Upload
baruch
View
44
Download
3
Embed Size (px)
DESCRIPTION
http://www.ueb.cas.cz/olomouc1. Analýza a třídění chromozomů. Pavlína Kovářová. Laboratoratoř molekulární cytogenetiky a cytometrie Ústav experimentální botaniky Olomouc. Průtokový cytometr. Analýza : Mikrospóry Protoplasty Buněčná jádra Chromozómy Chloroplasty. - PowerPoint PPT Presentation
Citation preview
Laboratoratoř molekulární cytogenetiky a cytometrieLaboratoratoř molekulární cytogenetiky a cytometrieÚstav experimentální botanikyÚstav experimentální botaniky
OlomoucOlomouc
http://www.ueb.cas.cz/olomouc1
Pavlína KovářováPavlína Kovářová
Analýza a třídění Analýza a třídění chromozomůchromozomů
Průtokový cytometr
BD FACSVantage (2 lasery, 8 parametrů)
Analýza: Mikrospóry
Protoplasty
Buněčná jádra
Chromozómy
Chloroplasty
Schéma průtokového cytometru
Laser.......
.
.Unášecí tekutina
Regulátortlaku
Průtoková komora
+-
Sběrná zkumavka
Vzorek
Vychylovacídestička
Elektrickýpulz
Vychylovacídestička
DetektorLaser
Vychylovacídestička
Vychylovacídestička
Odpad
Do leva tříděné kapky Do prava
tříděné kapky
Princip třídění
Analýza optických parametrů: fluorescence a rozptyl Společná analýza osmi parametrů Rychlost třídění (102 – 104 chr./ sec)
Materiál používaný k přípravě suspenze chromozomů: Buněčné kultury Protoplasty listového mezofylu Meristemy kořených špičky
Příprava suspenze chromozomů
Extrakce chromozomů
Cytometrická analýza
PřípravaBuněčná synchronizace
Akumulace v metafázi
Barvení chromozomů
Třídění chromozomů
Flow karyotyp
Idiogram
Relativní obsah DNA
Frek
venc
e
Idiogram Flow karyotyp vyjadřuje závislost relativního obsahu DNA na počtu daného typu chromozomů
Detekce strukturálních a početních změn chromozomů v karyotypu
Teoretický flow karyotyp
Flow karyotyp
Relativní intenzita fluorescence
Rela
tivvn
í fre
kven
ce ChineseSpring I
II
III
I: 1D, 4D, 6D; II: 1A, 3A, 6A, 2D, 3D, 5D, 7D; III: 2A, 4A, 5A, 7A, 1B, 2B, 4B, 5B, 6B, 7B
3B
3B
Vrana et al. (2001)
Hexaploidní pšenice (1C = 17 000 Mbp)
Identifikace a určení čistoty tříděné frakce :FISHPRINS PCR
Použití chromozomových linií :Použití chromozomových linií : Translokační linieTranslokační linie Deleční linieDeleční linie Adiční linieAdiční linie
Specifické chromozomové barveníSpecifické chromozomové barvení AT a GC nukletidových bazíAT a GC nukletidových bazí
Diskriminace jednotlivých chromozomů
Kromě chromozomu 3B je v histogramu oddělený pík pro translokační chromozomy 5BL·7BL a 4AL·4AS-5BL, které můžeme snadno třídit. Chromozomy jsou identifikovány pomocí PRINS s GAA mikrosatelitem.
