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L’apoptose
Dominique Kerboeuf et Yves le VernINRA, IASP, 37380 Nouzilly
I. Définitions et processus
La mort cellulaire
• 2 types de mort cellulaire :–apoptose–Nécrose
• Apoptose = Mort cellulaire « programmée » ou « Programmed Cell Death » (PCD)
• PCD = phénomène essentiel dans de nombreux processus physiologiques et pathologiques
Rôles de la mort cellulaire
• Elimination des « surplus » de cellules saines :– Embryologie (cavités, morphogénèse,
structures vestigiales, cellules « en trop »)– homéostasie = constance de la masse
cellulaire– processus physiologiques (cellules
mammaires, endomètre, cellules épithéliales…)
• Suppression des cellules endommagées (défauts génétiques, vieillissement, maladies, agents toxiques…)
• Régulation des populations cellulaires (ex. élimination régulée de certaines populations cellulaires immunitaires)
Apoptose et Nécrose
• Leurs mécanismes et modalités de déclenchement
• la morphologie des cellules• les conséquences tissulaires• leurs significations biologiques
Se différencient par :
Apoptose vs Nécrose
• Atrophie
• Intégrité organelles et membrane
• Condensation du noyau
• Bourgeonnement de la membrane
• Fragmentation (« corps apoptotiques »)
• Phagocytose / C voisines
• Pas d ’inflammation
• Turgescence
• Lyse des organelles et des membranes
• Pas de condensation
• Rupture des membranes
• Libération du contenu cellulaire
• Lyse de la chromatine
• Phagocytose tardive
• Inflammation
Nécrose
Apoptose
Photo Molecular Probes
1. Nécrose : membrane et organellesAltérées, noyau + conservéx 10 000 (TEM)
2. Apoptose (A) réarrangement de la chromatine (vs normal N), membrane ++ x 8000 (TEM)
3. Nécrose (SEM)x 5000
4. Apoptose (SEM) bourgeonnementsx 5000
5. Cellule normale : pores nucléairesx 30 000 (FF)
6. Apoptose : confluence des pores nucléairesx 35 000 (FF)
Remarques
• Etats intermédiaires : – facteurs déclenchants communs– importance des ressources énergétiques
(ATP)– succession apoptose puis nécrose
• Etat apoptotique « fugitif » inaperçu (phagocytose très rapide)
Un schéma simple : Caenorhabditis elegans
3 étapes :1) apparition de signaux (externes ou internes)2) activation de protéases cellulaires3) formation des « corps apoptotiques » et phagocytose
EGL-1 ----> CED-9 ----> CED-4 ----> CED-3 ----> Apoptose+ CED-3 activé
Membrane C Etape intra cellulaire
Inactivation Inactivation
Signal
Schéma général de l ’apoptose
Mitochondrie
AIFCytochrome C
Caspase 9
Caspases effectricesCaspase 3 (Caspases 6 et 7)
Bcl2-pro
Bcl2-anti
Conditions physico-chimiquesCa ++
ADN, noyau
P53
Cyclines
TNFFas
Caspase 8
NKPerforinGranzyme B
T cellCD8
Dégranulation
Récepteurs de mort
Les signaux déclencheurs
• Déclencheurs extra-cellulaires :– Souvent communications entre cellules– insuffisance de signaux suppresseurs de
« PCD »– augmentation de signaux inducteurs
• Déclencheurs intra-cellulaires– réponse à des stimuli ou à des perturbations
métaboliques
!
