69

Lampiran 1. Surat Identifikasi dan Determinasi tanaman

Gambar lampiran 1. Surat identifikasi dan determinasi tanaman sidaguri

70

Lampiran 2. Dokumentasi Penelitian

Gambar lampiran 2. Proses maserasi dengan alat stirer dan Penyaringan vakum

Gambar lampiran 2. Ekstrak Etanol Akar Sidaguri dan Pembuatan Fraksi Air dan Etil Asetat

71

Lampiran 2. Dokumentasi Penelitian (Lanjutan)

Gambar lampiran 2. Fraksi Air EEAS kental dan Enzim Xanthine Oxidase

Gambar lampiran 2. Larutan substrat Xanthine, Dapar fosfat dan Allopurinol

Lampiran 2. Dokumentasi Penelitian (Lanjutan)

72

Gambar lampiran 2. Larutan uji Ekstrak Etanol Akar Sidaguri dan Fraksi Air EEAS

Lampiran 3. Sertifikat Allopurinol Murni

73

Gambar lampiran 3. Sertifikat Allopurinol Murni

Lampiran 4. Perhitungan enzim Xanthine Oxidase, Larutan Buffer, Larutan Induk, Larutan Uji, dan Pembanding (allopurinol)

A. Xanthine Oxidase from bovine milk grade I (X1875 SIGMA)

74

Dalam kemasan enzim xanthine oxidase tertulis:

Pembuatan xanthine oxidase 100 mU/ml

Di dalam labu takar, larutan suspensi enzim xanthine oxidase dalam

ammonium sulfat sebanyak 50 l dicampur dengan larutan buffer fosfat 0,05

M pH 7.5 hingga 5,0 ml. Jumlah larutan induk yang digunakan dihitung

dengan persamaan :

V x 10000.0 mU/ml = 100 mU/ml x 5,0 ml

V = 0,05 ml = 50 µl

Kadar xanthine oxidase dalam campuran larutan pada kuvet:

100 l x 100 mU/ml = 9,76 mU/ml

1025 l

Lampiran 4. Perhitungan enzim Xanthine Oxidase, Larutan Buffer, Larutan Induk, Larutan Uji, dan Pembanding (allopurinol) (Lanjutan)

B. Pembuatan larutan buffer fosfat 0,05 M pH 7,5

5 unit Xanthine Oxidase bovine milk grade 1 dalam suspensi ammonium sulfat 0,4 unit/mg protein dengan volume 0,5 ml ~ 13 mg protein/ml. 0,8 unit/mg protein disimpan di suhu 2-8 C

75

Dipipet 81,4 ml larutan Na2HPO4 1 M dan 18,6 ml larutan KH2PO4 1 M

dimasukkan ke dalam gelas piala yang telah dikalibrasi 2000,0 ml dan telah diisi

500 ml aqua demineralisata bebas CO2, aduk rata kemudian volumenya

dicukupkan hingga volume akhir. pH larutan diperiksa dengan pH meter dan

ditambahkan dengan larutan Na2HPO4/ KH2PO4.

C. Pembuatan larutan induk fraksi air EEAS 10000,0 µg/ml

Di dalam labu takar fraksi air EEAS sebanyak 50,00 mg dilarutkan dalam

beberapa tetes DMSO, ditambah larutan buffer fosfat 0,05 M pH 7,5 hingga 5,0 ml.

D. Pembuatan larutan uji fraksi butanol 400 µg/ml, 500 µg/ml, 800 µg/ml dan

1000 µg/ml

1) Fraksi air EEAS 500 µg/ml.

Di dalam labu takar, larutan induk sebanyak 0,25 ml dicampur dengan larutan

buffer fosfat 0,05 M pH 7,5 hingga 5,0 ml. Jumlah larutan induk yang digunakan

dihitung dengan persamaan :

V x 10000,0 µg/ml = 500 µg/ml x 5,0 ml

V = 0,25 ml = 250 µl

Lampiran 4. Perhitungan mg solid Xanthine Oxidase, Larutan Buffer, Larutan Induk, Larutan Uji, dan Pembanding (allopurinol) (Lanjutan)

2) Fraksi air EEAS 800 µg/ml.

76

Di dalam labu takar, larutan induk sebanyak 0,4 ml dicampur dengan larutan

buffer fosfat 0,05 M pH 7,5 hingga 5,0 ml. Jumlah larutan induk yang digunakan

dihitung dengan persamaan :

V x 10000,0 µg/ml = 800 µg/ml x 5,0 ml

V = 0,4 ml = 400 µl

3) Fraksi air EEAS 1000 µg/ml.

Di dalam labu takar, larutan induk sebanyak 0,5 ml dicampur dengan larutan

buffer fosfat 0,05 M pH 7,5 hingga 5,0 ml. Jumlah larutan induk yang digunakan

dihitung dengan persamaan :

V x 10000,0 µg/ml = 1000 µg/ml x 5, 0 ml

V = 0,5 ml = 500 µl

E. Pembuatan larutan induk allopurinol 1000,0 µg/ml

Di dalam labu takar, allopurinol sebanyak 50,00 mg dilarutkan dalam

beberapa tetes NaOH 1 N, ditambah larutan buffer fosfat 0,05 M pH 7,5 hingga 50,0

ml.