Třídění translokačních linií u pšenice
„Cappelle Desprez“
Relativní intenzita fluorescence
Rela
tivní
frek
venc
e
3B
I
II
III
„Jubilar“
Relativní intenzita fluorescence
Rela
tivní
frek
venc
e I
II
III
3B
4AL·4AS-5BL
4AL·4AS-5BL
5BL·7BL
5BL·7BL
Kubalakova et al. (2002)
Jednotlivá ramena chromozomů můžeme třídit z ditelosomockych linií nebo z linií nesoucích izochromozomy. Chromozomy jsou identifikovány pomocí PRINS s GAA mikrosatelitem
„Chinese Spring“ iso5BL
Relativní intenzita fluorescence
Rela
tivní
frek
venc
e
3B
II
III
Třídění chromozomových ramen u pšenice
I
iso5BL
iso5BL
„Chinese Spring“ Dt1BS
Relativní intenzita fluorescence
Rela
tivní
frek
venc
e
3B
I
IIIII1BS
1BS
Kubalakova et al. (2002)
Adiční linie pšenice a žita
Jednotlivé chromozomy žita mohou být tříděny z adiční linie pšenice–žito. Tříděné žitné chromozomy jsou identifikovány FISH s pSc119.2 repeticí a GAA mikrosatelitem.
T. aestivum (21'' + 1'' 6R)
Relativní intenzita fluorescence
Rela
tivní
frek
venc
e
6R3B
6R
II
IIII
Secale cereale „Selgo“
Relativní intenzita fluorescence
Rela
tivní
frek
venc
e 5BL·7BL1R - 6R
Kubalakova et al. (2003)
Kubalakova et al. (2003)
Secale cereale „Adams“
Relativní intenzita fluorescence
Rela
tivní
frek
venc
e
2R - 7R
1R
B
119 Afa
Translokace BS·BL-1RS
5S45S
Afa45S
DAPI
Tato translokace byla detekována u 0.5% tříděných B chromozomů
B
Detekce vzácných strukturálních změn genomu
Průtoková cytometrie umožňuje analýzu velkého množství chromozomů (<103) a tím detekci vzácných strukturálních změn.
“High-resolution” FISH na natažených chromozomech
Valarik et al. (v tisku)
Tříděné chromozomy mohou být nataženy až na 100 x větší délku, než byla ta původní, čímž se výrazně zlepší prostorové rozlišení až o dva řády.
PI
BAC9
17 μm (1x)
1352 µm (79.5x)
42 µm Chromosome 3B(T. aestivum)
Gelová elektroforeza
PCR
1 2 3 4 5 6
TříděníI II III IV
Standartní karyotyp
1 2 3 4
I II
Translokace
5 6
Třídění 102 chromozomů trvá jen několik minut, proto je PCR velmi výhodným nástrojem k fyzickému mapování.
Fyzické mapování pomocí PCR se specifických primerů
Konstrukce chromozomově specifických BAC knihoven
Ligace do defosforylovaného
BAC vektoru
E. coli transformace
Izolace vysokomolekulárni
DNA
Cytometrická analýzaa třídění
I
IIIII
3B
ChineseSpring
2 3 S1kbp
- 2200
- 825
- 225- 50
Kolonie
Uspořádání na 384-jamkové destičky
3 BAC DNA knihovny byly konstruovány z tříděných chromozomů pšenice:
• 3B chromosomově-specifická BAC knihovna
• 1D, 4D, 6D subgenomicka BAC knihovna
• BAC knihovna specifická pro chromozomové rameno 1BS
Šafář et al. (přijato do tisku); Janda et al. (v přípravě)
V BAC knihovně hledáme specifické klony, které mapujeme na mitotických chromozomech pomocí in situ hybridizace.
Filtr po hybridizaci s genomickou DNA
Málo repetitivní BAC
Vysoce repetitivní BAC
BACDAPI
Tříděné 3B chromozomy
Fyzické mapování BAC klonů na tříděné chromozomy
63C11 63B13 63N2 81B7
Závěr
Průtoková cytometrie může být použita ke třídění mitotických chromozomů zemědělsky významných obilovin a leguminóz.
Flow karyotyping je vhodný ke kvantitavní detekci numerických a strukturálních změn chromozomů
Tříděné chromozómy jsou vhodné pro fyzické mapování použitím FISH, PRINS and PCR
Tříděné chromozomy lze využít ke konstrukci chromozomově specifických BAC knihoven
Naše laboratořNaše laboratoř
http://www.ueb.cas.cz/olomouc1