Combinaison des 2 types de signaux
Les récepteurs ont des rôles multiples(ex prolifération, différenciation, survie)
Rôle différent du récepteur selon type cellulaireex. récepteurs des stéroïdes
Différents mécanismes d ’inductionsouvent associés
Insuffisance de signaux suppresseurs
• Cultures cellulaires : concentration, sérum, diverses molécules solubles ou liées à la membrane (variations selon le type cellulaire)
• Liaison cellules cibles – ex. neurones = adaptation au nombre de cibles
Augmentation de signaux inducteurs
Ex = perte queue des têtards = rôle de l ’hormone thyroïdienne
Signaux extra-cellulaires
Signaux intra-cellulaires
= lésions de la cellule produites par :drogues, toxines, chaleur, radiations, hypoxie, virus…qui ne sont pas des « inducteurs » spécifiques
= « seuil de lésions » déclenchement de la PCD
= activation des caspases, de protéines proapoptotiques (voie p53 dépendante) ou protéines kinases
Induction in vitro
Fas ou Ac anti Fas (CD95)TNF ou ligands du TCR
Pas de sérum ou de facteur de croissanceUVH2O2
GlucocorticoidesIonophore calciumCamptothecine
Contact lymphocytes T cytotoxiques ou NK activés
+ concentration cellulaire, équilibre de populations
Temps nécessaire = 2 à 6 h
Voie Fas-L (CD 95) Fas
Membrane cellulaire
Fas-Ligand
Fas (trimérisation)
FADD Fas Associated protein with Death Domain
Pro Cas 8
Cas 8Pro Cas 3 Autres Cas
Apoptosome
(AIF)
m
Cytochrome C
dATP
Apaf-1Apaf-1
Pro Cas 9
Pro Cas 9
Cyt C
Cyt CCaspase 9
AIF = Apoptosis Inducing FactorApaf-1 = Apoptosis protease activating factor 1
Les caspases
= C aspases
14 caspases et pro-caspases
Cystéines protéases, résidus acide aspartique
3 groupes, selon affinité de substrat I = 1, 4, 5 ---> inflammationII= 2, 3, 7 + CED-3 ---> apoptoseIII = 6, 8, 9 ---> «
Activation des caspases « entre elles » = « cascade » irréversible
Rôle très important de la caspase 3exécuteur-clé (qq soit le stimulus)
Régulation de la cascade par des protéines activatrices inhibitrices
APAF1 Bcl2 FADDRIPFLASHBcl2
Activation en présence de : ATP + cytochrome C(rôle de la mitochondrie)
La famille des Bcl2
Action sur les membranes mitochondriales = libération ou non du cytochrome C (proApo ou antiApo)
Bax Bak Bok Bik Bin Bad Bid…Mbrane mitochondrie(Bad Bid = cytosol)
Bcl2* Bclxl* Bclw Mcl1 Nr13 Al/Bfl1(*= inhibe Cas9)
+ formation homodimères ou hétérodimères= régulation
II. Méthodes d’analyse de l’apoptose
* Membranes cellulaires= Translocation des phosphatidylsérines (Annexin V)
* Mitochondries= Potentiel de membranes (sondes fluorescentes)= Libération du cytochrome C (Ac ELISA)= Libération de AIF « Apoptosis inducing factor » (Ac ELISA)
* Noyau= Clivage de l ’ADN
- Ac anti-histones- fragments (180 pb) : gel d ’agarose (« DNA ladder »)- TUNEL ou TdT : extrêmités 3’OH- nucléosomes (ELISA)
= Libération des « Nuclear Matrix Proteins » (NMPs) Ac
* Dosages de molécules= Récepteurs des signaux Ac FAS-L (ou Apo-1 ou CD95) TNF
= CaspasesAc ou activités enzymatiques (substrats spécifiques) ==> fluorescence)
= Protéines régulatrices (pro ou anti) Ac
= Glutathion
= calcium
* Gènes impliqués
Cytométrie en flux et étude de l’apoptose
Principe de la cytométrie en flux
• Plusieurs paramètres simultanément pour chaque cellule (jusqu'à 11 paramètres dont 8 fluorescences)
• Sélection de populations (analyse et tri)
• Analyse de cellules vivantes, grand nombre en peu de temps
• Cellule par cellule, quantification de la fluorescence
2 types de signaux
• Signaux de diffusion de lumière
diffusion frontale de la lumière = FSC = Forward Scatter
diffusion latérale de la lumière = SSC = Side Scatter
• Signaux de fluorescence
couleur d’émission de fluorescence : violet, bleu, vert, jaune, orange, rouge
Spectres d’excitation et d’émission de la fluorescéine
Spectre d’excitation
Spectre d’émission
Invitrogen Molecular Probes
Analyse monoparamétrique : exemple la fluorescence
Intensité de fluorescence verte => échelle exprimée en unités arbitraires ou canaux
Nom
bre
de c
ellu
les
par
class
e d
’inte
nsi
té
(« c
anal »)
Témoin : autofluorescence des cellules
Après marquage spécifique
Population pure => une gausssienne
Analyse biparamétrique : exemple de deux fluorescences
• double marquage : amélioration de la discrimination entre les populations
• cellules positionnées en fonction coordonnées sur les 2 axes
Intensité de fluorescence verte
Inte
nsi
té d
e fl
uore
scence
ro
uge
Population doublement marquée
Populations simplement marquées
Population non marquée
Analyse multiparamétrique
Sélection des cellules sur les paramètres de diffusion de lumière