F. Pembuatan larutan allopurinol 10 µg/ml; 12,5 µg/ml; 15 µg/ml

1) Allopurinol 10 µg/ml

Di dalam labu takar, larutan induk sebanyak 0,05 ml dicampur dengan larutan

buffer fosfat pH 7,5 hingga 10,0 ml. Jumlah larutan induk yang digunakan dihitung

dengan persamaan :

V x 1000,0 µg/ml = 10 µg/ml x 10 ml

V = 0,05 ml= 50 µl

Lampiran 4. Perhitungan mg solid Xanthine Oxidase, Larutan Buffer, Larutan Induk, Larutan Uji, dan Pembanding (allopurinol) (Lanjutan)

2) Allopurinol 12,5 µg/ml

77

Di dalam labu takar, larutan induk sebanyak 0,0625 ml dicampur dengan

larutan buffer fosfat pH 7,5 hingga 5,0 ml. Jumlah larutan induk yang digunakan

dihitung dengan persamaan :

V x 1000,0 µg/ml = 12,5 µg/ml x 5 ml

V = 0,0625 ml= 62,5 l

3) Allopurinol 15 µg/ml

Di dalam labu takar, larutan induk sebanyak 0,075 ml dicampur dengan

larutan buffer fosfat pH 7,5 hingga 5,0 ml. Jumlah larutan induk yang digunakan

dihitung dengan persamaan :

V x 1000,0 µg/ml = 15 µg/ml x 5 ml

V = 0,075 ml= 75 l

Lampiran 5. Data Perhitungan Aktivitas Xanthine Oxidase

Bahan Uji Konsentrasi(g/ml)

Absorbansi

Aktivitas(A/menit)

Aktivitas (mU/ml)

Inhibisi(%)

78

Kontrol Negatif

0 0,46000,50400,5680

0,09200,10080,1136

77,3084,6995,44

0

Rata-rata 0,5107 0,1021 85,81Allopurinol 10 0,1900

0,18900,1910

0,03800,03780,0382

31,9331,7632,09

62,7962,9962,60

Rata-rata 0,1900 0,0380 31,93 62,7912,5 0,1390

0,15500,1500

0,02780,03100,0300

23,3626,0525,20

72,77 69,64 70,63

Rata-rata 0,1480 0,0296 24,87 71,0215 0,0690

0,07000.0670

0,01380,01400,0134

11,6011,7611,26

86,48 86,30 86,88

Rata-rata 0,0687 0,0137 11,54 86,55Ekstrak

Etanol Akar

Sidaguri

100 0,25000,25300,2540

0,05000,05060,0508

42,0142,5142,68

50,0450,4650,26

Rata-rata 0,0252 0,0505 42,40 50,25200 0,1860

0,18700,1880

0,03720,03740,0376

31,2531,4231,59

63,5863,3863,19

Rata-rata 0,1870 0,0374 31,42 63,38400 0,1310

0,12900,1320

0,02620,02580,0264

22,0121,6822,18

74,3574,7374,15

Rata-rata 0,1307 0,0261 21,96 74,41

Lampiran 5. Data Perhitungan Aktivitas Xanthine Oxidase (lanjutan)

Bahan Uji Konsentrasi(g/ml)

Absorbansi

Aktivitas(A/menit)

Aktivitas (unit/ml)

Inhibisi(%)

79

Fraksi Air Ekstrak

Etanol Akar Sidaguri

500 0,42400,42800,4260

0,08480,08560,0852

71,2571,9271,58

16,9716,1916,58

Rata-rata 0,4260 0,0852 71,58 16,58800 0,3420

0,34400,3450

0,06840,06880,0690

57,4757,8057,97

33,0232,6432,44

Rata-rata 0,3437 0,0687 57,75 32,771000 0,1270

0,12400,1250

0,02540,02480,0250

21,3420,8421,00

75,1375,7175,53

Rata-rata 0,1253 0,0251 21,06 75,46

Lampiran 6. Contoh Perhitungan Aktivitas Xanthine Oxidase

Rumus :

80

Aktivitas (unit/ml enzim) = (A/menit larutan uji - A/menit larutan blanko) (V) (df)

(12,2) (0,1)

Contoh perhitungan aktivitas xanthine oxidase oleh fraksi air ekstrak etanol akar

sidaguri 500 µg/ml :

Aktivitas (unit/ml enzim) = 0,0852 x 1,025

12,2 x 0,1

= 0,07158 unit/ml enzim x1000

= 71,58 mU/ml enzim

Lampiran 7. Perhitungan Persen Inhibisi Aktivitas XO dari Fraksi air ekstrak etanol akar sidaguri Dan Allopurinol

Rumus :

81

Contoh perhitungan % inhibisi fraksi air ekstrak etanol akar sidaguri 500 µg/ml.

