4. Homogénéiser en faisant rouler le tube entre les mains, en évitant la formation de bulles.

5. Couler en boîte de Pétri en évitant la formation de bulles.

Annexe Autre possibilité: le sang frais peut être placé directement dans la boîte de Pétri. On coule

ensuite le milieu en surfusion et on homogénéise dans la boîte de Pétri.

Milieu MSM : (Alexander and Lustigman, 1966)

Solutions A :

1- KH2PO4 …………..10g

2- K2HPO4 …………..10g

3- MgSO4 …………….2g

4- CaCl2 ………………1g

5- Fe EDTA …………0.1g

• Dans 100 ml d’eau distillé pour chaque composant, et chaque solution est autoclavée

• La solution A5 sera filtrée elle ne doit pas passer par l’autoclave

Solution B :

NaCl ………….0.05g

NH4Cl ………...0.6g

Dans 475ml d’eau distillé cette solution sera autoclavée aussi

pH =7.1

Après autoclavage : Solution B + 2 ml Solution A1 + 8 ml Solution A2 + 5 ml Solution A3 +

5ml Solution A4 + 5 ml Solution A5

Le mélange se fait une fois que les solutions se refroidissent

On peut additionner l’agar pour avoir du MSM Solide sur boite

Annexe Kit Clorometric Method Quantitative determination of Cholestérol

Réactifs :

1- Réactif (1) tampon

- PIPES pH 6.9 ….90 mmol/L

- Phénol …………26 mmpl/L

2- Réactif (2) enzymes

- Cholestérol esterase (CHE) ……….300 U/L

- Cholestérol oxidase ( CHOD)……..300 U/L

- Peroxydase ( POD)………………..1250U/L

- 4-Aminophenazone ( 4-AP)……….0.4 mmol/L

3- Cholestérol CAL

Principes :

Cholesterol esters + H2O à Cholesterol + fatty acids [ CHE ]

Cholestérol + O2 à 4 Cholestenona + H2O2 [ CHOD]

2H2O2 + phenol + 4 – Aminophenazone à Quinoneimine + 4 H2O [ POD]

L’intensité de la couleur formée est proportionnelle a la concentration du choléstréol présent

dans le milieu

Annexe Milieu bleu de méthylène (Rhamnolipdes) ( Abdel-Megeed et al 2011)

Gélose Nutritive

Bleu de méthylène ……. 0.1%

CaCl2………………….. 0.2 g

Milieu Luria Bertani (1951,2004)

Ce qui suit est une méthode commune pour la préparation de 1 litre de LB :

• Préparer les ingrédients suivants:

• 10 g de tryptone

• 5 g d'extrait de levures

• 10 g de NaCl

• Verser le tout dans ~800 ml d'eau distillée ou déminéralisée

• Ajouter de manière précise avec une éprouvette graduée de l'eau distillé pour atteindre un

total de 1 litre.

• Autoclave à 121°C.

• Après refroidissement, agiter le flacon pour s'assurer du mélange et le milieu LB est prêt à

l'emploi.

http://fr.wikipedia.org/w/index.php?title=Tryptone&action=edit&redlink=1

http://fr.wikipedia.org/wiki/Eau_distill%C3%A9e

http://fr.wikipedia.org/wiki/%C3%89prouvette_gradu%C3%A9e

http://fr.wikipedia.org/wiki/Autoclave

RésuméUne soixantaine de souches ont été isolées à partir de différents sites telluriques et aquatiques

parmi elles 34 souches ont été apparentées au genre Rhodococcus après criblage selon les

propriétés morphologique physico-chimiques, biochimique et selon des aptitudes biologique

(activité lipolytique)

25 souches ont présenté une activité catabolique vis-à-vis du pétrole brut mis en évidence sur

milieu MSM vaporisées par le polluant (pétrole) , une autre étude est réalisé sur MSM liquide

et neuf souches ont présenté un pouvoir de dégradation ( formation de biosurfactant), le

niveau de biodégradation a été estimé par le test INT. Le calcul de l’indice d’émulsion à

montré des souches ayant des valeurs remarquables E24

D’autre part, 19 souches ont présenté une activité catabolique sur le cholestérol, cette activité

est vraisemblablement due à la Cholestérol oxydase, une enzyme contrôlé par le gène CHO

dont l’amplification par des amorces spécifiques utilisées dans les techniques de biologie

moléculaire à base de PCR a abouti à un amplifiat pour deux souches témoin du laboratoire

(Pseudomonas) et pour une souche apparentée au genre Rhodococcus (LBTP2).

L’optimisation d’une méthode d’extraction d’ADN de souches apparentés au genre

Rhodococcus et une approche de diagnostique à base de PCR a été réalisée afin d’amplifier le


programme d’amplification approprié.

Mots clé :

Rhodoccocus; Biosurfactants; Activité Lipolytique; Biodégradation; INT; E24; CholestérolOxydase; PCR; Adnr 16S; Gène CHO.

RésuméSummary:

In this work we are more interested in the genus Rhodococcus, which is distinguished by its

ability to degrade several pollutants or even make the bioconversion and the biosynthesis of a

variety of interesting products that have appreciated in value several areas including areas of

environmental, industrial and medical sciences.

Sixty strains were isolated from different sites in particular agricultural land in various areas

polluted sites (gasoline, diesel, tar, and residual oils), fat legs and water polluted by

hydrocarbons Sea.