Analyse multiparamétrique
Marquage avec un anticorps un anti-lymphocytes T
Cellules vivantes
Cellules vivantes
Cellules en apoptose
Cellules en apoptose
Cellules mortes
Cellules mortes
Intensité de fluorescence orange
Nom
bre
de c
ellu
les
par
class
e d
’inte
nsi
té (
« c
anal »)
région 1
région 2
• Pourquoi trier ? Vérification des analyses Autres analyses (cytométrie ou autre méthodologie) Mise en culture (tri « stérile »)
• Comment trier ? Une à quatre populations différentes Vitesse de tri maximum 50000 Cellules/s Support : lames, tubes, plaques à microtitration Milieu : « coussin », PBS, RPMI… (+ SVF) La pureté, la viabilité, la stérilité
Le tri et ses options
Principe du tri par cytométrie
Buse
Drop delay
Rayon laser
Gouttelettes détachées
Plaques de déflection
+ 2500 V- 2500 V
AnalyseF
A
« Break off »
Exemple de tri par cytométrie
Analyse avant tri Réanalyse après tri
Drouet-Viard (2001)
99.6 % de pureté
Etapes principales de l’apoptose analysées en cytométrie
Récepteurs de mort
caspaseidentification activité
noyauFragmentation
« Nuclear Matrix Protein (NMP)
mitochondriemembrane
récepteursaltérations
Potentiel de membrane
calcium
Pro Bcl2AntiBcl2
Mise en évidence des récepteurs de mort
Anticorps dirigés contre lesrécepteurs de mort
fonctionnels :
• anti Fas (anti CD95)
• anti TRAIL (anti DR3,DR4,DR5…)
• anti DCR2, DCR3…
=> réaction immunofluorescence directe ou indirecte
Kyung-Mi Kim et al (2000). Experimental and molecular medicine 32, 246-254.
Fixation ligand spécifique => formation complexe multiprotéique
Mise en évidence des protéines agissant au niveau mitochondrial
Anticorps dirigés contre
• les protéines proapoptotiques: Bax
• les protéines antiapoptotiques : Bcl2
• la forme tronquée de Bid (obtenu après action caspase 8)
Perianayagam et al (2003). European Journal of Clinical Investigation 33, 905-911.
Variation du calcium intracellulaire
• mesure du flux de Ca++ => Fluo3
• mesure quantitative du Ca++ :
- Fura-2 modification spectre d’excitation
- Indo-1 modification spectre d’émission fluorochrome libre : émission 475nm (B)fluorochrome lié : émission 400nm (A)
mesure ratiométrique sonde liée/sonde libre
Etape précoce de l’apoptose => augmentation du calcium
intra-cellulaire
Spectre d ’émission de l ’indo-1
Variation de calcium intracellulaire utilisation du fluo-3
Cao QZ et al (2005). World J Gastroenterol Apr 21;11(15):2255-9.
Cellules témoins
Cellules traitéesVérapamil
WangXJ, Xu JX (2005). Neuroscience Letter Mar 11, 376(2) : 127-32.
Induction apoptose par la roténone sur des cellules neuronales
Modifications membranaires
• Modification graduelle de la perméabilité membranairepénétration plus facile : Hoechst 33342 ou Yo-Pro1
• Perte de l’assymétrie membranaire : externalisation des phospholipidesAnnexineV reconnaît les phosphatidylsérines
• Etude du désordre lipidique membranaireexternalisation des phosphatidylsérines => modification organisation membranaire => augmentation fixation merocyanine 540
discrimination cellules mortes-cellules vivantes
Externalisation des phosphatidylsérines
Intensité de fluorescence verte (annexine V FITC)
Inte
nsi
té d
e
fluore
scence
rouge (
7A
AD
)
Résultats A-M Chaussé (1996)
Cellules vivantes
Cellules mortes
Cellules en apoptose
Externalisation des phosphatidylsérines
Lignée de cellules T humaines, coloration annexineV Alexa 488 et Iodure de propidiumPhoto : Molecular Probes
Cellule en nécrose
Cellule en apoptose
Modifications dans la mitochondrie
Action protéines proapoptotiques (Bax…)
Ouverture des pores de transition
• modification équilibre ionique : dépolarisation de la membrane mitochondriale
• libération cytoplasmique du cytochrome c
• libération cytoplasmique des protéines SMAC/Diablo
• libération cytoplasmique des AIF
Mise en évidence de la dépolarisation de la membrane
• mitochondries fonctionnelles = multimères => fluorescence rouge
•mitochondries non fonctionnelles = monomères => fluorescence verte
Intensité de fluorescence verte
Inte
nsi
té d
e
fluore
scence
rouge
D’après Salvioli S. et al. (2000) Cytometry 40:189_197
Cellules normales
Cellules en apoptose
Cellules mortes
fluorochromes cationiques et lipophiles incorporation potentielle dépendante=> variation du potentiel mitochondrial
exemple : DiOC6, Rhodamine 123, MitoTracker, JC-1…
JC-1
Incorporation d ’un fluorochrome cationique : le JC-1
Coloration d ’une lignée de fibroblastes au JC-1, différents temps de stimulation de l ’apoptose
Photo : Ildo Nicoletti, Perugia University Medical School.