% inhibisi = 85,81 – 71,58 x 100 % = 16,58 % 85,81

Contoh perhitungan % inhibisi allopurinol 12,5 µg/ml.

% inhibisi = 85,81 – 24,87 x 100 % = 71, 02 % 85,81

Lampiran 8. Perhitungan IC50

82

Berdasarkan besar inhibisi dari tiap-tiap bahan uji (data pada tabel III), dibuat

persamaan regresi linier untuk menentukan nilai IC50. Nilai IC50 diperoleh dari

persamaan regresi linier antara konsentrasi bahan uji (sumbu x) dengan persen

penghambatan aktivitas xanthine oxidase oleh bahan uji (sumbu y).

Persamaan regresi linier antara konsentrasi fraksi air EEAS dan % inhibisi :

Y = 0,1139x – 45,8645

50 = 0,1139x – 45,8645

0.1139x = 95,8645

x = 841,65µg/ml

Persamaan regresi linier antara konsentrasi allopurinol dan % inhibisi :

Y = 4,66x + 14,80

50 = 4,66x + 14,80

4,66x = 35,20

x = 7,55 µg/ml

Persamaan regresi linier antara konsentrasi allopurinol dan % inhibisi :

Y = 0,0775x + 44,79

50 = 0,0775x + 44,79

0,0775x = 5,21

x = 67,27 µg/ml

Lampiran 9. Hasil Uji Statistik IC50

1. Uji Homogenitas

83

Analisis:Digunakan taraf kepercayaan 95%, maka = 0,05

Pengambilan Keputusan :

Data IC50 homogen jika asymp.sig > 0,05

Data IC50 tidak homogen jika asymp.sig < 0,05

Keputusan : Karena nilai sig > 0,05; maka Data IC50 homogen

Kesimpulan : Data IC50 antara 3 kelompok yaitu fraksi air EEAS, EEAS dan

allopurinol homogen.

Lampiran 9. Hasil Uji Statistik IC50 (lanjutan)2. Uji Distribusi Normal

84

Analisis :Digunakan taraf kepercayaan 95%, maka = 0,05

Pengambilan Keputusan :

Data IC50 terdistribusi normal jika asymp.sig > 0,05

Data IC50 tidak terdistribusi normal jika asymp.sig < 0,05

Keputusan : Karena nilai sig > 0,05; maka Data IC50 terdistribusi normal

Kesimpulan : Data IC50 antara 3 kelompok yaitu fraksi air EEAS, EEAS dan

allopurinol terdistribusi normal.

Lampiran 9. Hasil Uji Statistik IC50 (lanjutan)

3. Uji Parametrik (Uji Anova)

85

Alasan dilakukan parametrik ini adalah karena data IC50 antara 3 kelompok

memenuhi uji homogen dan uji distribusi normal.

Analisis :

1) Ho : Kelompok Fraksi EEAS = EEAS = Allopurinol

2) Ha : Kelompok Fraksi EEAS EEAS Allopurinol

Digunakan taraf kepercayaan 95%, maka = 0,05

Pengambilan Keputusan :

Ho diterima jika asymp.sig > 0,05

Ho ditolak jika asymp.sig < 0,05

Keputusan : Karena nilai sig 0,00 < 0,05; maka Ho ditolak

Kesimpulan : Ada perbedaan data IC50 antara 3 kelompok

Lampiran 10. Data kecepatan Aktivitas Xanthine Oxidase, Ekstrak Etanol Akar

Sidaguri (EEAS), Fraksi Air EEAS dan Allopurinol Menggunakan Spektrofotometri

86

Lampiran 11. Hasil Penentuan Panjang Gelombang Maksimun Aktivitas Xanthine Oxidase

Sample ID(g/ml)

Absorbansi menit ke 0

Absorbansi menit ke 5

maks

(nm)Aktivitas

(A/menit)

K. Negatif0.01900.01000.0490

0.47900.51400.6170

294.50.09200.10080.1136

Allopurinol 100.01600.01300.0170

0.20600.20200.2080

294.50.03800.03780.0382

Allopurinol 12,5

0.05600.04400.0260

0.19500.19900.1760

294.50.02780.03100.0300

Allopurinol 150.08600.02100.0260

0.15500.09100.0930

294.50.01380.01400.0134

EEAS 1000.02700.01300.0480

0.27700.26600.3020

294.50.05000.05060.0508

EEAS 2000.04200.10100.0870

0.22800.28800.2750

294.50.03720.03740.0376

EEAS 4000.16000.17200.1950

0.29100.30100.3270

294.50.02620.02580.0264

Fraksi Air EEAS500

0.30800.41000.4030

0.73200.83800.8290

294.50.08480.08560.0852

Fraksi Air EEAS800

0.43500.44400.3950

0.77700.78800.7400

294.50.06840.06880.0690

Fraksi Air EEAS1000

0.71000.64200.5920

0.83700.76600.7170

294.50.02540.02480.0250

87

Gambar lampiran 12. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum Aktivitas Xanthine Oxidase