34 strains were related to the genus Rhodococcus after primary screening according to the

physico-chemical properties, biochemical and pre-macroscopic and microscopic

identification, and on biological skills including lipolytic activity is highlighted by the patch

test middle-Tween80 Agar, twenty strains presented lipolytic activity resulted in opaque halos

around patches.

25 strains showed a catabolic activity vis-à-vis crude oil highlighted by clear halos on MSM

medium sprayed by the pollutant (oil) and seeded by the different isolates, they may pledge

assets as biosurfactants synthesis products this study is carried out by a culture liquid MSM

with crude oil as the sole carbon source, nine out of twelve strains tested showed a power

degradation and have given a qualified biosurfactant biofilm, the level of biodegradation was

estimated INT by the test. The calculation of the index emulsion showed strains with E24

equal to 54.54, 31.81, 27.27, which represents outstanding value requiring further

investigation toward their interest in biotechnology.

On the other side, 19 strains showed a catabolic activity on cholesterol, this activity is

probably due to the cholesterol oxidase, controlled by the CHO gene. Amplification with

specific primers used in molecular biology techniques based on PCR, amplification product

resulted in a witness for two laboratory strains (Pseudomonas) and a strain related to the

genus Rhodococcus (LBTP2).

RésuméThe optimization of a DNA extraction method related to the genus Rhodococcus strains and a

diagnostic approach based on PCR was performed to amplify the 16S rDNA gene of 1500 bp

by using a pair of universal primers and appropriate program amplification.

Keywords: Rhodoccocus, biosurfactants, INT, E24, cholesterol oxidase, PCR, DNAr 16S

:الملخص

یل التحویل عیل عدة ملوثات أو حتى تفتحلذي یتمیز بقدرتھ على ، الجنس رودوكوكوسفي عملنا ھذا كنا أكثر اھتماما في

تقدر قیمة في العدید والنفایات الصناعیة ھذه المیزة مثیرة لالھتمام ولوثات مجموعة متنوعة من المالبیولوجي والحیوي ل

.مجاالت البیئیة والصناعیة و العلوم الطبیةالمن المجاالت بما في ذلك

من مواقع مختلفة على وجھ الخصوص األراضي الزراعیة في مختلف المناطق المواقع الملوثة ةتم عزل ستین سالل

.الملوثة بالھیدروكربوناتالبحر ، الدھون ومیاه )البنزین والدیزل والقطران والزیوت المتبقیة(

بعد الفرز االبتدائي وفقا لخصائص الفیزیائیة والكیمیائیة، جنس رودوكوكوسإلىساللة انھا تنتمي 34یمكن اعتبار و

التحلیلي البیولوجیة بما في ذلك التحدید المجھري، وانطلقا من الخصائص والعینیةوالكیمیاء الحیویة ومعالجات ما قبل

.حول السالالتفي بقعساللة نشیطة حیث تمثل النشاط عشرینالذي ابرز، Tween80والتي أبرزھا اختبار للدھون

وش قبال رشالمMSMعلى الوسطواضحةھاالتأبرزھاالتيالخامالنفطاتجاه تقویضيالنشاطسالالت25وأظھرت

عوامل فعالیة سطحیة بیولوجیةھذه العزالت قد تعطيأنكماالمختلفة،االختبارعزالتنمي لوالم) النفط(الملوثاتب

اثنيأصلمنتسعة,للكربونوحیدكمصدرالخامالنفطمعالسائلMSMفي وسطالدراسةھذهتتم،التولیفمنتجاتك

البیولوجيالتحللمستوىوقدر،ھامةعوامل فعالیة سطحیة بیولوجیةوأعطتقوة التحلل أظھرتاختبارةساللعشر

قیمةیمثلالذي27. 54.54،31.81،27یساويE24أنسالالتاالستحالب للمؤشرحسابوأظھر. INTختباربا

.الحیویةالتكنولوجیامجالفيالذي تمثلھھتماماالنظرا لحیزالتحقیقمنمزیداتتطلبھامة

سالالت نشاط تقویضي على الكولیسترول، قد یكون ھذا النشاط نظرا ألوكسیدیز 19من ناحیة أخرى، أظھرت

تقنیات البیولوجیا الجزیئیة على ابراز ھذا الجین عز طریقحیث حولنا، CHOالكولسترول، والتي تسیطر علیھا الجینات

جنسالمتصلةوساللة) (Pseduomonasمختبرسالالتمنالثنینواھد االشفيجزالمنالتضخیمأدى، PCRأساس

إلى الحصول على ناتج إیجابي للتضخیم LBTP2)(الرودوكوكس

تشخیص یعتمد على البیولوجیا نا ھجتناوالرودوكوكوسجنسلتم إجراء التحسین من طریقة استخراج الحمض النووي

عن طریق استخدام زوج من زوج قاعدة 1500الذي یبلغ الجینوتحدید S16rDNAلتضخیم PCRالجزیئیة بواسطة

تضخیم للمناسبو برنامج عالمي التضخیملمبتدئات ا

RésuméPCR ،16Sأوكسیدیز الكولسترول، ،INT،E24،عوامل فعالیة سطحیة بیولوجیة، الرودوكوكوس:المفتاحیة كلمات

DNA

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LABORATOIRE DE GENETIQUE MICROBIENNEtheses.univ-oran1.dz/document/TH4138.pdf · LABORATOIRE DE GENETIQUE MICROBIENNE Mémoire de fin d ... 34 souches ont été apparentées au genre