Mise en évidence de la libération cytoplasmique du Cytochrome C
+ Act D
-Act D
Coloration d’une lignée de cellules T humainesPhoto et Histogramme : Merck Novagen
•Anticorps dirigés contre le Cytochrome C
Activité enzymatique des caspases
===>
• forme active : anticorps
• site actif de l’enzyme : Peptide spécifique (FLICA)
• quantification de l’activité enzymatique
Procaspases précurseurs inactifs
Caspases actives
Substrat non fluorescent produit fluorescent
Caspase active
Exemple de mesure de l’activité enzymatique
Activité caspase (FITC)
Quanti
t é d
’A
DN
(I
odure
de
Pro
pid
ium
)
F. Guérif, V. Cadoret et D. Royère (2001)
• monoparamétrique activité caspase
Cellules en apoptose
• biparamétrique : activité caspase et ploïdie
Fragmentation de l ’ADN
En fin de cascade apoptotique il y a activation de nucléases qui coupent l ’ADN entre les nucléosomes
• méthode TUNEL :Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP Nick End Labeling
• méthode du pic hypodiploïde :
Méthode TUNEL
Enzyme Tdt fixe des désoxynucléotides non fluorescents ou fluorescents sur l’extrémité 3’OH libre.
Photo Molecular probes
Cellule en nécrose
Cellule en apoptose
Méthode TUNEL
Utilisation de la ChromaTide BODIPY FL-14-dUTP • apoptose en cours => fluorescence verte
• apoptose terminale : fragmentation nucléaire intense => fluorescence jaune
Photo : Zbigniew Darzynkiewicz, Cancer Research Institute, New York Medical College.
Méthode du pic hypodiploïde
Intensité de fluorescence rouge (Iodure de Propidium)
Résultats M. Afanasieff (1993)
Nom
br e
de c
ellu
l es
par
c las s
e d
’in
tens i
t é
( « c
anal »)
Cellules normales
Cellules en apoptose
Pic G0/G1
Pic G2/M
coupure entre les nucléosomes => quantité ADN < 2Cquantification ADN avec un fluorochrome intercalant spécifique (Iodure de propidium, Bromure d’éthidium…)
III. Apoptose et Infectiologie
Pathologies associées à l ’apoptose
Apoptose excessiveAlzheimerParkinsonSIDAHépatitesCertains diabètesMalformationsRejet de greffevirus, bactériesToxines
Apoptose insuffisanteMaladies autoimmunesLeucémiesSyndromes lymphoprolifératifsTumeursOstéoporoseMalformationsRejet de greffeMaladies virales (poxvirus, adenovirus)Maladies parasitaires (Toxoplasmose, Leishmaniose)
Trois exemples d’apoptose en pathologie infectieuse
• Mort du macrophage infecté par des salmonelles
• Rôle de l’apoptose dans les relations Plasmodium-vecteur
• Virus et régulation mitochondriale de l’apoptose
A) SalmonelloseK. HUEFFER and JE Galan,
Cell.Microbiol., 2004, 6, 1019-1025
• Co-évolution pathogène-hôte = modulation des relations (ex. fonctions/mort macrophage)
• SPI-1 : stimulée par faible O2 et forte osmolarité = phase d’invasion intestinale
• SPI-2 : stimulée par faible Mg++ et pH acide (intra-cellulaire) = infection systémique
• Les 2 protéines induisent la mort du macrophage mais différents mécanismes et temps : 45 min (SPI-1 ?) ou 24 h (SPI-2 ?)
Les TTSS de Salmonella• Salmonelles 2 « Type III protein secretion system » ou TTSS
Les questions
• S’agit-il d’une PCD ou d’une nécrose ?
• Mécanisme typique de PCD ?
• Mort identique pour tous les macrophages ?
• Conséquences pour le pathogène et pour l’hôte ?
PCD ou nécrose ?
- fragmentation chromatine- activation caspase 3- nucléosomes dans cytoplasme
- perte intégrité membrane- pas d’activation caspase 3- altération des organites
témoins
apoptose nécrose
Mécanisme typique de PCD ?
• Rôle clé de la Caspase 1
• Inhibiteurs de caspases inactifs
• Cytotoxicité courte ou longue
• Pas d’activation de la caspase 3
• Différences selon les macrophages
• Existe sans Caspase 1
• Action de protéines effectrices délivrées par TTSS ?
• Régulation pro ou anti-apoptotique ?
• Action indirecte (ex dégradation de l’actine
Conclusions = apoptose par différents mécanismes
Conséquences
• Stimulation du PCD / salmonelles pour limiter la réaction de l’hôte ?
• Réponse de l’hôte pour limiter l’invasion bactérienne ?
• Souris caspase-1- sont plus résistantes = moins pénétration des salmonelles dans la muqueuse ?
B) le Plasmodium et son vecteurH. Hurd and V. Carter, 2004, Int J Parasitol., 34, 1459-1472
PCD chez le parasite, le vecteur et l’hôte
- Chez le parasite et chez le vecteur :
* images caractéristiques de PCD * blocage par les inhibiteurs de caspases des métazoaires
- Chez l’hôte : * liaison présence du parasite et mort CD4+ et CD8+ ( du Fas)
Les observations
PCD chez le parasite
• Pas d’homologues de caspases dans le génome autres cystéine protéases ?
= «méta » et « para » caspases dont calpaine, cathepsine
• Différences pour l’étape mitochondriale (pas de p53, AIF, Apaf1 et Bcl2)
• Ressemblances pour les signaux inducteurs Heat shock, médicaments, lectines (con A),
sérum, ROS, NO (moustique et hôte producteurs +++)
PCD dans le tube digestif du moustique (1)
– Pas un type cellulaire précis
– Ensemble de caractéristiques communes post-invasion parasitaire (très lié à la chronologie du cycle et du stade parasitaire)
– Présence de caspase-3 like
– Déclenchement par simple contact parasitaire
– = élimination des cellules endommagées et/ou libération du parasite ?
– Le parasite s’échappe intact alors que sensible aux inducteurs et présence de NO (= seuils ?)
PCD chez le moustique (2)
• Réduction de fécondité du moustique / le parasite ( mRNA de vitellogénine) et PCD cellules folliculaires (reversible avec inhibiteur de caspase)
• = Réponse adaptative du vecteur vs stress de son parasitisme ? Un stress physiologique à la fois ?
• = Optimisation par le parasite de la survie de son hôte pour sa propre maturation ? Intérêt à « ménager » l’hôte
C) Virus et modulation de PCD dans la mitochondrie
P. Boya et al., 2004, Biochem. Biophys. Acta, 1659, 178-189
• Virus peuvent 1) augmenter PCD
(dissémination, immunosuppression); 2) réduire (réplication)
Variation selon les familles de virus
• Différentes voies d’action sur PCD (TNF, PKR, P53, caspases, mitochondries)
• Mitochondries => action « MMP », (Mitochondrial Membrane Permeabilisation)
= point central clé
• Virus avec : 1) induction; 2) inhibition de MMP (début du cycle) (fin du cycle infectieux)
• MMP déclenchée par :=> Voie externe : « death receptors
», caspases, MMP)=> Voie interne : action directe
mitochondriale« mitochondrial targeting sequence = MTS)
Mécanismes anti-apoptotiques
Exemple du KSHV (herpes virus : sarcome de Kaposi’ et maladies lymphoprolifératives)
• Différentes protéines virales anti-PCD dont 2 localisées dans mitochondries (K7 et K15)
• K7 contient un MTS
• K7 bloque MMP induit par TNF-α, CD45 death receptor ligand, Bax…
• K7 a un domaine formant un pont Bcl-2 et caspase 3 activée
• K7 régule aussi la voie du calcium
Virus Protein Intracellular Localization
Partners Cellular homologs
Protects cells from
CMV vMIA M Bax, ANT
Oxidants, anti-Fas, Bax, tBid, TN, TG, STS, BFA, NFX, CPX, HCQ
Myxoma M11L M PBR STS, anti-Fas, PPIX
Vaccinia F1L M STS, anti-Fas
KSHV K7 or vIAP M, ER, PM CAML, Bcl-2, activated caspase 3
Survivin delta-Ex3
TG, TNF-α, anti Fas
K15 M, ER HAX-1
EBV BHRF1 M Bcl-2 TRAIL, t-BHP, DNA damage, virus infection
HCV NS2 ER (M with CIDE-B)
CIDE-B CIDE-B
Antiapoptotic viral proteins acting at the mitochondria
Abbreviations: ANT, adenine nucleotide translocase; BFA, brefeldin A; CIDE-B, cell death-inducing; CMV, cytomegalovirus; CPX, ciprofloxacin; DFF45-like effector-B; EBV, Epstein–Barr virus; ER, endoplasmic reticulum; HCQ, hydroxychloroquine; HCV, hepatitis C virus; KSHV; Kaposi's sarcoma-related herpes virus; M, mitochondria; N, nucleus; NFX, norfloxacin; PBR, peripheral benzodiazepin receptor; PM, plasma membrane; PPIX, protoporphyrin IX, TG, thapsigargin; TN, tunicamycin; STS, staurosporine; t-BHP, tert-butyt-hydroperoxide
Mécanismes pro-apoptotiques
Exemple du HBV (hépatite B) : Protéine X (HBx)
• Essentielle pour réplication virale, oncogène
• Sensibilisation des hépatocytes au PCD induit par # stimuli (TNF-α, TRAIL)
• Localisation mitochondriale, perte du ΔΨm, mort
• MTS identifiée et fonctions précisées
• HBx interagit avec 2 protéines mitochondriales (HSP60 et VDAC3)
• Protéines anti-PCD (Bcl2 et Bcl-Xl) protègent
• VDAC3 = rôle pathogène (hépatite chronique et carcinogénèse) ???
Virus Protein Intracellular localization
Partners Effect on mitochondrial morphology
HBV X M, N VDAC3, Hsp60, cFLIP, p53, survivin
Yes
HIV Vpr M, N ANT, cyclophilin A, 14-3-3 proteins, Gag, SP1, GR, TFIIB, p300/CREB-binding protein
Yes
IAV PB1-F2 M, N Yes
HTLV-1
P13 II M, N FPPS, C44, C254
Yes
BLV G4 M, N FPPS
AEV VP3 M Yes
2C M, N Yes
WDSV Orf C M, C Yes
HPV E1E4 M cytokeratin Yes
type 16
Proapoptotic viral proteins acting at the mitochondria
Abbreviations: AEV, avian encephalitis virus; ANT, adenine nucleotide translocase;BLV, bovine leukemia virus; C, cytosolic; ER, endoplasmic reticulum; FPPS, farnesylpyrophosphate synthetase; HBV, hepatitis B virus; HIV-1, human immundeficiency virus-1; HPV, human papillomavirus; HSP, heat shock protein; HTLV-1, human T leukemia virus-1; IAV, influenza A virus; M, mitochondria; N, nucleus; VDAC, voltage-dependent anion channel; WDSV, Walleye dermal sarcoma virus
Séquences en relation avec l’apoptose
1) Généralités sur l ’apoptose :http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/T/TOC.html voir « apoptosis »
2) Fournisseurs :Molecular Probes : sondes fluorescenteshttp://probes.invitrogen.com/handbook/
Roche www.roche-applied-science.com voir « cell biology » puis « apoptosis »
Genentech : www.researchApoptosis.com
Merck : http://www.merckbiosciences.co.uk/html/emd/ip_apoptosiskits.html
Quelques sites web intéressants
Laboratoire de Cytométrie Unité Infectiologie Animale Santé Publique (IASP-213)Centre de Tourstél 02-47-42-77-59
Dominique Kerboeuf, Yves Le Vern
E-mail :[email protected] [email protected]
Site web :http://www.tours.inra.fr/plates_formes/plate_forme_d_analyses_cellulaires_et_moleculaires
Notre adresse